專利名稱：來自臍帶膠質(zhì)的新生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由臍帶的細(xì)胞外基質(zhì)形成的生物材料(尤其是水凝膠)在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及一種基本由糖胺聚糖組成的生物材料及其制備方法和用途，所述糖胺聚糖僅在臍帶的臍帶膠質(zhì)中存在。該產(chǎn)品的實(shí)施方案可被單獨(dú)使用，或與基于細(xì)胞的療法組合使用。
背景技術(shù)：
由聚合物形成的生物材料在再生醫(yī)學(xué)中起重要作用，因?yàn)樗鼈優(yōu)橐浦布?xì)胞的附 著、增殖和分化提供暫時(shí)的三維錨定。這種三維結(jié)構(gòu)為細(xì)胞間的聯(lián)系以及細(xì)胞與生物材料組分之間的聯(lián)系提供合適的平臺(tái)?；|(zhì)和細(xì)胞之間隨時(shí)間的生物相互作用決定了細(xì)胞的增殖能力、其形成新組織的組構(gòu)、其分化以及釋放指導(dǎo)再生過程的信號(hào)(Dawson等，2008)。為了產(chǎn)生這些現(xiàn)象，需要將生物材料在應(yīng)用部位保持有限的時(shí)間直至其重吸收，使其結(jié)構(gòu)保持足夠長的時(shí)間以便得到具有再生效果的合適的細(xì)胞作用。水凝膠是一種特定類型的生物材料，其具有許多使其適用于組織工程的特性。水凝膠是由具有天然或合成性質(zhì)的交聯(lián)親水聚合物形成的結(jié)構(gòu)，具有在其結(jié)構(gòu)內(nèi)包含其自身重量的10-20%直至數(shù)百倍的大量水的能力。這些凝膠顯示具有三維點(diǎn)陣的半固體形態(tài)，該三維點(diǎn)陣是形成充當(dāng)支持物的結(jié)構(gòu)基質(zhì)的理想候選物。這些三維結(jié)構(gòu)可以通過物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)形成。物理交聯(lián)產(chǎn)生可逆的水凝膠，根據(jù)最終應(yīng)用其結(jié)構(gòu)可以逆轉(zhuǎn)，而共價(jià)化學(xué)交聯(lián)產(chǎn)生固定的水凝膠，其結(jié)構(gòu)在整個(gè)應(yīng)用過程中都被保持(Coburn等，2007)。因此，水凝膠是使用三維網(wǎng)絡(luò)形式交聯(lián)的聚合材料(具有天然或合成性質(zhì))，其在接觸水時(shí)膨脹，形成軟的彈性材料，并且在它們的結(jié)構(gòu)中保留其大部分組分而無溶解。水凝膠具有一系列特性，例如I.親水性由于它們的結(jié)構(gòu)中存在水溶性基團(tuán)(-oh、-cooh、-conh2、-conh、so3h)。它們具有類似于自然組織的高含水量(Elisseeff等，2005)。2.不溶于水由于它們結(jié)構(gòu)中緊密結(jié)合的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)的存在。3.它們具有膠狀的稠度，這是由親水起始單體和聚合物的低交聯(lián)密度決定的。所述水凝膠能夠在存在水或水溶液時(shí)膨脹，顯著增加其體積直至達(dá)到化學(xué)-物理平衡，但不失去它們的形狀。這種膨脹能力提供的水性微環(huán)境與細(xì)胞在軟組織中遇到的水性微環(huán)境相當(dāng)。水和多孔結(jié)構(gòu)的存在還允許低分子量溶質(zhì)和營養(yǎng)物的流動(dòng)(這對(duì)于細(xì)胞活性是重要和必要的)，以及將細(xì)胞廢棄物輸送到水凝膠外(Torres等，2000)。糖胺聚糖(GAG)，也稱為粘多糖，是被發(fā)現(xiàn)在生物體中與稱為蛋白多糖的蛋白細(xì)胞核結(jié)合形成大分子的雜多糖。這些可以發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)中，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的重要功能。糖胺聚糖采取硫酸化和非硫酸化的形式，其具有常見的特征性的分子部分，該分子部分包括由兩種不同的糖形成的二糖重復(fù)序列；其中一種通常是己糖醒(hexuronate),而另一種是己糖胺。二糖鍵合以及硫酸化位置的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致這些鏈的物理和化學(xué)性質(zhì)多樣性的增加。高硫酸化的含量和糖醛酸的存在給GAG提供大量的負(fù)電荷，所以WJ中的大量GAG使得該組織極度親水。
存在數(shù)種類型的GAG，其直接參與基本細(xì)胞功能，不僅由于它們的結(jié)構(gòu)，還因?yàn)樗鼈兪菙?shù)個(gè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的錨定位點(diǎn)。透明質(zhì)酸是WJ中最豐富的GAG。它是GAG家族中唯一非硫酸化的成員，其在體內(nèi)的功能就像游離的碳水化合物，其結(jié)構(gòu)由二糖D-葡糖醛酸和(I-β -3)Ν-乙?；?D-葡糖胺的重復(fù)組成(Goa等，1994 ；Laurent等，1992)。透明質(zhì)酸由數(shù)種細(xì)胞類型合成,并被分泌進(jìn)入細(xì)胞間隙，在細(xì)胞間隙中其與細(xì)胞外基質(zhì)的其它組分相互作用以產(chǎn)生圍繞細(xì)胞的支持和保護(hù)結(jié)構(gòu)(Collins等，2008)。透明質(zhì)酸是大的聚陰離子型線性聚合物，其具有分子量為100，000至5X IO6Da的單個(gè)分子(Toole等，2004 ；Bertolami等，1992)。透明質(zhì)酸具有占據(jù)大體積的螺旋結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生高粘度溶液。透明質(zhì)酸的單個(gè)分子彼此結(jié)合，形成網(wǎng)絡(luò)或點(diǎn)陣。在形成組織時(shí)，透明質(zhì)酸被認(rèn)為是參與細(xì)胞增殖和遷移的主要結(jié)構(gòu)大分子。透明質(zhì)酸已經(jīng)參與數(shù)個(gè)過程，例如血管形成、形態(tài)發(fā)生以及在細(xì)胞外基質(zhì)的整體完整性和修復(fù)中。已知羊水中包含的大量透明質(zhì)酸有利于胎兒傷口的修復(fù)(Longaker等，1989)。還可以觀察到在健康皮膚和疤痕之間透明質(zhì)酸分子性質(zhì)的差異，典型疤痕的透明質(zhì)酸與肥大性疤痕的透明質(zhì)酸不同(Ueno等，1992)。 硫酸軟骨素是由D-葡糖醛酸二聚體和N-乙酰半乳糖胺重復(fù)形成的線性聚合物。已經(jīng)在針對(duì)關(guān)節(jié)疾病的療法中檢測了其有效性，通過抑制導(dǎo)致軟骨組分的基質(zhì)降解的酶的活性。通過抑制補(bǔ)體，硫酸軟骨素可以充當(dāng)抗炎劑，并可用于在手術(shù)和眼科診所中治療血栓
栓塞病癥。硫酸皮膚素，也稱為硫酸軟骨素B，是一種有效的抗凝劑，由于其通過肝素輔因子II對(duì)凝血酶的選擇性抑制作用，其在體內(nèi)非常有效，因?yàn)槠涑鲅L(fēng)險(xiǎn)更低(Trowbridge等，2002)。通常糖胺聚糖(尤其是肝素)具有調(diào)節(jié)血漿級(jí)聯(lián)活性的能力，增強(qiáng)內(nèi)在凝結(jié)途徑的抑制并在不同點(diǎn)抑制典型的補(bǔ)體激活途徑(Rabenstein，2001)。肝素的其它已知功能是血管發(fā)生的抑制，體液生長及其抗病毒活性。硫酸類肝素具有與肝素密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)。其在動(dòng)物組織中廣泛分布，在其功能中，細(xì)胞附著和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)是最重要的。硫酸類肝素具有抗蛋白降解的保護(hù)作用，調(diào)節(jié)它們通過基底膜輸送以及干擾其內(nèi)化(Rabenstein, 2001)。有數(shù)篇專利文獻(xiàn)涉及獲自人或動(dòng)物來源的粘多糖。文獻(xiàn)US 3，887，703涉及由來自胎牛或胎羊來源的皮膚皮層和臍帶獲得的粘多糖混合物。在前述專利中獲得粘多糖的方法未描述臍帶的膜、細(xì)胞和血管組分的去除。提取產(chǎn)物以粉末形式獲得，而對(duì)于其中包含的單個(gè)粘多糖沒有組成上或定量上的清楚認(rèn)識(shí)。通過混合物中存在的己糖胺的量來鑒定活性產(chǎn)物。用提取物來制備用于治療油性頭皮和毛發(fā)以及炎癥的注射形式和口服攝入形式的組合物。專利文獻(xiàn)US 5，814，621涉及一種基本上由與水相比更易溶于有機(jī)溶劑-水混合物的藥物以及構(gòu)成藥物一部分的粘多糖組成的組合物，其中藥物的晶體或顆粒分布在粘多糖顆粒的表面，并且與其單獨(dú)形式相比，所述藥物更快地溶于水。所述組合物可為顆粒形式。專利申請(qǐng)WO 2008/021391 Al描述了包括臍帶膜的生物材料。此外，它還包括一種或更多種臍帶血管和/或臍帶膠質(zhì)。生物材料優(yōu)選的是干燥的，可以是扁平狀、管狀或適合特定結(jié)構(gòu)的形狀。本發(fā)明還提供制備包括至少一層臍帶膜的生物材料的方法，以及獲得所述生物材料的方法及其用于修復(fù)組織或器官的用途。說明書表征了來自臍帶的生物材料。它描述了所述材料的組成包括膠原(I、III和IV型，這些占生物材料基質(zhì)的75-80%)、纖連蛋白和糖胺聚糖。它還提及生物材料還可以包括不是來自臍帶的膠原，并具有商品化來源，或已經(jīng)利用該領(lǐng)域當(dāng)前水平已知的方法將其從其它組織分離。作者還補(bǔ)充了生物材料可以包括非結(jié)構(gòu)的化合物例如生長因子、激素、抗生素、免疫調(diào)節(jié)因子等。西班牙專利ES 8600613描述了以下方法用于治療機(jī)體組織，用于分離細(xì)胞膜、核酸、脂質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)組分以及形成細(xì)胞外基質(zhì)(其主要組分是膠原)，和用于制備適于用做機(jī)體移植物的機(jī)體組織，其包括用至少一種清潔劑提取所述組織并且同時(shí)將其保持為適于被移植到體內(nèi)的大小與形狀。
專利文獻(xiàn)ES2180653T3描述了將生物材料轉(zhuǎn)化為已經(jīng)歷自溶作用去除至少70%細(xì)胞的物質(zhì)的方法，以及處理所述材料以抑制其在移植入人或動(dòng)物后礦化的方法。它要求起始生物材料可以是(尤其是)臍帶；盡管它具體涉及豬的主動(dòng)脈瓣。盡管如此，說明書沒有包含涉及利用臍帶實(shí)施的任何詳情。使用獲得的生物材料產(chǎn)生生物心瓣膜。專利文獻(xiàn)US 4，240，794涉及制備人或其它動(dòng)物臍帶以用做血管替代物。該文獻(xiàn)具體描述了將臍帶在醇中脫水的技術(shù)，然后是將其固定為所需形態(tài)的方法。根據(jù)描述，一旦從臍帶上去除其它組織的可能殘留，就將其固定在軸上，浸于特定的乙醇溶液至脫水必需的時(shí)間。脫水后，將臍帶浸入1%醛溶液進(jìn)行固定。專利文獻(xiàn)FR 2，563，727描述了一種從去程序化的結(jié)締組織(用臍帶膠質(zhì)浸潰并保存于冷凍溫度)制備皮移植片的方法。作者描述了一種錨定到臍帶組織的裝置，并通過注射壓縮空氣的插管將其膨脹。根據(jù)描述，然后將臍帶切割并分離，但利用這種方法得到的產(chǎn)物不僅僅由WJ組成。存在使用臍帶獲得感興趣的細(xì)胞的專利文獻(xiàn)，為了這個(gè)目的他們實(shí)施分離臍帶膠質(zhì)并將其去除的方法，從而獲得所述細(xì)胞。例如，PCT文獻(xiàn)98/17791描述從臍帶分離前軟骨細(xì)胞，其隨后在治療上用于產(chǎn)生軟骨。類似地，在文獻(xiàn)WO 2004/072273 Al中，從位于臍帶血管周圍區(qū)域內(nèi)的臍帶膠質(zhì)提取祖細(xì)胞，用于修復(fù)人組織。與其它生物材料不同，本發(fā)明的生物材料由臍帶WJ中存在的不同GAG的組合組成。它主要由透明質(zhì)酸組成，但此外，與其它GAG化合物不同，它包含硫酸皮膚素、硫酸類肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素、軟骨素-4-硫酸鹽和軟骨素-6-硫酸鹽。如臍帶的WJ中存在的不同GAG的特定組合提高了生物材料的生物活性，因?yàn)樗鼈冎械拿恳环N都發(fā)揮細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)功能。例如，已知硫酸類肝素和肝素是FGF和EGF的主要結(jié)合部位(Kanematsu等,2003 ；Ishihara等，2002)，其保護(hù)它們免遭蛋白水解并允許細(xì)胞環(huán)境中這些因子的局部濃度，產(chǎn)生適合于大細(xì)胞活化的分子微環(huán)境(Malkowski等，2007)。