專利名稱：結(jié)合b7h6的單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體，特別是能夠結(jié)合被稱為B7H6的腫瘤細(xì)胞配體的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及所述抗體的用途。背景B7 家族正和負(fù)共刺激信號(hào)在淋巴細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，介導(dǎo)這些信號(hào)的分子經(jīng)證明是免疫調(diào)節(jié)劑的有效目標(biāo)。例如，在與抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的B7-1或B7-2發(fā)生相互作用時(shí)，原型T細(xì)胞共刺激分子CD28發(fā)送的信號(hào)能夠促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答T細(xì)胞受體(TcR)結(jié)合時(shí)發(fā)生的增殖和分化，而CD28的同源物細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原_4(CTLA_4)介導(dǎo)T細(xì)胞增殖和效應(yīng)子功能的抑制。(參見Chambers et al. , Ann. Rev.Immunol. , 19:565-594, 2001;Egen et al. , Nature Immunol.，3:611-618，2002)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與B7家族有同源性的分子(Abbas et al. , Nat.Med.，5:1345-6，1999; Coyle et al., Nat. Immunol. , 2:203-9, 2001; Carreno et al. , Annu.Rev. Immunol.，20:29-53，2002;Liang et al.，Curr. Opin. Immunol.，14:384-90，2002)，它們?cè)诹馨图?xì)胞活化中的作用才剛剛開始獲得闡述。這些新的共刺激反受體包括B7h2、PD-L1、PD-L2、B7-H3 和 B7-H4。已知B7家族成員的表達(dá)主要局限于抗原呈遞細(xì)胞。研究揭示B7家族成員是淋巴樣細(xì)胞上的反受體，它們與其淋巴細(xì)胞上的相應(yīng)受體相互作用從而提供對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有重要作用的正或負(fù)共刺激信號(hào)。NK 細(xì)朐和 NKd30自然殺傷(NK)細(xì)胞是活躍在免疫系統(tǒng)中的一個(gè)淋巴細(xì)胞亞組，代表了人類外周血中單核細(xì)胞的平均大約15%。NK細(xì)胞功能的描述最早在1971年觀察到被致死輻射的小鼠能夠排斥異體移植物或親本骨髓細(xì)胞(BMC)同種異體移植(allgraft)。(參見Cudowicz and Bennett, J.Exp.Med.134:83-102, 1971;Cudowicz and Bennett,J.Exp.Med. 135:1513-1528，1971)。Cudowicz 和 Bennett 觀察到被輻射的 Fl 雜交 H_2_ 雜合小鼠(A X B)能夠排斥親本H-2-純合BMC (A或B)。在有關(guān)移植的經(jīng)典理論中移植抗原被認(rèn)為是同等顯性遺傳，后代對(duì)親代主要組織相容性復(fù)合體(MHC)決定簇專性耐受，而以上觀察卻與該理論沖突(參見 Cudowicz and Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102，1971)。造成該現(xiàn)象的細(xì)胞經(jīng)發(fā)現(xiàn)是輻射抗性的，與淋巴樣細(xì)胞相同，之后在1975年發(fā)現(xiàn)它們的特征在于具有以非限制性MHC的方式介導(dǎo)體外自發(fā)殺傷腫瘤的能力(參見Herberman andOrtaldo, Science, 214:24-30，1981;Ortaldo and Herberman, Annu. Rev. Immunol.2:359-394, 1984;Trinchieri, Adv. Immunol. 47:187-376，1989; Murphy etal. , J. Natl.CancerInst. 85:1475-1482，1993)。在1987年觀察到有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠雖然不能發(fā)展出T和B細(xì)胞，卻有正常的NK細(xì)胞功能，因此更多證據(jù)表明僅有NK細(xì)胞即可介導(dǎo)骨髓移植物排斥的特異性(參見 Murphy etal.，J. Exp. Med. 165:1212-1217，1987)。目前NK細(xì)胞被認(rèn)為代表了先天免疫的重要部分，在對(duì)腫瘤和感染了病毒的細(xì)胞的免疫監(jiān)視中發(fā)揮主要作用。但是NK細(xì)胞除非被激活，它們即使處于足夠的數(shù)量也不能有效發(fā)揮其正常功能。NK細(xì)胞活性下降確實(shí)與癌癥和傳染病存在關(guān)聯(lián)性(參見Yamazakiet al. , Oncology Reports 9:359-363, 2002;Rosenberg et al. , Cancer Research 51:5074-5079 (suppl.), 1991; Britteenden et al. , Cancer 77:1226-1243，1996;美國(guó)專利5，082，833和4，883，662)。相反正如以上提到的，NK細(xì)胞活性介導(dǎo)BMC同種異體移植的急性排斥。因此NK細(xì)胞活性水平似乎在與免疫有關(guān)的疾病中起著重要作用。NK細(xì)胞活性一般是由I型MHC分子與抑制性受體和活化性受體的相互作用來調(diào)節(jié)的(參見，例如 Barao and Murphy, BB&MT 9:727-741,2003)。“丟失自我(missingself) ”假說最初是基于一個(gè)觀察結(jié)果，即缺乏I型MHC分子的腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷 敏感(參見 Ljunggren and Karre, Immunol. Todayll: 237-244, 1990; Ohlen et al. , J.Immunol. 145:52-58, 1990)。研究人員還觀察到人NK細(xì)胞能夠溶解I型缺陷型EB病毒轉(zhuǎn)化的 B 淋巴母細(xì)胞系(Storkus et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2361-2364,1989)。此外還發(fā)現(xiàn)給I型缺陷型靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染I型基因使得這些細(xì)胞能夠部分或者完全抗 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的溶解(參見，Storkus et al.,同前；Shimizu and DeMars, Eur.J. Immunol.，19:447-451, 1989)。而I型MHC對(duì)于免受NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性并非總是必需的，被I型MHC識(shí)別不都能防止NK細(xì)胞造成的細(xì)胞溶解(Barao and Murphy,同前)。近年來，鑒定到各種I型MHC特異的抑制性受體和活化性受體以及非I型MHC特異的活化性受體。這些受體與諸如例如異基因BMT和癌癥治療的治療手段有關(guān)(參見出處同上)。能夠介導(dǎo)抗I型MHC缺陷或陰性靶細(xì)胞的NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用的非I型MHC特異性活化性受體，其部分代表是被稱為自然細(xì)胞毒性受體(NCRs)的一組異質(zhì)的NK細(xì)胞特異性免疫球蛋白樣分子(參見例如 Moretta et al. , Annu. Rev. Tmmuno1. 19:197-223, 2001;Diefenbach and Raulet, TmmunoI. Rev. , 181:170-184，2001)。在缺乏 I 型 MHC 表達(dá)的情況下(比如例如，腫瘤細(xì)胞或者感染了病毒的細(xì)胞上)，NK細(xì)胞上這些活化性受體的連接將觸發(fā)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。這種活化性受體之一是NKp30，其在成熟的自然殺傷(NK)細(xì)胞上選擇性和組成性表達(dá)，并通過特別是與⑶3的偶聯(lián)發(fā)出信號(hào)(參見Barao and Murphy,同前)。NKp30所結(jié)合的靶物質(zhì)-細(xì)胞配體以前未被發(fā)現(xiàn)。NK細(xì)胞的這種天然免疫識(shí)別系統(tǒng)代表了潛在的一個(gè)有力工具，可能在臨床上應(yīng)用于同種異體骨髓移植(BMI)、癌癥療法或其他NK細(xì)胞相關(guān)疾病的治療(參見例如Barao andMurphy,同前)。例如，刺激或抑制NKp30的活化可能用于調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性，以及治療與NK細(xì)胞活性相關(guān)的疾病或紊亂。尤其是，通過觸發(fā)NKp30增強(qiáng)NK細(xì)胞活性可能用于治療以NK細(xì)胞活性不足為特征的疾病或紊亂，比如癌癥和傳染性疾病，而通過阻斷NKp30抑制NK細(xì)胞活性能夠用于治療NK細(xì)胞介導(dǎo)的紊亂，比如例如BMC同種異體移植排斥。最近發(fā)現(xiàn)的B7家族的最新成員B7H6被鑒定為NKp30的反受體(counter-receptor),它是在成熟自然殺傷(NK)細(xì)胞上選擇性表達(dá)的受體，以活化性受體參與人天然細(xì)胞毒作用(Brandt et al.，J. Exp. Med.，206 (7) : 1495-1503，2009)。B7H6 在正常人組織中未檢測(cè)到，而在人腫瘤細(xì)胞上有表達(dá)。因此，本領(lǐng)域需要鑒定能夠抑制B7H6和NKp30之間的相互作用的抗體?；谒鼈冋{(diào)節(jié)共刺激信號(hào)和免疫反應(yīng)的能力，這些抗體有潛在的治療應(yīng)用。此外，能夠結(jié)合B7H6蛋白的抗體在偶聯(lián)了細(xì)胞毒藥劑時(shí)很有用，可以用于尋靶到表達(dá)B7H6的細(xì)胞。這些和其他用途都是高度需要的。本發(fā)明提供了用于這些和其他用途的組合物和方法，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說根據(jù)本文的教導(dǎo)是顯而易見的。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離的單克隆抗體，所述抗體特異結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基25-266)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQID NO: 2中的氨基酸殘基25-266)。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266)。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào) CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266)。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266)。某些實(shí)施方案中，以上描述的抗-B7H6單克隆抗體是小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。某些實(shí)施方案中，抗體將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6胞外結(jié)構(gòu)域，抑制人B7H6與NKp30的相互作用。所述抑制可能是完全或部分阻斷，可能使相互作用被中和或者減少。合適的抗體還包括單鏈抗體。其他包含在內(nèi)的變化形式包括含有Fe區(qū)的抗體,其中所述Fe區(qū)具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一種。在某些這類變化形式中，F(xiàn)e區(qū)是單鏈Fc(ScFc)。結(jié)合人B7H6的單克隆抗體中每一種都適合制成包含抗體和可藥用介質(zhì)的組合物。這些抗體適合用在診斷試劑盒中，用于檢測(cè)所述抗體的結(jié)合。另一方面，本發(fā)明提供了抗體-藥物偶聯(lián)物，其包含特異結(jié)合人B7H6胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266)的單克隆抗體，其中所述抗體偶聯(lián)了細(xì)胞毒性試劑。某些實(shí)施方案中，抗體-藥物偶聯(lián)物中的抗體部分是與下述抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266)的抗體由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體可以是例如鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。合適的抗體還包括單鏈抗體。某些變化形式中，抗體包含具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一種的Fe區(qū)。在某些這類變化形式中，所述Fe區(qū)是單鏈Fc(ScFc)。細(xì)胞毒試劑可以是例如抗微管蛋白劑、DNA小溝結(jié)合劑、DNA小溝烷基化劑、度卡霉素(duocarmycin)或者嘌呤霉素。合適的抗微管蛋白劑包括，例如海兔毒素(dolastatin)、長(zhǎng)春堿類(vine alkaloid)、鬼曰毒素(podophyllatoxin)、紫杉燒(taxane)、衆(zhòng)果赤霉素baccatin)衍生物、cryptophysin、類美登醇(maytansinoid)或者 combretastatin。某些實(shí)施方案中，抗體經(jīng)由連接分子與藥物偶聯(lián)，某些情況中所述連接分子在胞內(nèi)狀況下可以被切割。合適的可切割連接分子包括肽連接分子，包括那些可以通過胞內(nèi)蛋白酶切割的肽連接分子。任何被包含在內(nèi)的抗體-藥物偶聯(lián)物都適合制成包含抗體-藥物偶聯(lián)物和可藥用介質(zhì)的組合物。另一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一些方法，所述方法通過抑制人B7H6與人NKp30的相互作用來降低抗表達(dá)人B7H6的細(xì)胞的自然殺傷(NK)細(xì)胞活性。這些方法通常包括將表達(dá)人B7H6的細(xì)胞在有人NK細(xì)胞的情況下與有效量的單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體能夠與以下(能夠抑制人B7H6與人NKp30的相互作用的)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。另一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一些方法，所述方法通過抑制人B7H6與人NKp30的相互作用來治療受試對(duì)象中的骨髓細(xì)胞(BMC)同種異體移植排斥。這些方法通常包括將單克隆抗體以能夠有效抑制NK細(xì)胞活性的量給予受試對(duì)象，從而治療急性BMC同種異體移植排斥，所述單克隆抗體能夠與以下(能夠抑制人B7H6與人NKp30的相互作用的)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242) 產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。降低人NK細(xì)胞活性的方法和治療BMC同種異體移植排斥的方法都包括這樣一些實(shí)施方案，所述實(shí)施方案中的抗體是人或人源化的單克隆抗體。方法還包括其中的抗體是單鏈抗體的實(shí)施方案。其他相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了利用抗體-藥物偶聯(lián)物來消除細(xì)胞群中的B7H6表達(dá)細(xì)胞或者抑制其生長(zhǎng)的方法。所述方法通常包括將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量的抗體-藥物偶聯(lián)物接觸，所述偶聯(lián)物包含(a)抗體，其與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQID NO: 2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體；以及(b)偶聯(lián)在抗體上的細(xì)胞毒性劑。另一個(gè)相關(guān)方面提供了利用抗體-藥物偶聯(lián)物治療受試對(duì)象中B7H6表達(dá)癌癥的方法。所述方法通常包括將有效量抗體-藥物偶聯(lián)物給予受試對(duì)象，所述偶聯(lián)物包含(a)抗體，其與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4244)產(chǎn)生的抗體；由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體；以及(b)偶聯(lián)在抗體上的細(xì)胞毒性劑。涵蓋的實(shí)施方案中癌癥是結(jié)腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。其他適合治療的B7H6表達(dá)癌癥包括早幼粒細(xì)胞白血病(prohemocyticleukemia)、B細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病(erythroleukemia)、伯基特氏淋巴瘤(Burkittj s lymphoma)和慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia)。在消除細(xì)胞群中的B7H6表達(dá)細(xì)胞或者抑制其生長(zhǎng)的方法，和/或治療受試對(duì)象中B7H6表達(dá)癌癥的方法中，人或人源化單克隆抗體都適合作為抗體-藥物偶聯(lián)物中包含的抗體。也適合使用單鏈抗體作為所述方法中抗體-藥物偶聯(lián)物中包含的抗體。其他相關(guān)方面中，提供了誘導(dǎo)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法。所述方法通常包括將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量的抗體接觸，所述抗體與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4243)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體；其中所述接觸是在有NK或⑶8+細(xì)胞的情況下進(jìn)行的,所述NK或⑶8+細(xì)胞表達(dá)具有ADCC活性的Fe受體,所述抗體包含能夠結(jié)合該Fe區(qū)的Fe區(qū)。其他相關(guān)方面，提供了誘導(dǎo)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的方法。所述方法通常包括將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量的抗體接觸，所述抗體與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體；其中所述接觸是在有補(bǔ)體的情況下進(jìn)行的，所述抗體包含具有⑶C活性的Fe區(qū)。在誘導(dǎo)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的ADCC的方法中，和/或誘導(dǎo)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的⑶C的方法中，實(shí)施方案包括人或人源化抗體。還包括單鏈抗體。另一種變化形式包括Fe區(qū)，其中所述Fe區(qū)是單鏈Fe (scFc)。對(duì)于這兩種方法，在某些實(shí)施方案中，所述B7H6表達(dá)癌癥是癌細(xì)胞。