專利名稱：血管內(nèi)皮生長因子(vegf)受體的抑制劑及其使用方法
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體的抑制劑及其使用方法對相關(guān)申請的交叉引用本申請涉及并要求2009年12月29日提交的美國臨時(shí)申請序列號61/290，789的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用特此引入本文。關(guān)于政府贊助研究或開發(fā)的聲明 本發(fā)明是利用由國家衛(wèi)生研究院以合同號ROl-AR 051448,ROl-AR 051886和P50AR054086資助的政府支持而完成的。政府可以擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過結(jié)合并激活受體酪氨酸激酶(RTK)的VEGF受體(VEGFR)家族的三名成員來調(diào)節(jié)血管和淋巴管的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性(Olsson等人，Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. ,7(5) :359-371 (2006))。VEGFRl (Fltl)、VEGFR2 (KDR/FlkI)和VEGFR3 (Flt4)是V型RTK的成員；V型RTK是包含由7個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域(D1-D7)組成的大的細(xì)胞外區(qū)域、單一的跨膜(TM)螺旋和具有酪氨酸激酶活性的胞質(zhì)區(qū)域以及另外的調(diào)控序列的家族。VEGFR的胞外域的第二和第三Ig-樣結(jié)構(gòu)域，例如D2和D3，起到細(xì)胞因子的VEGF家族的五個(gè)成員(即，VEGF-A、B、C、D和胎盤生長因子(PLGF))的結(jié)合位點(diǎn)的作用(Barleon 等人，J. Biol. Chem.，272 (16) 10382-10388 (1997)；和 Shinkai 等人，J. Biol.Chem.，273 (47) :31283-31288 (1998))。這些生長因子是共價(jià)連接的同型二聚體。各原體是由在名為半胱氨酸結(jié)(cysteine-knot)生長因子的結(jié)構(gòu)中以反向平行的方式排列的四鏈^折疊片構(gòu)成的(Weismann等人，Cell,91(5) :695-704(1997))。細(xì)胞因子的半胱氨酸結(jié)家族的其他成員包括神經(jīng)生長因子(NGF)和血小板源生長因子(TOGF)。但是，RTlU^roGFR家族(III型)的胞外域由5個(gè)Ig-樣重復(fù)序列構(gòu)成，其中Dl、D2和D3起到TOGFR和家族的其他成員(即KIT、CSFlR和Flt3)的配體結(jié)合區(qū)域的作用。結(jié)構(gòu)和生化實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，SCF結(jié)合細(xì)胞外區(qū)域誘導(dǎo)KIT 二聚化，該步驟隨后是鄰近的KIT分子的兩個(gè)近膜Ig-樣結(jié)構(gòu)域D4和D5之間的同型接觸(Yuzawa等人，Cell，130 (2) :323-334 (2007))。野生型和致癌KIT突變體的生化研究已經(jīng)表明，同型D4和D5接觸對于KIT 二聚體在胞質(zhì)區(qū)中以有利于反式自磷酸化、激酶活化和細(xì)胞信號傳導(dǎo)的距離和方向來定位起到關(guān)鍵作用。然而，有必要更好地表征VEGF受體的結(jié)構(gòu)。這種表征將會導(dǎo)致可以作為藥物、藥品或其他生物藥劑靶向的區(qū)域的有意鑒定。發(fā)明概述本發(fā)明提供了結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF受體)例如，VEGFRl(Fltl),VEGFR2 (KDR/Flkl)和VEGFR3 (Flt4)的胞外域的成分(moiety)，例如，抗體或其抗原結(jié)合部分、小分子、肽類分子、適體和adnectin。本發(fā)明的成分可以鎖定VEGF受體的胞外域處于非活性狀態(tài)，從而抑制VEGF受體的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該成分鎖定VEGF受體的胞外域?yàn)閱误w狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分允許VEGF受體的胞外域二聚化，但影響兩個(gè)單體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域(例如，VEGF受體的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、定向和/或距離，從而抑制VEGF受體的活性。換句話說，該成分可以允許配體誘導(dǎo)的VEGF受體胞外域的二聚化，但影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面處的定位或改變或阻止VEGF受體中的構(gòu)象變化，從而抑制VEGF受體的活性(例如，抑制受體內(nèi)化和/或抑制受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制受體激活下游信號傳導(dǎo)途徑的能力)。本發(fā)明至少部分地基于VEGF2受體胞外域部分的晶體結(jié)構(gòu)的解譯。這種晶體結(jié)構(gòu)的解譯使得能夠鑒別本發(fā)明的成分可以靶向的表位，例如，構(gòu)象表位。
本發(fā)明還至少部分地基于發(fā)現(xiàn)鄰近受體之間的同型D7相互作用不是在受體二聚化中起作用，而是兩個(gè)受體的近膜區(qū)以能夠?qū)崿F(xiàn)導(dǎo)致酪氨酸激酶激活的胞質(zhì)域之間的相互作用的距離和定向精確定位所必需的。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF受體)的胞外域的成分，其中該成分鎖定VEGF受體的胞外域于非活性狀態(tài)，從而拮抗VEGF受體的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合人VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，該Ig-樣結(jié)構(gòu)域不負(fù)責(zé)配體與VEGF受體的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該Ig-樣結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)配體與VEGF受體的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分不阻斷VEGF受體和VEGF受體配體之間的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分阻斷VEGF受體和VEGF受體配體之間的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分不阻止VEGF受體的二聚化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分阻止VEGF受體的二聚化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分阻止VEGF受體各原體的胞外域的近膜區(qū)之間的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該相互作用是同型的。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，該相互作用是異型的。在一個(gè)實(shí)施方案中，胞外域的近膜區(qū)是VEGF受體的第七Ig-樣結(jié)構(gòu)域(D7)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合到VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域的下列共有序列IVIX1 R O X2 X3X4 D/E X5 G (SEQ ID NO :158)，其中L是亮氨酸，I是異亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸以及Xi、X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，O是纈氨酸A1選自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2選自于精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸；X3選自于賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸；X4選自于谷氨酸和纈氨酸；以及X5選自于谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分引起VEGF受體各原體的胞外域的近膜區(qū)以約16人、17 A、18 A, 19 A或者20 A的距離間隔。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分鎖定VEGF受體的胞外域于非活性狀態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF受體是VEGFRl (Fltl)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF受體是VEGFR2 (KDR/Flkl)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF受體是VEGFR3 (Flt4)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Asp731。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726和Asp731。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合選自于包括VEGFR2的氨基酸殘基724、725、726、727、728、729、730、731、732和733的組中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。該成分可以結(jié)合在任何上述氨基酸殘基的IA、2A、3A、4A或5A內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Arg720。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Asp725。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Arg720和Asp725。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合選自于包括VEGFRl的氨基酸殘基718、719、720、721、722、723、724、725、726和727的組中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。該成分可以在結(jié)合上述任何氨基酸殘基的IA、2A、3人、4A或5A內(nèi)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Arg737。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Asp742。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Arg737和Asp742。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合選自于包括VEGFR3的氨基酸殘基735、736、737、738、739、740、741、742、743和744的組中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。該成分可以結(jié)合在上述任何氨基酸殘基的IA、2A> 3A、4人或5A內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGF受體胞外域上的構(gòu)象表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)象表位由VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基構(gòu)成。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)象表位包含或由氨基酸殘基Arg726和Asp731 ;Arg 720和Asp 725;或者Arg737
和Asp742組成。在某些實(shí)施方案中，該成分結(jié)合在上述構(gòu)象表位的IA、2A、3人、
或5 A內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGF受體上的連續(xù)表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位由VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位是選自于 VEGFRl 的 672VAISSS6'VEGFRl 的 678ITLDCHA684、VEGFRl 的 685NGVPEPQ691、VEGFRl的 700KIQQEPg706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的 714STLFI718' VEGFRl 的719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694、VEGFR3 的 695LEMQCLV7CI1、VEGFR3 的 7ci2AGAHAPS708、VEGFR3 的 717LLEEKSg723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN730' VEGFR3 的 731QKLSI735 和vegfr3 的 736Qrvreedagr745、vegfr2 的 678Tsiges683, vegfr2 的 684Ievscta690, vegfr2 的691SGNPPPq697, VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2 的 mDGN719、VEGFR2 的720RNLTI724和VEGFR2的725RRVRKEDEGL734的表位。在一些實(shí)施方案中，該成分可以結(jié)合在任何上述表位的I人、2A、3A、4人或5人內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分阻斷配體誘導(dǎo)的VEGF受體酪氨酸自磷酸化作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分阻斷配體誘導(dǎo)的VEGF受體的內(nèi)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合VEGF受體胞外域的成分是分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合選自于人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分選自于包括Fab片段、F(AB' )2片段、單鏈Fv片段、SMIP、親和體(affibody)、親和性多聚體(avimer)、納米抗體(nanobody)以及單域抗體的組。