但是，據(jù)我們所知，沒有文獻(xiàn)提及由源自臍帶的臍帶膠質(zhì)的GAG形成的生物材料，所述臍帶的臍帶膠質(zhì)1)不含臍帶膜和血管，2)其可以形成具有可調(diào)節(jié)粘度的水凝膠，3)其適用于范圍廣泛的人疾病。而且，前述專利實(shí)施例包括臍來源的產(chǎn)物，其與該文獻(xiàn)中提出的當(dāng)前實(shí)施方案有顯著差異。本發(fā)明的生物材料僅僅基于形成臍帶的細(xì)胞外基質(zhì)(稱為臍帶膠質(zhì)WJ)的糖胺聚糖。因此，雖然從文獻(xiàn)有多次合成細(xì)胞外基質(zhì)的嘗試，但還沒有實(shí)現(xiàn)模擬特定組織自然條件的準(zhǔn)確的組合物。本發(fā)明中開發(fā)的生物材料可提供一種三維支架，其具有作為組織工程基質(zhì)的潛在應(yīng)用。此外，當(dāng)在疾病中作為一部分直接應(yīng)用或與細(xì)胞組合應(yīng)用時(shí)，它參與再生過程，對(duì)周邊組織的細(xì)胞發(fā)揮趨化作用，從而為細(xì)胞過程的活化提供良好的環(huán)境。這種生物材料中存在的GAG組合提供許多特異性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子結(jié)合位點(diǎn)，其允許在應(yīng)用位點(diǎn)組織自身細(xì)胞的高度活化以便合成高水平的細(xì)胞外基質(zhì)，其將再生和修復(fù)被治療的缺陷。此外，本發(fā)明生物材料的來源提供來自非免疫原性區(qū)域的人或動(dòng)物來源的天然產(chǎn)物。該材料在體內(nèi)通過天然生物降解方法去除，從而阻止由其它生物材料引起的不期望的反應(yīng)或副反應(yīng)。例如，一些合成生物材料可能引起炎癥、硬化(器官組織的硬化)、肉芽瘤的發(fā)病，粘膜壞死以及由用于其制備的有毒物質(zhì)造成的組織并發(fā)癥。GAG在臍帶中是提供強(qiáng)度、彈性和抗性以保護(hù)位于其中的血管系統(tǒng)免遭外部物理 干擾(例如臍帶扭轉(zhuǎn)對(duì)胎兒將是致命的)最重要的功能之一。實(shí)際上，懷孕期間重要的疾病涉及這些分子合成中的缺陷(Gogiel等，2005)。因此，可認(rèn)為由7種不同類型的GAG (能夠成臍帶的一部分)組成的生物材料將通過具有以下功能而具有很大程度的通用性生物體中存在的生物活性的重演(recapitualtion)、具有有益于臍帶的相同的機(jī)械性能，以及具有對(duì)于進(jìn)一步處理和修飾(例如交聯(lián))的適用性。附圖描述圖I :本發(fā)明生物材料中存在的GAG的表征和定量。柱狀圖顯示本發(fā)明生物材料中存在的不同類型的GAG，以及其各自的組成百分比。HA :透明質(zhì)酸，KS :硫酸角質(zhì)素，C6S 軟骨素-6-硫酸鹽，HS :硫酸類肝素，C4S :軟骨素-4-硫酸鹽，DS :硫酸皮膚素，H :肝素。圖2 :通過組織學(xué)染色對(duì)樣品中存在GAG和不存在細(xì)胞和DNA/RNA的驗(yàn)證。左圖顯示含有細(xì)胞的樣品，右圖顯示單獨(dú)的生物材料的染色。A、B :蘇木素伊紅染色；C、D :甲基綠焦寧染色；E、F :阿爾辛藍(lán)染色。圖3 :通過掃描電子顯微鏡顯示的本發(fā)明生物材料的內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)的圖像。該圖像以兩種不同的放大率(A :10μπι和B :5μπι)顯示本發(fā)明生物材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其中可以觀察到GAG單位彼此相連，提供非常均勻的多孔結(jié)構(gòu)。圖4 :本發(fā)明生物材料中細(xì)胞毒性研究的結(jié)果。該圖顯示AMSC細(xì)胞(脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞)(圖Α)、小鼠成纖維細(xì)胞(圖B9)、L929 (圖C)、成骨細(xì)胞(圖D)、軟骨細(xì)胞(圖E)和角質(zhì)形成細(xì)胞(圖F)的細(xì)胞毒性曲線。給出相對(duì)于對(duì)照(不含生物材料的細(xì)胞)和陽性對(duì)照(在根據(jù)IS0-10993標(biāo)準(zhǔn)確定的有毒生物材料PVC中的細(xì)胞)的結(jié)果。從圖中可以觀察到，在任一被檢測的細(xì)胞類型中生物材料都不造成毒性，因?yàn)榉胖迷谏锊牧仙系募?xì)胞的線粒體活性沒有顯示與對(duì)照細(xì)胞的差異(在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下)。圖5:三維生物材料的放大的圖像。所顯示為凍干后本發(fā)明固體生物材料的肉眼可見的三維結(jié)構(gòu)，使用標(biāo)準(zhǔn)的24孔培養(yǎng)板作為凍干模子。圖6 :倒置光學(xué)顯微鏡圖像顯示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)的活性，以及在本發(fā)明的生物材料中的共培養(yǎng)物中用MTT染色的MSC。分別在第3天和第7天染色。染成黑色的細(xì)胞是有活性的和代謝活躍的。圖7 :本發(fā)明的生物材料和透明質(zhì)酸中人軟骨細(xì)胞增殖能力的對(duì)比。圖中的數(shù)據(jù)顯示相對(duì)于在透明質(zhì)酸中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，在本發(fā)明的生物材料中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的增殖能力顯著增加。圖8 :接觸本發(fā)明的生物材料和透明質(zhì)酸的成纖維細(xì)胞L-929的增殖率。該圖顯示當(dāng)與在透明質(zhì)酸中培養(yǎng)的細(xì)胞相比時(shí)，在本發(fā)明的生物材料中排列的細(xì)胞增殖顯著增加。圖9 :使用本發(fā)明的生物材料以及接觸細(xì)胞培養(yǎng)表面放置的透明質(zhì)酸水凝膠，在細(xì)胞培養(yǎng)塑料上接種的細(xì)胞的倒置熒光顯微鏡圖像。在這些圖像中，可以觀察到接觸本發(fā)明的生物材料的細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)表面分離并在本發(fā)明的生物材料中成簇。

圖10 :膠原II和多功能蛋白聚糖的表達(dá)的RT-PCR。來自瓊脂糖膠的光密度掃描的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于對(duì)照值(C)的強(qiáng)度的任意單位和平均值土s.e. m，n=3。(*p〈0. 05，**p〈0. 01)。該圖像顯示II型膠原表達(dá)的開始以及放置在本發(fā)明的生物材料上的AMSC中多功能蛋白聚糖的減少。這些表達(dá)特性表示在向軟骨細(xì)胞表型分化的過程中成熟的關(guān)節(jié)軟骨相應(yīng)的細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
圖11 :來自豬和人來源的3種不同濃度的本發(fā)明生物材料的儲(chǔ)能模量結(jié)果。從來源于各樣品的線性粘彈性區(qū)的單一激發(fā)頻率/應(yīng)變收集數(shù)據(jù)。通過溫度掃描(包括生理值的溫度)得到全部樣品的粘彈性溫度關(guān)系。圖12 :來自豬和人來源的3種不同濃度的組織原的損耗模量結(jié)果。從來源于各樣品線性粘彈性區(qū)的單一激發(fā)頻率/應(yīng)變收集數(shù)據(jù)。通過溫度掃描(包括生理值的溫度)得到全部樣品的粘彈性溫度關(guān)系。圖13 :來自豬和人來源的3種不同濃度的本發(fā)明生物材料的損耗模量結(jié)果。從來源于各樣品線性粘彈性區(qū)的單一激發(fā)頻率/應(yīng)變收集數(shù)據(jù)。通過溫度掃描(包括生理值的溫度)得到全部樣品的粘彈性溫度關(guān)系。圖14 :光學(xué)顯微鏡圖像，其顯示在第I天(a)、第3天(b)和第4天(C)細(xì)胞從周邊組織聚集(趨化作用)；其中(i)對(duì)應(yīng)于陽性對(duì)照，(ii)對(duì)應(yīng)于透明質(zhì)酸實(shí)驗(yàn)方案，(iii)對(duì)應(yīng)于陰性對(duì)照和(iv)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的生物材料實(shí)驗(yàn)方案。圖15 :光學(xué)顯微鏡圖像，其顯示在進(jìn)行存活/死亡測定后確定遷移至軟骨片段表面的細(xì)胞是否有活性。該圖像顯示來自軟骨片段的絕大多數(shù)細(xì)胞是有活性的。圖16 :光學(xué)顯微鏡圖像，其顯示在第5天(a)和第6天(b)細(xì)胞從周邊組織聚集(趨化作用)；其中(i)對(duì)應(yīng)于陽性對(duì)照，(ii)對(duì)應(yīng)于透明質(zhì)酸實(shí)驗(yàn)方案，(iii)對(duì)應(yīng)于陰性對(duì)照和(iv)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的生物材料實(shí)驗(yàn)方案。發(fā)明詳述臍帶包含形成軟結(jié)締組織(稱為WJ)的一部分的大量GAG (硫酸化和非硫酸化的)。在這些GAG中，主要的非硫酸化GAG是透明質(zhì)酸(Hadidian等，1948 ;Jeanloz等，1950),盡管還檢測到更小比例的硫酸化GAG (Danishefsky等，1966)。此外,臍帶的組織學(xué)研究表明肝素的存在(Moore等，1957)。還很有可能的是，臍帶含有更多的仍未被鑒定的少量硫酸化GAG0本發(fā)明涉及一種由GAG組成的可注射性水凝膠，所述GAG僅在臍帶的WJ中存在。該水凝膠完全不含臍帶中存在的細(xì)胞和任何其它血管組分，該生物材料可從臍帶中獲得，所以它沒有免疫原性或免疫原性很低。本發(fā)明的生物材料(以其與細(xì)胞組合的形式或者單獨(dú))用于治療和美容處理
在本發(fā)明的上下文中，下列術(shù)語如下所定義〃水凝膠〃是指膠體的形成，其中分散相(膠體)已經(jīng)和連續(xù)相(水)組合以產(chǎn)生粘性的膠凝物質(zhì)。膠體通常是合成產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的親水性絲的互穿網(wǎng)絡(luò)?！ㄗ⑸洹ㄊ侵笇⑽镔|(zhì)強(qiáng)制插入到空腔中。例如，將物質(zhì)(通常有治療價(jià)值)注射到傷口中，或注射到體腔、體循環(huán)或其它部位。就本發(fā)明的目的而言，注射可由穿入預(yù)期部位的各種模式構(gòu)成。例如，注射可包括皮下范圍O. 5mm至15mm規(guī)格尺寸的注射針頭。在關(guān)節(jié)鏡或腹腔鏡手術(shù)中，使用圓柱形孔(cylinder port)、針頭，或其它類似物來治療內(nèi)部疾病。在該注射形式下，治療劑例如支架強(qiáng)制穿過進(jìn)入孔，該孔可以具有比皮下注射針頭大很多的規(guī)格尺寸(例如O. 5cm-4cm)。"可注射性水凝膠"是指使用注射技術(shù)將水凝膠應(yīng)用于穿透皮膚屏障的疾病的行動(dòng)。例如，疾病可以是需要治療的慢性傷口、受損的器官、受損的組織或皮膚屏障下的任何其它損傷。從皮下注射到關(guān)節(jié)鏡/腹腔鏡技術(shù)到特別設(shè)計(jì)的特殊裝置，應(yīng)用方法可以廣泛 地變化以將材料應(yīng)用于患病區(qū)域。例如，可以使用堵縫槍類似物來遞送高粘度物質(zhì)；可以將使線穿過針頭的裝置應(yīng)用于遞送絲狀聚合的水凝膠物質(zhì)；可利用關(guān)節(jié)鏡/腹腔鏡孔來遞送踝突軟骨缺陷的水凝膠栓。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解多種可能的注射技術(shù)。"交聯(lián)的水凝膠"是指水凝膠的離子或共價(jià)穩(wěn)定作用，其可能是可逆或不可逆的。相比比非交聯(lián)的水凝膠，交聯(lián)的水凝膠具有更高的粘度、適于操作、具有穩(wěn)定的三維形態(tài)，并且會(huì)在施加機(jī)械力時(shí)破裂?！ㄈS水凝膠〃是指保持三維形式的交聯(lián)的水凝膠，所述三維形式包括穩(wěn)定的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)例如孔。與此相反，非交聯(lián)的水凝膠將流動(dòng)以填充放置它的任何容器。在交聯(lián)的水凝膠中的這種流動(dòng)阻力是交聯(lián)的水凝膠保持穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的能力的特征。來自為本發(fā)明的目的而提取的WJ的臍帶可以來源于哺乳動(dòng)物，其包括動(dòng)物和人兩者。WJ的其他潛在來源是下述動(dòng)物的臍帶，例如牛、綿羊、豬、羚羊、駱駝、鹿、山羊、馬、大象、犀牛、河馬、長頸鹿、野牛、水牛、虎、獅、豹、熊等。