專利名稱：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜炎為基本病理改變，以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖卟?，大多病情呈進(jìn)行性，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)纖維性或骨性強(qiáng)直而嚴(yán)重致殘，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。未經(jīng)正確治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可遷延不愈，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。作為自身免疫性疾病，致病抗原驅(qū)動(dòng)的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞活化是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的核心途徑。對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷，現(xiàn)在主流仍然沿用1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)RA的分類標(biāo)準(zhǔn)，其主要靠臨床表現(xiàn)并排除其他關(guān)節(jié)炎從而對(duì)RA進(jìn)行判斷。另外，X線改變和類風(fēng)濕因子也是判斷RA的常用標(biāo)準(zhǔn)。但上述方法操作繁瑣且特異性不高，且不適用于早期診斷。眾所周知，RA的病理改變從滑膜組織開始逐漸向軟骨到骨發(fā)展。RA在早期若未得到有效治療，將會(huì)引起關(guān)節(jié)功能障礙甚至勞動(dòng)力喪失，并導(dǎo)致全身多臟器受累進(jìn)而危及生命。如果能盡早對(duì)RA病情做出診斷，及早治療，從而阻止或延緩其發(fā)展，將能有效的提高RA 的治療效果并減少其并發(fā)癥的發(fā)生。而針對(duì)RA早期有高度敏感性和特異性的檢測(cè)指標(biāo)是實(shí)現(xiàn)RA早期診斷和治療的前提。早期診斷指標(biāo)中，IL-8、IL-6水平在巨細(xì)胞病毒DNA陽(yáng)性的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中升高和CMV基因組出現(xiàn)之間存在聯(lián)系，但特異性和敏感性低。在RA自身抗體作為檢測(cè)指標(biāo)方面類風(fēng)濕因子(RF)存在靈敏度低的缺點(diǎn)；在早期RF陰性的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中可 53. 3%的病人抗核周因子(APF)呈陽(yáng)性，但APF抗原片的保存時(shí)間較短(僅為1 2周)，檢測(cè)穩(wěn)定性低；Μ抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中陽(yáng)性率為40%，特異性為98. 9%，但類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期僅約23% ；過(guò)氧化物還原酶IV (在說(shuō)明書附圖中簡(jiǎn)稱“IV”)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究尚未有人報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種過(guò)氧化物還原酶IV的新應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)在RA滑膜組織中篩選出RA備選抗原，再在備選抗原中篩選出過(guò)氧化物還原酶IV并對(duì)其抗體在初診和復(fù)診RA患者血清中通過(guò)間接ELISA進(jìn)行特異性和敏感性檢測(cè)，過(guò)氧化物還原酶IV主要表達(dá)于RA病變起始部位滑膜細(xì)胞胞漿，過(guò)氧化物還原酶IV體外特異性刺激RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖并分泌RA發(fā)病相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、TNF-α和 IFN- γ，所以過(guò)氧化物還原酶IV是新的RA疾病相關(guān)抗原，該抗體檢測(cè)的新應(yīng)用在初診RA患者血清當(dāng)中特異性和敏感性高，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷及治療提供了新思路。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應(yīng)用。
進(jìn)一步，所述過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用； 進(jìn)一步，所述過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷試劑中的應(yīng)用； 進(jìn)一步，過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疫苗中的應(yīng)用。