癌細(xì)胞可以是例如直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、紅白血病細(xì)胞、伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞或者慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞。另一個(gè)相關(guān)方面提供了治療B7H6表達(dá)癌癥的方法。所述方法通常包括給予受試對(duì)象有效量的單克隆抗體，所述抗體與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO: 2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCMI-4244)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4245)產(chǎn)生的抗體；其中所述抗體包含具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一種的Fe區(qū)。合適的單克隆抗體包括人抗體、人源化抗體和單鏈抗體。在某些變化形式中，所述Fe區(qū)是單鏈Fe (scFc)。可接受治療的B7H6表達(dá)癌癥包括，例如直腸、肝、宮頸、肺、胰腺或前列腺的癌癥。其他合適的B7H6表達(dá)癌癥包括例如早幼粒細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒細(xì)胞白血病。另一個(gè)相關(guān)方面提供了檢測(cè)B7H6的細(xì)胞表達(dá)的方法，其中抗體的結(jié)合表明細(xì)胞上存在B7H6。通常所述方法包括(I)將包含待測(cè)試的人細(xì)胞的生物樣品與單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCMI-4244)產(chǎn)生的抗體、或者由克隆編號(hào)17B1. 3)的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245產(chǎn)生的抗體；以及(2)檢測(cè)抗體的結(jié)合和細(xì)胞是否表達(dá)B7H6，其中結(jié)合表明細(xì)胞上存在B7H6。在某些實(shí)施方案中。生物樣品是完整的人細(xì)胞或待測(cè)試的細(xì)胞的膜部分。某些實(shí)施方案中，抗體被標(biāo)記了可檢測(cè)的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記或生物發(fā)光標(biāo)記。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了給懷疑患有表達(dá)B7H6的癌癥的受試對(duì)象進(jìn)行診斷的方法。所述方法通常包括(I)給予受試對(duì)象單克隆抗體，所述單克隆抗體偶聯(lián)了可檢測(cè)的標(biāo)記，可與以下抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266):由克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCMI-4243)產(chǎn)生的抗體、由克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體、或者由克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體；以及(2)檢測(cè)所述單克隆抗體在受試對(duì)象中的分布。合適的應(yīng)用包括直腸、肝、宮頸、肺、胰腺或前列腺癌的診斷。另一方面中，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，所述細(xì)胞選自克隆編號(hào)4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)、克隆編號(hào)9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)、克隆編號(hào)10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)、或者克隆編號(hào)17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4245)。發(fā)明詳述
I.概論本發(fā)明涉及抗B7H6抗體的鑒定和表征，所述抗體能夠結(jié)合B7家族細(xì)胞表面蛋白的成員，特別是抗人B7H6單克隆抗體。B7H6抗體最初被認(rèn)定是NKp30的反受體，NKp30多肽是在成熟自然殺傷(NK)細(xì)胞上選擇表達(dá)的一種受體，并且作為活化性受體參與人天然細(xì)胞毒作用(參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開2009/0220502，通過引用全部并入本文)。SEQ ID NO: I提供了示意性的編碼人B7H6的核苷酸序列，SEQ ID N0:2顯示了所編碼的多肽。SEQ ID NO:2的B7H6多肽包含大約242個(gè)氨基酸殘基的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的殘基25-266)、大約18個(gè)氨基酸殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的殘基267-284)和大約158個(gè)氨基酸殘基的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:2中的殘基285-454)。B7H6還含有大約117個(gè)氨基酸殘基的IgV結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的殘基25-141)和大約97個(gè)氨基酸殘基的IgC結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的殘基142-238)。B7H6的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中還有幾個(gè)可能的信號(hào)傳導(dǎo)基序，包括IHM基序(SaYtpL，SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基293-298) ;SH2結(jié)合基序(YqlQ，SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基229-332)和SH3結(jié)合基序(PdaPiIPvsP, SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基418-427)。因制得抗人B7H6蛋白的小鼠單克隆抗體并鑒定出這些抗體的特性而得到本發(fā)明。由雜交瘤制備了 IgGl同種型的五種抗人B7H6的小鼠單克隆抗體。所述抗體被指定為4E5. 5、5E1. 4、9G9. 2、10E2. 9和17B1. 3。競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法揭示特定抗體識(shí)別的是不同表位。NKp30Fc結(jié)合被抑制和D0MSP30的活化表明抗B7H6mAbs中的兩種，即17B1. 3和4E5. 5能夠部分地阻斷NKp30:B7H6相互作用。這些研究將結(jié)構(gòu)和功能關(guān)聯(lián)起來，在實(shí)施例中有描述。各種單克隆抗體經(jīng)證實(shí)可以作為生化和診斷檢測(cè)中的試劑，并且具有治療價(jià)值。因此，本發(fā)明包括那些能夠以等同或類似mAbs 4E5. 5、5E1.4、9G9. 2、10E2. 9和/或17B1. 3的特異性和特性與人B7H6細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的單克隆抗體。如文中所述，制備了小鼠抗人B7H6單克隆抗體并在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中證明它們結(jié)合不同的表位。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了能夠與這些抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6的抗體(例如和選自mAbs 4E5. 5、9G9. 2U0E2. 9 和17B1. 3的抗體結(jié)合相同B7H6表位的抗體)。此外，一些抗體被顯示會(huì)影響B(tài)7H6_NKp30相互作用。相應(yīng)地，一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗人B7H6單克隆抗體能夠抑制B7H6介導(dǎo)的NKp30的活化。
本發(fā)明還提供了由非人抗B7H6抗體衍生的人源化抗體(例如由小鼠抗體衍生的人源化抗體)、中和抗體、人單克隆抗體以及它們的抗原結(jié)合片段。示范性的抗體片段包括F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小識(shí)別單位。中和抗體結(jié)合B7H6從而使得它與NKp30的相互作用被抑制或阻斷。包含在發(fā)明范圍內(nèi)的是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，所述單克隆抗體可用于在例如急性骨髓細(xì)胞(BMC)同種異體移植排斥中抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中抗體被以有效量給予從而阻斷NK細(xì)胞活性和治療BMC同種異體移植排斥。本發(fā)明的抗B7H6抗體還可用于將細(xì)胞毒性劑尋靶到B7H6表達(dá)細(xì)胞，特別是B7H6表達(dá)癌癥細(xì)胞。這種抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物在給予受試對(duì)象(比如帶有B7H6表達(dá)癌癥的受試對(duì)象)時(shí)，對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生臨床上的有益效果?？贵w通常是單獨(dú)給予的，但也可以與其他治療劑聯(lián)用。在典型實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)，這樣得到的抗體-藥物偶聯(lián)物在被細(xì)胞攝取或內(nèi)在化時(shí)對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞(例如B7H6表達(dá)癌癥細(xì)胞)發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)或抑制細(xì)胞效應(yīng)。 因此，本發(fā)明某些方面包括抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物。其中抗體部分以本文描述的相同或類似特異性和特性結(jié)合人B7H6細(xì)胞表面蛋白，藥物偶聯(lián)物部分作為治療劑。抗人B7H6抗體-藥物偶聯(lián)物在給予帶有B7H6表達(dá)癌癥的受試對(duì)象時(shí)，對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞發(fā)揮臨床上的有益效果。一般來說，藥物偶聯(lián)物部分是細(xì)胞毒性劑，能夠?qū)7H6表達(dá)細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)或抑制細(xì)胞效應(yīng)。對(duì)于這些抗體-藥物偶聯(lián)物，抗體部分識(shí)別B7H6上的一定表位。某些變化形式中，抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物影響B(tài)7H6-NKp30相互作用。例如，一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物抑制NKp30的活化。其他實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體包含具有效應(yīng)子功能的Fe區(qū)用于誘導(dǎo)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(⑶C)。本發(fā)明包括抗人B7H6單克隆抗體，其包含具有ADCC活性的Fe區(qū)可用于誘導(dǎo)ADCC。對(duì)于該用途，通常在有表達(dá)Fe受體(具有溶細(xì)胞活性)的溶細(xì)胞性免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下，將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量含有Fe區(qū)的抗人B7H6單克隆抗體接觸。表達(dá)溶細(xì)胞性Fe受體(例如Fe y RIIIa或⑶16)的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括例如NK細(xì)胞以及某些⑶8+T細(xì)胞。對(duì)于抗人B7H6單克隆抗體被用于誘導(dǎo)CDC的實(shí)施方案，其中所述單克隆抗體包含具有CDC活性的Fe區(qū)，通常在有補(bǔ)體的情況下，將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量含有Fe區(qū)的抗人B7H6單克隆抗體接觸?？梢岳帽疚囊蟮目贵w和方法進(jìn)行靶向殺傷的B7H6表達(dá)細(xì)胞包括例如癌癥細(xì)胞，僅舉數(shù)例，比如例如直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、紅白血病細(xì)胞、伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞和慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞。本發(fā)明的這些和其他方面在參考以下詳細(xì)描述的情況下是顯而易見的。此外，下文確認(rèn)了各種參考文獻(xiàn)，通過引用全文并入。II.定義除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語具有與所述方法和組合物相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的意義。本文中，以下術(shù)語和短語具有認(rèn)定給它們的含義除非另有明確說明。
術(shù)語“一個(gè)/種(“a” “an”和“the”)”本文中包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有
明確說明?！岸嚯摹笔峭ㄟ^肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，無論是天然還是合成生產(chǎn)的。少于大約10個(gè)氨基酸殘基的多肽通常被稱為“肽”?！暗鞍踪|(zhì)”是包含一或多個(gè)多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)還可能包含非肽成分，比如碳水化合物基團(tuán)。產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞可以給蛋白添加碳水化合物和其他非肽取代成分，并且根據(jù)細(xì)胞類型而不同。本文中 按照蛋白質(zhì)的氨基酸骨架結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白進(jìn)行定義；諸如碳水化合物的取代成分一般不作限定，但可能仍然存在?！胺蛛x的多肽”是基本不含污染細(xì)胞成分的多肽，比如與自然界中多肽關(guān)聯(lián)的碳水化合物、脂類或其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的雜質(zhì)。一般來說，分離的多肽制品含有高度純化形式的多肽，即純度至少大約80%、純度至少大約90%、純度至少大約95%、純度大于95%，比如純度96%,97%或98%或以上，或者純度大于99%。顯示特定蛋白制品含有分離的多肽的一個(gè)途徑是通過蛋白制品在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色后出現(xiàn)單一條帶。但是術(shù)語“分離的”不排除相同多肽存在的替代物理形式，比如二聚體或備選地糖基化形式或衍生形式。術(shù)語“氨基端”和“羧基端”本文中指示多肽內(nèi)的位置。上下文允許的情況下，這些術(shù)語是參照多肽中的特定序列或部分來指示接近性或相對(duì)位置的。例如，多肽內(nèi)位于參照序列羧基端的特定序列是位于靠近參照序列的羧基端，但不一定是整個(gè)多肽的羧基端。術(shù)語“表達(dá)”是指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，就結(jié)構(gòu)基因而言，表達(dá)涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為mRNA和mRNA翻譯為一或多個(gè)多肽。本文中，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、共刺激分子(co-stimulatory molecules)、造血因子等，以及這些分子的合成類似物。術(shù)語“抗體”本文中是指免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白家族的多肽或其片段，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)與特異抗原(例如B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域)免疫特異性結(jié)合?！翱躬?dú)特型抗體”是與免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)合的抗體。在本文語境中，抗獨(dú)特型抗體與抗人B7H6單克隆抗體的可變區(qū)結(jié)合，因此抗獨(dú)特型抗體模擬B7H6的表位。“抗體片段”是抗體中諸如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab等的部分。無論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段結(jié)合的抗原與完整抗體識(shí)別的抗原相同。例如，抗B7H6單克隆抗體片段與B7H6的表位結(jié)合。術(shù)語“抗體”還涵蓋基因改造的完整抗體或片段，比如例如嵌合抗體、人源化抗體、由重鏈和輕鏈的可變區(qū)構(gòu)成的“Fv”片段、由輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的多肽、其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過連接肽相連的重組單鏈抗體(“scFv蛋白”)、由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基構(gòu)成的最小識(shí)別單位等，以及合成的抗原結(jié)合肽和多肽?！扒逗峡贵w”是含有來源于嚙齒動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域和補(bǔ)體決定區(qū)，而抗體分子的其他部分來源于人抗體的重組蛋白?！叭嗽椿贵w”是這樣的重組蛋白，所述重組蛋白中非人(例如小鼠)單克隆抗體的補(bǔ)體決定區(qū)是從非人免疫球蛋白的重和輕可變鏈被轉(zhuǎn)移到人可變區(qū)內(nèi)的。由非人(例如小鼠)抗體構(gòu)建用于人類治療用途的人源化抗體，比如能夠結(jié)合或中和人蛋白的那些人源化抗體，是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。術(shù)語“Fe片段”、“Fe區(qū)”或“Fe結(jié)構(gòu)域”本文中是同義詞，是指抗體中負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞上的抗體受體和補(bǔ)體的Clq成分的部分。Fe表示“結(jié)晶片段”，是抗體中很容易形成蛋白晶體的片段。最初通過蛋白水解消化描述的不同蛋白片段可以限定免疫球蛋白的整體的大概結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)中原來定義Fe片段是由二硫鍵連接的重鏈鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。但是近來該術(shù)語被應(yīng)用于由Ch3、Ch2和至少部分鉸鏈構(gòu)成的單鏈，其中所述部分鉸鏈足夠與第二個(gè)這樣的鏈形成二硫鍵連接的二聚體。