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分以選自于包括Ix KT7M或更小、更優(yōu)選地5x 10_8M或更小、更優(yōu)選地Ix 10_8M或更小、更優(yōu)選地5x 10_9M或更小的KD結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域。一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生結(jié)合本文所描述的VEGF受體胞外域的抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合VEGF受體胞外域的部分是小分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該小分子結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726或Asp731中的至少一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該小分子結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Arg720或Asp725中的至少一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該小分子結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Arg737或Asp742中的至少一個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合VEGF受體胞外域的成分是一種肽類分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽類分子是基于VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該肽類分子是基于人VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽類分子包含結(jié)構(gòu)-XJI X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO : 158)，其中L是亮氨酸，I是異亮氨酸，R為精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸以及Xp X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，O是纈氨酸；X1選自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2選自于精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸；X3選自于賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸；X4選自于谷氨酸和纈氨酸；且X5選自于谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽類分子包含與人VEGFR2的氨基酸殘基724-733、678-683、684-690、691-697、706-712、713-716、717-719、720-724 或 725-734 至少 8085^^90%或95%相同的結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽類分子包含與人VEGFRl的氨基酸殘基 718-727、672-677、678-684、685-691、700-706、707-710、711-713、714-718 或 719-728至少80%、85%、90%或95%相同的結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽類分子包含與人￥￡6卩1 3的氨基酸殘基 735-744、689-694、695-701、702-708、717-723、724-727、728-730、731-735或736-745至少80%、85%、90%或95%相同的結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽類分子包含至少一個(gè)D-氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合VEGF受體胞外域的成分是adnectin。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象表位并拮抗人VEGF受體的活性的成分，其中所述的構(gòu)象表位包含VEGFR2的殘基Arg726和Asp731 ；VEGFRl 的殘基 Arg720 和 Asp725 ;或 VEGFR3 的殘基 Arg737 和 Asp742。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726和Asp731 ；VEGFRl的氨基酸殘基Arg720和Asp725 ;或VEGFR3的氨基酸殘基Arg737和Asp742，從而拮抗人VEGF受體的活性的成分。在另一個(gè)方面，發(fā)明提供了包含如本文所述的結(jié)合VEGF受體的胞外域的成分和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防受試者中VEGF受體相關(guān)疾病的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的成分，從而治療或預(yù)防該疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病選自于癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、淋巴系統(tǒng)的疾病和疼痛相關(guān)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自于GIST、AML、SCLC、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌和其生長由基質(zhì)支持的癌癥。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于鑒定結(jié)合VEGF受體的胞外域，如Ig-樣結(jié)構(gòu)域的成分的方法，該方法包括將VEGF受體與候選成分接觸；同時(shí)地或相繼地將VEGF受體與VEGF受體的配體接觸；和測定該成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域之間的定位、定方和/或距離，從而鑒定結(jié)合VEGF受體的胞外域，如Ig-樣結(jié)構(gòu)域的成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該成分鎖定VEGF受體的胞外域于非活性狀態(tài)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGF受體的第七Ig-樣結(jié)構(gòu)域(D7)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象表位的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分拮抗人VEGF受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位包含VEGFR2的殘基Arg726和Asp731殘基。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象表位的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分拮抗人VEGF受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位包含VEGFRl的殘基Arg720和Asp725。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象表位的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分拮抗人VEGF受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位包含VEGFR3的殘基Arg737和Asp742。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基724-733，從而拮抗VEGFR2的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基718-727，從而拮抗VEGFRl的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基735-744，從而拮抗VEGFR3的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合選自于人VEGFR2的Arg726和Asp731的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而拮抗人VEGFR2的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合選自于人VEGFRl的Arg720和Asp725的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而拮抗人類VEGFRl的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合選自于人類VEGFR3的Arg737和Asp742的至少一個(gè)氨基酸殘基,從而拮抗人VEGFR3的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域，例如，Ig-樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的成分，其中該成分鎖定受體酪氨酸激酶的胞外域于非活性狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該Ig-樣結(jié)構(gòu)域可以負(fù)責(zé)或不負(fù)責(zé)配體與受體酪氨酸激酶的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分可以阻斷或不阻斷受體酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶的配體之間的相互作用。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分可以阻止或不阻止受體酪氨酸激酶的二聚化。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分可以不阻止配體誘導(dǎo)的受體二聚化，但會阻止受體酪氨酸激酶活化所需的近膜區(qū)之間的同型或異型相互作用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分阻止受體酪氨酸激酶各原體的胞外域的近膜區(qū)之間的同型或異型相互作用。例如，本發(fā)明的成分可以導(dǎo)致受體酪氨酸激酶各原體的胞外域末端(胞外域最接近于細(xì)胞膜的端部)以大于約15 A、約20A、約25 A、約30A、約35 A或約40A的距離間隔。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受體酪氨酸激酶是III型受體酪氨酸激酶，如KU、PDGFRa、PDGFRP、CSF1R、Fms、Flt3 或 Flk2。在其他的實(shí)施方案中，被本發(fā)明的成分結(jié)合的Ig-樣結(jié)構(gòu)域是III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該成分結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列=LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L為亮氨酸，R為精氨酸，G是甘氨酸，且m X4、X5、X6和X7是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，X1選自于蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬酰胺或賴氨酸；X2選自于亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自于賴氨酸、組氨酸、天冬酰胺和精氨酸；X4選自于甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自于蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自于谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自于甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，被本發(fā)明的成分結(jié)合的Ig-樣結(jié)構(gòu)域是III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域，如人Kit的氨基酸殘基309-413或410-519。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合到D5相互作用位點(diǎn)的保守氨基酸的共有序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合III型受體酪氨酸激酶D4或D5結(jié)構(gòu)域的突變體或結(jié)合V型受體酪氨酸激酶D7結(jié)構(gòu)域的突變體。在具體的實(shí)施方案中，該成分結(jié)合在人Kit的突變D5結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變，其中該突變選自于Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503 和 Ala502。在一些實(shí)施方案中，III型受體酪氨酸激酶是人Kit和本發(fā)明的成分結(jié)合從下面表4所示的那些氨基酸殘基組成的組中選擇的I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，如2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、11個(gè)或更多、12個(gè)或更多、13個(gè)或更多、14個(gè)或更多、15個(gè)或更多、16個(gè)或更多、17個(gè)或更多或18個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。