該生物材料由選自以下的糖胺聚糖的混合物形成透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸類肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、硫酸皮膚素和肝素。優(yōu)選發(fā)現(xiàn)生物材料形成下述組合和比例的GAG混合物透明質(zhì)酸(40-80%)、硫酸角質(zhì)素(2-25%)、軟骨素-6-硫酸鹽(3-10%)、硫酸類肝素(1-9%)、軟骨素_4_硫酸鹽(O. 5-7%)、硫酸皮膚素(O. 1-7%)和肝素(O. 05-3%)，更優(yōu)選的GAG組合是透明質(zhì)酸(70%)、硫酸角質(zhì)素(10%)、軟骨素-6-硫酸鹽(7%)、硫酸類肝素(5%)、軟骨素-4-硫酸鹽(4%)、硫酸皮膚素(3%)和肝素(1%)。本發(fā)明還涉及由先前描述的水凝膠組成的生物材料，其任選地與細(xì)胞組合以起到組合治療作用。生物材料現(xiàn)在含有有助于產(chǎn)品效果的健康細(xì)胞，由于這一事實(shí)，在嚴(yán)重受損的組織或不可能通過患者原位細(xì)胞補(bǔ)充的組織中，水凝膠在再生和組織修復(fù)過程中的作用得到增強(qiáng)。此外，加入生物材料支架以形成構(gòu)造的細(xì)胞可以是未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞或分化為另一種細(xì)胞株的間充質(zhì)干細(xì)胞，未分化的造血干細(xì)胞或分化為另一種細(xì)胞株的造血干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、月旨肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或來自神經(jīng)系統(tǒng)的其它細(xì)胞、來自白血細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞、角膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
本發(fā)明被分為下面幾個(gè)部分(i)從臍帶的臍帶膠質(zhì)獲得GAG的提取物，(ii)從臍帶的臍帶膠質(zhì)分離的GAG水凝膠的制備，(iii)表征獲得的水凝膠和(iv)水凝膠生物材料的用途。此外，之后的研究/實(shí)例顯示當(dāng)與透明質(zhì)酸(HA)對(duì)比時(shí)，可注射性水凝膠影響積極細(xì)胞行為和相互作用的能力。從臍帶的WJ獲得GAG的提取物用于獲得生物材料的方法包括下列步驟a.由動(dòng)物或人來源獲得臍帶；b.用鹽溶液和抗生素處理臍帶；c.去除臍帶表面的所有血液； d.將臍帶分為l-2cm的片段；e.清潔內(nèi)部殘留的所有血液；f.去除臍帶膜和血管；g.分離包括臍帶膠質(zhì)的膠凝物質(zhì)；h.酶法消化獲得的膠凝物質(zhì)；和i.沉淀并分離GAG。具體來說，進(jìn)行下列步驟以從臍帶的WJ分離糖胺聚糖獲得臍帶膠質(zhì)在分娩后立即收集臍帶，對(duì)其進(jìn)行處理或處理前在4°C保存。在這些條件下不應(yīng)超過24小時(shí)。為了處理，臍帶優(yōu)選的在II級(jí)生物安全的層流凈化罩中無菌條件下放置。用含有抗生素混合物(青霉素、鏈霉素、兩性霉素B)的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM (Dulbeccc/ s ModifiedEagle' s Medium)溶液或磷酸鹽緩沖液I X (I XPBS)和/或紅細(xì)胞裂解緩沖液將其連續(xù)清洗至少3次，以完全去除血液殘留。一旦去除掉臍帶表面的血液，將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，分成l-2cm的片段。將臍帶切割為片段時(shí)，臍帶血管內(nèi)殘留的血液有可能被排出，在這種情況下有必要徹底清洗臍帶片段。在結(jié)構(gòu)水平上臍帶具有兩條臍帶動(dòng)脈和一條臍靜脈，由WJ的堅(jiān)固基質(zhì)支持并覆蓋薄膜。為了僅獲得WJ，用機(jī)械方法去除膜和血管。為此，將臍帶片段縱向切開，利用手術(shù)刀和鑷子小心去除臍帶膜和血管。利用這種機(jī)械分離獲得的膠凝物質(zhì)是WJ。從25到200g臍帶通常獲得20至160g臍帶膠質(zhì)。從臍帶膠質(zhì)提取GAG。使用文獻(xiàn)(Rogers等,2006)中描述的方案,通過來自木瓜的木瓜蛋白酶的酶促消化從軟骨獲得GAG (SIGMA,Ref P4762)(其中作了一些改動(dòng))從臍帶的WJ獲得GAG。將之前獲得的WJ在60°C浸潤于20ml提取緩沖液(5mM L-半胱氨酸、IOOmM Na2HPO4緩沖液、5mMEDTAUOmg (14U/mg)木瓜蛋白酶，pH 7. 5)中24-48小時(shí)以便完全消化。一旦WJ被完全消化，將其離心以去除無用的消化殘留物。此時(shí)，觀察到消化體積大于初始體積。這種增加是由于WJ中存在的GAG溶解并從而釋放它們聚集的水。一旦樣品被離心，將上清轉(zhuǎn)移到另一容器，然后沉淀出樣品中存在的GAG。從臍帶的WT沉淀和分離GAG。利用5體積的100%乙醇沉淀出WJ的GAG。通過這個(gè)步驟，樣品的GAG以及其中存在的鹽被沉淀出。由于樣品中存在的水分子與乙醇分子相互作用導(dǎo)致沉淀，這樣的話水分子無法與樣品的GAG相互作用，后者變得不溶于水，從而沉淀出。因此，就在添加乙醇并振搖管子以后，觀察到白色沉淀。使GAG在-20°C下沉淀12小時(shí)。一旦沉淀出，將它們離心以去除100%乙醇，用5體積的75%乙醇清洗沉淀來去除可能殘留的鹽(它們沉淀出在樣品上)。將樣品再離心一次以完全去除上清。一旦沉淀出GAG樣品，將殘留物在環(huán)境溫度靜置干燥至少30分鐘，直至所有乙醇都被蒸發(fā)。一旦乙醇被蒸發(fā)，將GAG樣品重懸于Milli-Q H2O,并在使用前在4°C保存。由此獲得的水凝膠可與可注射性血清混合和或直接應(yīng)用于待治療的區(qū)域。盡管如此，該類型材料機(jī)械抗性低；不考慮將其用于承載負(fù)荷，除非它與增強(qiáng)材料組合以形成復(fù)合材料。例如，在復(fù)合材料中磷酸鈣支持物可以充當(dāng)增強(qiáng)基質(zhì)。此外；在組成該可注射性水凝膠的多糖分子中存在非常高的親和力。水凝膠生物材料的高凝聚中該親和力是明顯的。但是，還存在對(duì)水凝膠的實(shí)質(zhì)膠粘性質(zhì)，這有利于注射處水凝膠的局部分離。最后，水凝膠的通用性表明其可被單獨(dú)施用或與細(xì)胞組合施用。存在需要更加具有抗性、穩(wěn)定和耐久的可注射性水凝膠生物材料的其它治療應(yīng) 用，所述生物材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以更好地促進(jìn)來自應(yīng)用部位中相鄰組織的細(xì)胞或在其移植前位于生物材料上的特定細(xì)胞形成集落。在這種情況下，本發(fā)明的生物材料將作為生物活性三維基質(zhì)來誘導(dǎo)組織傷口的治愈和修復(fù)。透明質(zhì)酸、軟骨素-6-硫酸鹽和軟骨素-4-硫酸鹽、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素和肝素調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和并活化新細(xì)胞外基質(zhì)的合成。生物材料中存在的GAG的多樣性和組合物允許大量對(duì)于生長因子特異的結(jié)合位點(diǎn)的存在，所述生長因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化過程，以及細(xì)胞合成新的細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子的能力。這種作用在患病組織中導(dǎo)致更強(qiáng)的細(xì)胞應(yīng)答能力，并加速再生，就極度退化的區(qū)域來說甚至允許治愈，如慢性潰瘍的情況。在生物材料用作穩(wěn)定的三維支架的地方，需要有穩(wěn)定(交聯(lián))策略以便促進(jìn)應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，可將GAG化學(xué)修飾或交聯(lián)以形成本發(fā)明的可注射性水凝膠。這些化學(xué)修飾(交聯(lián)、聚合)通常涉及醇或羧基，并于注射后或注射前在原位出現(xiàn)。此外，這一過程涉及水溶性聚合物的鏈變?yōu)椴蝗苄缘?Elisseeff等，2005)。通過交聯(lián)獲得的可注射性水凝膠具有使其能夠用于組織工程的獨(dú)特的性質(zhì)用于攜帶營養(yǎng)物或廢棄物的高含水量、彈性以及在3D微環(huán)境下原位包裹或固定細(xì)胞的能力。交聯(lián)密度直接影響可注射性水凝膠的孔徑大小，從而影響其物理特性，例如含水量或機(jī)械抗性。具有大交聯(lián)密度進(jìn)而非常小的孔徑的可注射性水凝膠將吸收更少的水份，比具有更低交聯(lián)度和大孔徑的可注射性水凝膠具有更大的機(jī)械抗性。通過交聯(lián)的可注射性水凝膠的形成可以通過數(shù)種方法來進(jìn)行，所述方法包括但不限于溫度變化、化學(xué)反應(yīng)和光聚合作用?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)皮下注射方法在注射后在原位進(jìn)行交聯(lián)或在注射前在體外進(jìn)行交聯(lián)，從而使用的技術(shù)更類似于如本文獻(xiàn)之前所定義的腹腔鏡檢
查/關(guān)節(jié)鏡檢查。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中如下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)獲得待交聯(lián)的聚合物的水溶液(本實(shí)例中是GAG的水溶液)，添加將促成交聯(lián)的化學(xué)試劑。在這種情況下，為了獲得穩(wěn)定的水凝膠，使用EDC (I-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，因?yàn)镋DC活化水溶液中的羧基。這些活化的羧基能夠與伯胺或羥基反應(yīng)，產(chǎn)生酰胺或酯鍵。一旦形成水凝膠，將其用PBS清洗數(shù)次以去除可能剩余的EDC殘留物。(Pieper等，1999 ；ffissink等,2001)。任選地，可以在交聯(lián)反應(yīng)期間在為了所述目的設(shè)計(jì)的模子中將可注射性水凝膠固化，這樣的話所需的形狀和大小取決于使用的模子。可以通過所謂的凍干方法干燥這些水凝膠，由于去除了水凝膠中存在的GAG分子間插入的水分子，從而獲得多孔結(jié)構(gòu)(圖5)。此夕卜，一旦生物材料被凍干，可以通過掃描電子顯微鏡(SEM)表征水凝膠的三維結(jié)構(gòu)(圖3)。一旦獲得其最終形狀的水凝膠，通過暴露于紫外線將其滅菌40分鐘。水凝膠上進(jìn)行的無菌試驗(yàn)顯示生物材料被徹底滅菌。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的那樣，其他滅菌技術(shù)可以是環(huán)氧乙烷氣體處理或Y輻照。 一旦被滅菌，可注射性水凝膠準(zhǔn)備好直接使用或與細(xì)胞聯(lián)用。基于增殖能力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用本發(fā)明水凝膠的細(xì)胞結(jié)合測定顯示生物材料無細(xì)胞毒性(圖4)。生物凝膠的用途本發(fā)明的生物材料(與細(xì)胞組合的形式或單獨(dú)的形式)可以其可注射形式應(yīng)用于關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病和美容處理。其中，可以使用的細(xì)胞是未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞或分化為另一種細(xì)胞株的間充質(zhì)干細(xì)胞、未分化的造血干細(xì)胞或分化為另一種細(xì)胞株的造血干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或來自神經(jīng)系統(tǒng)的其它細(xì)胞、來自白血細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞、角膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞。取決于水凝膠的預(yù)期的治療或美容應(yīng)用，注射技術(shù)將是不同的，水凝膠的粘度應(yīng)適合注射系統(tǒng)的口徑。本發(fā)明的水凝膠的粘度可為從10到150，OOOcS ;在非交聯(lián)的水凝膠的情況下為從10到15，OOOcS，優(yōu)選為10到2，OOOcS0交聯(lián)的水凝膠可具有從15，000到150，OOOcS的粘
度。根據(jù)需要可以通過交聯(lián)改變水凝膠的粘度。表I。如本發(fā)明的生物材料中所描述，來源于臍帶膠質(zhì)的各種非交聯(lián)的和交聯(lián)的水凝膠的粘度值。