有關(guān)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能的綜述，參見 Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc.，1987)，pp. 49-140;和Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994。本文中，術(shù)語Fe包括天然存在序列的變體。術(shù)語“單鏈Fe”、“單鏈Fe結(jié)構(gòu)域”和“scFc”本文中是同義詞，是指包含兩個(gè)通過柔性連接分子連接起來的Fe結(jié)構(gòu)域單體的多肽融合,其中兩個(gè)Fe單體能夠二聚化形成可以結(jié)合Fe受體的功能性二聚體Fe結(jié)構(gòu)域。單鏈Fe多肽在名為“Single Chain Fe, Methodsof Making, and Methods of Treatment” 的國(guó)際 PCT 專利申請(qǐng)公開號(hào) WO 08/0131242 中有更詳細(xì)的描述，其公開內(nèi)容通過引用全部并入本文。 術(shù)語“具有ADCC活性的Fe區(qū)”本文中是指Fe結(jié)構(gòu)域，所述Fe結(jié)構(gòu)域能夠通過結(jié)合表達(dá)Fe受體的溶細(xì)胞性免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如NK細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞)上的溶細(xì)胞性Fe受體(例如Fe Y RIII a )而介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。術(shù)語“補(bǔ)體”是指正常血清中這樣一些成分的總稱，所述成分與結(jié)合在抗原上的抗體一起展現(xiàn)出溶解細(xì)胞的能力。補(bǔ)體由一組協(xié)調(diào)作用并按順序發(fā)揮效應(yīng)的血清蛋白構(gòu)成。術(shù)語“經(jīng)典補(bǔ)體途徑”和“經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)”本文中是同義詞，是指特定的補(bǔ)體活化途徑。經(jīng)典途徑的開始需要抗原-抗體復(fù)合體，途徑包括被命名為Cl到C9的9個(gè)主要蛋白成分的順序活化。活化過程的幾個(gè)步驟中，產(chǎn)物是催化后續(xù)步驟的酶。這種級(jí)聯(lián)方式使得通過較小的初始信號(hào)即可放大和活化大量補(bǔ)體。術(shù)語“具有⑶C活性的Fe區(qū)”本文中是指能夠通過結(jié)合Clq補(bǔ)體成分蛋白和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的活化來介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)的Fe結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“試劑”本文中意味著元素、化合物或其他分子實(shí)體，包括例如藥學(xué)、治療或藥理化合物。試劑可以是天然或合成的或者它們的組合?！爸委焺笔菃为?dú)或者與另一種試劑(例如前藥轉(zhuǎn)換酶與前藥組合)聯(lián)用時(shí)對(duì)細(xì)胞或組織(例如對(duì)表達(dá)B7H6的細(xì)胞或組織，比如B7H6表達(dá)癌細(xì)胞)發(fā)揮(例如有益的)治療效果的試劑。本發(fā)明的某些方面中，“治療齊U”是與抗體偶聯(lián)形成有治療用途的偶聯(lián)物的試劑。治療劑的例子包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化合物、光敏的試劑或染料，以及放射性同位素。一些變化形式中，與抗體偶聯(lián)的治療劑是發(fā)揮細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性效應(yīng)的試劑。在談及試劑對(duì)細(xì)胞的影響時(shí)，“細(xì)胞毒效應(yīng)”表示對(duì)細(xì)胞的殺傷?！耙种萍?xì)胞效應(yīng)”意味著對(duì)細(xì)胞增殖的抑制?！凹?xì)胞毒性劑”意味著試劑對(duì)細(xì)胞有細(xì)胞毒效應(yīng)或抑制細(xì)胞效應(yīng)，從而將細(xì)胞群中的細(xì)胞分別消除或抑制其生長(zhǎng)?！翱蓹z測(cè)標(biāo)記”是可以與抗體部分偶聯(lián)形成診斷使用的分子的分子或原子?？蓹z測(cè)標(biāo)記的例子包括螯合劑、光敏劑、放射性同位素、熒光劑、順磁離子或其他標(biāo)記物部分。術(shù)語“親和標(biāo)簽”本文中是指多肽區(qū)段，所述多肽區(qū)段可以附著到第二多肽上協(xié)助第二多肽的純化或檢測(cè)，或者給第二多肽提供附著到底物上的位點(diǎn)。理論上，有抗體或其他特異結(jié)合劑可供使用的任何肽或蛋白都可以作為親和標(biāo)簽。親和標(biāo)簽包括多組氨酸串、蛋白 A (Nilsson et al. , EMBO J. 4:1075, 1985;Nilsson et al. , MethodsEnzymoI. 198:3，1991)、谷胱甘妝 S 轉(zhuǎn)移酶(Smith and Johnson, Gene 67:31，1988)、Glu-Glu 親和標(biāo)簽(Grussenmeyer et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952，1985)、P 物質(zhì)(substance P)、FLAG 妝(Hopp et al. , Biotechnology 6:1204，1988)、鏈霉親和素結(jié)合肽或其他抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一般可參見Ford et al. , Protein Expression andPurification2:95, 1991。編碼親和標(biāo)簽的DNA分子可以從商家購買(例如PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ)。“裸抗體”與抗體片段不同，是完整的未偶聯(lián)治療劑的抗體。裸抗體包括多克隆和單克隆抗體，以及某些重組抗體，比如嵌合和人源化抗體。術(shù)語“單克隆抗體”是指來源于單一細(xì)胞克隆(包括真核或原核細(xì)胞克隆或者噬菌體克隆)的抗體，而不是說它的制備方法。因此，術(shù)語“單克隆抗體”本文中不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。 “免疫偶聯(lián)物”是抗體與治療劑或可檢測(cè)標(biāo)記的偶聯(lián)物。術(shù)語“表位”是指能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異結(jié)合的任何蛋白決定簇。表位決定簇通常由具有化學(xué)活性的表面分子群，比如氨基酸或糖側(cè)鏈構(gòu)成，并且一般有特異的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特性。更具體地說，術(shù)語“B7H6表位”本文中是指B7H6多肽中在動(dòng)物里具有抗原或免疫原活性的部分，所述動(dòng)物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是小鼠或人。具有免疫原活性的表位是B7H6多肽中在動(dòng)物里引發(fā)抗體反應(yīng)的部分。具有抗原活性的表位是B7H6多肽中抗體可以特異免疫反應(yīng)性地結(jié)合的部分，所述結(jié)合可以通過任何本領(lǐng)域已知方法，例如免疫檢測(cè)來確定?？乖砦徊恍枰欢ㄊ敲庖咴缘摹！胺沁B續(xù)表位”是由B7H6蛋白一級(jí)序列中至少兩個(gè)分開的區(qū)域形成的構(gòu)象表位。構(gòu)象表位在有變性溶劑的情況下，失去特異結(jié)合的能力(例如在Western印跡分析中)。“NK細(xì)胞活性”本文中是指NK細(xì)胞溶細(xì)胞活性。有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的檢驗(yàn)方法可以檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)這種活性，包括但不限于本文提供的實(shí)施例中描述的檢驗(yàn)方法。本文中，短語“B7H6和NKp30的相互作用”是指功能性B7H6受體與NK細(xì)胞上的NKp30之間直接的物理相互作用(例如結(jié)合)和/或間接的相互作用，造成B7H6受體和/或NKp30得到刺激以及相關(guān)聯(lián)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。本文中，術(shù)語“封閉抗體”是指干擾(即抑制)B7H6和NKp30的相互作用的抗體，和/或通過例如溶細(xì)胞活性可以測(cè)量到的干擾B7H6激發(fā)NK細(xì)胞活性的能力的抗體。抑制不必是完全徹底的，可以是“部分”的，即活性相對(duì)對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生下降或減少。短語“以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征的疾病或紊亂”本文中，是指(至少部分)涉及表達(dá)B7H6的病理細(xì)胞的任何疾病或紊亂。這類病理細(xì)胞包括，例如某些腫瘤細(xì)胞。相應(yīng)地，典型的以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征的疾病或紊亂是某些癌癥。正如本文將進(jìn)一步描述的，這類疾病或紊亂特別適合靶向B7H6表達(dá)細(xì)胞的某些治療方法。術(shù)語“NKp30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂”和“與NKp30表達(dá)細(xì)胞活性提高相關(guān)的疾病或紊亂”在本文中作為同義詞使用，是指其病理至少部分地由NKp30表達(dá)細(xì)胞的溶細(xì)胞活性介導(dǎo)的任何疾病或紊亂。某些變化形式中，NKp30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂是“NK細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂”，其病理至少部分地由NK細(xì)胞溶細(xì)胞活性介導(dǎo)。這類疾病或紊亂的一個(gè)例子是骨髓細(xì)胞(BMC)同種異體移植物急性排斥。正如本文將進(jìn)一步描述的，這類疾病或紊亂特別適合抑制NK細(xì)胞活性的某些治療方法。術(shù)語“有效量”在如本文所述通過給予受試對(duì)象封閉抗B7H6抗體從而對(duì)NKp30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂進(jìn)行治療的語境中，或者在如本文所述通過給予受試對(duì)象抗B7H6抗體或抗體-藥物偶聯(lián)物從而對(duì)以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征的疾病或紊亂進(jìn)行治療的語境中，是指所述分子的量足夠抑制疾病或紊亂在受試對(duì)象中的發(fā)生或者足夠緩解一或多個(gè)臨床或診斷癥狀。按照本發(fā)明的方法在“有效治療方案”中用有效量的抗原進(jìn)行給藥。術(shù)語“有效治療方案”是指用于給藥的試劑的量和劑量頻率的組合，所述組合足以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病或紊亂的治療或預(yù)防。由于常規(guī)分析方法的不精確，可以理解聚合物的分子量和長(zhǎng)度都是大概值。當(dāng)這類值被表達(dá)為“大約” X或“大概” X，所述X值應(yīng)理解為精確至土 10%。III. B7H6蛋白的杭體
本發(fā)明一個(gè)方面提供了特異結(jié)合人B7H6表位(例如，結(jié)合SEQ ID N0:2中氨基酸殘基25-266給出的氨基酸序列中的某個(gè)多肽區(qū)段)的抗人B7H6單克隆抗體。某些變化形式中，提供的抗人B7H6單克隆抗體能夠抑制B7H6-NKp30相互作用。抑制不必是對(duì)B7H6-NKp30相互作用的完全阻斷，而可以是活性相對(duì)對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)下降或減少。某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗人B7H6抗體能夠與選自4E5. 5(保藏號(hào)CNCM
1-4242)、9G9. 2 (保藏號(hào) CNCM 1-4243)、10E2. 9 (保藏號(hào) CNCM 1-4244)或 17B1.3(保藏號(hào)CNCM 1-4245)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6。這四種雜交瘤于2009年11月18 日以 Institut National De La Santeet De La Recherche Medicale (INSERM)的名義保藏在 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, InstitutPasteur;Paris, France)。鑒定到五種小鼠抗人B7H6單克隆抗體并進(jìn)行了表征，本文中有描述。通過本文公開的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析法顯示，對(duì)這些抗體的表征表明這些單克隆抗體中的某些識(shí)別的是B7H6蛋白上的不同表位。對(duì)抗體的表征還顯示其中的兩種抗體至少部分地阻斷B7H6-NKp30相
互作用。表位歸類(Epitope binning)可用于鑒定落在本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體。表位歸類是指利用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)鑒定能夠或者不能同時(shí)結(jié)合B7H6蛋白的抗體對(duì)，從而鑒定出與蛋白上相同或重疊的表位相結(jié)合的抗體對(duì)。表位歸類試驗(yàn)提供了證據(jù)表明，存在著抗原性有差異的表位。還需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)來將所述表位鑒定為或“作圖”至B7H6蛋白分子中的特定氨基酸序列或位置?？梢栽u(píng)估任何成對(duì)抗體或片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的情況。例如，使用合適的檢測(cè)劑可以將來自任何來源的抗體或結(jié)合片段的結(jié)合特異性與本文公開的單克隆抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行比較?？梢杂谩胺蛛x的抗體”或細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行表位歸類。通常，對(duì)第一輪克隆上清進(jìn)行歸類來指導(dǎo)對(duì)有待進(jìn)一步開發(fā)的克隆的選擇。被比較的抗體應(yīng)當(dāng)是基本同質(zhì)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)于“雙特異性”或“雙功能”抗體的情況，兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合特異性需要獨(dú)立地評(píng)價(jià)或歸類。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域任何已知方法檢驗(yàn)其特異結(jié)合。許多不同的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析形式可以用于表位歸類。可以使用的免疫分析法包括，但不限于利用諸如Western印跡、放射免疫分析、ELISA、“夾心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀試驗(yàn)、凝膠擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)、免疫放射分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析和補(bǔ)體結(jié)合分析的技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)檢驗(yàn)系統(tǒng)。這類檢驗(yàn)方法是本領(lǐng)域常規(guī)的公知方法(參見例如Ausubel et al.，eds, 1994CurrentProtocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & sons, Inc. , New York)。此夕卜，可以進(jìn)行諸如 Antibodies, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, EdHarlow and David Lane, 1988中描述的那些常規(guī)交叉阻斷分析方法。B丨八CORiW": (GEHealthcare, Piscaataway, NJ)只是常規(guī)用于單克隆抗體表位歸類分組的表面等離子共振分析形式中的一種。其他參考文獻(xiàn)，例如The Epitope Mapping Protocols, Methods inMolecular Biology, Vol. 66, Glenn Morris ed. Humana Press, 1996 描述了可以用于結(jié)合抗體的替代方法，所述方法預(yù)期可以提供關(guān)于抗體與B7H6配體結(jié)合特異性的可比信息。在使用BIAC0RE 系統(tǒng)時(shí)，用可溶性、天然或重組抗原進(jìn)行表位歸類試驗(yàn)。表位歸類研究可以在BIAC0RE1000 系統(tǒng)(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上進(jìn)行。BIAlogUC v. I. 2軟件可用于設(shè)計(jì)操作方法。例如，為了 bin培育的抗B7H6的小鼠單克隆抗體，可以將多克 隆山羊抗小鼠 IgG Fe 抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)共價(jià)固定到mAC’ORI汍CM5傳感芯片上，用于將測(cè)試系列中的第一單克隆抗體結(jié)合(捕獲)到芯片上。然后使用多克隆IgG Fe片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)封閉芯片上未被占據(jù)的Fe結(jié)合位點(diǎn)。隨后，注射B7H6蛋白并允許其與捕獲的第一單克隆抗體特異結(jié)合。BIACORL A儀器測(cè)量結(jié)合到傳感芯片上的蛋白質(zhì)量，可以驗(yàn)證每輪中第一抗體和B7H6抗原都結(jié)合了。第一抗體和抗原都結(jié)合到芯片后，注射可溶性的第二抗體，允許其結(jié)合到預(yù)先結(jié)合好的抗原上。如果第二單克隆抗體能夠與第一單克隆抗體同時(shí)結(jié)合B7H6抗原，BIACORE 可以檢測(cè)到它的結(jié)合。而如果第二單克隆抗體不能與第一單克隆抗體一起結(jié)合B7H6抗原，則不會(huì)檢測(cè)到另外的結(jié)合。測(cè)試每個(gè)單克隆抗體抗自身的情況作為陰性對(duì)照，從而確立背景(無結(jié)合)信號(hào)。還可以利用無標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性ELISA形式(LFC-ELISA)對(duì)抗體歸類。這種方法是 Nagata et al. , J. Immunol. Methods 292:141-155，2004 中描述的，使用的是生物素化B7H6。在對(duì)培育的抗B7H6的小鼠單克隆抗體進(jìn)行歸類的例子中，用稀釋在ELISAB (PBS, 0. l%Tween 20，1%BSA)中的 I y g/mL 的山羊抗小鼠 IgG Fe-y 特異抗體(JacksonImmunoResearch)以100 y L/孔包被微量滴定板。該包被抗體在室溫下結(jié)合3小時(shí)后,將每種含有mAb的條件培養(yǎng)基在ELISAB中稀釋得到大概0. 5 u g/mL的mAb濃度，并允許其與包被了山羊抗小鼠IgG的培養(yǎng)板于4° C過夜結(jié)合(mAb#l)。與此平行，第二組條件培養(yǎng)基(mAb#2)在聚苯乙烯試管中在ELISA B里稀釋至大概0. 5 y g / mL mAb,與50ng/mL生物素化的B7H6抗原混合，4° C過夜溫育。