本技術(shù)方案分別利用免疫蛋白組學(xué)方法在RA滑膜中篩選出RA備選抗原及抗體， 通過(guò)TOF-TOF質(zhì)譜法及免疫蛋白印跡(Western Blotting)法進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證備選抗原中的五號(hào)蛋白點(diǎn)為過(guò)氧化物還原酶IV ；利用Western-blot檢測(cè)RA和骨性關(guān)節(jié)炎(OA)滑膜組織中過(guò)氧化物還原酶IV表達(dá)差異；通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法證實(shí)過(guò)氧化物還原酶IV主要表達(dá)于RA起始病變部位滑膜細(xì)胞胞漿；借助間接法ELISA測(cè)定過(guò)氧化物還原酶IV抗體在 RA血清中的特異性和敏感性；并發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物還原酶IV抗體滴度在初診的早期RA患者(病程少于3個(gè)月)中明顯高于正常人，并且高于經(jīng)免疫抑制治療的復(fù)診RA患者；通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)了過(guò)氧化物還原酶IV特異性刺激RA外周血單核細(xì)胞增殖，并分泌IL-17、TNF- α 和IFN-Y等與RA發(fā)病相關(guān)細(xì)胞因子。根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明得出如下結(jié)論過(guò)氧化物還原酶IV為RA特異性疾病相關(guān)抗原。在上述研究基礎(chǔ)上針對(duì)過(guò)氧化物還原酶IV抗原進(jìn)行改造等方式制備疫苗可能為RA的特異性免疫治療提供新的手段。
本發(fā)明的有益效果在于過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應(yīng)用中，其特異性和敏感性高，尤其適用于早期診斷試劑的應(yīng)用，過(guò)氧化物還原酶IV還為制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疫苗中提供了新思路。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為RA滑膜組織蛋白點(diǎn)2-D分離后Coomassie blue染色雙向凝膠電泳圖。圖2為RA患者血清與圖1蛋白點(diǎn)雜交的雙向凝膠電泳圖。圖3為OA患者血清與圖1蛋白點(diǎn)雜交的雙向凝膠電泳圖。圖4為正常人血清與圖1蛋白點(diǎn)雜交的雙向凝膠電泳圖。圖5為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血清與圖1蛋白點(diǎn)雜交的雙向凝膠電泳圖。圖6為RA滑膜組織中特異性與RA患者血清反應(yīng)的雙向凝膠電泳圖，包含12個(gè)蛋白點(diǎn)。圖7為T0F-T0F蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)第5號(hào)蛋白點(diǎn)的鑒定圖譜。圖8為免疫印跡法蛋白定性檢測(cè)電泳譜，其中A為單向凝膠電泳圖(1、2為不同 RA滑膜組織，3、4為Hela細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照)，B為RA滑膜組織雙向凝膠電泳圖。圖9為免疫印跡法檢測(cè)RA患者和OA患者滑膜組織中過(guò)氧化物還原酶IV的差異表達(dá)電泳圖(1、2分別為RA和OA滑膜組織)。圖10-A和圖10-B為蘇木素-依紅(HE)染色RA滑膜組織的病理照片圖，圖10_C 和圖10-D為RA滑膜組織過(guò)氧化物還原酶IV免疫組化染色的病理照片圖。圖11為PBMC增殖實(shí)驗(yàn)的放射強(qiáng)度(cpm)分析圖，其中A為cpm值分析圖，B為刺激指數(shù)(stimulation index, Si)分析圖。圖12為CFSE染色流式細(xì)胞檢測(cè)PBMC增殖圖。
圖13為ELISA法檢測(cè)過(guò)氧化物還原酶IV刺激PBMC IFN- y、IL-17和TNF- α分泌量的分析圖，其中，A為IFN-Y的分析圖，B為IL-17的分析圖，C為TNF-α的分析圖。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)驗(yàn)材料 1. 1試劑
丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED、過(guò)硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、Tris、甘氨酸、溴酚藍(lán)、二硫蘇糖醇(DTT)、CHAPS、低熔點(diǎn)瓊脂糖、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、IPG緩沖液、IPG膠條(pH3_ll L)、IPG 覆蓋油、尿素和 PhastGel Blue R 購(gòu)自 Amersham Pharmacia Biotech ；碘乙酰胺購(gòu)自Sigma;測(cè)序級(jí)胰蛋白酶購(gòu)自！Iomega;蛋白酶抑制劑和ECL Western blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche ；甲醇、冰乙酸和無(wú)水乙醇購(gòu)自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠； 辣根酶標(biāo)記山羊抗人IgG (H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)、Power VisionTM(IgG 抗體-HRP多聚體)復(fù)合物和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司；鼠抗人過(guò)氧化物還原酶IV單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；Recombinant human過(guò)氧化物還原酶IV購(gòu)自 Lifescience公司；多聚甲醛購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。1. 2 儀器