水凝膠粘度(CS)
5%-10%人/豬來源(交聯(lián)的)70，000
50%人/豬來源15，000
40%人/豬來源9,100
30%人/豬來源4, 900
20%人/豬來源2,000
10%人/豬來源150-580
5%人/豬來源19-58
1%人/豬來源4^6
本發(fā)明開發(fā)的生物材料優(yōu)選以可注射形式用于下列疾病重建、填充或重構(gòu)軟組織；治療皺紋、皺褶和疤痕、燒傷、潰瘍、軟組織增大、臉部脂肪萎縮、椎間盤疾??；修復(fù)軟骨、肌骨胳損傷、骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)周炎；治療腫瘤、陰道疾病、腦損傷、骨髓修復(fù)、神經(jīng)變性病癥，心血管疾病和潤滑過程，作為止痛劑和抗炎劑。本發(fā)明的交聯(lián)的可注射性水凝膠可以具有實(shí)質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中孔徑為O. 5-1，000 μ m,優(yōu)選O. 5-500 μ m,其粘度大于15，OOOcS0所述生物材料優(yōu)選作為支架應(yīng)用于下列疾病治療燒傷、潰瘍和皮膚表皮缺陷；治療眼科疾 病，例如角膜損傷、視網(wǎng)膜損傷或白內(nèi)障；修復(fù)軟骨；治療骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)，例如骨軟骨缺陷、骨關(guān)節(jié)炎或骨缺陷的情況，和陰道疾病解決中的佐劑；治療牙齦炎和牙周炎；用于開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。軟骨疾病是世界范圍內(nèi)重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題。從這種意義上講，盡管很難記錄它們的發(fā)病率，據(jù)估計(jì)有5億人患有關(guān)節(jié)損傷。軟骨病作為損傷或疾病的結(jié)果出現(xiàn)，如果不進(jìn)行治療，可能導(dǎo)致退行性疾病例如骨關(guān)節(jié)炎(0A)。OA是最常見的關(guān)節(jié)炎類型之一，在美國和歐洲有3500萬到4000萬人患有0A。它是一種變性疾病，引起軟骨的分解并伴隨骨的反應(yīng)。它通常影響手、膝、髖部、腳和頸部，在成人中，它被認(rèn)為是身體失能的最常見原因之一。關(guān)節(jié)軟骨是高度特化的無血管組織，保護(hù)動(dòng)關(guān)節(jié)的骨免受引起關(guān)節(jié)表面間的摩擦的與體重和撞擊有關(guān)的力。該組織由單一的細(xì)胞類型(軟骨細(xì)胞)以及重要并且豐富的細(xì)胞外基質(zhì)組成。所述基質(zhì)由II型膠原纖維(主要的分子)的致密網(wǎng)絡(luò)以及這一網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的蛋白多糖大聚集物(包含GAG例如硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸和聚集蛋白聚糖(aggrecan))組成。軟骨的特化結(jié)構(gòu)以及其有限的修復(fù)能力使得這類損傷的治療非常復(fù)雜。血管形成的缺失使其再生能力非常有限，因?yàn)樵偕^程中干細(xì)胞無法接近受損區(qū)域發(fā)揮作用。近年來，已經(jīng)使用可生物降解的生物材料來治療軟骨損傷。從這種意義上講，宏觀的合成聚合物(乳酸、羥基乙酸、己內(nèi)酯…)已經(jīng)成為最重要的和許多組的生物材料。但是，這些固體的宏觀材料需要侵入性手術(shù)方法的使用，例如常規(guī)手術(shù)。為了克服這些限制，目前正在開發(fā)可以通過最低限度的侵入性技術(shù)植入(例如通過注射或關(guān)節(jié)鏡技術(shù))的新的生物基質(zhì)。因此，本發(fā)明的可注射性生物材料的一個(gè)應(yīng)用是骨關(guān)節(jié)炎退化過程中受損的關(guān)節(jié)軟骨的再生。通過局部注射技術(shù)例如關(guān)節(jié)鏡檢查或通過任何注射裝置，本發(fā)明的可以方便的在待再生的區(qū)域施用。除了方便施用之外，可注射性水凝膠具有形成穩(wěn)定植入物的性質(zhì)，其適合退化組織的大小和幾何形狀。本發(fā)明的生物材料的另一應(yīng)用是用于傷口的治療。在美國，慢性糖尿病、褥瘡和靜脈曲張性潰瘍是影響3百萬至6百萬人的重要問題。該疾病影響發(fā)達(dá)國家人口的1_3%，普遍認(rèn)為醫(yī)院中15%的患者患有這種疾病?；加羞@些病害的大量患者造成相當(dāng)大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和保健反響，因此形成高的治療費(fèi)用，患者的生活質(zhì)量也被顯著改變。潰瘍是對(duì)生物體具有深遠(yuǎn)影響的創(chuàng)傷，具有相當(dāng)復(fù)雜的生理病理學(xué)。在創(chuàng)面床上存在的成纖維細(xì)胞(真皮的細(xì)胞)、角質(zhì)形成細(xì)胞(表皮的細(xì)胞)、細(xì)胞外基質(zhì)和血漿衍生的蛋白之間發(fā)生復(fù)雜的協(xié)同相互作用。不同傷口愈合期止血、炎癥、修復(fù)和重建的進(jìn)展是典型的，但是這些傷口的慢性病性質(zhì)和復(fù)發(fā)具有臨床重要性。盡管目前存在大量可用的治療和支架，但治愈百分比和治愈速度仍然非常低，因此需要更有效的治療方法可以實(shí)現(xiàn)快速的創(chuàng)傷愈合。近年來獲得越來越多的關(guān)于慢性潰瘍的生理病理學(xué)的知識(shí)已經(jīng)開發(fā)出新的支架，它是所述疾病治療的顯著進(jìn)步。但是迄今為止，沒有覆蓋皮膚的理想支架；所述支架必須符合一系列基本特點(diǎn)，例如I)快速粘附到傷口，2)提供防止液體損失的有效屏障，3)機(jī)械彈性和長期穩(wěn)定性，4)容易滅菌，5)易于處理和運(yùn)輸，以及6)它們必須是無害的?？傊?，本發(fā)明的生物材料具有能夠有效治療所述疾病的支架或稀釋劑所必需的大部分特點(diǎn)。從這種意義上講，為了評(píng)價(jià)本生物材料的治療效果，已經(jīng)進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，如實(shí)施例9和10所描述。
實(shí)施例實(shí)施例I :獲得臍帶膠質(zhì)。
用人和豬來源的臍帶進(jìn)行下列實(shí)施例。為了從各自臍帶的WJ分離GAG，按照下面的方法進(jìn)行。在每種情況下，分娩后立即將50g臍帶收集到無菌瓶，之前已經(jīng)在瓶中保存了300ml IX 濃度的 PBS(對(duì)于 I 升 H2O :8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HPO4、O. 24g KH2PO4,pH=7. 4溶于I L H2O)和3ml青霉素(30，000單位)、鏈霉素(30，000 μ g)和兩性霉素-B(75 μ g)的IX濃度的抗生素混合物(L0NZA，Ref :17_745E)。臍帶在處理前可以在4°C保存不超過24小時(shí)，但在本實(shí)施例中，在收到臍帶后立即將其處理。為了進(jìn)行處理，臍帶在II級(jí)生物安全層流凈化罩的無菌條件下放置，進(jìn)行連續(xù)清洗以完全去除它們包含的血液殘留物。為此，將它們置于兩個(gè)容器，向其中加入包含3ml青霉素(30，000單位)、鏈霉素(30，000 μ g)和兩性霉素-B (75 μ g)的抗生素混合物的300mlIXPBS (對(duì)于 I 升 H2O 8g NaCl.O. 2g KCl、I. 44g Na2HP04、0. 24g KH2PO4' pH=7. 4 溶于 ILH2O) (L0NZA,Ref :17_745E);通過10秒內(nèi)將瓶垂直傾斜5次將其人工振蕩，棄去液體，重復(fù)這一操作至少3次直至去除大部分血液。然后用500ml IX濃度的紅細(xì)胞裂解液(對(duì)于I升!120:8.998 NH4ClUg KHC03、37mg EDTA，pH 7. 3)清洗臍帶直至完全去除血液殘留物。一旦去除掉臍帶表面的血液，將其轉(zhuǎn)移到IOcm培養(yǎng)皿，用無菌剪將其切成l-2cm的片段。因?yàn)閷⒛殠谐善螘r(shí)血管中殘留的血液被排出，添加IOml IXPBS(包含Iml抗生素(10，000單位)、鏈霉素(10，000 μ g)和兩性霉素-B (25 μ g)的混合物)以徹底清潔所述片段，將片段表面壓在其支持表面，用無菌手術(shù)刀沿著片段作水平移動(dòng)。重復(fù)該步驟直至去除內(nèi)部的所有血液殘留物。將完全清潔的臍帶片段轉(zhuǎn)移到無菌管，立刻進(jìn)行處理，盡管如果需要，它們可以在-80°C長期低溫保存。然后用機(jī)械方法去除圍繞臍帶的膜以及位于其中的血管。為此，將臍帶片段縱向打開，利用手術(shù)刀和鑷子小心去除臍帶膜和血管。利用這種機(jī)械分離獲得的膠凝物質(zhì)是WJ。獲得25g WJ0實(shí)施例2 :從臍帶膠質(zhì)提取GAG用人和豬來源的臍帶進(jìn)行下列實(shí)施例。使用描述的從人軟骨獲得GAG的方案(其中作了一些改動(dòng))從臍帶的WJ獲得GAG (Rogers等，2006)。
將實(shí)施例I中獲得的WJ浸于20ml提取緩沖液(242μ I 200mML_半胱氨酸、I. 42ml 704mM Na2HPO4 緩沖液、100 μ I O. 5Μ EDTA，IOmg (14U/mg)，pH 7. 5)木瓜蛋白酶(SIGMA, Ref :P4762)，將其在60°C放置12小時(shí)以完全消化WJ，一旦其被消化，將樣品在1，500g的離心速度下離心5分鐘以去除消化殘留物。觀察到消化體積約為30ml，超過20ml的起始體積約10ml，這是由于WJ中存在的GAG的溶解，進(jìn)而由于這些聚集的水的釋放。樣品一旦被離心，將上清轉(zhuǎn)移到另一管，然后沉淀出樣品中存在的GAG。實(shí)施例3 :從臍帶的WJ沉淀和分離GAG。利用5體積的100%乙醇沉淀出存在于實(shí)施例2的上清中的WJ的GAG。通過這個(gè)步驟，樣品的GAG以及其中存在的鹽被沉淀出。這是由于以下事實(shí)樣品中存在的水分子與乙醇分子相互作用，這樣的話水分子無法與樣品的GAG相互作用。將GAG在-20°C靜置12小時(shí)進(jìn)行沉淀。一旦沉淀出，將它們?cè)?，500g下離心5分鐘，從而去除所有的100%乙醇。將沉淀用5體積的75%乙醇清洗以去除可能殘留的鹽，它們可能沉淀出在樣品上。然后將 其在1，500g下離心約5分鐘，完全去除上清。一旦沉淀出樣品，將固體殘留物在環(huán)境溫度干燥約30分鐘，直至所有乙醇都被蒸發(fā)。從約25g WJ樣品起始沉淀出的GAG的量范圍是50至300mg，這取決于起始原料。在這些特定情況下，獲得約250mg GAG沉淀。為獲得本發(fā)明的水凝膠，將GAG沉淀重懸于ImlMilli-Q H2O,并在4°C下保存。實(shí)施例4 :包含臍帶WJ的GAG的可注射性水凝膠的產(chǎn)生。水凝膠的含水量可以為其自身重量的10%至100倍，這取決于其應(yīng)用需要的粘度。將沉淀的GAG用Iml H2O重懸后獲得的水凝膠用可注射性生理血清溶液重懸，將其在渦旋振蕩器中溫和攪拌直至完全溶解和勻漿。一旦水凝膠溶解，將其在4°C下保存。實(shí)施例5 :包含來自臍帶WT的GAG的交聯(lián)的水凝膠的產(chǎn)牛。為了產(chǎn)生更加均一和穩(wěn)定的水凝膠，依照實(shí)施文獻(xiàn)(Cui等，2006)描述的方法。從根據(jù)實(shí)施例3的獲自WJ的GAG提取物制備水溶液。具體來說，在H2O中制備1%的GAG溶液。為此，向沉淀和分離后獲得的200mg GAG中添加IOml H2O (實(shí)施例3)。向溶液中添加I. 2g己二酸二肼(ADH)，利用O. IN HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)為pH = 3. 5。一旦調(diào)節(jié)到所述pH，向溶液中添加O. 6g固定劑EDC (I-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(SIGMA,Ref :E6383)?；旌衔镌诃h(huán)境溫度恒定攪拌條件下保持30分鐘到I小時(shí)，直至獲得穩(wěn)定的水凝膠。一旦形成穩(wěn)定的水凝膠，將其用I XI3BS (對(duì)于I升H2O :8g NaCUO. 2g KCl、1.44gNa2HP04、0. 24g KH2PO4, pH=7. 4溶于IL H2O)清洗3次，每次5分鐘，以去除過量的EDC。就水凝膠的物理形狀而言，它具有其固化時(shí)所在模子的形狀，這樣的話可以使用標(biāo)準(zhǔn)的96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或具有所需形狀的任何其它容器。此外，水凝膠可以在大的容器(例如燒杯)中固化，一旦其固化，可以將水凝膠切割成特定的形狀和厚度。具體來說，在本實(shí)施例中水凝膠在24-孔板的孔中固化，一旦固化，將其用500 μ I的I X PBS清洗3次(5分鐘)。