例如，本發(fā)明的成分可以結(jié)合以下的一個(gè)或多個(gè)殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合選自于 K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371 和Y373中的Kit受體的至少一個(gè)氨基酸殘基，或選自于Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390中的Kit受體的至少一個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成表4中確定的口袋或空腔的所有殘基或者他們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的亞集。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分可以很容易地靶向其他III型RTK中與以上列出的那些殘基對應(yīng)的殘基，例如，那些形成類似的口袋或空腔的殘基或者通過結(jié)構(gòu)比對或序列比對處于相同位置的殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合人Kit的氨基酸殘基381Arg和386Glu15在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合人Kit的氨基酸殘基418Tyr和/或505Asiu在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合I3DGFRa或TOGFRP受體。在類似的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合人I3DGFRP的氨基酸殘基385Arg和/或39°G1u，或TOGFRa中的相應(yīng)殘基。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合III型RTK的構(gòu)象表位。在具體的實(shí)施方案中，該構(gòu)象表位由III型RTK，例如人Kit受體或TOGF受體，的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基構(gòu)成。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合由選自于表4中列出的那些氨基酸殘基中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基，如2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、11個(gè)或更多、12個(gè)或更多、13個(gè)或更多、14個(gè)或更多、15個(gè)或更多、16個(gè)或更多、17個(gè)或更多或18個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的人Kit受體中的構(gòu)象表位。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合由選自于 Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位。在類似的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合由選自于下組的氨基酸的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238 和 S239 ;K127、A207、F208 和 T295 ;L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371 和 Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371 ;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398 ;K218、A219、S220、N367、E368 和 S369 ;K218、A220、E368 和 S369；G384、T385、T411、K412、E414和 K471;Y408、F433、G470、K471和 L472;F324、V325、N326 和N410 ;D327、N410、T411、K412 和 V497 ;G384、G387、V409 和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ;K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470 和 K471 ;D327、T411、K412、E414、A431、G432 和 K471 ;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390 ;Y350、R353和F355。如上所述，本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成表4中確定的口袋或空腔的所有殘基或者他們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的亞集。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合構(gòu)象表位，其中該構(gòu)象表位是由選自 于表5中列出的肽中的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基組成的。在具體的實(shí)施方案中，該構(gòu)象表位是由選自于第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自于第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的，其中該第一和第二肽選自于表5中所列的肽。因此，本發(fā)明的成分可以結(jié)合其中第一和第二肽組如下的構(gòu)象表位Ala219-Leu222 和 Thr304_Val308 ；Asp309-Gly311 和Arg224-Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367_Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和 Asn396_Val399 ；Ala339-Pro343 和 Glu368_Arg372 ；Lys358-Tyr362 和Val374-His378 ;Asp357_Glu360 和 Leu377-Thr380 ;Met351_Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和 Val323_Asp332 ；Val409-Ile415 和 Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325-Asn330 ；Val409-Ile415 和 Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和 Gly384-gly388 ；Val325-Glu329 和Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497_Ala502 ;Ile415_Leu421 和 Ala502_Ala507 ；Ala502-Ala507 和 Lys484_Thr488 ；以及 Ala502_Ala507 和 Gly445_Cys450。本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成上述的第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或他們可以結(jié)合形成上述的第一和第二肽組的殘基的亞集。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合作為VEGF受體家族(V型受體酪氨酸激酶)成員的受體酪氨酸激酶，例如，VEGFR-I (Fltl)、VEGFR-2 (Flkl)和VEGFR-3 (Flt4)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分所結(jié)合的Ig-樣結(jié)構(gòu)域可以是VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，該成分結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列IX1RVX2X3EDX4G，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸；且父1、&、\和乂4是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，X1選自于谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；父2選自于精氨酸和蘇氨酸；X3選自于谷氨酸和賴氨酸；且\選自于谷氨酸和丙氨酸(SEQ IDNO :1)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分是分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。該抗體或其抗原結(jié)合部分可以是人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或嵌合抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。此外，本發(fā)明的成分可以是抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分選自于Fab片段、F (ab' ) 2片段、單鏈Fv片段、SMIP、親和體、親和性多聚體、納米抗體以及單域抗體。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分以Ix 10_7M或更小、更優(yōu)選地5x 10_8M或更小、更優(yōu)選地Ix10_8M或更小、更優(yōu)選地5x 10_9M或更小的KD結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人Kit的氨基酸殘基309-413或410-519，從而使人Kit的胞外域鎖定于非活性狀態(tài)并拮抗人Kit的活性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分是小分子。 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子結(jié)合選自于表4所示的那些氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。例如，本發(fā)明的小分子可以與下面的一個(gè)或多個(gè)殘基結(jié)合Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431 或 G432。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子結(jié)合選自于〖218、5220、￥221兒222、卩340、？341、1(342州367、￡368、5369、吧70、1371和Y373的Kit受體中的至少一個(gè)氨基酸殘基。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子結(jié)合選自于 Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386 和 T390 的 Kit 受體中的至少一個(gè)氨基酸殘基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子可以很 容易地靶向其他的III型RTK中與上述所列出的那些殘基對應(yīng)的殘基，例如，那些形成類似的口袋或空腔的殘基或那些通過結(jié)構(gòu)比對或序列比對處于相同位置的殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分是肽類分子。在一些實(shí)施方案中，該肽類分子是基于受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽類分子是基于Kit的D4結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的。本發(fā)明的肽類分子可以包含保守的D4相互作用位點(diǎn)，例如，如上所述的D4共有序列(LX1RX2X3X4X5X6X7G)，或通過比對或比較III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域所產(chǎn)生的其他序列。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽類分子包含與人Kit的氨基酸殘基309-413至少80%相同的結(jié)構(gòu)，或與人Kit的氨基酸殘基410-519至少80%相同的結(jié)構(gòu)。該肽類成分也可以基于Kit的D5結(jié)構(gòu)域而設(shè)計(jì)，且在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以包含通過比對或比較III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的共有序列。在可選的實(shí)施方案中，肽類分子可以基于突變的D5結(jié)構(gòu)域的序列或共有序列而設(shè)計(jì)。本發(fā)明的肽類成分可以是包含或由本文所確認(rèn)的任何氨基酸序列組成的肽(例如，SEQ ID NO :1-89、92、93 和 105-157)。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的肽類分子包含至少一個(gè)D-氨基酸殘基。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分是adnectin。此外，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子和肽類分子結(jié)合靶RTK中的構(gòu)象表位。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子和肽類分子結(jié)合到靶RTK中作為非構(gòu)象構(gòu)象表位的表位。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的任何成分以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在其他方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者中受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的方法。該方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的成分(例如，結(jié)合III型受體酪氨酸激酶的D4或D5結(jié)構(gòu)域或V型受體酪氨酸激酶的D7結(jié)構(gòu)域的成分)，從而治療或預(yù)防該疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病是淋巴疾病或癌癥，如GIST、AML、SCLC、黑色素瘤、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌及其他癌癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者中受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的方法，該方法通過向受試者施用有效量的結(jié)合人III型受體酪氨酸激酶的D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)的成分從而治療或預(yù)防該疾病。