mAb#l與包被抗體溫育后，培養(yǎng)板用無關(guān)抗體進(jìn)行封閉直至培養(yǎng)板上未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)飽和。向培養(yǎng)板中加入mAb#2-生物素-B7H6混合物，允許進(jìn)行結(jié)合。作為分析中的(非競(jìng)爭(zhēng))對(duì)照，向含有固定化mAb#l的孔中直接(未經(jīng)與mAb#2的預(yù)溫育)加入50ng/mL生物素化的B7H6。在與生物素化B7H6_mAb#2復(fù)合體溫育后，以0. 5 ii g/mL向培養(yǎng)板中加入鏈霉親和素-HRP (Pierce，Rockford, 111.)。培養(yǎng)板用TMB底物(BioFX Laboratories, Owings Mills, Md.)顯影，各個(gè)孔在450nm處的吸光度用培養(yǎng)板閱讀儀(Molecular Devices SPECTRAMAX 340, Sunnyvale, Calif.)測(cè)量。如果 mAb#l 和mAb#2結(jié)合的表位不同，生物素-B7H6-mAb#2復(fù)合體會(huì)結(jié)合到培養(yǎng)板上，導(dǎo)致高的吸光度讀數(shù)。如果mAb#l和mAb#2結(jié)合的表位相同，生物素_B7H6_MAb#2復(fù)合體不會(huì)與培養(yǎng)板結(jié)合，因此得到低的吸光度讀數(shù)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗人B7H6單克隆抗體能夠抑制B7H6與人NKp30的相互作用；所述抗體可用于例如抑制與B7H6和NKp30的相互作用有關(guān)的細(xì)胞或其他生理事件(包括例如B7H6-和/或NKp30介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo))和相關(guān)的效應(yīng)子功能(例如NKp30介導(dǎo)的溶細(xì)胞活性)。針對(duì)B7H6的抗體可以利用例如B7H6表達(dá)載體的產(chǎn)物或者分離自天然來源的B7H6作為抗原來獲得。特別有用的抗人B7H6單克隆抗體與B7H6特異結(jié)合?？贵w如果表現(xiàn)出以下兩個(gè)特性中的至少一個(gè)，即可認(rèn)為是特異結(jié)合(I)抗體以閾值水平的結(jié)合活性與B7H6結(jié)合，和(2)抗體和B7H6的相關(guān)多肽不發(fā)生顯著交叉反應(yīng)。對(duì)于第一個(gè)特點(diǎn)，抗體如果與B7H6多肽、肽或表位以IO6M.1或以上的結(jié)合親和 力(Ka),優(yōu)選IO7IT1或以上,更優(yōu)選IO8IT1或以上,最優(yōu)選IO9IT1或以上的結(jié)合親和力結(jié)合，它們是特異結(jié)合的。抗體的結(jié)合親和力可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過例如Scatchardanalysis (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660，1949)很容易地確定。對(duì)于第二個(gè)特點(diǎn)，如果例如利用標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡分析，抗體可以檢測(cè)到B7H6，但不能檢測(cè)到目前已知的多肽，就可以說抗體與相關(guān)多肽分子不發(fā)生顯著交叉反應(yīng)。已知的相關(guān)多肽的例子包括已知的B7家族成員?？谷薆7H6單克隆抗體可以利用帶有B7H6抗原表位的肽和多肽來生產(chǎn)。帶有抗原表位的肽和多肽通常含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中包含的至少9個(gè)，或者15到大約30個(gè)氨基酸的序列。但是，包含更大一部分發(fā)明所述氨基酸序列的肽或多肽也可以用于誘導(dǎo)能與B7H6結(jié)合的抗體，所述肽或多肽含有30到50個(gè)氨基酸，或者是最多并且包括B7H6多肽的整個(gè)氨基酸序列的任何長(zhǎng)度。希望選擇的所述帶有表位的肽的氨基酸序列能夠?qū)崿F(xiàn)在水溶劑中的較大溶解度(即序列包括相對(duì)親水的殘基，而一般避免疏水殘基)。此外，含有脯氨酸殘基的氨基酸序列也是有利抗體制備的。B7H6中的潛在抗原位點(diǎn)可以利用比如LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI)中 PROTEAN 程序(3. 14 版本)執(zhí)行的 Jameson-Wolf 方法(Jameson andWolf (CABI0S4:181, 1988)進(jìn)行鑒定。該分析中可以使用缺省參數(shù)。Jameson-Wolf方法通過聯(lián)合6個(gè)主要的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)子程序來預(yù)測(cè)潛在的抗原決定簇。例如，首先可以利用Hopp-Woods方法(參見Hopp et al.，Proc. Nat’I Acad. Sci.USA 78:3824, 1981)鑒定代表局部親水性最高的區(qū)域的氨基酸序列(參數(shù)7個(gè)殘基的平均值)。第二步，可以利用 Emini 的方法(參見 Emini et al. , J. Virology 55:836，1985)計(jì)算表面概率(參數(shù)表面決策閾值(0. 6)=1)。第三,可以利用Karplus-Schultz方法(Karplusand Schultz, Naturwissenschaften 72:212, 1985)預(yù)測(cè)主鏈柔性(參數(shù):柔性閾值(0. 2) =1)。在分析的第四和第五步,利用 Chou-Fasman (參見Chou, “Prediction of ProteinStructural Classes from Amino Acid Composition, ” in Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation 549-586(Fasman, ed. , PlenumPress 1990))和 Garnier-Robson(參見 Garnier et al. , J. Mol. Biol. 120:97, 1978)的方法對(duì)數(shù)據(jù)實(shí)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(Chou-Fasman參數(shù)構(gòu)象表格=64個(gè)蛋白質(zhì)；a區(qū)閾值=103; ^區(qū)閾值=105;Garnier-Robson參數(shù)a和0決策常數(shù)=0)。在第6個(gè)子程序中，結(jié)合柔性參數(shù)和親水性/溶劑可及性因子來確定表面外形數(shù)值，指定為“抗原性指數(shù)”。最后，對(duì)抗原性指數(shù)運(yùn)用峰加寬函數(shù)，所述函數(shù)通過增加對(duì)應(yīng)峰值的20、40、60或80%使主要表面峰加寬從而計(jì)算表面區(qū)域相對(duì)內(nèi)部區(qū)域的移動(dòng)所產(chǎn)生的附加自由能。但這種計(jì)算通常不會(huì)應(yīng)用在任何位于螺旋區(qū)內(nèi)的主要峰，因?yàn)槁菪齾^(qū)傾向于有較低的柔性。產(chǎn)生單克隆抗體的方法是公知的。例如針對(duì)特定抗原的嚙齒單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得(參見例如Kohler et al. , Nature256:495, 1975; Coliganet al. (eds. ), Current Protocols in Immunology, Vol. 12. 5. 1-2. 6. 7 (John Wiley &Sons 1991) [ “Coligan，，]; Picksley et al. , “Production of monoclonal antibodiesagainst proteins expressed in E.coli，，，in DNA Cloning2:Expression Systems, 2ndEdition 93 (Glover et al. , eds. , Oxford University Press 1995)。某些變化形式中，獲取單克隆抗體是通過用包含B7H6基因產(chǎn)物(例如包含SEQ ID NO: 2中殘基25-266或者由其組成的多肽)的組合物注射小鼠、取血清樣品驗(yàn)證有抗體產(chǎn)生、移取脾獲得B淋巴細(xì)胞、將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤、克隆雜交瘤、挑選能夠產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體 的陽性克隆、培養(yǎng)產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體的克隆并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。抗人B7H6單克隆抗體也可以是人單克隆抗體，或者來源于人單克隆抗體的抗體?？梢詮霓D(zhuǎn)基因小鼠獲得人單克隆抗體，所述小鼠經(jīng)過基因改造能夠在應(yīng)答抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生特異人抗體。在該項(xiàng)技術(shù)中，人重鏈和輕鏈基因座中的元件被導(dǎo)入由胚胎干細(xì)胞系衍生的小鼠株中，后者含有被定向破壞了的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座。轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成針對(duì)人抗原的特異性人抗體，并且小鼠可以用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。例如Greenet al. , Nature Genet. 7:13, 1994;Lonberg et al. , Nature 368:856，1994;和 Taylor etal.，Int. Immun. 6:579, 1994中描述了由轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法。產(chǎn)生或者挑選單克隆抗體的替代技術(shù)包括，例如體外將淋巴細(xì)胞與B7H6蛋白或肽進(jìn)行接觸和從噬菌體或類似載體中的抗體展示文庫中挑選抗體(例如，通過利用固定化或標(biāo)記的B7H6蛋白或肽)。制備和篩選這類抗體展示文庫的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如美國(guó)專利 5，580，717,5, 885，793,5, 969，108 和 6，040，136)。單克隆抗體可以通過多種成熟技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中得以分離和純化。這類分離技術(shù)包括例如，用蛋白A Sepharose進(jìn)行的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析(參見例如 Coligan at pages 2. 7. 1-2. 7. 12 和 pages 2. 9. 1-2. 9. 3;Baineset al. , “Purification of Immunoglobulin G(IgG),，，in Methods in MolecularBiology (Vol. 10)79-104(The Humana Press,Inc. 1992))。單克隆抗體的氨基酸序列通過采用重組DNA技術(shù)可以有所不同。因此，可以重新設(shè)計(jì)抗體以得到所需的特點(diǎn)。經(jīng)過改造的抗體相對(duì)其未改造形式可以帶來例如改善的穩(wěn)定性和/或治療效力?？赡艿淖兓泻芏?，從只改變一個(gè)或少量幾個(gè)氨基酸到例如可變區(qū)或恒定區(qū)的完全重新設(shè)計(jì)。通常為了提高或改變諸如補(bǔ)體結(jié)合、與膜的相互作用以及其他效應(yīng)子功能的特性，要對(duì)恒定區(qū)進(jìn)行改變。一般來說，要在可變區(qū)內(nèi)進(jìn)行改變以便提高抗原結(jié)合特性、提高可變區(qū)穩(wěn)定性或減少免疫原性的危險(xiǎn)。也可以采用噬菌體展示技術(shù)。參見例如 Huse et al. , Science 246:1275-1281，1989; Ladner et al.,美國(guó)專利 5，571，698。在一些實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體是包含完整(整個(gè))抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段。這類抗體片段可以通過例如對(duì)抗體進(jìn)行蛋白水解獲得?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法用胰蛋白酶或木瓜酶對(duì)完整抗體消化來獲得抗體片段。作為一個(gè)實(shí)例，抗體片段的產(chǎn)生可以用胰蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行酶法切割從而得到表示為？(&13’)2的55片段。該片段可以進(jìn)一步用巰基還原劑切割產(chǎn)生3. 5S Fab’單價(jià)片段。任選地，進(jìn)行切割反應(yīng)時(shí)可以使用硫氫基(切割二硫鍵產(chǎn)生的)的封閉基團(tuán)。作為替代方法，利用胰蛋白酶進(jìn)行的酶法切割可以直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和F。片段。這些方法在例如授予Goldenberg的美國(guó)專利 4，331，647;Nisonoff et al. , Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960;Porter, Biochem.J. 73:119，1959;Edelman et al. , in Methods in Enzymology(Vol. I)422(Academic Press1967);以及 Coligan(2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 頁)中有描述。還可以使用其他抗體切割方法，比如將重鏈分開形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段；片段的進(jìn)一步切割；或者其他酶學(xué)、化學(xué)或者基因技術(shù)，只要片段能夠與完整抗體所識(shí)別的抗原
彡口口 例如，F(xiàn)v片段包含VdP八鏈的關(guān)聯(lián)。這種關(guān)聯(lián)可以是非共價(jià)的，正如Inbar et al. ,Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 69:2659，1972描述的。或者，可變鏈可以通過分子內(nèi)二硫鍵或者化學(xué)物質(zhì)(比如戍二醒)的交聯(lián)連接在一起(參見例如Sandhu, Crit. Rev.Biotech.12:437， 1992)。Fv片段可能包含通過連接肽連接的Vh和\鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(scFv)的制備是通過構(gòu)建結(jié)構(gòu)基因，所述結(jié)構(gòu)基因包含通過寡核苷酸連接在一起的編碼Vh和\結(jié)構(gòu)域的DNA序列。將結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體，后者隨后被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，比如大腸桿菌。重組宿主細(xì)胞合成單個(gè)多肽鏈，其帶有銜接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的連接肽。例如Whitlowet al. , Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97，1991 描述過制備 scFvs的方法(還可以參見Bird et al. , Science 242:423，1988;授予Ladner等的美國(guó)專利
4,946, 778; Pack et al. , Bio / Technology 11:1271，1993 和 Sandhu,同前)。作為一個(gè)實(shí)例，scFv可以通過篩選scFvs文庫(例如scFvs展不文庫)中與B7H6 (例如，固定化的或者帶標(biāo)記的B7H6蛋白或肽)的特異結(jié)合來獲得。另一種形式的抗體片段是代表單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的肽。⑶R肽(“最小識(shí)別單位”)可以通過構(gòu)建編碼目的抗體CDR的基因來獲得。這類基因是通過例如利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備的，從而可以由抗體產(chǎn)生細(xì)胞的RNA來合成可變區(qū)(參見例如Larrick etal. , Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991;Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,，，in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application 166 (Ritter et al. , eds. , CambridgeUniversity Pressl995);以及Ward et al. ,“Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies,，，in Monoclonal Antibodies!Principles and Applications 137 (Birch etal. , eds. , ffiley-Liss, Inc. 1995))。備選地，抗人B7H6單克隆抗體可以是來源于非人抗B7H6抗體的“人源化”單克隆抗體。人源化單克隆抗體是通過將非人(例如，小鼠)免疫球蛋白重和輕可變鏈的非人互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)移到人可變結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的。然后將非人抗體框架區(qū)內(nèi)的人抗體典型殘基取代。使用人源化單克隆抗體避免了小鼠恒定區(qū)相關(guān)的潛在問題。克隆小鼠免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般技術(shù)在例如Orlandi et al. , Proc. Nat' I Acad. Sci. USA86:3833，1989中有描述。制備人源化單克隆抗體的技術(shù)由例如Jones et al. , Nature321:522, 1986;Carter et al. , Proc. Nat1 I Acad. Sci. USA 89:4285, 1992;Sandhu, Crit.Rev. Biotech. 12: 437, 1992 ; Singer et al. , J. Immun. 150 : 2844, 1993 ; Sudhir (ed.),Antibody Engineering Protocols(Humana Press,Inc. 1995);Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,，，in Protein Engineering:Principles and Practice399-434(Cleland et al. , eds. , John Wiley & Sons, Inc. 1996);以及授予Queen等的美國(guó)專利5，693，762描述過。某些變化形式中，抗人B7H6單克隆抗體包含F(xiàn)e區(qū)，所述Fe區(qū)包含免疫球蛋白(Ig)重鏈的Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域，并且一般還含有部分Ig鉸鏈區(qū)。IgG的非常有利的屬性中的兩個(gè)是Fe引起的召集效應(yīng)子功能和較長(zhǎng)的血清半壽期。對(duì)抗體附著其上的靶細(xì)胞的殺傷能力來源于經(jīng)由Fe分別與Fe受體和補(bǔ)體蛋白Clq的結(jié)合引起的免疫效應(yīng)途徑(ADCC)和補(bǔ)體途徑(CDC)的活化。