在這種情況下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將24-孔板中交聯(lián)的水凝膠凍干。在本實(shí)施例中，通過掃描電子顯微術(shù)(SEM)來分析水凝膠的三維結(jié)構(gòu)。一旦凍干水凝膠，進(jìn)行下列步驟切割凍干水凝膠的切片，在AUT0SAMDRI-814干燥機(jī)中用CO2將該切片干燥到臨界點(diǎn)，并在SPUTTER中用金進(jìn)行金屬化。在JEUL掃描電子顯微鏡(JSM35)中20KV的電壓下觀察所述制品。脫水的水凝膠的SEM分析(圖3)顯示它具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)。顯微照片顯示高孔隙度三維結(jié)構(gòu)的存在，孔徑范圍是O. 5至500 μ m?？椎倪@個(gè)范圍包括微孔和大孔的存在。大孔(300-500μπι)是必需的，以便進(jìn)行合適的細(xì)胞群集，這樣的話大量細(xì)胞匯集，不同的細(xì)胞類型共存，有利于形成結(jié)構(gòu)化組織，例如，可以形成血管網(wǎng)絡(luò)。中等大小的孔允許細(xì)胞摻入。微孔(O. 5-50 μ m)是細(xì)胞存活必需的，因?yàn)樗鼈冐?fù)責(zé)進(jìn)行氣體、營養(yǎng)物的有效擴(kuò)散和細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物的去除?；趻呙桦娮语@微鏡獲得的米尺測量孔徑。這種生物材料顯示更高的結(jié)構(gòu)靈敏性，提示其應(yīng)用不僅滿足生物活性性質(zhì)和營養(yǎng)作用，而且是可以暫時(shí)容納細(xì)胞直至進(jìn)行組織修復(fù)的結(jié)構(gòu)，例如尤其是潰瘍和其它皮膚表皮疾病的治療，軟骨的修復(fù)和眼科治療。生物材料中包含的細(xì)胞可以是鄰近于植入部位的組織的細(xì)胞(其能夠形成集落)，也可以是在其臨床應(yīng)用前體外排列在生物材料上的細(xì)胞，這樣的話其再生作用被增強(qiáng)。
這種生物材料具有大小范圍是O. 5-1000微米的孔的均勻分布，通過掃描電子顯微鏡技術(shù)測定。這種孔隙范圍適合于氣體和營養(yǎng)物擴(kuò)散通過其整個(gè)結(jié)構(gòu)，以及允許細(xì)胞增殖。實(shí)施例6 :本發(fā)明生物材料中存在的GAG的表征和定暈。通過質(zhì)譜(ESI/MS)技術(shù)分析和定量本發(fā)明生物材料中存在的不同GAG?？紤]到通過這種技術(shù)只能測定分子量為200至2，000道爾頓的分子并且GAG分子大部分超過這個(gè)范圍，首先將樣品用酶消化以便獲得分子量在200-2，OOODa之間的GAG鏈。作為GAG鑒定和定量的標(biāo)準(zhǔn)品，使用它們中每一種濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)商品化化合物。具體來說，用于進(jìn)行GAG定量的標(biāo)準(zhǔn)品如下對(duì)于透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸鉀(SIGMA，Ref 53750);對(duì)于硫酸軟骨素硫酸軟骨素鈉(SIGMA，Ref C4384);對(duì)于硫酸皮膚素硫酸皮膚素鈉(SIGMA，Ref :C3788);對(duì)于硫酸角質(zhì)素硫酸角質(zhì)素(CHEMOS，Ref :7295);對(duì)于肝素肝素鈉(SIGMA，Ref H8537);和對(duì)于硫酸類肝素硫酸類肝素鈉(SIGMA，Ref51541)?；谑褂酶鞣NGAG標(biāo)準(zhǔn)品得到的結(jié)果獲得樣品中存在的GAG的定量值。按照文獻(xiàn)描述的方法(Mahoney等，2001)，進(jìn)行GAG的酶促消化。為此，使用對(duì)每種GAG的消化特異的酶。對(duì)于透明質(zhì)酸，使用透明質(zhì)酸酶(SIGMA，Ref H3506);對(duì)于硫酸軟骨素，使用軟骨素酶(SIGMA，Ref C2780);對(duì)于硫酸皮膚素，使用軟骨素酶B (SIGMA, Ref C8058);對(duì)于肝素，使用肝素酶I (SIGMA，Ref :H2519);對(duì)于硫酸類肝素，使用肝素酶I (SIGMA，Ref H2519)；對(duì)于硫酸角質(zhì)素，使用角質(zhì)素酶(K2876)。通過將440U相應(yīng)酶重懸于IOml下列緩沖液來制備這些酶2ml IOOmM磷酸鹽緩沖液 ρΗ=7· 77、770μ L IM NaClUmg BSA 和 7. 23ml H2O0含有160U/ml酶濃度的酶促消化緩沖液如下制備將4. 5ml酶(2000U)添加到7. 5ml 消化緩沖液，I. 5ml IM NaCl,O. 333ml 3M 乙酸鈉 pH=5. 2 和 5. 67ml H2O0 用于酶促消化的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品如下制備將500 μ L消化緩沖液(80U酶)添加到500 μ L各種GAG的標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為2mg/ml),這樣的話標(biāo)準(zhǔn)品最終溶液的濃度為lmg/ml。對(duì)于GAG樣品同樣如此將500 μ L消化緩沖液(80U酶)添加至IJ 500 μ L GAG樣品。
將樣品在37°C消化I小時(shí)，之后通過在60°C熱變性5分鐘將酶滅活。一旦消化完成，通過質(zhì)譜分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)譜是一種實(shí)驗(yàn)方法，用于確定待分析的樣品中存在的某些離子的質(zhì)荷比。質(zhì)譜儀由三個(gè)基本部件組成離子源、質(zhì)量分析器和檢測器。通過離子源將待分析的樣品離子化，它們?cè)谫|(zhì)量分析器中分離并被檢測產(chǎn)生質(zhì)譜，其中顯示與特定離子類型的相對(duì)豐度比較的質(zhì)荷值。具體來說，在該實(shí)施例中，如下將樣品注射入質(zhì)譜儀按照O. 2ml/分鐘的流速將20 μ L樣品樣品直接注射入質(zhì)譜儀(Thermo LCQ型號(hào))。使用陰性電噴射電離(ESI/MS)方法，層析時(shí)間設(shè)為10分鐘。選擇根據(jù)文獻(xiàn)(Mahoney等,2001)對(duì)應(yīng)于已知的各類GAG分子量的±6Da范圍的分子離子。所述離子存在于標(biāo)準(zhǔn)GAG樣品和待分析的樣品，所以樣品中各種GAG的存在被定性顯示。為了確保結(jié)果的再現(xiàn)性，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品一式兩份進(jìn)行注射。對(duì)于不同GAG的定量,對(duì)于lmg/ml各GAG的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)線。做出的標(biāo)準(zhǔn)線包括 下列濃度的各標(biāo)準(zhǔn)GAG (透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸類肝素和硫酸角質(zhì)素)，用于制備標(biāo)準(zhǔn)線750 μ g/ml>500 μ g/ml>250 μ g/ml> 100 μ g/ml>0 μ g/ml。利用 H2O 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)線的稀釋，包含相等比例的酶促消化緩沖液和H2O的混合物被用作該線的空白對(duì)照。本發(fā)明生物材料中各GAG的鑒定結(jié)果和比例如下，考慮到生物材料的來源是天然的，這意味著在它們的組成中存在變化(圖I)70%透明質(zhì)酸10%硫酸角質(zhì)素7%軟骨素-6-硫酸鹽5%硫酸類肝素4%軟骨素-4-硫酸鹽3%硫酸皮膚素1% 肝素。實(shí)施例7 :用于檢測牛物材料中細(xì)胞殘金存在的組織學(xué)研究本發(fā)明的生物材料包含天然來源的GAG組合。這種天然來源增強(qiáng)了它們的再生效果以及對(duì)細(xì)胞活性的作用，因?yàn)镚AG的結(jié)構(gòu)以及它們之間的相互作用與生理?xiàng)l件下在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的類似。臍帶是一種免疫原性不高的組織，實(shí)際上，WJ中包含的干細(xì)胞的異源使用在許多情況下被認(rèn)為可用于治療。還有一些情況從臍帶的血管發(fā)展動(dòng)脈或靜脈系統(tǒng)，也用于異源使用。但是，為了確保本發(fā)明的生物材料不含細(xì)胞和細(xì)胞殘余(它們可引起炎癥反應(yīng)或植入物排斥反應(yīng))，進(jìn)行蘇木素曙紅、阿爾新藍(lán)和甲基綠焦寧組織染色(圖2)。蘇木素曙紅這是組織病理水平使用最廣泛的組化染色。它允許觀察細(xì)胞和細(xì)胞組分。蘇木素顯示對(duì)細(xì)胞的酸成分(特別是核酸)的親和力，而曙紅顯示對(duì)堿性區(qū)域的親和力，允許很好的觀察細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。對(duì)GAG樣品的制品(圖2B)進(jìn)行染色，用細(xì)胞的延展物(extensions)作為陽性對(duì)照(圖2A)。進(jìn)行蘇木素曙紅染色的方法如下進(jìn)行通過無菌拭子將GAG樣品在載玻片上延展，并將該延展物靜置干燥至少24小時(shí)。一旦載玻片被干燥，將延展物用70%甲醇固定5分鐘。隨后，通過用H2O清洗去除固定劑。載玻片用蘇木素染色3分鐘(PANREAC，DC Harris蘇木素溶液)。隨后，通過用H2O清洗去除過量的染料。所有載玻片都經(jīng)過含O. 5% HCl的H2O以去除染料的非特異性結(jié)合。用H2O清洗載玻片。載玻片用曙紅(O. 5%溶于H2O)染色30秒。載玻片用H2O清洗以去除過量的曙紅。向所述制品添加數(shù)滴Fluoromount-G封固劑(SOUTHERN BIOTECH, Ref :0100-01 )，用蓋玻片覆蓋，并在顯微鏡下觀察。用蘇木素曙紅染色的結(jié)果(圖2，圖像A和B)顯示被分析的GAG樣品中沒有細(xì)胞。阿爾新藍(lán)阿爾新藍(lán)是主要的陽離子染料之一(在其分子中包含正電荷)，其結(jié)合多糖帶負(fù)電荷的位點(diǎn)，所述多糖載有硫酸鹽，磷酸鹽或碳酸鹽基團(tuán)(構(gòu)成蛋白聚糖的一部分)。這些靜電鍵取決于培養(yǎng)基的PH ;在中性pH染料結(jié)合含中性基團(tuán)的蛋白聚糖；在酸性pH它結(jié)合蛋白聚糖硫酸鹽；和在堿性pH它結(jié)合蛋白聚糖磷酸鹽。當(dāng)pH= I時(shí),阿爾新藍(lán)結(jié)合弱和強(qiáng)硫酸化的蛋白聚糖，其包含硫酸軟骨素，硫酸皮膚素硫酸類肝素和硫酸角質(zhì)素(構(gòu)成臍帶膠質(zhì)GAG的一部分)。對(duì)GAG樣品的制品(圖2F)進(jìn)行染色,細(xì)胞的延展物(extensions)被用作對(duì)照(圖2E)。本實(shí)施例中進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色的方法具體如下進(jìn)行 透過過無菌拭子將GAG樣品在載玻片上延展，該延展物靜置干燥至少24小時(shí)。一旦載玻片被干燥，將延展物用70%甲醇固定5分鐘。隨后，通過用IXPBS清洗去除固定劑。將載玻片浸于O. IN HCl pH = I中5分鐘。隨后將它們用溶于O. IN HCl pH = I的1%阿爾新藍(lán)染色2小時(shí)。將載玻片浸于O. IN HCl中5分鐘，立刻用H2O清洗以去除過量的染料。向所述制品添加數(shù)滴Fluoromount-G封固劑(SOUTHERN BIOTECH，Ref :0100-01 )，用蓋玻片覆蓋，并在顯微鏡下觀察。用阿爾新藍(lán)染色的結(jié)果(圖2，圖像E和F)顯示被分析的生物材料樣品中存在GAG。甲基綠焦寧:這種染色用于組織包含的核酸的組織學(xué)研究，以及顯示淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的存在。它還用于組織切片和細(xì)胞學(xué)制品中漿細(xì)胞和RNA的鑒定。焦寧把漿細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和大部分核仁染為紅色。甲基綠將DNA染為藍(lán)綠色(略呈紫色)。對(duì)GAG樣品的制品(圖2D)進(jìn)行染色，細(xì)胞的延展物被用作陽性對(duì)照(圖2C)。本實(shí)施例中進(jìn)行甲基綠焦寧染色的方法具體如下進(jìn)行透過過無菌拭子將各GAG樣品在載玻片上延展，該延展物靜置干燥至少24小時(shí)。一旦載玻片被干燥，將延展物用70%甲醇固定5分鐘。隨后，通過用H2O清洗去除固定劑。將載玻片浸于O. IN HCl pH = I中5分鐘。隨后將它們用甲基綠焦寧染色5分鐘(O. 012%甲基綠溶于H2O, O. 01%焦寧溶于H2O, O. 75%甲醇)，立即用H2O清洗以去除過量的染料。向所述制品添加數(shù)滴Fluoromount-G封固劑(SOUTHERN BIOTECH，Ref :0100-01 )，用蓋玻片覆蓋，并在顯微鏡下觀察。用甲基綠焦寧染色的結(jié)果(圖2，圖像C和D)顯示被分析的GAG樣品中沒有核酸。實(shí)施例8 :數(shù)種細(xì)胞類型在本發(fā)明牛物材料上的毒件。生物材料能夠用于移植或作為組織工程基質(zhì)的主要需求是沒有細(xì)胞毒性。為了驗(yàn)證本發(fā)明的生物材料不引起毒性作用，通過MTT法(Roche Diagnostics,USA)測定細(xì)胞毒性，并由歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM, European Centre for theValidation of Alternative Methods)對(duì)排列在本發(fā)明生物材料上的細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。使用的細(xì)胞類型與生物材料針對(duì)的疾病有關(guān)，例如，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，骨的成骨細(xì)胞，軟骨的軟骨細(xì)胞和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，以及ISO 10993中指定的用于L929毒性測定的細(xì)胞系。