在具體的實(shí)施方案中，該受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病是癌癥，如GIST、AML、SCLC、黑色素瘤、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌及其他癌癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于鑒定結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域和使受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定于非活性狀態(tài)的成分的方法。該方法包括將受體酪氨酸激酶與候選成分接觸；同時(shí)地或相繼地將受體酪氨酸激酶與受體酪氨酸激酶的配體接觸；和測定該成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域和使受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定于非活性狀態(tài)的成分。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于鑒定將III型受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定于非活性狀態(tài)的成分的方法。該方法包括將III型受體酪氨酸激酶與候選成分接觸；同時(shí)地或相繼地將受體酪氨酸激酶與受體酪氨酸激酶的配體接觸；和測定該成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定將III型受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定于非活性狀態(tài)的成分。從下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求能夠清楚本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢。附圖簡要說明該專利或申請案包含至少一個(gè)以彩色完成的附圖。帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_文本將根據(jù)要求和繳納必要費(fèi)用后由專利局提供。圖IA-E描繪了 Kit胞外域的晶體結(jié)構(gòu)。圖IA顯示了 Kit胞外域單體的帶狀柵圖(ribbon diagram)(左)和表面不意圖(surface representation)(右)。右圖顯不的是左圖中顯示的視圖沿垂直軸旋轉(zhuǎn)了 90°后的視圖。Dl標(biāo)為藍(lán)色、D2標(biāo)為綠色、D3標(biāo)為黃色、D4標(biāo)為橙色和D5標(biāo)為粉色，標(biāo)記了 N和C末端。Dl和D5中的二硫鍵用球-棍表示，使硫原子標(biāo)為橙色。天冬酰胺連接的糖以棍模型顯示。圖IB-E提供了 D1-D2(B)、D2-D3(C)、D3-D4(D)和D4-D5(E)界面的詳細(xì)視圖。顏色編碼與圖IA相同。參與結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用的氨基酸被標(biāo)記，并且氫鍵用黃色虛線畫出。根據(jù)IgSF命名法命名二級結(jié)構(gòu)元件。圖2A-B描繪了 SCF-Kit胞外域2:2復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。圖2A顯示了 SCF-Kit 2:2復(fù)合體的帶狀柵圖。Dl到D5的顏色編碼與圖I相同，并且SCF標(biāo)為紅紫色。標(biāo)記了 Kit以及SCF的N和C末端。Dl和D5中的二硫鍵用球-棍表示，使硫原子標(biāo)為橙色。天冬酰胺連接的糖顯示為棍模型。箭頭標(biāo)記SCF-Kit 2:2復(fù)合體中大的空腔。圖2B顯示了 SCF-Kit胞外域2:2復(fù)合體的表面不意圖。該圖顯不了俯視圖(頂圖)、正視圖(中左圖)、側(cè)視圖(中右圖)和仰視圖(下圖)。顏色編碼與圖A相同。視圖顯示SCF 二聚體與兩個(gè)相應(yīng)的、Kit胞外域的D1、D2和D3對稱地相互作用。此外，Kit胞外域通過兩個(gè)相鄰受體的D4(橙色)之間和D5(粉紅色)之間的側(cè)向接觸形成同型相互作用。圖3A-E描繪了 Kit的SCF識別。圖3A顯示了 SCF-Kit界面的視圖。通過拉開兩個(gè)分子使SCF和Kit胞外域的包埋的表面中的氨基酸可視化。該圖顯示了 Kit Dl-D2-D3(左圖)和SCF(右圖)的分子表面。酸性氨基酸用紅色表示，堿性氨基酸用藍(lán)色表示，極性氨基酸用橙色表示和疏水性氨基酸用黃色表示。Kit上的SCF結(jié)合位點(diǎn)-I、位點(diǎn)-II和位點(diǎn)-III被圈起來。圖3B描繪了在配體-受體界面中靜電勢的互補(bǔ)性。右圖顯示了沿左圖呈現(xiàn)的靜電表面的垂直軸旋轉(zhuǎn)180°后的視圖。D1-D2-D3的靜電表面電位疊加在具有以標(biāo)為綠色的結(jié)合SCF的草圖印記的分子表面上。右圖描繪了 SCF-結(jié)合Kit的靜電表面電位，標(biāo)為藍(lán)色(正)和紅色(負(fù))。Kit以藍(lán)綠色的帶狀柵圖形式表示。圖3C-E顯示SCF-Kit界面的位點(diǎn)-I (C)、位點(diǎn)-II⑶和位點(diǎn)-III (E)的近視圖。SCF標(biāo)為綠色和Kit標(biāo)為藍(lán)綠色。標(biāo) 記了相互作用的氨基酸，用黃色虛線畫出氫鍵和用色和條標(biāo)記二級結(jié)構(gòu)元件。圖4A-C描繪了 SCF結(jié)合Kit時(shí)的構(gòu)象變化。圖4A顯示當(dāng)Kit結(jié)合時(shí)兩個(gè)SCF原體之間的角度發(fā)生了改變。該視圖顯示了游離的SCF(綠色)和結(jié)合Kit的SCF(紅紫色)的草圖。一個(gè)SCF原體(左)的疊加揭示了第二個(gè)原體(右)大約5°的角移動，正如對aC螺旋所測量的。標(biāo)記了螺旋并用圓柱體表示。圖4B描繪了當(dāng)Kit結(jié)合時(shí)SCF的N-末端的構(gòu)象變化。Kit的位點(diǎn)-III顯示為分子表面(灰色)、游離SCF的N-末端顯示為綠色和結(jié)合Kit的SCF的N-末端為紅紫色。Cys4’和Cys89’之間的二硫鍵顯示為黃色球。標(biāo)記了關(guān)鍵氨基酸并顯示為棍模型。圖4C描繪了當(dāng)結(jié)合Kit的位點(diǎn)-I時(shí)SCF的a C-P 2環(huán)的構(gòu)象變化。顏色編碼與圖B相同。圖5A-B描繪了 SCF結(jié)合時(shí)Kit D4和D5的重構(gòu)。圖5A顯示了 SCF-Kit復(fù)合體中D4和D5的重構(gòu)。Kit單體的D3與結(jié)合SCF的Kit的D3 (都標(biāo)為藍(lán)色)的疊加顯示，結(jié)合形式的D4(紅色)相對于游離形式的D4(綠色)的位置移動了 22°。兩種形式的D4(都為藍(lán)色)的疊加(右圖)表明SCF結(jié)合形式的D5 (紅色)相對于游離形式的D5 (綠色)的位置移動了 27°。兩幅底圖顯示了單體(綠色)和同型二聚體(紅色)形式的D3-D4和D4-D5界面的鉸鏈區(qū)的近視圖。圖5B顯示了 SCF占據(jù)的Kit的D4和D5的表面示意圖(頂圖)，以與圖2相同的方向觀察。黑色輪廓顯示通過結(jié)合到配體結(jié)合區(qū)域的SCF橋接的Kit胞外域單體的D4和D5的位置。D4和D5的重構(gòu)導(dǎo)致了兩個(gè)相鄰的胞外域的C-末端彼此之間的75人到15人的移動。下圖顯示SCF-Kit復(fù)合體的細(xì)胞膜的視圖(仰視圖)。注意沿X軸的90°的旋轉(zhuǎn)。Dl到D5的顏色編碼同圖I。圖6A-D描繪了 D4-D4和D5-D5界面的視圖。圖6A(頂圖)顯示了呈現(xiàn)D4-D4界面的I. I O水平下勾畫的2Fo-Fc電子密度圖。Kit原體的骨架分別呈現(xiàn)為粉紅色和黃色管。兩個(gè)相鄰胞外域的D4-D4界面的近視圖(下圖)。在兩個(gè)相鄰D4的Arg381和Glu386之間形成的鏈間氫鍵標(biāo)為黃色。標(biāo)記了關(guān)鍵氨基酸并用棍模型顯示。根據(jù)IgSF命名法標(biāo)記二級結(jié)構(gòu)元件。圖6B描繪了 III型和V型RTK家族的成員間的D4-D4 二聚化基序的保守性。人 Kit 殘基 370-398 (AAC50969. I) (SEQ ID NO 94)與小鼠(AAH75716. I) (SEQID NO :95)、雞(NP_989692. I) (SEQ ID NO :96)、爪蟾(AAH61947) (SEQ ID N0:97)、真螈(AAS91161. I) (SEQ ID NO 98)和斑馬魚(A 型(SEQ ID NO 99)和 B 型(SEQ ID NO :100)(NP_571128，XP_691901)同源物的序列比對。也顯示了人CSF1R(P07333) (SEQ ID N0:101)、小鼠(P09581) (SEQ ID NO :102)及河豚(torafugu)A 型(SEQ ID NO :103)和 B 型(SEQ IDNO :104) (P79750、Q8UVR8)的氨基酸序列以及人 PDGFR a 和 PDGFR P (分別為 SEQ ID NO:105 和 107) (P16234、P09619)及小鼠(分別為 SEQ ID NO :106 和 108) (NP_035188, P05622)的序列。也顯示了人VEGFR 1-3型的V型RTK的氨基酸序列(以出現(xiàn)先后為序分別為SEQID NO =109-111)(第七Ig樣結(jié)構(gòu)域)(P17948、P35968和P35916)。在序列比對的頂部標(biāo)記Kit 的二級結(jié)構(gòu)元件。保守殘基 Arg381 和 Lys383、Leu382 和 Leu379、Glu386 和 Gly388 分別標(biāo)為藍(lán)色、黃色、紅色和綠色。圖6C描繪了 D5-D5界面的帶狀柵圖。兩個(gè)鄰近Kit原體的A鏈和G鏈參與了 D5-D5界面的形成。D5-D5界面可能是通過離子或水分子由兩個(gè)相鄰受體的Tyr418和Asn505之間的側(cè)向相互作用維持的。圖6D描繪了 Kit的D4和D5的靜電勢表面。圖中顯示了 D4-D4相互作用表面的正視圖(右圖)和沿垂直軸旋轉(zhuǎn)90°后的視圖(左圖)。圈出了酸性補(bǔ)丁和D4-D4界面的位置并標(biāo)記了相互作用殘基Arg381和Glu386。圖7A-C描繪了涉及到癌癥和其他疾病以及Kit和其它RTK激活的機(jī)理的Kit胞外域突變。圖7A描繪了在左圖中顯示的導(dǎo)致花斑性狀的功能缺失突變。Dl (藍(lán)色)、D2(綠色)和D3(黃色)的帶狀柵圖和SCF(灰色)的表面示意圖。突變的氨基酸標(biāo)為紅色。右圖 顯示導(dǎo)致GIST、SCLC和AML的功能獲得突變。同型二聚體形式的D4和D5的表面示意圖以灰色顯示。在GIST中加倍的Ala502和Tyr503標(biāo)為藍(lán)色且接近Asp419的缺失和插入突變(AML和NCLL)標(biāo)為綠色。注意，激活的Kit突變局限于D5-D5界面。圖7B顯示，Kit活化被D4-D4界面中的點(diǎn)突變減弱。正如所標(biāo)明的(左上圖)，瞬時(shí)表達(dá)野生型Kit (WT)、D4中的R381A或E386A點(diǎn)突變的HEK293細(xì)胞用10ng/ml的SCF在37°C下刺激6分鐘。未刺激的或SCF刺激的細(xì)胞的裂解液用抗-Kit抗體進(jìn)行免疫沉淀(IP)，然后進(jìn)行SDS-PAGE和用抗-Kit抗體或抗磷酸酪氨酸(p-Tyr)抗體進(jìn)行免疫印跡(IB)?？?p_Tyr-免疫印跡的Kit酪氨酸自磷酸化的密度定量(右上圖)。用不同濃度的SCF處理穩(wěn)定表達(dá)野生型Kit(WT)或R381A突變體的3T3細(xì)胞。來自未刺激的或SCF刺激的細(xì)胞的裂解液用抗-Kit抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE并用抗-Kit抗體或抗-p-Tyr抗體進(jìn)行免疫印跡(左下圖)。用天然SCF進(jìn)行的細(xì)胞結(jié)合125I-SCF的置換分析。存在漸增濃度的天然的SCF情況下用 125I-SCF 處理表達(dá) WT ( ■ )、R381A( ▼ )、R381A/E386A( )或激酶陰性 Kit(A)的3T3細(xì)胞。SCF對于WT Kit的EC50 (置換50%的結(jié)合c-Kit的SCF的配體濃度)(I. InM)與 SCF 對于 R381A(1. OnM)、R381A/E386A(0. 8nM)或激酶陰性 Kit 突變體(I. 4nM)的 EC50相當(dāng)。圖7C顯示了由可溶性的(左圖)或在相鄰細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的膜錨定的(右圖)SCF分子驅(qū)動的Kit和其它RTK的活化的模型。SCF結(jié)合D1-D2-D3配體結(jié)合模塊使得兩個(gè)結(jié)合的Kit胞外域單體的C-末端彼此相距75人以外。D3-D4和D4-D5鉸鏈的靈活性使得能夠?qū)崿F(xiàn)使兩個(gè)相鄰胞外域的C-末端彼此在15人以內(nèi)的橫向D4-D4和D5-D5相互作用。因此，增加的接近性和Kit胞質(zhì)域的局部濃度提高導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域中調(diào)控性酪氨酸殘基的自磷酸化，從而導(dǎo)致PTK活化。(注意PTK活化未在模型中畫出)。胞質(zhì)域中關(guān)鍵酪氨酸的磷酸化后，將進(jìn)行細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子的補(bǔ)體的募集和活化。該模型是基于游離SCF的結(jié)構(gòu)、無配體Kit、SCF-Kit復(fù)合體和Kit PTK結(jié)構(gòu)(PDB項(xiàng)目1QZJ、1R01和1T45)。對結(jié)構(gòu)還未確定的區(qū)域用二級結(jié)構(gòu)預(yù)測進(jìn)行建模(綠色螺旋和黑色環(huán))。SCF標(biāo)為紫紅色、Kit胞外域標(biāo)為藍(lán)色和kit PTK標(biāo)為淡藍(lán)色。圖8描繪了 III型RTK的基于結(jié)構(gòu)的序列比對，基于Kit胞外域的結(jié)構(gòu)，和基于結(jié)構(gòu)的III型家族RTK的配體的比對。各排顯示單個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的比對?；贗gSF折疊特征手動比對氨基酸序列，如由(Harpaz等人.(1994) J Mol Biol 238 =528-539)確定的，并且與Jpred(Cuff等人.(1998)Bioinformatics 14:892-893)計(jì)算的家族成員的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相一致。紅色標(biāo)記的氨基酸代表IgSF折疊決定氨基酸。在序列上方用箭頭標(biāo)記P鏈和用彈簧標(biāo)記a -螺旋，以及人Kit和人SCF的編號。用星號標(biāo)記配體結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出溶劑可達(dá)性降低的配體結(jié)合位點(diǎn)的殘基。位點(diǎn)-I標(biāo)為黑色、位點(diǎn)-II標(biāo)為紅色和位點(diǎn)-III標(biāo)為綠色。相同的顏色編碼被用于標(biāo)記SCF中的相 互作用的氨基酸殘基。用藍(lán)綠色的方框圈出負(fù)責(zé)D4-D4相互作用的D4EF環(huán)。用于比對的序列是人Kit (AAC50969)、Kit小鼠(AAH75716)、CSFRl 人(P07333) ,PDGFRa 人(P16234) ,PDGFR^ 人(P09619)和 Flt3 人(P36888)。對于配體結(jié)構(gòu)比對，用 Lsqman (Kleywegt 和 Jones，1995)對 SCF (IEXZ) XSF(IHMC)、Flt3L (IETE)的PDB項(xiàng)進(jìn)行疊加，并用ClustalW比對小鼠SCF的序列(NP_038626)和人SCF。圖分別按出現(xiàn)的先后順序顯示了 SEQ ID NO :112-147。圖9提供了 2:2SCF_Kit復(fù)合體的結(jié)構(gòu)的立體視圖。2:2SCF_Kit復(fù)合體的帶模型以立體示意圖顯示。視圖和顏色編碼與圖2A相同。圖IOA-B描繪了 SCF-Kit復(fù)合體表面的氨基酸保守性。圖IOA顯示彩色編碼的SCF-Kit晶體結(jié)構(gòu)復(fù)合體的保守性模式。藍(lán)綠色至栗色用來標(biāo)記從可變氨基酸到保守氨基酸。圖IOB顯示了通過將兩個(gè)分子彼此拉開而得到的SCF和Kit可視化。圈出了位點(diǎn)I、位點(diǎn)II和位點(diǎn)III以及D4-D4相互作用區(qū)域(D4-D4界面)。圖IlA-B描繪了 SCF-Kit界面的電子密度。圖IlA顯示了具有以2 o水平在Kit周圍繪出的電子密度圖的2:2 SCF-Kit復(fù)合體的位點(diǎn)II的局部視圖。除標(biāo)記的側(cè)鏈外，用黃色管繪出Kit主鏈。圖IlB描繪了 SCF-Kit界面的電子密度，顯示了具有以1.5 0水平在Kit周圍繪出的實(shí)驗(yàn)圖的游離Kit的局部視圖。方向和顏色編碼與