結(jié)合是由主要位于鉸鏈區(qū)下半部和CH2結(jié)構(gòu)域上半部的殘基介導(dǎo)的(參見例如 Wines et al. , J. Tmmuno1. 164:5313, 2000;ffoof and Burton, Nature Reviews4:1, 2004)。IgG表現(xiàn)出來的較長(zhǎng)血清半壽期是由Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸與新生兒Fe受體一FcRn之間的pH依賴性相互作用介導(dǎo)的(參見例如Getie and Ward, Immunology Today 18:592, 1997;Petkova et al.，Int. Immunol. 18:1759，2006)。相應(yīng)地，在包含F(xiàn)e區(qū)的抗人B7H6單克隆抗體的某些實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)具有ADCC和/或CDC活性。這類抗體對(duì)于介導(dǎo)殺傷表達(dá)B7H6的靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞尤其有用。其他實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體包含的Fe區(qū)缺少一或多種效應(yīng)子功能(例如，缺乏ADCC和/或CDC活性)。獲得缺少效應(yīng)子功能或者效應(yīng)子功能極大地降低的Fe區(qū)可以通過例如給天然Fe區(qū)序列引入一或多個(gè)氨基酸取代，從而使得Fe區(qū)與溶胞性Fe受體和/或Clq補(bǔ)體蛋白不能結(jié)合或者結(jié)合極大地降低。有多種經(jīng)過改造的缺少效應(yīng)子功能或者效應(yīng)子功能極大降低的Fe區(qū)是本領(lǐng)域已知的。特別合適的缺少效應(yīng)子功能或者效應(yīng)子功能極大降低的Fe區(qū)包括例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2009/0220502中描述的Fe區(qū)變體。某些包含F(xiàn)e區(qū)的實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)是單鏈Fc(ScFc),其包含兩個(gè)通過柔性連接分子相連的Fe結(jié)構(gòu)域單體,這樣兩個(gè)Fe單體能夠二聚化形成有功能的二聚Fe結(jié)構(gòu)域。例如，在包含scFc的抗人B7H6單克隆抗體的一些變化形式中，抗體包含與scFc部分融合的單鏈Fv(scFv)，其中所述scFv部分特異結(jié)合B7H6。單鏈Fe多肽，包括含有scFc和另一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scFv)的融合多肽在名為“Single Chain Fe, Methods ofMaking, and Methods of Treatment” 的國(guó)際 PCT 專利申請(qǐng) WO 08/0131242 中有進(jìn)一步描述，該專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用全部并入本文。此外，本發(fā)明的抗人B7H6單克隆抗體或抗體片段可以利用本領(lǐng)域和本文描述的方法進(jìn)行PEG化?？谷薆7H6單克隆抗體可以偶聯(lián)上可檢測(cè)標(biāo)記從而形成抗B7H6免疫偶聯(lián)物。合適的可檢測(cè)標(biāo)記包括例如放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記或膠態(tài)金。制成和檢測(cè)這類帶有可檢測(cè)標(biāo)記的免疫偶聯(lián)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，下文有更詳細(xì)描述?？蓹z測(cè)標(biāo)記可以是能夠通過放射自顯影檢測(cè)的放射性同位素。對(duì)于本發(fā)明的目的尤其有用的同位素是3h、125i、131i、35s和14C0抗B7H6免疫偶聯(lián)物還可以用熒光化合物標(biāo)記。通過將免疫偶聯(lián)物暴露于合適波長(zhǎng)的光并檢測(cè)產(chǎn)生的熒光可以證實(shí)熒光標(biāo)記抗體的存在。熒光標(biāo)記化合物包括異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。備選地，抗B7H6免疫偶聯(lián)物可以通過給抗體偶聯(lián)上化學(xué)發(fā)光化合物而帶上可檢測(cè)標(biāo)記。通過檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)過程中出現(xiàn)發(fā)光現(xiàn)象可以證實(shí)帶化學(xué)發(fā)光物標(biāo)簽的免疫偶聯(lián)物的存在。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子包括魯米諾、異魯米諾、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。類似地，可以利用生物發(fā)光化合物來標(biāo)記本發(fā)明的抗B7H6免疫偶聯(lián)物。生物發(fā)光是可見于生物系統(tǒng)的一類化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，其中催化蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在可以通過檢測(cè)發(fā)光現(xiàn)象來確認(rèn)?？捎糜跇?biāo)記的生物發(fā)光化合物包括蟲螢光素、蟲螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。
備選地，抗B7H6免疫偶聯(lián)物可以通過將抗人B7H6單克隆抗體連接到酶上而帶上可檢測(cè)的標(biāo)記。當(dāng)抗B7H6-酶偶聯(lián)物在有合適底物的情況下溫育時(shí)，酶部分與底物反應(yīng)產(chǎn)生可以通過例如分光光度法、熒光測(cè)定或目測(cè)手段來檢測(cè)的化學(xué)部分?？梢杂脕砜蓹z測(cè)地標(biāo)記多特異性免疫偶聯(lián)物的酶的例子包括3 -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其他可用于本發(fā)明的合適標(biāo)記。標(biāo)記物部分與抗人B7H6單克隆抗體的結(jié)合可以利用本領(lǐng)域的已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。這方面的典型方法學(xué)在Kennedyet al.，Clin. Chim. Acta 70: 1，1976 ; Schurs et al. , Clin. Chim. Acta 81: 1，1977; Shihet al. ,Intr I J. Cancer 46:1101，1990;Stein et al.，Cancer Res. 50:1330，1990;和Coligan(同前)中有描述。此外，使用偶聯(lián)有抗生物素蛋白、鏈霉親和素和生物素的抗人B7H6單克隆抗體可以進(jìn)一步提高免疫化學(xué)檢測(cè)的便利性和多能性(參見例如Wilchek etal. (eds.), ‘‘Avidin-Biotin Technology, Methods In Enzymology (Vol. 184) (AcademicPress 1990);Bayer et al. , “Immunochemical Applications of Avidin-BiotinTechnology, ” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson，ed.，TheHumana Press, Inc. 1992))。實(shí)施免疫分析的方法已經(jīng)成熟(參見例如Cook and Self，“MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays，，，in Monoclonal Antibodies:Production，Engineering，and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman，eds.，CambridgeUniversity Press 1995);Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in theAdvancement of Immunoassay Technology, ”in Monoclonal Antibodies:Principles andApplications 107-120 (Birch and Lennox, eds. , Wiley-Lissj Inc. 1995);Diamandis, Immunoassay (Academic Press,Inc.1996))。IV.抗人B7H6單克降抗體-葯物偶聯(lián)物本發(fā)明另一方面提供了抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物。“抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物”本文中是指偶聯(lián)有治療劑的抗人B7H6單克隆抗體(如Section III中的描述，同前)。這類抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物在被給予受試對(duì)象時(shí)，一般是單獨(dú)給予但也可以與其他治療劑聯(lián)用，對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞能夠產(chǎn)生臨床上的有益效果，所述受試對(duì)象是例如患有B7H6表達(dá)性癌癥的個(gè)體。在典型實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體被偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑，從而使得所得到的抗體-藥物偶聯(lián)物在被B7H6表達(dá)細(xì)胞(例如，B7H6表達(dá)癌細(xì)胞)攝取或內(nèi)化時(shí)，對(duì)所述細(xì)胞能夠發(fā)揮細(xì)胞毒或抑制細(xì)胞效應(yīng)。尤其適合與抗體偶聯(lián)的部分是化學(xué)治療劑、前藥轉(zhuǎn)換酶、放射性同位素或化合物，或者毒素。例如，可以給抗人B7H6單克隆抗體偶聯(lián)上細(xì)胞毒性劑，比如化學(xué)治療劑(參見下文)或毒素(例如，抑制細(xì)胞性的或者殺細(xì)胞性的試劑，比如例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素)。下文提供了適合與抗人B7H6單克隆抗體偶聯(lián)的其他試劑的例子。其他實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體被偶聯(lián)了前藥轉(zhuǎn)換酶。所述前藥轉(zhuǎn)換酶可以利用已知方法通過重組融合到抗體上或者以化學(xué)方法偶聯(lián)到抗體。示范性的前藥轉(zhuǎn)換酶是羧肽酶G2、P -葡糖苷酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、^ -內(nèi)酰胺酶、P -半乳糖苷酶、硝基還原酶和羧肽酶A。
將治療劑與蛋白(特別是抗體)偶聯(lián)的方法是已知的(參見例如Arnonet al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy,，，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (ReisfeId et al. eds. , AlanR. Liss, Inc.，1985) ; Hellstrom et al. , “Antibodies For Drug Delivery,，，inControlled Drug Delivery(Robinson et al.eds. , Marcel Deiker, Inc. , 2nded. 1987);Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview,，，in Monoclonal Antibodies ' 84:Biological And Clinical Applications(Pinchera et al. eds. , 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of theTherapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy, ” in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al. eds. , AcademicPress, 1985);和 Thorpe et al. , 1982, Immunol. Rev. 62:119-58。還可參見例如 PCT 公開W089/12624)。某些變化形式中，按照本文描述的方法，抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物被B7H6表達(dá)細(xì)胞內(nèi)化并累積，所述抗體-藥物偶聯(lián)物即在這些細(xì)胞中發(fā)揮治療效果(例如，細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞效應(yīng))。確定累積和累積速率的方法可以在例如名為“DrugConjugates and Their Use for Treating Cancer, an Autoimmune Disease or anInfectious Disease” 的 WO 2004/010957 中找到。在典型實(shí)施方案中，當(dāng)使用偶聯(lián)有治療劑(例如，藥物或前藥轉(zhuǎn)換酶)的抗人B7H6單克隆抗體時(shí)，優(yōu)選試劑在被待治療的B7H6表達(dá)細(xì)胞(例如，B7H6表達(dá)性癌癥的細(xì)胞)內(nèi)化時(shí)有活性。其他實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物不被內(nèi)化，而藥物能夠通過結(jié)合到細(xì)胞膜上發(fā)揮治療效果(例如，消除B7H6表達(dá)細(xì)胞或者抑制其生長(zhǎng))。為了使治療劑在B7H6-表達(dá)細(xì)胞(例如，B7H6表達(dá)癌細(xì)胞)以外的活性最小化，治療劑的偶聯(lián)方式通常使得它活性下降，除非被從抗體上切割下來(例如，通過水解或切割試劑)。這類實(shí)施方案中，治療劑通過可切割的連接分子附著到抗體上，所述連接分子對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)境中的切割敏感，但對(duì)胞外環(huán)境基本不敏感，這樣在被B7H6表達(dá)細(xì)胞內(nèi)化時(shí)，偶聯(lián)物即被(例如，在內(nèi)體，或者例如借助PH敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶體環(huán)境或者質(zhì)膜微囊中)從抗體上切割下來)(參見下文IV(A)部分)。此外，某些實(shí)施方案中，抗體-藥物偶聯(lián)物包含的治療劑相對(duì)質(zhì)膜帶有電荷，從而進(jìn)一步降低試劑在被細(xì)胞內(nèi)化后穿過質(zhì)膜的能力。本文中，“帶電荷的試劑”意味著試劑(a)是極化的，所述試劑的一個(gè)區(qū)域相對(duì)質(zhì)膜帶有電荷，或者(b)相對(duì)質(zhì)膜帶有凈電荷。A.連接分子一般來說，B7H6抗體-藥物偶聯(lián)物包含位于治療劑和抗人B7H6單克隆抗體之間的連接分子區(qū)。正如上文指出的，在某些實(shí)施方案中，連接分子在胞內(nèi)條件下可以被切割，連接分子在胞內(nèi)環(huán)境中的切割使治療劑被從抗體上釋放。例如，在一些實(shí)施方案中，所述連接分子可以被存在于胞內(nèi)環(huán)境(例如處于溶酶體或內(nèi)體或質(zhì)膜微囊內(nèi))的切割劑切割。連接分子可以是例如肽連接分子，可以被胞內(nèi)肽酶或蛋白酶，包括但不限于溶酶體或內(nèi)體蛋白酶切割。一般來說，肽連接分子是至少兩個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或者至少三個(gè)氨基酸長(zhǎng)。切割劑可以包括cath印sins B和D以及胞質(zhì)素 (plasmin)，這三者已知可以水解二肽藥物衍生物，導(dǎo)致有活性的藥物在靶細(xì)胞內(nèi)被釋放(參見例如 Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123,1999)。最典型的是可以被B7H6表達(dá)細(xì)胞中存在的酶切割的肽連接分子。例如，可以使用能夠被在癌變組織中高度表達(dá)的巰基依賴性蛋白酶cathepsin-B切割的肽連接分子(例如Phe-Leu或者Gly-Phe-Leu-Gly連接分子)。其他這類連接分子在例如美國(guó)專利6，214，345中有描述。特定實(shí)施方案中，可以被胞內(nèi)蛋白酶切割的肽連接分子是Val-Cit (纈氨酸-瓜氨酸)連接分子或者Phe-Lys (苯丙氨酸-賴氨酸)連接分子(參見例如美國(guó)專利6，214，345，該專利描述了帶有Val-Cit連接分子的多柔比星(doxorubicin)的合成)。利用胞內(nèi)蛋白水解來釋放治療劑的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是試劑在偶聯(lián)狀態(tài)時(shí)通常是弱化的，偶聯(lián)物的血清穩(wěn)定性一般較高。在其他實(shí)施方案中，可切割的連接分子是pH敏感的，即對(duì)在某個(gè)pH值的水解敏感。一般來說，對(duì)PH敏感的連接分子在酸性條件下可被水解。例如，可以使用在溶酶體中可被水解的酸不穩(wěn)定連接分子(例如，腙、縮氨基脲、縮氨基硫脲、順烏頭酰胺、原酸酯、乙縮醛、縮酮等等)(參見例如美國(guó)專利5，122，368,5, 824，805,5, 622，929;Dubowchikand Walker,Pharm. Therapeutics 83:67-123，1999;Nevi I Ie et al. , Biol.Chem. 264:14653-14661，1989)。這類連接分子在中性pH條件(比如血液中的條件)下相對(duì)穩(wěn)定，但在pH 5. 5或5. 0 (溶酶體的大概pH)以下時(shí)不穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，可水解的連接分子是硫醚連接分子(比如，例如通過酰腙鍵附著到治療劑上的硫醚(參見例如美國(guó)專利 5,622,929))。還有一些實(shí)施方案中，連接分子在還原條件下是可切割的(例如，二硫化物連接分子)。多種二硫化物連接分子是本領(lǐng)域已知的，包括例如可以利用SATA(N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯)、SH)B(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-硫代吡啶)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亞胺基-羰氧基-a -甲基-a-(2-硫代吡啶)甲苯)、SPDB、以及SMPT形成的那些二硫化物連接分子(參見例如 Thorpe et al. , Cancer Res. 47:5924-5931, 1987; Wawrzynczak et al. , InImmunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagety and Therapy of Cancer(C.W. Vogel ed. , Oxford U. Press, 1987。還可見美國(guó)專利 4，880，935)。再有一些變化形式中，連接分子是丙二酸連接分子(Johnson et al. , AnticancerRes. 15:1387-93，1995)、馬來酰亞胺苯甲酰連接分子(Lau et al.，Bioorg-Med-Chem. 3:1299-1304, 1995)、或者 3’ -N-酰胺類似物(Lau et al.，Bioorg-Med-Chem. 3:1305-12，1995)