MTT測定法基于活細(xì)胞的線粒體酶將某些底物轉(zhuǎn)化為其它次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。形成的化合物的量取決于線粒體脫氫酶的活性，這是培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞數(shù)目的明確指標(biāo)。具體來說，這種線粒體檢測，細(xì)胞增殖試劑盒I(MTT)目錄號(hào)1465 007羅氏，通過細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶將(黃色)四唑鹽變?yōu)椴蝗苄缘?藍(lán)色)甲臜晶體來測定轉(zhuǎn)化。隨后將細(xì)胞透化，溶解形成的晶體，產(chǎn)生染色的溶液，這通過ELISA微板讀數(shù)器在550nm波長處測量其吸光度進(jìn)行定量。得到的結(jié)果顯示于圖4。如下所述進(jìn)行該方法I.將細(xì)胞種于96-孔板，每孔50 μ I生物材料，密度為2，000-5, 000個(gè)細(xì)胞/孔(取決于細(xì)胞類型)。先前已經(jīng)確定每一細(xì)胞類型的合適細(xì)胞濃度。成纖維細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，所有均來自人來源的原代培養(yǎng)物，按照每孔4，000個(gè)細(xì)胞的濃度接種，L929小鼠成纖維細(xì)胞系按照每孔200個(gè)細(xì)胞的濃度接種，獲自人皮膚原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞按照每孔5，000個(gè)細(xì)胞的濃度接種。 2.在開始細(xì)胞毒性測定前，將細(xì)胞靜置在37°C和5% CO2條件下穩(wěn)定24小時(shí)。該測定包括陽性對(duì)照(細(xì)胞+培養(yǎng)基+已知誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的材料，就本例來說是聚乙烯多氯化物或PVC)，對(duì)照(細(xì)胞+標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)，以及接觸本發(fā)明生物材料的細(xì)胞。3.將其在培養(yǎng)箱中37°C溫育實(shí)驗(yàn)方案指定的時(shí)間段直至進(jìn)行測定，就本例來說是接觸24、48和72小時(shí)。4.溫育期結(jié)束后，對(duì)每孔各100 μ I培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物添加10 μ IMTT溶液(O. 5mg/ml)，并在培養(yǎng)箱中37°C溫育4小時(shí)。5.溫育結(jié)束后，可以觀察到細(xì)胞內(nèi)部的甲臜晶體。每份培養(yǎng)物或每孔中添加100 μ I增溶液，并在培養(yǎng)箱37°C溫育過夜。細(xì)胞因此被透化，晶體用指定的100 μ I增溶劑溶解，產(chǎn)生可方便定量的染色溶液。6. 一旦晶體被溶解，用ELISA讀數(shù)器在550nm處直接讀取培養(yǎng)板。在讀取前，建議用乙醇清潔板的底面。從圖4可以看出，本發(fā)明的生物材料不對(duì)被檢測細(xì)胞系的任意一種產(chǎn)生毒性作用，與對(duì)照相比不存在顯著差異。實(shí)施例9:本發(fā)明可注射形式的生物材料用于治療骨關(guān)節(jié)炎的用途為了在骨關(guān)節(jié)炎(OA)中體內(nèi)鑒定本發(fā)明生物材料的治療效果，使用實(shí)施例3獲得的水凝膠，將其重懸在含有異體、軟骨來源的軟骨細(xì)胞的可注射性生理血清溶液中。在一個(gè)膝蓋處接受前十字韌帶切除術(shù)的兔被用作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通過外側(cè)關(guān)節(jié)切開術(shù)進(jìn)行韌帶的這種切除。隨后，為了使膝蓋失穩(wěn)，等待數(shù)月到數(shù)周的時(shí)間，在此期間發(fā)生類似于骨關(guān)節(jié)炎的軟骨侵蝕。此外，在膝蓋處未進(jìn)行關(guān)節(jié)切開術(shù)的動(dòng)物被用作對(duì)照組。利用關(guān)節(jié)鏡手術(shù)通過清洗和清創(chuàng)術(shù)制備受損的關(guān)節(jié)表面，用本發(fā)明的可注射性細(xì)胞/生物材料覆蓋損傷處。放置生物材料4周后，處死動(dòng)物并提取軟骨。將獲得的軟骨用4%多聚甲醛固定以便其后續(xù)的組織學(xué)處理。為了獲得組織切片，將樣品包埋入石蠟，為此將其在50、70、90和100%的醇中放置5分鐘。隨后將樣品放入Citrosol (商品名)中5分鐘，并包埋入石蠟直至獲得固體塊。利用切片機(jī)獲得5μπι組織切片，利用這些切片進(jìn)行組織染色和免疫染色。通過免疫組化技術(shù)分析組織切片中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的不同標(biāo)記物。被研究的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的特異性分子和分子標(biāo)記物是I型和II型膠原、聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖。使用單克隆抗體進(jìn)行免疫染色。用于標(biāo)記組織切片的技術(shù)是直接的免疫染色，使用標(biāo)記熒光染料的單克隆抗體。使用共焦顯微鏡觀察標(biāo)記。獲得的結(jié)果顯示生物材料/細(xì)胞組合誘導(dǎo)受損軟骨的再生，因?yàn)?一旦被植入，可注射性生物材料及其細(xì)胞組分不引起毒性，S卩，在組織切片的肉眼可見和顯微鏡水平?jīng)]有觀察到炎癥現(xiàn)象。-生物材料適合待修復(fù)的傷口的幾何形狀和大小，并停留在移植區(qū)域內(nèi)。-沒有觀察到鄰近植入物區(qū)域的健康組織細(xì)胞表型的改變。-在植入物區(qū)域的對(duì)軟骨特異的細(xì)胞外基質(zhì)分子(例如II型膠原)的存在表明再生過程的起始，伴隨與天然組織相同質(zhì)量的新細(xì)胞外基質(zhì)的形成。
這些事實(shí)證明，與細(xì)胞療法組合的本發(fā)明的生物材料(與細(xì)胞治療組合)促進(jìn)軟骨缺陷的再生，這與對(duì)照動(dòng)物(其不存在任何軟骨修復(fù)的跡象)不同。實(shí)施例10 :三維牛物材料的用涂實(shí)施例5獲得的本發(fā)明固體生物材料具有能夠有效治愈慢性潰瘍的敷料必需的大部分特點(diǎn)。從這種意義上講，為了評(píng)價(jià)對(duì)慢性潰瘍的治療效果，使用Swiss白化小鼠(在背部區(qū)域接受約3cm2的熱蝕)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)照組由相同類型的傷口但用商品化的透明質(zhì)酸凝膠治療的動(dòng)物組成。對(duì)于本發(fā)明生物材料的應(yīng)用，通過清洗、消毒和手術(shù)清創(chuàng)術(shù)制備誘導(dǎo)傷害的表面。然后將生物材料經(jīng)注射應(yīng)用于傷口，在傷口處生物材料在深度和表面均覆蓋并充滿患病區(qū)域。在放置生物材料15天后，處死動(dòng)物，切除傷口區(qū)域并在4%多聚甲醛中固定用于其后續(xù)的組織學(xué)檢查。為了進(jìn)行處理，將樣品包埋入石蠟，為了這個(gè)目的將其置于50、70、90和100%的醇中5分鐘。隨后將樣品放入Citrosol中5分鐘，并包埋入石蠟直至獲得固體塊。利用切片機(jī)獲得5 μ m組織切片，利用這些切片進(jìn)行組織染色和免疫染色。通過免疫組化技術(shù)分析組織切片中的不同表皮表型標(biāo)記物，例如5和10角蛋白、分化標(biāo)記物，例如外皮蛋白和兜甲蛋白、皮膚標(biāo)記物波形蛋白，和基質(zhì)成分例如層粘連蛋白。用于標(biāo)記組織切片的技術(shù)是直接的免疫染色，使用標(biāo)記熒光染料的單克隆抗體。使用共焦顯微鏡觀察標(biāo)記。獲得的結(jié)果顯示生物材料在潰瘍?cè)偕惺怯行У模驗(yàn)?用于傷口的生物材料是免疫無活性的，未顯示毒性癥狀。-生物材料適合待修復(fù)的傷口的幾何形狀和大小，在深度和表面均完全覆蓋患病區(qū)域。-隨著愈合過程進(jìn)展，生物材料降解，并被皮膚的上皮組分取代。-組織切片顯示生物材料誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞(它們?cè)谄渲腥允怯谢钚缘?的遷移和增殖。-本發(fā)明的生物材料誘導(dǎo)傷口愈合的有效性是對(duì)照動(dòng)物的兩倍，此外，新疤痕組織的質(zhì)量顯著高于沒有應(yīng)用本發(fā)明生物材料的動(dòng)物中的新疤痕組織的質(zhì)量。實(shí)施例11 :在共培養(yǎng)物中以本發(fā)明的牛物材料的可灃射形式的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的活性和代謝活性。為了確定活性和代謝活性，在24-孔板中將2 X IO6細(xì)胞在800 μ L 10mg/ml本發(fā)明的生物材料。將軟骨細(xì)胞和MSC放置培養(yǎng)7天。在第3天和第7天，用MTT活體染料進(jìn)行染色，其將代謝活躍的細(xì)胞染色，從而獲得細(xì)胞活性的測量。圖6。倒置光學(xué)顯微鏡圖像，其顯示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)的活性和本發(fā)明的生物材料中的共培養(yǎng)物中用MTT染色的MSC。在第3天和第7天染色。染成黑色的細(xì)胞是有活性的和代謝活躍的?？傊?，基于圖6中顯示的結(jié)果，與檢測的細(xì)胞組合中的對(duì)照相比，本發(fā)明的生物材料保持細(xì)胞活性。實(shí)施例12 :與透明質(zhì)酸(HA)相比本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞中的增殖能力。根據(jù)實(shí)施例8中描述的技術(shù)，在本發(fā)明的生物材料中和HA中使用MTT進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的檢測。檢測的細(xì)胞包括人軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞L-929、人成纖維細(xì)胞，和人脂肪組織(AMSC)間充質(zhì)干細(xì)胞。在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)觀察增殖。圖7和8均表明在類似濃 度下，與HA相比，本發(fā)明的生物材料中培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖和存活顯著更高。實(shí)施例13 :與透明質(zhì)酸(HA)相比本發(fā)明的生物材料中細(xì)胞的親和力和三維生長倉泛力。使用本發(fā)明的生物材料的目的是增強(qiáng)細(xì)胞從周邊組織到損傷區(qū)域的聚集，以及作為細(xì)胞群體治療學(xué)應(yīng)用于損傷的載體。因此，本發(fā)明的生物材料在保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的重要性是明顯的。為了確定軟骨細(xì)胞在本發(fā)明的生物材料內(nèi)部形成聚集物的能力，我們?cè)?