IPGphor等電聚焦儀、SE600垂直電泳儀、MultiTempIII循環(huán)水浴和TE50X電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自 Amersham Pharmacia Biotech公司；550型酶聯(lián)儀和GS-800圖像掃描系統(tǒng)Bio-Rad公司； MALDI-T0F質(zhì)譜儀購(gòu)自Bruker公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；脫色搖床購(gòu)自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；LEICA AM 2135型切片機(jī)購(gòu)自Leica公司；BX-50型Olympus顯微鏡和PM-20型Olympus顯微攝像系統(tǒng)Olympus公司；紫外分光光度儀Backmen公司。主要試劑配制
1.3.1樣品裂解液貯液40 mmol/L Tris, 7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的 CHAPS，Iml/ 管分裝，_70°C凍存。1.3.2 10mg/ml RNase A，_20°C凍存?zhèn)溆谩?. 3. 3 mg/ml DNase I，_20°C凍存?zhèn)溆?br> 1. 3. 4 20X蛋白酶抑制劑1粒蛋白酶抑制劑溶解于350 μ L純水中。1.3.5 1 mol/L DTT，_20°C凍存?zhèn)溆谩?. 3. 6 IPG buffer，4°C保存?zhèn)溆谩?.3.7樣品裂解液工作液40mmol/L Tris, 7 mol/L尿素，2mol/L硫脲，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4% 的 CHAPS，100μ g/ml DNase I，25 μ g/ml RNase A, IX 蛋白酶抑制劑，0.8% IPG buffer,60 mmol/L DTT。1. 3. 8溶漲液貯液7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CHAPS，痕量溴酚藍(lán)，-70°C凍存。1. 3. 9溶漲液工作液溶漲液貯液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的IPG buffer, 60 mmol/ L DTT (臨用前加)。1. 3. 10 平衡緩沖液50 mmol/L Tris-Cl pH 8. 8，6 mol/L urea,體積分?jǐn)?shù)為
530%的glycerol，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的SDS，溴酚藍(lán)痕量。1. 3. 11質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%低熔點(diǎn)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的低熔點(diǎn)瓊脂溶解于 SDS-PAGE電泳緩沖液。1. 3. 12 30%丙烯酰胺貯液30g丙烯酰胺，0. Sg甲叉丙烯酰胺溶解于IOOml純水中，過(guò)濾，4°C貯存于棕色瓶中。1. 3. 13 4X 分離膠緩沖液1. 5 mol/L Tris-Cl (pH 8. 8) 1.3.14 10% SDS IOg SDS 溶解于 50ml H20 中，定容至 IOOml。1. 3. 15 10%過(guò)硫酸銨0. Ig過(guò)硫酸銨溶解于Iml純水中。1. 3. 16 SDS-PAGE 電泳緩沖液:94g 甘氨酸，12. Ig Tris, 50ml 10% SDS，溶解于水并定容至1000ml。1. 3. 17考馬斯亮藍(lán)染色液貯液溶解1片PhastGel Blue R于80ml水中，攪拌 5-lOmin，加入120mL甲醇，攪拌直至染料完全溶解，過(guò)濾溶液備用。1. 3. 18考馬斯亮藍(lán)染色液工作液(0. 1% )染色液貯液與體積分?jǐn)?shù)為20%乙酸按體積比為1 :1的比例混合。1. 3. 19脫色液體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇，體積分?jǐn)?shù)為10%乙酸溶于水中。1. 3. 20轉(zhuǎn)移緩沖液(39mm甘氨酸，48mmTris堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 037%的SDS，體積分?jǐn)?shù)為20%甲醇)稱取甘氨酸2. 9g，1Tris堿5. 8g，SDS 0. 037g，并加入200ml甲醇，最后加水補(bǔ)充至總體積為1000ml。1. 3. 21 TBS (50mM Tris 堿，150mM 氯化鈉，ρΗ7· 5)稱取 6. 05g Tris 堿，8. 76g 氯化鈉，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 5，加水至總體積為1L，2_8°C保存3個(gè)月。1. 3. 22 TBST 將 ImLTween 20 加入 IL TBS 中，2_8°C保存 3 個(gè)月。1. 3. 23 封閉液加入IOmL封閉液貯液到90mlTBS中，在-15 _25°C穩(wěn)定保存。1. 3. 24 0. 5%封閉液加入5mL封閉液貯液到95mLTBS中，在-15 _25°C穩(wěn)定保存。1.3. 25 一抗(血清)用0. 5%的封閉液稀釋一抗。1. 3. 26 POD標(biāo)記的抗鼠或兔IgG 用100 μ L純水將凍干粉溶解，得到二抗貯液。 用0.5%的封閉液稀釋得到工作液。40mU/mL 二抗通常足夠用來(lái)檢測(cè)。該貯液在2_8°C可以保存12個(gè)月，但工作液需要新鮮配置。1. 3. 27 ECL檢測(cè)溶液將溶液A與溶液B以體積比為1 1的比例混合，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。1. 3. 28 0. OlM PBS :50mL0. 2mol/L PB 加 8. 8g NaCl，雙蒸水定容至 IOOOmL01. 3. 29 RIPA 裂解液1.5M Nacl ImL，IOOmM Tris-HCL (pH7. 4) 5mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10% SDS IOOuL, 500mM DTT 100uL，NP_40 lOOuL，Complete Mini (蛋白酶抑制劑)1 片，