O一般來說，連接分子對(duì)胞外環(huán)境基本不敏感。本文中，就連接分子而言的“對(duì)胞外環(huán)境基本不敏感”意味著抗 體-藥物偶聯(lián)物樣品中不超過大約20%，普遍來說不超過等于15%，更普遍來說不超過大約10%，甚至更普遍來說不超過大約5%，不超過大約3%，或者不超過大約1%的連接分子，在所述抗體-藥物偶聯(lián)物處于胞外環(huán)境(例如，在血漿中)時(shí)被切害I]。要確定連接分子對(duì)胞外環(huán)境是否基本不敏感可以通過例如將血漿分別與(a)抗體-藥物偶聯(lián)物(“抗體-藥物偶聯(lián)物樣品”)和(b)等摩爾量的未偶聯(lián)抗體或治療劑(“對(duì)照樣品”)溫育預(yù)先確定的一段時(shí)間(例如2、4、8、16或24小時(shí))，然后將通過例如高效液相層析測(cè)量到的抗體-藥物偶聯(lián)物樣品中存在的未偶聯(lián)抗體或治療劑與對(duì)照樣品存在的進(jìn)行比較?！┳兓问街?連接分子能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化。某些實(shí)施方案中，當(dāng)連接分子與治療劑偶聯(lián)(即，位于抗體-藥物偶聯(lián)物的連接分子-治療劑部分之中)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)化得以增強(qiáng)。而其他實(shí)施方案中，當(dāng)連接分子與治療劑和抗B7H6抗體均偶聯(lián)(即，位于抗體-藥物偶聯(lián)物之中)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)化得以增強(qiáng)。可以用于本發(fā)明的組合物和方法的多種連接分子在例如名為“Drug Conjugatesand Their Use for Treating Cancer, an Autoimmune Disease or an InfectiousDisease” 的 WO 2004/010957 中有描述。B.治療劑按照本發(fā)明，能夠?qū)7H6表達(dá)細(xì)胞發(fā)揮治療效果的任何試劑可以作為與抗人B7H6單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)的治療劑。某些實(shí)施方案中，比如治療B7H6表達(dá)性癌癥，治療劑是細(xì)胞毒性劑。有用的細(xì)胞毒性劑種類包括，例如抗微管蛋白劑、auristatins、DNA小溝結(jié)合齊U、DNA復(fù)制抑制劑、烷基化劑(例如，鉬絡(luò)合物，比如順鉬、單(鉬)、雙(鉬)以及三核鉬絡(luò)合物和卡鉬)、蒽環(huán)類、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化療增敏劑、duocarmycins、依托泊式(etoposides)、氟化嘌卩密唳劑、離子載體、lexitropsins、nitrosoureas、普拉汀諾(platinols)、預(yù)形成化合物(pre-forming compounds)、嘌呤拮抗劑、嘌呤霉素、放療增敏齊U、類固醇、紫杉醇、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、長(zhǎng)春花生物堿等。具體細(xì)胞毒性劑包括例如，雄激素\安曲霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮雜胞苷、硫唑嘌呤、博萊霉素、白消安(busulfan)、丁胱亞磺酰亞胺(buthionine sulfoximine)、喜樹喊(camptothecin)、卡鉬、卡莫司汀(carmustine (BSNU) )、CC-1065 (Li et al. , CancerRes. 42:999-1004, 1982)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉬、秋水仙喊(colchicine)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、胞喃唳阿拉伯糖苷、細(xì)胞松弛素B、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(以前稱為放線菌素)、道諾霉素(daunorubicin)、decarbazine、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星、雌激素、5-氟脫氧尿苷、依托泊甙磷酸酯(VP-16)、5_氟尿嘧啶、短桿菌肽D、羥基脲、伊達(dá)比星(idarubicin)、異磷酰胺、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(Iomustine)(CCNU)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、6_巰基嘌呤、氨甲蝶呤、光輝霉素(mithramycin)、絲裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、硝基咪唑、太平洋紫杉醇、普卡霉素(plicamycin)、普魯節(jié)肼(procarbizine)、鏈脲霉素(streptozotocin)、替尼泊苷(tenoposide, VM-26)、6_硫鳥嘌呤、硫ΤΕΡΑ、拓?fù)涮乜?topotecan)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、長(zhǎng)春新喊(vincristine)和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)。特別合適的細(xì)胞毒性劑包括例如，海兔毒素(例如auristatin E、AFP、MMAF,MMAE)、DNA小溝結(jié)合劑(例如烯二炔類和lexitropsins)、倍癌霉素(duocarmycins) >紫杉醇(例如太平洋紫杉醇和多烯紫杉醇)、嘌呤霉素、長(zhǎng)春花生物堿、CC-1065、SN-38(7-乙基-10-羥基-喜樹堿)，拓?fù)涮乜?、嗎?多柔比星、根霉菌素(rhizoxin)、cyanomorpholino-多柔比星、棘霉素(echinomycin)、combretastatin、紡錘菌素(netropsin)、埃博霉素 A 和 B、雌莫司汀(estramustine)、cryptophysins、西馬多丁(cemadotin)、美登類化合物(maytansinoids)、discodermolide、eleutherobin 以及米托蒽醌。某些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑是常規(guī)的化療劑，比如例如多柔比星、太平洋紫杉醇、美法侖、長(zhǎng)春花生物堿、氨甲蝶呤、絲裂霉素C或依托泊甙。此外，諸如CC-1065類似物、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、海兔毒素10的類似物、根霉菌素和沙海 葵毒素(palytoxin)的強(qiáng)力試劑可以與抗B7H6表達(dá)抗體連接。在特定變化形式中，細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞抑制劑是auristatin E (現(xiàn)有技術(shù)中又稱為海兔毒素10)或其衍生物。一般來說,auristatin E衍生物是例如auristatinE和酮酸之間形成的酯。例如，auristatin E可以分別與對(duì)乙?；郊姿峄虮郊柞Ｊ岱磻?yīng)產(chǎn)生AEB和AEVB。其他典型的auristatin衍生物包括AFP (二甲基纈氨酸-纈氨酸-海兔異亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔腦氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸-p-苯二胺)、MMAF (dovaline-繳氨酸-海兔異亮氨酸-dolaproine-苯丙氨酸)和MAE ( —甲基auristatin E)。Auristatin E及其衍生物的合成和結(jié)構(gòu)在美國(guó)專利申請(qǐng)公開20030083263;國(guó)際專利公開 WO 2002/088172 和 W02004/010957;以及美國(guó)專利 6，884，869,6, 323，315,6, 239，104、6，034，065,5, 780，588,5, 665，860,5, 663，149,5, 635，483,5, 599，902,5, 554，725、5，530，097,5, 521，284,5, 504，191,5, 410，024,5, 138，036,5, 076，973,4, 986，988、4，978，744,4, 879，278,4, 816，444 和 4，486，414 中有描述。其他變化形式中，細(xì)胞毒性劑是DNA小溝結(jié)合劑(參見例如美國(guó)專利6，130，237)。例如，在某些實(shí)施方案中，所述小溝結(jié)合劑是CBI化合物。其他實(shí)施方案中，小溝結(jié)合劑是烯二炔(例如，卡奇霉素)。某些實(shí)施方案中，抗體-藥物偶聯(lián)物包含抗微管蛋白劑?？刮⒐艿鞍讋┑睦影ǎ缱仙即?例如Taxol (太平洋紫杉醇)、Taxotere (多烯紫杉醇))、T67 (Tularik)、長(zhǎng)春花生物堿(例如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛(vindesine)和長(zhǎng)春瑞濱)和海兔毒素(例如，auristatin E、AFP、MMAF, MMAE, AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白劑包括，例如漿果赤霉素(baccatin)衍生物、紫杉烷類似物(例如，埃博霉素A和B)、諾考達(dá)唑(nocodazole)、秋水仙堿和秋水仙胺、雌氮芥、cryptophysins、西馬多丁、美登類化合物、combretastatins、discodermolide 和 eleutherobin。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑是另一組抗微管蛋白劑-美登類化合物。例如，在特定實(shí)施方案中，美登類化合物是美登素或DM-I (ImmunoGen, Inc.;還可參見 Chari et al. , Cancer Res. 52:127-131，1992)。其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑是抗代謝物。所述抗代謝物可以是例如嘌呤拮抗劑(例如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酹酸酯(mycophenolate mofetil))、二氫葉酸還原酶抑制劑(例如，氨甲蝶呤)、無環(huán)鳥苷、丙氧鳥苷(gangcyclovir)、疊氮胸苷(zidovudine)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韋林(ribavirin)、疊氮胸苷(azidothymidine)、胞卩密唳阿拉伯糖苷、金剛燒胺(amantadine)、二脫氧尿苷、碘脫氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或三氟胸苷。C.抗B7H6抗體-藥物偶聯(lián)物的 形成抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物的制備可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來完成。簡(jiǎn)單來說，抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物包含抗人B7H6單克隆抗體、藥物以及任選的將藥物和抗體連接在一起的連接分子。有多種不同反應(yīng)可用于將藥物共價(jià)連接到抗體上。這經(jīng)常是通過抗體分子的氨基酸殘基(包括賴氨酸的胺基)、谷氨酸和天冬氨酸的游離羧基、半胱氨酸的巰基以及芳香族氨基酸的各種部分的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。最常用的非特異性共價(jià)連接方法之一是將化合物的羧基(或氨基)與抗體的氨基(或羧基)連接的碳化二亞胺反應(yīng)。此外，雙功能試劑，比如二醛或亞氨酸酯也曾被用于連接化合物的氨基和抗體分子的氨基。還可用于藥物與抗體連接的是席夫堿反應(yīng)(Schiff base reaction)。該方法包括將含有乙二醇或羥基的藥物進(jìn)行過碘酸氧化，然后將這樣形成的醛與抗體分子反應(yīng)。通過與抗體分子的氨基形成席夫堿而發(fā)生連接。異硫氰酸酯也可以作為將藥物與抗體共價(jià)連接的偶聯(lián)劑。其他技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類技術(shù)的非限制性實(shí)施例在例如，美國(guó)專利5，665，358,5, 643，573和5，556，623中有描述。在一些實(shí)施方案中，作為連接分子的前體的中間體在合適的條件下與藥物進(jìn)行反應(yīng)。某些實(shí)施方案中，活性基團(tuán)被用于藥物和/或中間體。藥物和中間體之間的反應(yīng)產(chǎn)物，或者藥物衍生物隨后與抗人B7H6單克隆抗體在合適的條件下反應(yīng)。D.細(xì)胞毒或者抑制細(xì)胞活性的檢驗(yàn)方法某些實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物包含偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑的抗人B7H6單克隆抗體，從而所述抗體-藥物偶聯(lián)物對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞(例如，B7H6表達(dá)癌細(xì)胞)能夠發(fā)揮細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制效應(yīng)?？梢杂糜跈z測(cè)抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物的細(xì)胞毒效應(yīng)或細(xì)胞抑制效應(yīng)的B7H6表達(dá)細(xì)胞可以是培養(yǎng)細(xì)胞系，比如例如下文表5中列舉的那些?？谷薆7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物一經(jīng)證實(shí)能夠?qū)7H6表達(dá)細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制作用，即可在合適的動(dòng)物模型中驗(yàn)證其治療價(jià)值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，包含細(xì)胞毒性劑的抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物被用于治療B7H6表達(dá)性癌癥。下文V(B)部分和實(shí)施例X中描述了可以用于評(píng)估發(fā)明所述抗體-藥物偶聯(lián)物的治療效果的多種癌癥的示范性動(dòng)物模型。確定試劑對(duì)細(xì)胞是否有細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制效應(yīng)的方法一般是本領(lǐng)域已知的。這類方法的說明性例子在下文有描述。證實(shí)對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞有任何這類效果即表明抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物能夠用于治療或防止那些其病理至少部分是由B7H6表達(dá)細(xì)胞的異常生長(zhǎng)或活化介導(dǎo)的疾病或紊亂，比如例如B7H6表達(dá)性癌癥。為了確定抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物是否對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞有細(xì)胞抑制效應(yīng)，可以利用胸腺嘧啶核苷摻入法。例如，可以將96孔板上密度為5000細(xì)胞/孔的B7H6表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)，在72小時(shí)時(shí)間段的最后8小時(shí)與0. 5 μ Ci的3H-胸腺嘧啶核苷接觸，并在有和沒有抗體-藥物偶聯(lián)物的情況下測(cè)量3H-胸腺嘧啶核苷摻入細(xì)胞的情況。
為了確定細(xì)胞毒性，可以測(cè)量壞死或細(xì)胞凋亡(程序化細(xì)胞死亡)。壞死通常伴有細(xì)胞質(zhì)膜通透性提高、細(xì)胞腫脹和細(xì)胞質(zhì)膜的破裂。細(xì)胞凋亡的特征通常在于膜起泡、細(xì)胞質(zhì)凝聚和內(nèi)源核酸內(nèi)切酶的活化。細(xì)胞活性的測(cè)量可以通過確定細(xì)胞攝取染料，比如中性紅、臺(tái)盼藍(lán)或者AhnnarBIueiH' (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH)的情況。還可參見例如 Pageet al.,Intl. J. of Oncology 3:473-476,1993。在這類分析法中，細(xì)胞溫育在含有染料的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞洗滌，經(jīng)分光光度術(shù)測(cè)量存留的染料，反映細(xì)胞所攝取的染料。蛋白結(jié)合染料磺酰羅丹明B(SRB)也可以用于測(cè)量細(xì)胞毒性(Skehan et al.，J. Nat' I CancerInst. 82:1107-12，1990)。備選地，諸如MTT等四氮唑鹽(tetrazolium salt)被用于通過僅檢測(cè)活細(xì)胞進(jìn)行的定量比色試驗(yàn)來分析哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活和增殖(參見例如Mosmann, J. Immunol.Methods 65:55-63， 1983)。細(xì)胞凋亡可以通過測(cè)量例如DNA片段化來進(jìn)行定量。DNA片段化的體外定量確定 有商業(yè)光度測(cè)定方法可供使用。這類分析法的例子，包括TUNEL (檢測(cè)被片段化的DNA中摻入帶標(biāo)記核苷酸的情況)和基于ELISA的分析法,在Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals)中有描述。細(xì)胞凋亡還可以通過測(cè)量細(xì)胞中的形態(tài)變化來確定。例如，和對(duì)于壞死一樣，通過測(cè)量某些染料的攝取可以確定細(xì)胞質(zhì)膜完整性的喪失(例如，熒光染料，比如例如吖啶橙或溴化乙錠)。測(cè)量凋亡細(xì)胞數(shù)量的方法已由Dukeand Cohen, Current Protocols InImmunology (Coligan et al. eds. , 1992, pp. 3. 17. 1-3. 17. 16)描述過。還可以用 DNA 染料(例如，吖啶橙、溴化乙錠或碘化丙錠)將細(xì)胞標(biāo)記，觀察細(xì)胞中染色質(zhì)凝聚和沿內(nèi)核膜著邊的情況。其他可以測(cè)量用于確定凋亡的形態(tài)變化包括例如細(xì)胞質(zhì)濃縮、膜起泡增加和細(xì)胞皺縮。附著的和“浮動(dòng)”的培養(yǎng)物區(qū)域內(nèi)都可以測(cè)量是否存在凋亡細(xì)胞。例如，兩種區(qū)域的采集可以通過移去上清、對(duì)附著細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶解、離心洗滌步驟(例如，10分鐘，2000rpm)后將制品合并以及檢測(cè)凋亡(例如，通過測(cè)量DNA片段化)(參見例如Piazza etal. , Cancer Research 55:3110-16，1995)。V.使用方法A.總論本發(fā)明另一方面提供了調(diào)控NKp30表達(dá)細(xì)胞，包括例如自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞(例如CD8+T細(xì)胞)的活性(例如溶細(xì)胞活性)的方法。這類方法包括例如與NKp30表達(dá)細(xì)胞活性提高相關(guān)的疾病或紊亂的治療方法。合適的抗體包括能夠與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6的抗體，所述雜交瘤是(i)克隆4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4242) ; (ii)克隆9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243) ; (iii)克隆10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和(iv)克隆17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)。