圖12A相同。圖12A-D描繪了游離的和SCF結(jié)合的Kit的Ig樣結(jié)構(gòu)域的疊加對的視圖。游離的和SCF結(jié)合的Kit的單獨(dú)D1、D2、D3和D4疊加在一起。顯示的是Ig樣結(jié)構(gòu)域(A)Dl和D2、⑶D2和D3、(C)D3和D4以及(D)D4和D5對的結(jié)構(gòu)，其中各對中疊加的Ig樣結(jié)構(gòu)域標(biāo)為藍(lán)色且第二(未疊加)Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)τ谟坞x的胞外域標(biāo)為綠色和對于SCF結(jié)合的胞外域標(biāo)為紅色。這些圖顯示，當(dāng)SCF結(jié)合時(shí)五個(gè)單獨(dú)Kit Ig樣結(jié)構(gòu)域的各結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)實(shí)際上沒發(fā)生變化，且D1-D2-D3作為準(zhǔn)備用于SCF結(jié)合的配體結(jié)合單元發(fā)揮作用。相反，在SCF結(jié)合的Kit中D3-D4和D4-D5界面發(fā)生大的重排。圖13A-B描繪了 SCF-Kit復(fù)合體結(jié)構(gòu)的靜電表面電位。圖13A具體地顯示了SCF-Kit 2:2復(fù)合體。圖13B描繪了 SCF-Kit復(fù)合體結(jié)構(gòu)的靜電表面電位，具體地說在SCF被從SCF-Kit 2:2復(fù)合體中拉開后，Kit的靜電表面電位的可視化。帶正和負(fù)電荷的表面分別標(biāo)為藍(lán)色和紅色。圈出了 SCF結(jié)合區(qū)域和D4-D4界面。圖14描繪了抗Kit_D5抗體抑制SCF誘導(dǎo)的Kit激活。表達(dá)Kit的3T3細(xì)胞用漸增濃度的抗Kit-D5(針對Kit的第五Ig樣結(jié)構(gòu)域)孵育或作為對照用抗-SCF(針對SCF配體)或抗-Kit胞外域(針對整個(gè)Kit胞外域)孵育。圖15描繪了用重組Kit D4抑制SCF誘導(dǎo)的Kit激活。表達(dá)Kit的3T3細(xì)胞用漸增濃度的重組Kit-D4室溫下孵育10分鐘,然后SCF刺激10分鐘。圖16A顯示D4中的點(diǎn)突變阻止I3DGF誘導(dǎo)的I3DGFR激活。對表達(dá)WT PDGFR或D4突變體(R385A和E390A)的roGFR-/_MEF血清饑餓過夜并用注明濃度的TOGF BB刺激5分鐘。細(xì)胞裂解液用抗-PDGFR抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE和用抗-磷酸酪氨酸抗體4G10進(jìn)行免疫印跡。膜剝離，并用抗-flag標(biāo)簽抗體再印跡分析以確定總TOGFR水平。圖16B表明D4中的點(diǎn)突變阻止經(jīng)由I3DGFR的信號傳導(dǎo)。對表達(dá)WT PDGFR和D4突變體(R385A和E390A)的roGFR-/_MEF血清饑餓過夜，并用注明濃度的TOGF BB在23°C下刺激5分鐘。等量的總細(xì)胞裂解液(TCL)進(jìn)行SDS-PAGE和分別用抗-磷酸_MAPK、MAPK、磷酸-Akt和Akt進(jìn)行免疫印跡。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，D4中的點(diǎn)突變阻止了 MAPK反應(yīng)和Akt活化。圖16C表明阻止TOGFR激活的D4點(diǎn)突變不干擾I3DGF誘導(dǎo)的TOGFR二聚化。對表達(dá)WT或E390A突變體的roGFR-/-MEF血清饑餓過夜，隨后用含有注明量的I3DGF的DMEM/50mMHEPES緩沖液(pH7. 4)在4°C孵育90分鐘。去除未結(jié)合的配體后，細(xì)胞用PBS中的0. 5mM 的辛二酸二琥珀酰亞胺(DSS)孵育30分鐘。用抗-PDGFR抗體對未刺激的或刺激的細(xì)胞的裂解液進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析和用抗-flag抗體(左圖)或抗-pTyr抗體(右圖)進(jìn)行免疫印跡。圖17顯示D3-D4鉸鏈區(qū)中的空腔。幾個(gè)空腔散布在胞外域單體結(jié)構(gòu)的D3-D4界面上。參與限定空腔的氨基酸總結(jié)于表4(如下)中。當(dāng)兩個(gè)Kit受體之間形成同型相互作用時(shí)，D3-D4鉸鏈區(qū)發(fā)生改變導(dǎo)致形成由下列殘基形成的淺空腔D3的K218、S220、Y221、L222 和 D4 的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371、Y373。圖 17 顯示了未占據(jù)的單體(A)和SCF-結(jié)合的二聚體(B)的D3-D4鉸鏈區(qū)的帶狀柵圖和D3-D4 口袋的網(wǎng)格示意圖。圖18顯示了 D4-D5鉸鏈區(qū)中的空腔。小空腔由Kit單體的D4的AB環(huán)和EF環(huán)、連接D4-D5的接頭和D5的部分DE環(huán)和FG環(huán)形成。限定空腔的殘基總結(jié)于表4(如下)中。在Kit胞外域二聚體結(jié)構(gòu)中空腔的形狀和大小是改變的。由D4的EF環(huán)和G鏈、D4-D5接頭和D5的B鏈和DE環(huán)形成的主要空腔位于D4的EF環(huán)之下，D4同型界面形成的關(guān)鍵區(qū)域。注意，如未結(jié)合的和占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)的電子密度的較低質(zhì)量所揭示的，靠近空腔定位的D5的DE環(huán)可具有更高的靈活性。圖18顯示了未占據(jù)的單體(A)和SCF-二聚體(B)的帶狀柵圖和D4-D5鉸鏈區(qū)周圍的淺空腔的網(wǎng)格示意圖。圖19顯示了介導(dǎo)D4同型相互作用的區(qū)域處的空腔。Kit D4的⑶環(huán)和EF環(huán)形成的凹面位于D4同型界面正上方。D4的殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390為胞外域二聚結(jié)構(gòu)中的凹面提供了大約130A2的表面積。在D4同型界面中起著重要作用的Glu386的側(cè)鏈向表面的中心突出。凹面的特征性結(jié)構(gòu)是由帶電的殘基(Glu386和Lys358)圍繞的小的疏水補(bǔ)丁。當(dāng)同型D4:D4相互作用時(shí)該表面的大小和可接近性發(fā)生改變，CD環(huán)的構(gòu)象中發(fā)生朝向結(jié)構(gòu)域頂部折疊的變化。參與形成凹面的殘基總結(jié)于表4(如下)中。下圖中圖A顯示了覆蓋在配體-占據(jù)的Kit D4(未示出)上的未占據(jù)的Kit D4結(jié)構(gòu)域(金色)的帶狀柵圖，配體-占據(jù)(綠色)和未占據(jù)的胞外域結(jié)構(gòu)(紅色)之間的CD環(huán)和EF環(huán)的構(gòu)象不同。D4:D4相互作用的關(guān)鍵殘基以棍模型形式表示。圖B和C顯示了未占據(jù)的Kit (圖19B)和SCF-占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)(圖19C)的帶狀柵圖和D4同型界面之上的淺空腔的網(wǎng)格示意圖。圖20顯示了配體-結(jié)合的D2和D3區(qū)域處的凹面。淺凹面位于D2和D3的部分配體結(jié)合表面。包括于小口袋中的殘基是D2的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206 和 F208 以及 D3 的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269?？诖峭ㄟ^由親水性殘基包圍的小疏水補(bǔ)丁形成的。未占據(jù)的和SCF-占據(jù)的Kit結(jié)構(gòu)之間沒有大的變化，整體包埋的表面積約為500A2。圖A和圖B顯示了未占據(jù)的Kit(A)和SCF-結(jié)合的Kit (B)的帶狀柵圖和D2-D3 口袋的網(wǎng)格示意圖。圖21描繪了 TOGF受體近膜區(qū)的基于結(jié)構(gòu)的序列分析和同源性建模。圖21A描繪7 PDGFRa ,PDGFR^和Kit的D4的氨基酸序列(按出現(xiàn)順序分別為SEQ ID NO =148-157)的比對。人Kit結(jié)構(gòu)D4的IgSF折疊的關(guān)鍵殘基和Ig折疊的核心殘基的氨基酸相應(yīng)地標(biāo)為紅色和綠色。負(fù)責(zé)D4同型相互作用的兩個(gè)關(guān)鍵堿性和酸性殘基分別用藍(lán)色和紅色框出。對應(yīng)于在Ig樣結(jié)構(gòu)域(B5和F5)上保守的二硫鍵形成半胱氨酸殘基的位置用星號標(biāo)記。在Kit序列下面用箭頭標(biāo)記P -鏈。根據(jù)IgSF命名法標(biāo)記二級結(jié)構(gòu)元件。圖21B描繪了 TOGFR胞外結(jié)構(gòu)域的近膜域模型。TOGFRP胞外域的近膜區(qū)域標(biāo)為白色并且顯示為具有透明的分子表面的帶(D4標(biāo)為橙色和D5標(biāo)為粉色；左圖)。兩個(gè)相鄰的I3DGFRP分子的D4-D4界面的放大圖(右圖)表明，D4之間的相互作用是由從兩個(gè)鄰近的EF環(huán)伸出的殘基Arg385和Glu390介導(dǎo)的。標(biāo)記了關(guān)鍵氨基酸并以棍模型表示。 圖22描繪了證明I3DGF誘導(dǎo)的I3DGFR激活被D4中的突變影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖22A顯示了表明I3DGF誘導(dǎo)的TOGFRP的酪氨酸自磷酸化在表達(dá)I3DGFRP的E390A、R385A、RE/AA和RKE/AAA突變體的細(xì)胞中受到強(qiáng)烈影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖22B是顯示了野生型和突變體PDGFR^的置換曲線的曲線圖。用Prism4通過曲線擬合確定IC50值。圖22C描繪了免疫印跡的結(jié)果，其證明R385A、E390A或RE/AA突變體不影響I3DGFR的固有酪氨酸激酶活性。圖23描繪了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其表明^)6 -刺激的04結(jié)構(gòu)域突變的^^卩1^ 在細(xì)胞表面上以非活性的二聚體形式表達(dá)。細(xì)胞裂解液用抗-PDGFR抗體進(jìn)行免疫沉淀，并通過SDS-PAGE分析免疫沉淀物和分別用抗-flag抗體(左圖)和抗磷酸酪氨酸抗體(右圖)進(jìn)行免疫印跡。圖24描繪了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其表明TOGF誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)受TOGFRP D4突變體中突變的影響。圖25描繪表明在表達(dá)TOGFR D4突變體的MEF中，肌動蛋白環(huán)形成的TOGF刺激受到影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。大約83%的表達(dá)WT I3DGFR的MEF表現(xiàn)出環(huán)形肌動蛋白環(huán)形成，但只有5%的TOGFR D4突變體細(xì)胞在用50ng/ml的TOGF刺激2分鐘后表現(xiàn)出相似的環(huán)形肌動蛋白環(huán)形成。此外，在I3DGF刺激后2-5分鐘在表達(dá)WT PDGFR的MEF中達(dá)到峰值的瞬時(shí)環(huán)形肌動蛋白環(huán)形成在表達(dá)R385A、E390A或RE/AA的TOGFR突變體的細(xì)胞中微弱地檢測到。圖26描繪了表明TOGFR D4中的突變影響I3DGFR內(nèi)化和泛素介導(dǎo)的I3DGFR的降解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖26A是表明與表達(dá)WT PDGFR的MEF結(jié)合的125I標(biāo)記TOGF的內(nèi)化動力學(xué)要比與表達(dá)E390A、R385A或RE/AAPDGFR的細(xì)胞結(jié)合的125I標(biāo)記I3DGF的內(nèi)化動力學(xué)快得多的曲線圖。圖26B表明，R385A、E390A或RE/AA I3DGFR突變體的降解動力學(xué)大大減弱；雖然一半的WT PDGFR在TOGF刺激的I. 5小時(shí)之內(nèi)降解，但是I3DGFR D4突變體的半衰期延長到大約4至6小時(shí)。26C圖描繪了顯示在相同條件下與WT TOGFR相比，PDGF誘導(dǎo)的E390APDGFR的泛素化也大大降低的實(shí)驗(yàn)。圖27描繪了表明D4界面的破壞阻斷了 KIT中的致癌突變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。野生型Kit的SCF刺激導(dǎo)致了由KIT的酪氨酸自磷酸化的增強(qiáng)顯示的KIT活化的增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，KIT的致癌性D5重復(fù)突變體是組成型酪氨酸自磷酸化的。相反，D5-重復(fù)/E386A突變體阻斷了由致癌的D5-重復(fù)突變介導(dǎo)的KIT的組成型酪氨酸自磷酸化。圖28描繪了免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其表明抗對應(yīng)于KIT-D4的同型相互作用基序的肽的抗體識別全長KIT受體。圖29A描繪了來自不同物種的VEGFRl和VEGFR2的D7的預(yù)測EF環(huán)區(qū)域的基于結(jié)構(gòu)的多序列比對。I-群Ig框中的關(guān)鍵氨基酸用綠色突出顯示，以及EF環(huán)中的保守Arg/Asp對用紅色突出顯示。圖29B描繪了 VEGFR的D4及KIT、CSFlR和I3DGFR(III型RTK)的D4的預(yù)測EF環(huán)區(qū)域的比較。I-群Ig框中的關(guān)鍵氨基酸以綠色突出顯示，并且EF環(huán)中的保守Arg/Asp或Glu對以紅色突出顯示。EF環(huán)中帶相反電荷的非保守氨基酸以藍(lán)色突出顯示。保守的Y-conner基序用*標(biāo)記。