三蒸水定容至10 mL。1. 3. 30 包被液0. 85M (PH 9. 6)碳酸鹽緩沖液1. 59g Na2CO3 加 2. 93g NaHCO3, 三蒸水定容1000mL。
1.3.31洗滌液0. OlM pH7. 4 PBS +吐溫-20 (T)使最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 05%。1. 3. 32底物溶液磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(ρΗ5· 0 5· 5) :0. IM檸檬酸Μ. 3mL加入 25. 7ml 0. 2M Na2HPO4 · 12H20加入鄰苯二胺40. Omg,定容至50mL，臨用前加0. 15mL體積分?jǐn)?shù)為30%的吐02。
1.3. 33終止劑22. 2mL硫酸加入蒸餾水177. 8mL。1.4樣品5例RA滑膜組織由北京大學(xué)附屬人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科栗占國(guó)教授提供；534例RA (其中初診67例、復(fù)診467例)、65例OA、120例SLE、10例硬皮病 (scleroderma)、15例皮肌炎(dermatomyositis)及120例正常對(duì)照(NC)血液標(biāo)本源自西南醫(yī)院。雙向凝膠電泳法篩選RA滑膜組織中的備選抗原
2.1樣品制備
2. 1. 1取出-70°C凍存的RA滑膜組織樣品，室溫平衡約lOmin，加入樣品裂解液工作液充分研磨，渦旋器上振蕩約20-30min后，室溫放置l_2h，使細(xì)胞蛋白充分溶解，經(jīng)過(guò)超聲裂解后 40C 12000rpm 1 小時(shí)。2.1.2 樣品溶液的蛋白定量(DC Protein Assay, BIO-RAD COMPANY)。2. 1. 2. 1配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(0. 25mg/ml 1. 5mg/ml蛋白)先將BSA溶解于水配制10mg/mL的BSA母液，然后用樣品裂解液稀釋成0,0. 25,0. 5,1. OU. 5mg/ml五個(gè)不同濃度的BSA溶液。2. 1. 2. 2樣品液的稀釋用樣品裂解液將樣品液稀釋10、20倍備用。2. 1. 2. 3準(zhǔn)備工作液試劑A0 每Iml試劑A加入20 μ L試劑S (該工作液試劑Α0 可穩(wěn)定1周，即使1天以后形成了沉淀。如果形成了沉淀，加熱溶液并振蕩。不要用加樣槍頭吹打，因?yàn)槿菀锥氯麡岊^而改變加入樣品中的試劑體積)。2. 1. 2. 4樣品及標(biāo)準(zhǔn)品Α655值的測(cè)定吸取5 μ L標(biāo)準(zhǔn)液和樣品加入干凈、干燥的微孔板。每孔加入25 μ L試劑Α0或試劑Α。每孔加入200 μ L試劑B。15min后，655nm測(cè)吸光值。Ih內(nèi)吸光值穩(wěn)定。2. 1. 2. 5建立線性方程，計(jì)算樣品蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)方法
2. 2. 1 2D-PAGE第一向——等電聚焦
2. 2. 1. 1取出_20°C凍存的IPG strip，室溫平衡數(shù)分鐘。2. 2. 1. 2樣品和溶漲液在IPG holder中混合，達(dá)到合適的上樣量，去掉IPG膠條的保護(hù)膜，膠面朝下，避免產(chǎn)生氣泡，放入溶漲液中。IPG膠條上覆蓋一層礦物油，蓋上蓋子， 溶漲過(guò)夜。2. 2. 1. 3儀器運(yùn)行參數(shù)如下
等電聚焦運(yùn)行參數(shù)溫度，20°C ；最大電流，50mA per IPG strip ；樣品體積， 350 μ 1 (180mm IPG strip)或 250 μ 1 (130mm IPG strip) ；30V，10-12 小時(shí)(溶漲)；200V, 1 小時(shí)；500V, 1 小時(shí)；500-8000V, 30min ；8000V, 5-6 小時(shí)(IPG 3-10L)，6-7 小時(shí)(IPG 4-7)。2. 2. 1. 4達(dá)到適當(dāng)?shù)目傠妷?時(shí)間積(Total Volt-hours, Vh)后，取出膠條于平衡液中平衡。2. 2. 2 平衡
2. 2. 2. 1 IOOmg DTT溶解于IOmL平衡緩沖液中(平衡緩沖液I )。取出IPG膠條分別放入玻璃管中，在振蕩儀上振蕩平衡15min。2. 2. 2. 2 400mg碘乙酰胺溶解于IOmL平衡緩沖液(平衡緩沖液II )，將膠條轉(zhuǎn)移到平衡緩沖液II中，蓋上蓋，在振蕩儀上振蕩平衡15min。2. 2. 3 2D-PAGE 第二向-SDS-PAGE
權(quán)利要求
1.過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷試劑中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于過(guò)氧化物還原酶IV在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及過(guò)氧化物還原酶Ⅳ在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑，所述過(guò)氧化物還原酶Ⅳ在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷試劑中的應(yīng)用，過(guò)氧化物還原酶Ⅳ在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應(yīng)用中，其特異性和敏感性高，尤其適用于早期診斷試劑的應(yīng)用，過(guò)氧化物還原酶Ⅳ還為制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疫苗中提供了新思路。
文檔編號(hào)A61P19/02GK102344916SQ20111002563
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者吳喬, 吳玉章 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)