特定變化形式中，抗體是嵌合或人源化抗體，其來源于由選自以上(i)-(iv)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于干擾B7H6和NKp30的相互作用。用于這類實(shí)施方案，方法包括在有NKp30表達(dá)細(xì)胞的情況下，將表達(dá)功能性B7H6的細(xì)胞與有效量的抗人B7H6單克隆抗體或者其他能夠干擾B7H6和NKp30的相互作用的試劑進(jìn)行接觸。合適的抗體包括能夠與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6的抗體,所述雜交瘤是(i)克隆4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)或者(ii)克隆17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4245)。在特定變化形式中，抗體是嵌合或人源化抗體，其來源于由選自以上(i)和(ii)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。這類方法可以在體外、離體或體內(nèi)實(shí)施。某些優(yōu)選變化形式中，NKp30表達(dá)細(xì)胞是NK細(xì)胞，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性的用途或方法是為了例如治療與NK細(xì)胞活性提高相關(guān)的疾病或紊亂。其他變化形式中，NKp30表達(dá)細(xì)胞是NKp30表達(dá)T細(xì)胞(例如⑶8+T細(xì)胞)，調(diào)節(jié)NKp30表達(dá)T細(xì)胞活性的用途或方法是為了例如治療與NKp30表達(dá)T細(xì)胞活性提高相關(guān)的疾病或紊亂。某些T細(xì)胞(包括⑶8+T細(xì)胞)已被證實(shí)能夠表達(dá)NKp30 (參見例如 Srivastava and Srivastava, Leuk. Res. 30:37-46, 2006) 正如以上提及的，在某些變化形式中，本發(fā)明的抗體是用于治療與NK細(xì)胞活性相關(guān)的疾病或紊亂。例如，在一些實(shí)施方案中，使用所述抗體的方法包括將能夠干擾B7H6和NKp30的相互作用的有效量抗人B7H6單克隆抗體給予患有或者有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展出NK細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂(例如，NK細(xì)胞介導(dǎo)的同種異體移植排斥，比如，例如NK細(xì)胞介導(dǎo)的骨髓細(xì) 胞(BMC)同種異體移植排斥)的患者。包含在本發(fā)明中的是用于抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的骨髓同種異體移植排斥的方法，所述方法包括使用抗人B7H6單克隆抗體。骨髓移植(BMT)已成為治療各種血液科惡性疾病的一種被認(rèn)可的療法。但是同種異體BMT的效力受到某些障礙的限制，比如例如移植物被排斥。充分的證據(jù)表明NK細(xì)胞是進(jìn)行骨髓同種異體移植物植入的障礙，NK細(xì)胞單獨(dú)即可介導(dǎo)小鼠中BMC排斥的特異性(參見例如Murphy et al.，J.Exp. Med. 165:1212-1217，1987;Murphy et al. , J. Exp. Med. 166:1499-1509，1987;Murphyet al., J. Tmmunol.144:3305-3311, 1990;Murphy et al. , Eur. J. Tmmunol. 20:1729-1734,1990;Murphy et al.，Immunol. Rev. 181:279-289，2001)。臨床上，在接受了 HLA 配型不合BMTs (T細(xì)胞被去除，但未經(jīng)細(xì)胞減滅調(diào)節(jié))的SCID患者中觀察到的同種異體移植阻力是供體NK細(xì)胞的高活性造成的(參見O’Reilly et al. , Vox. Sang. 51:81-86, 1986) 相應(yīng)地，在BMT過程中可以使用本文描述的抗體來抑制NK細(xì)胞抗同種異體移植物的溶細(xì)胞活性，從而治療或防止BMC同種異體移植排斥，所述抗體抗B7H6胞外結(jié)構(gòu)域并且能夠抑制B7H6和NKp30的相互作用。還有一些實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體被用于誘發(fā)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或者補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)，用于比如例如治療以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征的疾病或紊亂。例如，在一些實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體被用于誘發(fā)抗B7H6表達(dá)癌細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)。抗體療法在癌癥的治療中特別成功，因?yàn)槟承┠[瘤會(huì)展示獨(dú)特的抗原、種系特異性抗體或者相對(duì)正常細(xì)胞抗原的量過多。試驗(yàn)證據(jù)顯示相對(duì)正常組織，許多來源于腫瘤的細(xì)胞系高度表達(dá)B7H6，所述來源于腫瘤的細(xì)胞系包括來源于直腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的細(xì)胞系，以及那些來源于各種血癌，比如早幼粒細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒細(xì)胞白血病的細(xì)胞系。這一證據(jù)表明B7H6是新的腫瘤特異性或者腫瘤相關(guān)性抗原，并且抗人B7H6單克隆抗體可以作為抗腫瘤治療劑。與單克隆抗體療法相關(guān)的一個(gè)機(jī)制是抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。在ADCC中，單克隆抗體與靶細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)結(jié)合，表達(dá)單克隆抗體受體的特異效應(yīng)細(xì)胞(例如，NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)與單克隆抗體/靶細(xì)胞復(fù)合體結(jié)合，造成靶細(xì)胞死亡。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，包含具有效應(yīng)子功能的Fe區(qū)的抗人B7H6單克隆抗體被用于誘發(fā)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或者補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(⑶C)。誘發(fā)ADCC的方法通常包括將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量的抗人B7H6單克隆抗體接觸，其中所述單克隆抗體包含具備ADCC活性的Fe區(qū)。該接觸步驟是在有溶細(xì)胞免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下進(jìn)行的，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)具備溶細(xì)胞活性的Fe受體。表達(dá)溶細(xì)胞性Fe受體(例如，F(xiàn)e Y RIIIa或⑶16)的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括例如NK細(xì)胞和某些⑶8+T細(xì)胞。誘發(fā)CDC的方法通常包括將B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量的抗人B7H6單克隆抗體接觸，其中所述單克隆抗體包含具備CDC活性的Fe區(qū)。該接觸步驟是在有補(bǔ)體的情況下進(jìn)行的?？梢岳盟龇椒ㄟM(jìn)行靶向殺傷的B7H6表達(dá)細(xì)胞包括例如癌細(xì)胞，比如象結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、紅白血病細(xì)胞、伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞和慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞等等。合適的抗體包括能夠與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6的抗體，所述雜交瘤是(i)克隆4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242) ； (ii)克隆9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào) CNCM 1-4243) ; (iii)克隆 10E2. 9 的雜交瘤(保藏號(hào) CNCM 1-4244);和(iv)克隆 17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)。在一些實(shí)施方案中，抗體能夠與由選自以上(ii)-(iii)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6。特定變化形式中，抗體是嵌合或人源化抗體，其來源于由選自以上(i)-(iv)或者(ii)-(iii)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。相關(guān)實(shí)施方案中，如本文所述的包含具有效應(yīng)子功能的Fe區(qū)的抗人B7H6單克隆抗體被用于治療受試對(duì)象的B7H6表達(dá)性癌癥。這類方法通常包括將有效量的抗人B7H6單克隆抗體給予受試對(duì)象，所述單克隆抗體包含具有ADCC活性和/或CDC活性的Fe區(qū)。特別適合利用這類方法進(jìn)行治療的B7H6表達(dá)性癌癥包括，例如直腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌或者前列腺癌，以及血癌，比如例如早幼粒細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病、伯基特氏淋巴瘤或慢性粒細(xì)胞白血病。還有一些實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物(參見上文IV部分)被用于將治療劑遞送到B7H6表達(dá)細(xì)胞，藥劑在此發(fā)揮治療效果。這類方法對(duì)于以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征的疾病或紊亂的治療尤其有用。在某些使用抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物的優(yōu)選變化形式中，所述治療劑是對(duì)B7H6表達(dá)細(xì)胞，比如B7H6表達(dá)癌細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒或者抑制細(xì)胞效應(yīng)的細(xì)胞毒性劑。正如上文指出的，試驗(yàn)證據(jù)顯示相對(duì)正常組織，許多來源于腫瘤的細(xì)胞系高度表達(dá)B7H6，所述來源于腫瘤的細(xì)胞系包括來源于直腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的細(xì)胞系，以及那些來源于各種血癌，比如早幼粒細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒細(xì)胞白血病的細(xì)胞系。這一證據(jù)表明B7H6是新的腫瘤特異性或者腫瘤相關(guān)性抗原，可以用于給在癌癥治療中有治療效果的試劑，特別是可以消除腫瘤細(xì)胞或者抑制其生長(zhǎng)的細(xì)胞毒性劑導(dǎo)靶。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，包含偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑的抗人B7H6單克隆抗體的抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物被用于治療B7H6表達(dá)性癌癥。合適的抗體-藥物偶聯(lián)物包括那些含有能夠與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6的抗體，所述雜交瘤是(i)克隆4E5. 5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242) ; (ii)克隆9G9. 2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243) ; (iii)克隆10E2. 9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和(iv)克隆17B1. 3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4245)。在一些實(shí)施方案中，抗體-藥物偶聯(lián)物包含能夠與由選自以上(ii)-(iii)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7H6的抗體。特定變化形式中，抗體-藥物偶聯(lián)物包含嵌合或人源化抗體，其來源于由選自以上(i)-(iv)或者(ii)-(iii)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。在本文描述的治療方法的每個(gè)實(shí)施方案中，抗人B7H6單克隆抗體或者抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物的遞送方式與要治療的疾病或紊亂的處置相關(guān)的傳統(tǒng)方法一致。按照本文的公開內(nèi)容，將有效量的抗體或抗體-藥物偶聯(lián)物給予需要這類治療的受試對(duì)象，并且給藥時(shí)間和條件足以防止或治療所述疾病或紊亂。被給予本文描述的抗人B7H6單克隆抗體或者抗體-藥物偶聯(lián)物的受試對(duì)象包括有高于正常的發(fā)展出疾病或紊亂的風(fēng)險(xiǎn)的患者，以及已經(jīng)表現(xiàn)出疾病或紊亂的患者，其中所述疾病或紊亂是NKp30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的或者以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征。某些實(shí)施方案中，受試對(duì)象還未受到疾病或紊亂的困擾，用途是進(jìn)行篩選或診斷。其他一些實(shí)施方案中，受試對(duì)象已被診斷患有需要所述治療的疾病或紊亂。此外，在治療過程中可以監(jiān)測(cè)受試對(duì)象是否有疾病或紊亂的任何變化(例如疾病或紊亂的臨床癥狀是否增加或減少)。在預(yù)防性應(yīng)用中，將藥物組合物(藥物)以足夠消除疾病或減少疾病風(fēng)險(xiǎn)或者延遲發(fā)病的量給予患者，所述患者是對(duì)特定疾病易感或者通過其他方式有患病風(fēng)險(xiǎn)。在治療應(yīng)用中，將所述組合物以足夠治愈或至少部分地遏制疾病及其并發(fā)癥癥狀的量給予患者，所述患者是被懷疑或者已經(jīng)受到這類疾病的困擾。足夠?qū)崿F(xiàn)以上目的的量是指對(duì)于治療來說或者預(yù)防來說有效的劑量或用量。在預(yù)防和治療方案中，通常是將抗體或抗體-藥物偶聯(lián)物以多個(gè)劑量給藥直至已經(jīng)達(dá)到足夠的反應(yīng)(例如激發(fā)合適的NK細(xì)胞活性或抑制不當(dāng)?shù)腘K細(xì)胞活性)。一般來說，要對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如果期望的反應(yīng)開始消退可以給予多次劑量。
對(duì)于本發(fā)明的這樣的變化形式，所述變化形式中受試對(duì)象還未受到那些NKp30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的或者以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征的疾病或紊亂的困擾，用途是診斷或者篩選風(fēng)險(xiǎn)提高的受試對(duì)象，可以從受試對(duì)象中取生物樣品，與來自正?；蚪】祩€(gè)體的生物樣品或者預(yù)先確定的基礎(chǔ)水平進(jìn)行比較。在受試對(duì)象樣品中檢測(cè)到高于來自正常和健康個(gè)體的相當(dāng)生物樣品或者基礎(chǔ)水平可以確定患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)本發(fā)明所述抗體組合物的方法在V. C部分進(jìn)行了描述。本發(fā)明的組合物和方法可以用于在骨髓移植后的不同時(shí)間或者被給予抗癌癥藥物或治療后的不同時(shí)間，在來自受試對(duì)象的生物樣品中監(jiān)測(cè)治療進(jìn)展。在來自受試對(duì)象的生物樣品中檢測(cè)到的B7H6水平作為治療前水平(Tl)，并與來自相同個(gè)體的第二次取的生物樣品的治療后水平(T2)進(jìn)行比較。B7H6水平升高通常表明疾病的進(jìn)展，B7H6降低表明疾病的消退。為了鑒定按照本發(fā)明的方法進(jìn)行篩選或治療的受試患者，可以采用獲得認(rèn)可的篩選方法來確定與特定疾病或紊亂相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素，所述疾病或紊亂是由NKp30表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的或者以存在B7H6表達(dá)細(xì)胞為特征；或者確定受試對(duì)象中鑒定到的已有紊亂的狀態(tài)。這類方法可以包括，例如確定個(gè)體是否有親戚已被診斷患有特定疾病。篩選方法還可以包括，例如常規(guī)工作來確定已知有遺傳性組成的特定疾病的家族狀況(例如，就BMT而言，臨床研究顯示某些HLA-C等位基因的存在與BM同種異體移植排斥風(fēng)險(xiǎn)增加有相關(guān)性(參見Scott et al. ,Blood 92:4864-4871，1998)，而且已知多種癌癥有一定的遺傳性組成)。癌癥的遺傳性組成包括，例如多個(gè)基因中的轉(zhuǎn)化性突變(例如Ras、Raf、EGFR、cMet和其他)；某些HLA和殺傷細(xì)胞抑制性受體(KIR)分子，或者這樣一些機(jī)制的存在與否，所述機(jī)制是癌癥細(xì)胞能夠通過它直接或者間接地調(diào)節(jié)對(duì)諸如NK細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞的免疫抑制(參見例如 Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Tmmunol. 7:329-339, 2007; Boyton andAltmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007)。為了這個(gè)目的,可以常規(guī)地使用核苷酸探針來鑒定攜帶與特定目標(biāo)疾病相關(guān)的遺傳標(biāo)記物的個(gè)體。此外，有大量已知的免疫學(xué)方法可用于鑒定具體疾病的標(biāo)記物。例如，有各種本領(lǐng)域公知的采用單克隆抗體探針來檢測(cè)與特定種類相關(guān)的抗原的ELISA免疫檢測(cè)法可供使用。通過已知的患者癥狀學(xué)、年齡因素、相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素等可以實(shí)現(xiàn)篩選。這些方法使得臨床醫(yī)師可以常規(guī)地選擇需要利用本文描述的方法進(jìn)行治療的患者。與這些方法相對(duì)應(yīng)，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性可以作為獨(dú)立的治療流程，或者作為其他治療的復(fù)查、附加或協(xié)同治療方案。B.癌癥治療I.癌癥的類型