圖30表明配體誘導(dǎo)的VEGFR2的活化被D7的EF環(huán)區(qū)域中突變?nèi)趸皇蹹4的EF環(huán)區(qū)域中突變的影響。圖30A表明用注明量的VEGF在37°C刺激瞬時(shí)表達(dá)野生型VEGFR2、R726A或E731A VEGFR2突變體的HEK293細(xì)胞5分鐘。未刺激的或VEGF刺激的細(xì)胞的裂解液用抗-VEGFR2抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后與抗-pTyr或與抗-VEGFR2抗體進(jìn)行免疫印跡(IB)。用SDS-PAGE分析由同一實(shí)驗(yàn)得到的總細(xì)胞裂解液，然后用抗-磷酸MAPK (pMAPK)或抗-MAPK抗體進(jìn)行免疫印跡。圖30B表明，穩(wěn)定表達(dá)WT VEGFR2-PDGFR嵌合受體或攜帶D7區(qū)域中的突變(R726A、D731A或R726/D731雙突變體RD/2A)的嵌合受體的血清饑餓的3T3細(xì)胞在37°C下用VEGF刺激5分鐘。未刺激的或VEGF刺激的細(xì)胞的裂解液用抗嵌合受體的胞質(zhì)區(qū)的抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后分別用抗-PTyr或抗-標(biāo)簽(FLAG)抗體進(jìn)行免疫印跡。圖30C表明，穩(wěn)定表達(dá)WT VEGFR1-PDGFR嵌合受體或攜帶D7區(qū)域中的突變(R721A、D725A或R721D725/2A雙突變)的嵌合受體的血清饑餓的3T3細(xì)胞在37°C下用VEGF刺激5分鐘。未刺激的或VEGF刺激的細(xì)胞的裂解液用抗嵌合受體的胞質(zhì)區(qū)的抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后分別用抗-PTyr或抗-標(biāo)簽(FLAG)抗體進(jìn)行免疫印跡。圖30D表明，如圖30A中所述的分析了表達(dá)WT VEGFR2-PDGFR嵌合受體或攜帶在D4區(qū)中的突變(D392A或D387/R391A雙突變)的嵌合受體的3T3細(xì)胞。。圖31描繪了 VEGFR2胞外域D7 二聚體的結(jié)構(gòu)。圖31A描繪了 D7同型二聚體結(jié)構(gòu)的帶狀柵圖和透明分子表面(側(cè)視圖)。Asp731和Arg726以棍模型顯示。圖31B描繪了兩個(gè)相鄰分子(粉色和綠色)的同型D7界面的近視圖。由Asp731和Arg726形成的鹽橋顯示為虛線。圖31C描繪了作為表面電位模型的D7 二聚體(側(cè)視圖)的電荷分布(左圖)。介導(dǎo)同型接觸的D7表面的視圖(右圖)。圖31D描繪了以I. Io水平描繪的2Fo-Fc電子密度圖，呈現(xiàn)出D7-D7界面的視圖。VEGFR D7原體的骨架分別表示為粉色和黃色管。圖32描繪了 VEGFR2的D7結(jié)構(gòu)與二聚的KIT-SCF復(fù)合體的D4結(jié)構(gòu)的疊加。VEGFRD7結(jié)構(gòu)(PDB ID代碼3KVQ)和與SCF的復(fù)合體的KIT 二聚體(PDB ID代碼2E9W)的覆蓋圖(左圖)。疊加的D7和D4區(qū)域的放大圖(右圖)顯示了結(jié)構(gòu)域排列和同型接觸的高度相似性。VEGFR D7顯示為綠色和EF環(huán)為黃色。KIT的D4顯示為灰色以及它的EF環(huán)為橙色。圖33描繪了 VEGFRl和VEGFR2的系統(tǒng)發(fā)生分析。圖33A描繪了來自各種不同物種的III型和V型RTK的保守EF環(huán)的位置。含有保守的EF環(huán)基序的Ig樣結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為藍(lán)色。圖33B描繪了 VEGFR2 D7區(qū)域的顏色編碼的保守模式。人VEGFR的氨基酸序列作為查詢序列使用PSI-BLAST來對非冗余數(shù)據(jù)庫(nr)進(jìn)行同源序列檢索(Altschul等人，J. Mol. Boiol.，215(3) :403-410(1990))。用 ClustalW2 (Thompson 等人，Nucleic Acids Res. ,22(22)4673-4680(1994))進(jìn)行D7的序列比對，基于對20個(gè)關(guān)鍵殘基的IgSF折疊限制進(jìn)行手動調(diào)節(jié)。氨基酸序列的比對提交到Consurf 3. 0服務(wù)器(Landau等人,Nucleic Acids Res.,33 (Web Server號)W299_302 (2005))以產(chǎn)生各個(gè)位置的最大似然歸一進(jìn)化速率。藍(lán)綠色至栗色用來標(biāo)記從可變氨基酸到保守氨基酸。圖33C描繪了使用Clustal W2基于鄰接法生成的VEGFRl和VEGFR2的系統(tǒng)發(fā)生樹。在分析中使用的氨基酸序列包括VEGFR2_HUMAN(gi 11321597)、VEGFR2_D0G(gi :114158632)、VEGFR2_H0RSE (gi :194209154)、VEGFR2_CATTLE(gi :158508551)、VEGFR2_RAT(gi :56269800)、VEGFR2_M0USE (gi :27777648)、VEGFR2_CHICK(gi :52138639)、VEGFR2_QUAIL (gi :1718188)、VEGFR2_ZEBRARISH(gi 46401444)、VEGFRl_HUMAN(gi :143811474)、VEGFR1_M0USE (gi :148673892)、VEFGR1_RAT(gi :149034835)、VEFGR1_H0RSE (gi :149730119)、VEGFR1_CHICK (gi :82105132)、VEGFR1_ZEBRAFISH (gi :72535148)、VEGFR_SEAURCHIN (gi :144226988)、VER1_C_ELEGANS (gi :6003694)、VER3_C_ELEGANS (gi :3877967)、VER4_C_ELEGANS (gi :3877968)、PVR_DR0S0PHILA(gi :45552252)、VEGFR_SEASQUIRT(gi :198434052)。 發(fā)明詳述本發(fā)明提供了結(jié)合受體酪氨酸激酶，例如VEGF受體如VEGFRl (Fltl)、VEGFR2 (KDR/Flkl)和VEGFR3 (Flt4)，的胞外域，例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈，的成分，例如抗體或其抗原結(jié)合部分、小分子、肽類分子、適體和Adnectin。本發(fā)明的成分可以使VEGF受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，從而抑制VEGF受體的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該成分使VEGF受體的胞外域鎖定在單體狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該成分允許VEGF受體的胞外域二聚化，但影響兩個(gè)單體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離(例如，VEGF受體的D7-D7結(jié)構(gòu)域)，從而抑制VEGF受體的活性。換句話說，該成分可以允許VEGF受體胞外域的配體誘導(dǎo)的二聚化，但影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面處的定位或者改變或阻止VEGF受體中的構(gòu)象變化，從而抑制VEGF受體的活性(例如，抑制受體內(nèi)化和/或抑制受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制受體激活下游信號傳導(dǎo)途徑的能力)。本發(fā)明至少部分地基于VEGF受體VEGFR2整個(gè)胞外域的晶體結(jié)構(gòu)的破譯。這種晶體結(jié)構(gòu)的破譯使得能夠鑒別本發(fā)明的成分可以靶向于的表位，例如，構(gòu)象表位。如本文中所使用，術(shù)語“成分”意圖包括任何結(jié)合受體酪氨酸激酶的胞外域(例如Ig樣結(jié)構(gòu)域)的成分，其中所述成分將受體酪氨酸激酶的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，例如單體狀態(tài)，從而拮抗受體酪氨酸激酶的活性。所述成分可以是分離的抗體或其抗原結(jié)合部分；小分子；肽類分子(例如基于受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的肽類分子)；適體或adnectin。在一些方面,所述成分結(jié)合連接受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)(例如III型RTK的D3-D4或D4-D5鉸鏈區(qū))。在一些實(shí)施方式中，所述成分將結(jié)合人VEGF受體的特定序列，例如，VEGFRl的718-727 殘基、VEGFRl 的 Arg720 和 Asp725 殘基、VEGFR2 的 724-733 殘基、VEGFR2 的 Arg726和Asp731殘基、VEGFR3的735-744殘基或VEGFR3的Arg737和Asp742殘基。所述成分可選地結(jié)合人Kit受體的特定序列，例如人Kit的殘基309-413、殘基410-519、381Arg和386Glu或418Tyr和505Asno殘基309-413包含D4結(jié)構(gòu)域，殘基410-519包含人Kit的D5結(jié)構(gòu)域，并在本文中表明對于Kit受體二聚化至關(guān)重要。殘基381Arg和386Glu是Kit的D4結(jié)構(gòu)域中的殘基，在本文中表明對于D4結(jié)構(gòu)域的非共價(jià)連接是重要的，因此，對于受體的二聚化是重要的。類似地,殘基418Tyr和5ci5Asn是Kit的D5結(jié)構(gòu)域中的殘基，在本文中表明對于受體的二聚化是重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，特異性結(jié)合上述殘基的成分可以通過例如阻止兩個(gè)單體Kit或VEGF受體分子的二聚化而拮抗受體的活性。在另外的實(shí)施方案中，所述成分結(jié)合人VEGF受體的突變的氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基是至少 VEGFRl 的 Arg720 或 ASP725、VEGFR2 的 Arg726 或 Asp731 或 VEGFR3 的Arg737或Asp742之一。在另外的實(shí)施方式中，所述成分結(jié)合人Kit中突變的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基是 417Thr、418Tyr、419ASp、421LeU、42°Arg、5°3Tyr 或 5tl2Ala 中的至少之一。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合Kit受體中的一或多個(gè)殘基，這些殘基構(gòu)成在表4 (下文)中所述的小腔或口袋。例如，本發(fā)明的成分可以結(jié)合Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222和來自D4結(jié)構(gòu)域 的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本發(fā)明的成分也可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)以下殘基，這些殘基構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合一個(gè)或多個(gè)以下殘基，這些殘基形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)中的口袋來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206 和 F208,以及來自 D3 結(jié)構(gòu)域的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的近膜區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動分子楔(molecular wedge)的作用。本發(fā)明的成分也可以起到阻止同型或異型的D4或D5受體相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的成分結(jié)合Kit受體上的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以容易地靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對或序列比對處于相同位置的那些殘基。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK(例如人Kit受體或TOGF受體)的D3、D4和/或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由表4中所列的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的成分結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 的氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合由選自以下的氨基酸組之一的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238和S239 ;K127、A207、F208和T295 ；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、I371 和 Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398;K218、A219、S220、N367、E368 和S369 ;K218、A220、E368 和 S369 ;G384、T385、T411、K412、E414 和 K471 ;Y408、F433、G470、K471 和 L472 ;F324、V325、N326 和 N410 ;D327、N410、T411、K412 和 V497 ;G384、G387、V409和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ;Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470 和 K471 ;D327、T411、K412、E414、A431、G432 和K471 ;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386 和 T390 ;Y350、R353 和 F355。如以上所指出的，本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成如表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在特定實(shí)施方式中，當(dāng)提到結(jié)合表位例如構(gòu)象表位的本發(fā)明的成分時(shí)，意圖是所述成分僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表4中確定的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種具體實(shí)施方式