-孔板中用I. O或2. Omg/ml本發(fā)明的生物材料培養(yǎng)每孔750k軟骨細(xì)胞。開始培養(yǎng)后72小時(shí)，可以觀察到在2. Omg/mL濃度下軟骨細(xì)胞在水凝膠中聚集成簇，而在I. Omg/mL下水凝膠中沒有聚集。開始培養(yǎng)96小時(shí)后，在2. Omg/mL本發(fā)明的生物材料中軟骨細(xì)胞完全聚集成簇，而在I. Omg/mL水凝膠中的軟骨細(xì)胞開始成簇。換句話說，與對(duì)照相比，本發(fā)明的材料容易在較高濃度下發(fā)生聚集和簇的形成。與標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞培養(yǎng)塑料表面相比，與本發(fā)明的生物材料接觸排列的細(xì)胞呈現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的生物材料更高的親和力。它們從細(xì)胞培養(yǎng)板分離并遷移至本發(fā)明的生物材料中，在該生物材料中它們形成有活性的簇。但是，當(dāng)使用相同濃度的HA作為對(duì)照時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)塑料更高的親和力。在相同濃度下在本發(fā)明的生物材料和HA之間的一致性存在實(shí)質(zhì)性的不同。HA比本發(fā)明的生物材料粘度低。圖9表明，與HA相比，本發(fā)明的生物材料中觀察到的該遷移效應(yīng)。使用存活/死亡測定來將有活性的(綠色)細(xì)胞與無活性的(紅色)細(xì)胞區(qū)分開。總之，相比細(xì)胞培養(yǎng)塑料，該實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞對(duì)本發(fā)明的生物材料具有更強(qiáng)的親和力，這一發(fā)現(xiàn)未對(duì)HA和塑料重復(fù)進(jìn)行。實(shí)施例14 :本發(fā)明中培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)比HA中培養(yǎng)的細(xì)胞的功能件的觀察。在該實(shí)施例中，確定了與組織再生相關(guān)的標(biāo)記物的表達(dá)。為了確定在本發(fā)明的生物材料中和對(duì)照HA中MSC中不同軟骨標(biāo)記物的表達(dá)，在T75瓶中，在兩種不同濃度的水凝膠(O. I和O. 5mg/mL)和HA中培養(yǎng)細(xì)胞，每瓶有7. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞。4天后，通過細(xì)胞的離心和后續(xù)的RNA純化，用Agilent總RNA分離迷你試劑盒(Agilent technologies, USA)從樣品中提取RNA。RNA提取后，合成cDNA并根據(jù)II型膠原和多功能蛋白聚糖表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行RT-PCR。圖10表明，與HA對(duì)照的結(jié)果相比，來自MSC的軟骨因子膠原II和多功能蛋白聚糖的基因表達(dá)分析的結(jié)果，所述MSC在本發(fā)明的生物材料中培養(yǎng)。II型膠原形成了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的大部分(90%)，并且是細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化的標(biāo)記物。培養(yǎng)4天后，在本發(fā)明的生物材料中培養(yǎng)的MSC開始II型膠原的表達(dá)，而當(dāng)其在HA中培養(yǎng)時(shí)未觀察到這一現(xiàn)象。多功能蛋白聚糖是軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中的較少組分。它被認(rèn)為是之前的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞中去分化或失去軟骨細(xì)胞表型的標(biāo)記物。由于軟骨細(xì)胞指示細(xì)胞成熟，其表達(dá)多功能蛋白聚糖較少，同時(shí)其聚集蛋白聚糖、硫酸軟骨素和膠原II表達(dá)的增加。與在濃度匹配的HA中細(xì)胞的對(duì)照群體相比，在本發(fā)明的生物材料中的MSC顯示基因多功能蛋白聚糖的表達(dá)減少，同時(shí)膠原II表達(dá)增加。因此，本發(fā)明的生物材料顯示誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型分化或合成關(guān)節(jié)軟骨再生相關(guān)分子的能力。實(shí)施例15來自人和豬來源的本發(fā)明的生物材料的流變學(xué)表征。通常會(huì)進(jìn)行生物材料的機(jī)械表征，以便提供關(guān)于組織工程支架的相關(guān)的并且可比較的信息。對(duì)于水凝膠，機(jī)械研究可提供關(guān)于水凝膠對(duì)于使用各種技術(shù)注射的適用性的重要信息，或化學(xué)方法例如交聯(lián)的完成程度。在本實(shí)施例中，如前所述，從WJ分離的GAG支架分裝為3種百分比的溶液(1%、5%、 10%),分別2ml體積，以便評(píng)價(jià)濃度對(duì)流變學(xué)參數(shù)的影響。實(shí)驗(yàn)中使用TA Instruments型號(hào)AR2000eX流變儀。首先，對(duì)于各樣品，在涉及儲(chǔ)能模量和損耗模量以及粘度的后續(xù)研究中進(jìn)行應(yīng)變掃描，以確認(rèn)各樣品在其線性粘彈性范圍(未顯示數(shù)據(jù))內(nèi)檢測。測定線性粘彈性范圍后，通過從20°C至50°C變化的生理相關(guān)溫度掃描用恒定頻率來確定各樣品的損耗模量、儲(chǔ)能模量和粘度。將數(shù)據(jù)作圖，并列于圖11-13。在圖11中，人在10%濃度的值高于豬在10%濃度的值。人在5%的值超過豬在5%的值。由于雙錐粘度計(jì)的內(nèi)部質(zhì)量(interial qualities),在更低濃度(對(duì)于兩者為1%,對(duì)于豬為5%)下結(jié)果具有更低的信噪比。定量地和定性地，與豬的樣品相比(按克計(jì))，人的樣品顯示較大模量。而且，觀察到隨檢測溫度改變模量略有降低一這一發(fā)現(xiàn)與在恒定振蕩頻率、在變更溫度下的粘彈性溫度效應(yīng)一致。在圖12中，對(duì)于各自的濃度，來自人的數(shù)值的結(jié)果超過豬的樣品。由于雙錐粘度計(jì)的內(nèi)部質(zhì)量，在更低濃度(對(duì)于兩者為1%，對(duì)于豬為5%)下的結(jié)果具有低的信噪比。如儲(chǔ)能模量結(jié)果中所示，觀察到模量隨溫度的預(yù)期的微小降低。損耗模量值高于儲(chǔ)能模量值，從而表明粘度效應(yīng)相對(duì)于彈性效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。考慮到分離的GAG是具有固定流動(dòng)特性的非交聯(lián)的水凝膠，這一發(fā)現(xiàn)是預(yù)料之中的。來自豬和人來源的3種不同濃度的本發(fā)明的生物材料的損耗模量結(jié)果。在圖13中，對(duì)于各自的濃度，來自人的數(shù)值的結(jié)果超過豬的樣品。由于雙錐粘度計(jì)的內(nèi)部質(zhì)量，在更低濃度(對(duì)于兩者為1%，對(duì)于豬為5%)下的結(jié)果具有較低的信噪比。范圍廣泛的粘度是可能的通過改變樣品的濃度(即使按每克計(jì))，人水凝膠始終更有粘度。在該實(shí)施例中，本發(fā)明的人生物材料的10%溶液具有類似于蓖麻油的平均粘度?？傊?，僅通過調(diào)節(jié)提取的GAG的濃度便可得到多種粘度和模量。實(shí)施例16 :來自周邊組織的細(xì)胞聚集(趨化作用)。本測驗(yàn)的目的是確定本發(fā)明的生物材料對(duì)來自組織的細(xì)胞的趨化能力。為此，我們使用來自兩個(gè)不同人患者的人軟骨樣品。已經(jīng)證明，在MSC和軟骨細(xì)胞的活性和增殖檢測中2mg/mL的濃度是適合的，所以在當(dāng)前實(shí)施例中使用該濃度。使用非吸附板以避免吸附前底物的存在)實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下·陰性對(duì)照DMEM中的片段
·透明質(zhì)酸在2mg/mL下HA中的片段·感興趣的材料在2mg/mL下在本發(fā)明的生物材料中的片段而且，用粘性空斑(sticky plaque)作為陽性對(duì)照。在補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)組織。每天收集圖像并將其列于圖14。結(jié)果顯示任何對(duì)照或暴露于HA的片段中均無細(xì)胞。但是，在本發(fā)明的生物材料的片段中，觀察到已有大量細(xì)胞從最早的時(shí)間點(diǎn)遷移至軟骨的外表面。使用存活/死亡測定來確定遷移至軟骨片段的表面的細(xì)胞是否有活性。圖15中顯示的結(jié)果表明，來自軟骨片段的絕大多 數(shù)細(xì)胞有活性。但是，未觀察到細(xì)胞從軟骨片段的表面遷移至本發(fā)明的生物材料周圍?；谠摻M的結(jié)果，我們可以得出結(jié)論I.本發(fā)明的生物材料具有從天然組織聚集軟骨細(xì)胞的能力。2.由本發(fā)明的生物材料聚集的軟骨細(xì)胞是有活性的。由于各種可能的實(shí)施方案可由上述發(fā)明組成，并且由于在以上陳述的實(shí)施方案中可做出各種修改，應(yīng)當(dāng)理解本文描述的所有內(nèi)容應(yīng)當(dāng)被解釋為說明性的，而不應(yīng)解釋為限制意義。參考文獻(xiàn)-Collins M. N, Birkinshaw C. 2008. "Physical properties of crosslinkedhyaluronic acid hydrogels' Journal of Material Science.Materials inMedicine, 19:3335-3343.-Coburn J. A, Pandit A. 2007. "Development of naturally-derivedbiomaterials and optimization of their biomechanical properties' Topics inTissue Engineering, 3:1-14.-Cui F. Zj Tian W. M，Hou S. P，Xu Q. Y，Lee I. S. 2006. "Hyaluronic acid hydrogelimmobilized with RGD peptides for brain tissue engineering' Journal of MaterialScience. Materials in Medicine, 17:1393-1401.-Danishefsky I，Bella Jr. A. 1996. 〃The sulfated mucopolysaccharides fromhuman umbilical cord〃，J. of Biological Chemistry, 241:143-146.-Dawson J. I, Oreffo R. 2008. "Bringing the regeneration gap: stemcells，biomaterials, and clinical translation in bone tissue engineering'Archives of Biochemistry and Biophysics,473:124-131.-Elisseeff Jj Ruf f ner M，Kim T. Gj Wi 11 iams C. 200 5. "Ce 11 u I arphotoencapsulation in hydrogels ^. Culture of Cells for TissueEngineering, Chapter 9.-Goa K. Lj Benfield P. 1994. "Hyaluronic acid. A review of its pharmacologyand use as a surgical aid in ophthalmology, and its therapeutic potential injoint disease and wound healing. 〃Drugs，47:536-566.-Gogiel T，Galewska Z，Jaworski S.2005. ^Pre-eclampsia-associatedalterations in Wharton’s jelly proteoglycans' Acta Biochim Pol,52:501-507.Hadidian Z，Pirie N. W. 1948. "The preparation and some properties ofhyaluronic acid from human umbilical cord〃. The Biochemical Journal,42:260-265.