正如本文描述并經(jīng)研究證實(shí)的，B7H6抗體可以被用于通過活化ADCC或⑶C途徑直接殺傷B7H6表達(dá)細(xì)胞，所述途徑的活化經(jīng)由Fe與Fe受體和補(bǔ)體蛋白Clq的結(jié)合。還有一些變化形式中，包含偶聯(lián)在抗人B7H6單克隆抗體上的細(xì)胞毒性劑的抗人B7H6單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物可以被用于給B7H6表達(dá)癌細(xì)胞遞送細(xì)胞毒性劑，細(xì)胞毒性劑在此通過消除癌細(xì)胞或者抑制其生長(zhǎng)而發(fā)揮治療效果。下表4列舉了本發(fā)明所述治療方法適用的一些癌癥，主要按照目標(biāo)部位排列。表4:示范性癌癥類型列表
權(quán)利要求
1.分離的單克隆抗體，所述抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243); c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)。
2.權(quán)利要求I所述的抗體，其中所述抗體選自小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
3.權(quán)利要求I所述的抗體，其中所述抗體是選自下述的小鼠抗體a)由克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段；b)由克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段； c)由克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4244)產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段；和d)由克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM1-4245)產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段。
4.權(quán)利要求I的抗體，是人源化抗體，所述人源化抗體來源于選自下述的抗體 a)由克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體； b)由克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體； c)由克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體；和 d)由克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。
5.權(quán)利要求I所述的抗體，其中所述抗體與(a)或(d)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6胞外結(jié)構(gòu)域，并能抑制人B7H6與人NKp30的相互作用。
6.權(quán)利要求1、4和5中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體。
7.權(quán)利要求1、2、4和5中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含的Fe區(qū)具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一種。
8.權(quán)利要求7所述的抗體,其中所述Fe區(qū)是單鏈Fe(scFc)。
9.診斷試劑盒，其包含 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的抗體；和 檢測(cè)所述抗體的結(jié)合的裝置。
10.組合物，其包含 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的抗體；和 可藥用載體。
11.抗體-藥物偶聯(lián)物，其包含 單克隆抗體，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243); c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)；其中所述抗體偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑。
12.權(quán)利要求11所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述抗體選自小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
13.權(quán)利要求11所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述抗體是人源化抗體，所述人源化抗體來源于選自下述的抗體 a)由克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體； b)由克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體； c)由克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體；和 d)由克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。
14.權(quán)利要求11或13的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述抗體是單鏈抗體。
15.權(quán)利要求11或13所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述抗體包含的Fe區(qū)具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一種。
16.權(quán)利要求15所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述Fe區(qū)是單鏈Fc(ScFc)。
17.權(quán)利要求11-16之一所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述細(xì)胞毒性劑選自抗微管蛋白劑、DNA小溝結(jié)合劑、DNA小溝烷基化劑、度卡霉素或者嘌呤霉素。
18.權(quán)利要求17所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述抗微管蛋白劑選自海兔毒素、長(zhǎng)春堿類、鬼白毒素、紫杉燒、衆(zhòng)果赤霉素衍生物、cryptophysin、類美登醇和combretastatin。
19.權(quán)利要求11-16之一所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述抗體經(jīng)由連接分子偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑。
20.權(quán)利要求19所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中所述連接分子在胞內(nèi)條件下是可切割的。
21.權(quán)利要求20所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，其中可切割性連接分子是能被胞內(nèi)蛋白酶切割的連接肽。
22.組合物，其包含 權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述的抗體-藥物偶聯(lián)物；和 可藥用載體。
23.降低人自然殺傷(NK)細(xì)胞抗表達(dá)人B7H6的細(xì)胞的活性的方法，所述方法包括 將表達(dá)人B7H6的細(xì)胞，在有人NK細(xì)胞的情況下，與有效量單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242);和 b)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)； 其中所述抗體抑制人B7H6與人NKp30的相互作用。
24.治療受試對(duì)象中骨髓細(xì)胞(BMC)同種異體移植排斥的方法，包括 將單克隆抗體以有效抑制NK細(xì)胞活性的量給予受試對(duì)象，從而治療急性BMC同種異體移植排斥，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242);和 b)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)；其中所述抗體抑制人B7H6與人NKp30的相互作用。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述抗體是人或人源化單克隆抗體。
26.權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體，所述人源化抗體來源于選自下述的抗體 a)由克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體；和 b)由克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。
27.權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述抗體是單鏈抗體。
28.消除包含B7H6表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞群中的B7H6表達(dá)細(xì)胞或者抑制所述B7H6表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括 將有效量抗體-藥物偶聯(lián)物與所述B7H6表達(dá)細(xì)胞接觸，其中所述抗體-藥物偶聯(lián)物包含的單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)； c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)； 并且其中所述抗體偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑。
29.治療受試對(duì)象中B7H6表達(dá)性癌癥的方法，所述方法包括 將有效量抗體-藥物偶聯(lián)物給予受試對(duì)象，其中所述抗體-藥物偶聯(lián)物包含的單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)； c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)； 并且其中所述抗體偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述B7H6表達(dá)性癌癥是結(jié)腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌或者前列腺癌。
31.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述B7H6表達(dá)性癌癥是早幼粒細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病、伯基特氏淋巴瘤、慢性粒細(xì)胞白血病或急性淋巴母細(xì)胞白血病。
32.權(quán)利要求28-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是人或人源化抗體。
33.權(quán)利要求28-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是人源化抗體，所述人源化抗體來源于選自下述的抗體 a)由克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體； b)由克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體； c)由克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體；和 d)由克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。
34.權(quán)利要求28-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單鏈抗體。
35.誘發(fā)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)的方法，所述方法包括 將所述B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)； c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)； 其中所述接觸是在有NK細(xì)胞的情況下或者有表達(dá)具有ADCC活性的Fe受體的CD8+T細(xì)胞的情況下進(jìn)行的，并且其中所述抗體包含能夠結(jié)合所述Fe受體的Fe區(qū)。
36.誘發(fā)抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(⑶C)的方法，所述方法包括 將所述B7H6表達(dá)細(xì)胞與有效量單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)； c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)； 其中所述接觸是在有補(bǔ)體的情況下進(jìn)行的，并且其中所述抗體包含具有CDC活性的Fe區(qū)。
37.治療受試對(duì)象中B7H6表達(dá)性癌癥的方法，所述方法包括 將有效量單克隆抗體給予受試對(duì)象，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)； c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)； 其中所述抗體包含的Fe區(qū)具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一種。
38.權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是人或人源化抗體。
39.權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體，所述人源化抗體來源于選自下述的抗體 a)由克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)產(chǎn)生的抗體； b)由克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)產(chǎn)生的抗體； c)由克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244)產(chǎn)生的抗體；和 d)由克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)產(chǎn)生的抗體。
40.權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單鏈抗體。
41.權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Fe區(qū)是單鏈Fe(scFc)。
42.權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述B7H6表達(dá)細(xì)胞是癌細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。
44.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、紅白血病細(xì)胞、伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞、慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞或急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞。
45.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述B7H6表達(dá)性癌癥是結(jié)腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。
46.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述B7H6表達(dá)性癌癥是早幼粒細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、單核細(xì)胞淋巴瘤、紅白血病、伯基特氏淋巴瘤、慢性粒細(xì)胞白血病或急性淋巴母細(xì)胞白血病。
47.檢測(cè)B7H6細(xì)胞表達(dá)的方法，所述方法包括 (1)將包含待檢人細(xì)胞的生物樣品與單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243)； c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245);和 (2)檢測(cè)所述抗體的結(jié)合情況，其中所述抗體的結(jié)合表明細(xì)胞上存在B7H6，從而檢測(cè)了細(xì)胞是否表達(dá)B7H6。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述生物樣品包含完整的人細(xì)胞。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述生物樣品包含待檢細(xì)胞的膜部分。
50.權(quán)利要求47-49中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體標(biāo)記了選自放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記和生物發(fā)光標(biāo)記的可檢測(cè)標(biāo)記。
51.給懷疑患有表達(dá)B7H6的癌癥的受試對(duì)象進(jìn)行診斷的方法，包括 (1)將偶聯(lián)了可檢測(cè)標(biāo)記的單克隆抗體給予所述受試對(duì)象，其中所述單克隆抗體與選自下述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7H6的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基25-266): a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242)； b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243); c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245);以及 (2)檢測(cè)抗體在所述受試對(duì)象內(nèi)的分布。
52.權(quán)利要求51所述的方法，其中所述癌癥是結(jié)腸癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。
53.選自下述的抗體生成細(xì)胞 a)克隆編號(hào)4E5.5的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4242); b)克隆編號(hào)9G9.2的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4243); c)克隆編號(hào)10E2.9的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4244);和 d)克隆編號(hào)17B1.3的雜交瘤(保藏號(hào)CNCM 1-4245)。
全文摘要
本發(fā)明公開了與B7家族成員B7H6特異結(jié)合的單克隆抗體，包括能夠抑制B7H6和NKp30相互作用的抗體。還公開了抗B7H6抗體-藥物偶聯(lián)物，其包含偶聯(lián)了治療劑的抗人B7H6單克隆抗體。所述抗B7H6抗體和抗體-藥物偶聯(lián)物可用于有抗B7H6表達(dá)細(xì)胞的治療效果的方法中，還可用于檢測(cè)B7H6或B7H6表達(dá)細(xì)胞的診斷方法中。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102741290SQ201080063065
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者E.維維爾, M.佩雷斯, M.巴拉廷 申請(qǐng)人:國(guó)家健康和醫(yī)學(xué)研究院