中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的成分可以結(jié)合構(gòu)象表位，其中來自表 5 的所述第一和第二肽組如下Ala219-Leu222 和 Thr304_Val308 ；Asp309-Gly311 和Arg224-Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367_Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和 Asn396_Val399 ；Ala339-Pro343 和 Glu368_Arg372 ；Lys358-Tyr362 和Val374-His378 ；Asp357-Glu360 和 Leu377-Thr380 ;Met351_Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和 Val323_Asp332 ；Val409-Ile415 和 Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325_Asn330 ；Val409-Ile415 和 Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和 Gly384-Gly388 ；Val325-Glu329 和Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497_Ala502 ;Ile415_Leu421 和 Ala502_Ala507 ;Ala502-Ala507 和 Lys484_Thr488 ;及 Ala502_Ala507 和 Gly445_Cys450。本發(fā)明的成分可以結(jié)合形成前述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在特定實(shí)施方式中，當(dāng)提到結(jié)合表位例如構(gòu)象表位的本發(fā)明的成分時(shí)，意圖是所述成分僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表5中確定的特定肽)的那些特定殘基，而不是在該受:體的線性氣基酸序列中的其它殘基。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370 和 G466 的氨基酸組成的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合VEGF受體的連續(xù)表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位是由VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位是選自于VEGFRl的672VAISSS6' VEGFRl的678TTLDCHA684、VEGFRl的685NGVPEPq691、VEGFRl 的 700KIQQEPG706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的714STLFI718' VEGFRl 的 719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694, VEGFR3 的 695LEMQCLV701、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7CI8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN7'VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745、VEGFR2 的 678TSIGES683, VEGFR2 的684IEVSCta690, VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分結(jié)合人TOGFRP的氨基酸殘基385Arg和39°G1u，或者TOGFRa中的相應(yīng)殘基。AroGFRP的殘基385Arg和390Glu與Kit受體的殘基381Arg和386Glu類似，并介導(dǎo)TOGFRP的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的成分可以通過阻止III型RTK的近膜區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人I3DGFRP的385Arg和390Glu之間形成的鹽橋)而發(fā)揮其對受體活化的抑制作用，所述相互作用對于胞質(zhì)域以對于酪氨酸激酶活化至關(guān)重要的距離和定向進(jìn)行定位是不可或缺的。本文中討論的實(shí)驗(yàn)證明同型D4-D4相互作用對于I3DGFRP 二聚化不是必要的，而I3DGFRP 二聚化對于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的成分可以允許TOGFRP 二聚化而阻止活化。基于結(jié)構(gòu)的序列比對已經(jīng)表明在KU、PDGFR a、PDGFR^和CSFlR中，EF環(huán)的大小以及包含重要氨基酸的D4-D4界面是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會理解，本發(fā)明的成分可以結(jié)合糖殘基，所述糖殘基可以出現(xiàn)在RTK的糖基化形式上。本發(fā)明的成分也可以結(jié)合由氨基酸殘基和糖殘基兩者組成的表位。術(shù)語“受體酪氨酸激酶”和“RTK”在本文中可互換地使用以表示公知的使酪氨酸殘基磷酸化的膜受體的家族。很多受體酪氨酸激酶在發(fā)育或者細(xì)胞分裂中起到重要作用。受體酪氨酸激酶具有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合細(xì)胞因子、生長因子或其它配體，并通常由一或多個(gè)可識別的結(jié)構(gòu)基序組成，包括富半胱氨酸區(qū)、纖連蛋白III樣結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、EGF樣結(jié)構(gòu)域、鈣粘著蛋白樣結(jié)構(gòu)域、kringle樣結(jié)構(gòu)域、因子VIII樣結(jié)構(gòu)域、富甘氨酸區(qū)、富亮氨酸區(qū)、酸性區(qū)和盤狀(discoidin)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的活化通過配體結(jié)合細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn),這引起受體二聚化。以這種方式活化的受體能夠自磷酸化催化結(jié)構(gòu)域外面的酪氨酸殘基，從而促進(jìn)活性受體構(gòu)象的穩(wěn)定。磷酸化殘基也作為隨后在細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。RTK的實(shí)例包括但不限于Kit受體(亦稱干細(xì)胞因子受體或SCF受體)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體、肝細(xì)胞生長因子(HGF)受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體、PDGF受體-a、H)GF受體-3、CSF-I受體(亦稱M-CSF受體或Fms)和Flt3_受體(亦稱Flk2)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，RTK是III型RTK。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，RTK是V型，即VEGF受體家族的成員。如本文中所使用，術(shù)語“受體酪氨酸激酶的III型家族”或“III型RTK”意于包括一般地在其胞外域中包含五個(gè)免疫球蛋白像結(jié)構(gòu)域或Ig樣結(jié)構(gòu)域的受體酪氨酸激酶。III型RTK的實(shí)例包括但不限于I3DGF受體、M-CSF受體、FGF受體、Flt3受體(亦稱Flk2)和Kit受體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，III型RTK是Kit (在本領(lǐng)域也稱為SCF受體)。KU，與其它III型RTK相似，由通過單一跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域連接于胞質(zhì)區(qū)糖基化的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)、域(胞外域)構(gòu)成(綜述于 Schlessinger (2000)Cell 103:211-225)。III型 RTK，例如 Kit或TOGFR，的另一標(biāo)志是帶有大的激酶插入?yún)^(qū)的胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶(PTK)結(jié)構(gòu)域。已知存在至少兩種Kit受體的剪切同工型，較短的利用框內(nèi)的剪接位點(diǎn)。本發(fā)明包括Kit以及其它上述RTK的所有同工型。本文中所用的受體酪氨酸激酶(RTK)的“Ig樣結(jié)構(gòu)域”意于包括本領(lǐng)域公知的存在于RTK胞外域中的結(jié)構(gòu)域。在III型受體酪氨酸激酶(III型RTK)家族例如Kit的胞外域中，存在5個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域，已知為D1、D2、D3、D4和D5。III型RTK的D1、D2和D3結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合 RTK 的配體(綜述于 Ullrich 和 Schlessinger (1990) Cell 61 :203-212)。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，術(shù)語“ Ig樣結(jié)構(gòu)域”不意于包括負(fù)責(zé)配體結(jié)合的RTK的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，Ig樣結(jié)構(gòu)域是III型RTK的D4和/或05結(jié)構(gòu)域。在VEGF受體家族的胞外域中，存在7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，已知為Dl、D2、D3、D4、D5、D6和D7。在本發(fā)明 的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，Ig樣結(jié)構(gòu)域是VEGF受體家族的D7結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語“血管內(nèi)皮生長因子受體”、“VEGF受體”或“VEGF受體家族”，亦稱V型RTK，包括血管內(nèi)皮生長因子的RTK受體。如上所述，這些RTK在其胞外域中具有7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域。VEGF家族受體的實(shí)例為VEGFR-I (亦稱Flt_l)、VEGFR_2 (亦稱KDR或Flk-I)和 VEGFR-3(亦稱 Flt-4)。術(shù)語受體酪氨酸激酶(RTK)的“胞外域”是本領(lǐng)域公知的，并且指RTK的細(xì)胞外部分，即在質(zhì)膜外的RTK的部分。術(shù)語受體酪氨酸激酶的胞外域的“近膜區(qū)”指的是接近質(zhì)膜的RTK的細(xì)胞外部分，并優(yōu)選地不直接負(fù)責(zé)配體與RTK的結(jié)合。近膜區(qū)的實(shí)例包括但不限于III型受體酪氨酸激酶的D4結(jié)構(gòu)域、III型受體酪氨酸激酶的D5結(jié)構(gòu)域、III型受體酪氨酸激酶的D3-D4鉸鏈區(qū)、III型受體酪氨酸激酶的D4-D5鉸鏈區(qū)和V型受體酪氨酸激酶的D7結(jié)構(gòu)域。本文中所用的術(shù)語“同型相互作用”指的是來自兩個(gè)單體受體的兩個(gè)相同的近膜區(qū)之間的相互作用。本文中所用的術(shù)語“異型相互作用”指的是來自兩個(gè)單體受體的兩個(gè)不同的近膜區(qū)之間的相互作用。異型相互作用可以是兩個(gè)不同類型的單體受體二聚化的結(jié)果，或者同種單體受體的野生型和突變體形式二聚化的結(jié)果。例如，本領(lǐng)域公知癌癥患者可以攜帶某一受體的野生型等位基因和突變體等位基因。本文中所用的術(shù)語“單體狀態(tài)”指的是其中RTK分子由單一多肽鏈組成的RTK的狀態(tài)，該單一多肽鏈不與相同或不同類型的第二 RTK多肽結(jié)合。RTK二聚化導(dǎo)致自磷酸化和受體活化。因此，單體狀態(tài)的RTK是非活性狀態(tài)。單體狀態(tài)也是其中單一 RTK的D4、D5或D7結(jié)構(gòu)域不與第二 RTK的D4、D5或D7結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合的狀態(tài)。本文所使用的，“原體”是寡聚蛋白如RTK的結(jié)構(gòu)單元。原體是可以以確定的化學(xué)計(jì)量組裝以形成低聚物的蛋白質(zhì)亞基。受體酪氨酸激酶的VEGFR家族是共價(jià)連接的二聚體，并且各個(gè)VEGFR原體是以名為“半胱氨酸結(jié)生長因子”的結(jié)構(gòu)由按反向平行方式排列的四鏈￠-折疊片組成的。短語“鎖定受體酪氨酸激酶的胞外域在非活性狀態(tài)”指的是本發(fā)明的成分抑制受體酪氨酸激酶的活性的能力。換言之，該短語包括本發(fā)明的成分將平衡轉(zhuǎn)向形成非活性或抑制性的受體構(gòu)型的能力。例如，與不存在本發(fā)明的成分時(shí)受體活性相比，本發(fā)明的成分可以抑制受體酪氨酸激酶的活性至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。本文中所用的術(shù)語“非活性狀態(tài)”指的是其中RTK分子不能激活下游的信號傳導(dǎo)的RTK的狀態(tài)。非活性狀態(tài)可以是這樣的狀態(tài)，其中受體酪氨酸激酶的胞外域被允許二聚化，但是兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、定向、構(gòu)象和/或距離發(fā)生改變，從而抑制了受體酪氨酸激酶的活性(例如受體內(nèi)化受抑制和/或受體的酪氨酸自磷酸化受抑制和/或受體激活下游信號傳導(dǎo)途徑的能力受抑制)。