-Hiles M，Hodde J. 2006. "Tissue engineering a clinically usefulextracellular matrix biomaterial"· Int Urogynecol Journal,17:39-43.-Ishihara Mj Obara Kj Ishizuka T，F(xiàn)ujita M，Sato M，Masuoka K，Saito Yj YuraH，Matsui T，Hattori H，Kikuchi M，Kurita A. 2002,Controlled release of fibroblastsgrowth factors and heparin from photocrosslinked chitosan hydrogels andsubsequent effect on in vivo vascularization^. Journal of Biomedical MaterialsResearch, 78:364-371.-Jeanloz R. Wj Forchielli E. 1950. ^Studies on hyaluronic acid and relatedsubstances I. Preparation of hyaluronic acid and derivatives from humanumbilical cord〃. Journal of Biological Chemistry, 186:495-511.-Kanematsu A, Yamamoto Sj Ozeki M，Noguchi T，Kanatani I, Ogawa 0，TabataY. 2003. "Collagenous matrices as release carriers of exogenous growth factors'Biomaterials, 25:4513-4520. -Laurent T. C，F(xiàn)raser J. R. E. 19 9 2. 〃 Hyaluronan 〃· The FASEBJournal,6:2397-2404-Longaker M，Chiu E. Sj Harrison M. Rj Crombleholmej Langer J. Cj DuncanB. Wj Adzick N. S，Verrier E. D，Stern R. 1989."Studies in fetal wound healing" Annals of Surgery, 210:667-672.-Mahoney D. Jj Aplin R. Tj Calabro A，Hascall V. Cj Day A. J. 2001. "Novelmethods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharidesof defined length". Glycobiology，11:1025-1033.-Malkowski A, Sobolewski Kj Jaworski Sj Bankowski E. 2007. "FGF bindingby extracellular matrix components of Wharton’ sjelly〃. Acta BiochimPol, 54:357-363.-Moore R. Dj Schoenberg M. D. 1957. "Studies on connective tissue.I. The polysaccharides of the human umbilical cord".A.M.A. Archives ofpathology, 64:39-45.-Pieper J. Sj Oosterhof A, Dijkstra P. Jj Veerkamp J. Hj van KuppeveltT. H. 1999. ^Preparation and characterization of porous crosslinked collagenousmatrices containing bioavailable chondroitin sulphate"，Biomaterials，20:847-858.-Rabenstein D.L.2002. ^Heparin and heparin sulfate: structure andfunction' Natural products reports,19:312-331.-Rogers B. A，Murphy C. Lj Cannon S. R，and Briggs T. W. R. 2006. "Topographicalvariation in glycosaminoglycan content in human articular cartilage' TheJournal of Bone and Joint Surgery, 88:1670-1674.-Sobolewski Kj Malkowski A, Bankowski Ej Jaworski S. 2005. "Wharton，s jellyas a reservoir of peptide growth factors. 〃Placenta，26，747-752.Toole B.P.2004.^Hyaluronanifrom extracellular glue to pericellularcue〃. Nature Cancer Reviews, 4，528-539.-Torres D. Sj Freyman T. Mj Yannas I. V，Spector M. 2000. "Tendon cellcontraction of collagen—GAG matrices in vitro: effect of cross-1 inking.Biomaterials, 21，607-619.-Trowbridge J. Mj Gallo R. 2002. "Dermatan sulfate:new functions from anold glycosaminoglycan^. Glycobiology, 12:117-125.-Ueno N，Chakrabarti B，Garg H. G. Hyaluronic acid of human skin andpost-burn scar:heterogeneity in primary structure and molecular weight' 1992.Biochem Int，26:787-796.-Wissink M. J. Bj Beernink Rj Pieper J. S，Poot A. A, Engbers G. Η. M，BeugelingTj van Aken W.Gj Feijen J. 2001. "Binding and release of basic fibroblast growth factor from heparinized collagen matrices^, Biomaterials, 22:2291-2299.
權(quán)利要求
1.一種可注射性水凝膠形式的生物材料，其特征在于所述生物材料包括存在于臍帶中的糖胺聚糖(GAG)混合物，所述臍帶不含臍帶膜、血管以及細(xì)胞或細(xì)胞殘余。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物材料，其提取自人類來源的臍帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物材料，其提取自動(dòng)物來源的臍帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括選自透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸類肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、硫酸皮膚素和肝素的糖胺聚糖混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG總混合物40-80%的透明質(zhì)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于,所述生物材料包括占GAG總混合物2-25%的硫酸角質(zhì)素。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG總混合物3-10%的軟骨素-6-硫酸鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于,所述生物材料包括占GAG總混合物1-9%的硫酸類肝素。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG總混合物O.5-7%的軟骨素-4-硫酸鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于,所述生物材料包括GAG的總混合物O.1-7%的硫酸皮膚素。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于,所述生物材料包括占GAG總混合物O.05-3%的肝素。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的源自人類臍帶的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含透明質(zhì)酸(70%)、硫酸角質(zhì)素(10%)、軟骨素-6-硫酸鹽(7%)、硫酸類肝素(5%)、軟骨素-4-硫酸鹽(4%)、硫酸皮膚素(3%)和肝素(1%)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12所述的生物材料，其特征在于，所述可注射性水凝膠具有10cS-150, OOOcS 的粘度。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物材料，其特征在于，具有10至15，OOOcS的粘度。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物材料，其特征在于，具有10至2，OOOcS的粘度。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料具有三維結(jié)構(gòu)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料具有孔徑為O.5-1000 μ m的實(shí)質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述孔徑是O.5-500 μ m。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-19所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料還包括細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的生物材料，其特征在于所述細(xì)胞選自未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞或分化為另一種細(xì)胞株的間充質(zhì)干細(xì)胞、和/或未分化的造血干細(xì)胞或分化為另一種細(xì)胞株的造血干細(xì)胞、和/或軟骨細(xì)胞、和/或成軟骨細(xì)胞、和/或成骨細(xì)胞、和/或骨細(xì)胞、和/或角質(zhì)形成細(xì)胞、和/或成纖維細(xì)胞、和/或肌細(xì)胞、和/或脂肪細(xì)胞、和/或神經(jīng)細(xì)胞和/或來自神經(jīng)系統(tǒng)的其它細(xì)胞、和/或來自白血細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞、和/或角膜細(xì)胞、和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/或上皮細(xì)胞。
21.根據(jù)任何在前的權(quán)利要求所述的一種生物材料，其中生物材料與增強(qiáng)材料組合形成復(fù)合材料。
22.—種獲得根據(jù)權(quán)利要求1-20所述的生物材料的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟 a)獲得人臍帶； b)用鹽溶液和抗生素處理臍帶； c)去除臍帶表面的所有血液； d)將臍帶分為l-2cm的片段； e)清潔內(nèi)部殘留的所有血液； f)去除臍帶膜和血管； g)分離包括臍帶膠質(zhì)的膠凝物質(zhì)； h)酶法消化獲得的膠凝物質(zhì)；和 i)沉淀并分離GAG。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用于獲得所述生物材料的方法，其特征在于，所述方法還包括溶解權(quán)利要求22的步驟i)中獲得的所述GAG。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用于獲得所述生物材料的方法，其特征在于，所述方法還包括交聯(lián)權(quán)利要求22的步驟i)中獲得的所述GAG。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用于獲得所述生物材料的方法，其特征在于，通過溫度變化、化學(xué)反應(yīng)或光聚合進(jìn)行所述共價(jià)交聯(lián)。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用于獲得所述生物材料的方法，其特征在于，通過對(duì)所述WJ中單個(gè)GAG組分的側(cè)基修飾進(jìn)行離子交聯(lián)。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-21所述的生物材料的用途，其用于重建、填充或重構(gòu)軟組織；治療皺紋、皺褶和疤痕、燒傷、潰瘍、軟組織增大、臉部脂肪萎縮、椎間盤疾病；修復(fù)軟骨、肌骨胳損傷、骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)周炎；治療腫瘤、陰道疾病、腦損傷、骨髓修復(fù)、神經(jīng)變性病癥，心血管疾病和潤滑過程，作為止痛劑和抗炎劑；治療燒傷，潰瘍和皮膚表皮缺陷；治療眼科疾病，例如角膜損傷、視網(wǎng)膜損傷或白內(nèi)障；修復(fù)軟骨；治療骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)，例如骨軟骨缺陷、骨關(guān)節(jié)炎或骨缺陷的情況，和解決陰道疾病的佐劑；治療牙齦炎和牙周炎；以及用于開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于臍帶的細(xì)胞外基質(zhì)的生物材料(尤其是水凝膠)在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及一種由糖胺聚糖組成的生物材料及其制備方法和用途，所述糖胺聚糖僅在臍帶的臍帶膠質(zhì)(可任選與細(xì)胞組合作為組合治療)中存在。
文檔編號(hào)A61K31/726GK102905710SQ201080066020
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者胡里奧·方特佩雷斯, 瑪麗亞·畢格納·卡斯特羅費(fèi)奧, 邁特·德爾奧爾莫巴斯特里夏 申請(qǐng)人:海斯特賽爾有限公司