非活性狀態(tài)也包括如上所述的單體狀態(tài)。非活性狀態(tài)也可以是這樣的狀態(tài)，其中受體酪氨酸激酶的胞外域結(jié)合于受體配體并二聚化，但是還沒有發(fā)生允許受體活化的構(gòu)象變化。實(shí)施例22-25進(jìn)一步討論了表明存在對于RTK活化至關(guān)重要(例如通過介導(dǎo)D4或D5同型相互作用)但是對于受體二聚化不是必要的特定保守氨基酸殘基的實(shí)驗(yàn)。術(shù)語“非活性狀態(tài)”包括這樣的狀態(tài)，其中與沒有本發(fā)明的成分時(shí)的受體活性相比，本發(fā)明的成分可以降低或抑制受體酪氨酸激酶的活性至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80^^85^^90%或95%。本文中描述的任何功能試驗(yàn)可用于確定本發(fā)明的成分抑制受體酪氨酸激酶活性的能力。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以表現(xiàn)出寬的效應(yīng)，例如當(dāng)大部分或全部目標(biāo)RTK滅活時(shí)。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以表現(xiàn)出較窄的效應(yīng)，例如當(dāng)部分靶RTK滅活時(shí)。在這樣的實(shí)施方式中，與沒有所述成分時(shí)的受體相比，至少5%、10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%, 45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85 %、90 %或95 %的受體被鎖定在非活性狀態(tài)。本文中所使用的術(shù)語“構(gòu)象表位”或“非線性表位”或“不連續(xù)表位”可互換地使用以指由至少兩個(gè)不是單蛋白質(zhì)鏈中的連續(xù)氨基酸的氨基酸組成的表位。例如，構(gòu)象表位可以是由一段(strech)插入氨基酸分開，但是足夠靠近以被本發(fā)明的成分作為單一表位識別的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸組成。作為進(jìn)一步的實(shí)例，在單蛋白質(zhì)鏈上由插入氨基酸分開的氨基酸或者存在于分離的蛋白質(zhì)鏈上的氨基酸可以由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或復(fù)合體的構(gòu)象形狀而拉近，以成為可以被本發(fā)明的成分結(jié)合的構(gòu)象表位。特定的不連續(xù)表位和構(gòu)象表位在本文中進(jìn)行描述(參見例如表4和5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通常，本發(fā)明的成分結(jié)合的線性表位可以取決于或不取決于RTK的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可以結(jié)合一組氨基酸而無論它們是否以天然的三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行折疊。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分可能不識別組成該表位的單個(gè)氨基酸殘基，而是可能需要特別的構(gòu)象(彎曲、盤旋、轉(zhuǎn)角或折疊)以識別和結(jié)合表位。如本文使用的，“鄰近表位”或“連續(xù)表位”可互換使用，指的是由單肽鏈中的連續(xù)氨基酸的至少兩個(gè)氨基酸組成的表位。本文中描述了特定的連續(xù)表位(見，例如，表8)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分結(jié)合VEGF受體上的連續(xù)表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位由VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位是選自于 VEGFRl 的 672VAISSS6' VEGFRl 的 678ITLDCHA684、VEGFRl 的 685NGVPEPQ691、VEGFRl的 700KIQQEPg706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的 714STLFI718' VEGFRl 的719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694、VEGFR3 的 695LEMQCLV7CI1、VEGFR3 的 7ci2AGAHAPS708、VEGFR3 的 717LLEEKSg723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN730' VEGFR3 的 731QKLSI735 和vegfr3 的 736Qrvreedagr745、vegfr2 的 678Tsiges683, vegfr2 的 684Ievscta690, vegfr2 的691SGNPPPq697, VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2 的 mDGN719、VEGFR2 的720RNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。本文所用的短語“疏水氨基酸”是指包含疏水性能的氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸、絲氨酸、脯氨酸和本文列出的其他氨基酸。本發(fā)明的各個(gè)方面將在以下小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述I.結(jié)合人受體酪氨酸激酶胞外域的抗體在本發(fā)明的一個(gè)方面，結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的成分是抗體或其抗原結(jié)合片段。 在本文中所指的“抗體”包括整個(gè)的抗體和任何抗原結(jié)合片段(即抗原結(jié)合部分”)或其單鏈?？贵w”指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。各個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(在這里縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，CH1、CH2和CH3。各個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在這里縮寫為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域，Q，組成。V1^P'區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，其間交替散布著更加保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。各個(gè)Vh和\由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，按以下順序從氨基端至羧基端排列FR1，⑶Rl，F(xiàn)R2，⑶R2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq))的結(jié)合。本文中所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱“抗體部分”)指的是保留特異性結(jié)合抗原(例如Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)表明，全長抗體的片段可以執(zhí)行抗體的抗原結(jié)合功能。包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fab’片段，主要是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab (參見，F(xiàn)UNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul編著，第三版1993) ； (iv)由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(v)由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341 :544-546),其由Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);以及(viii)納米體,含有單一的可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。而且，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域'和Vh由獨(dú)立的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過使得它們能夠形成單蛋白質(zhì)鏈的合成接頭連接的，其中'和Vh區(qū)配對以形成單價(jià)分子(已知為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等(1988) Science 242 423-426 ;和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883) 這樣的單鏈抗體也意于包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。這些抗體片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并且片段以與完整抗體同樣的方法進(jìn)行用途篩選。本文中所用的“分離的抗體”意于指基本上沒有具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如特異性結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的分離的抗體基本上沒有特異性結(jié)合除了 RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域之外的抗原的抗體)。而且，分離的抗體可以是基本上沒有其它的細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。但是，“分離的抗體”可以包括全都特異性結(jié)合例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體。本文中所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組成”指的是單分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組成顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親合性。本文中所用的術(shù)語“人抗體”意于包括具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。而且，如果抗體含有恒定區(qū)，該恒定區(qū)也源自于人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或者體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，本文中所用的術(shù)語“人抗體”不意于包括其中來自另一哺乳動物種(例如小鼠)的種系的CDR序列嫁接于人框架序列的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”是指具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的顯示單一結(jié)合特異性的單克隆抗體。在一種實(shí)施方式中，人單克隆抗體由包括由非人類轉(zhuǎn)基因動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生，所述非人類轉(zhuǎn)基因動 物具有融入無限增殖細(xì)胞的包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。本文中所用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的所有人抗體，例如(a)從對于人免疫球蛋白基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤分離的抗體(以下進(jìn)一步描述)，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如從轉(zhuǎn)染瘤的抗體，(C)從重組、組合的人抗體文庫分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列剪接的任何其它方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有其中框架區(qū)和⑶R區(qū)域源自于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。然而，在某些實(shí)施方式中，這樣的重組人抗體可以進(jìn)行體外誘變(或在使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，從而盡管重組抗體的％和'區(qū)的氨基酸序列源自人種系Vh和\序列和與之相關(guān)，但它們可以并不是天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫內(nèi)。本文中所用的“同種型”指的是由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類(例如IgM或IgGl)。短語“識別抗原的抗體”和“抗原特異性的抗體”在本文中與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”互換地使用。術(shù)語“人抗體衍生物”指的是人抗體的任何修飾形式，例如抗體和另一種物質(zhì)或抗體的綴合物。術(shù)語“人源化抗體”意于表示其中源自另一哺乳動物種例如小鼠的CDR序列嫁接于人框架序列上的抗體?？梢栽谌丝蚣苄蛄袃?nèi)進(jìn)行另外的構(gòu)架區(qū)修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，當(dāng)序列“源自于”特定的種時(shí)，所述序列可以是蛋白質(zhì)序列，例如當(dāng)可變區(qū)氨基酸取自鼠抗體時(shí)，或者所述序列可以是DNA序列，例如當(dāng)編碼可變區(qū)的核酸取自鼠DNA時(shí)。也可以基于人和非人(例如鼠或兔)抗體來設(shè)計(jì)人源化抗體。所述設(shè)計(jì)的抗體(可能結(jié)合了人的和非人的殘基)可以是化學(xué)合成的。所述序列也可以在DNA水平合成，并在體外或體內(nèi)表達(dá)以產(chǎn)生人源化抗體。術(shù)語“嵌合抗體”意于指其中可變區(qū)序列源自于一個(gè)種而恒定區(qū)序列源自于另一個(gè)種的抗體，例如其中可變區(qū)序列源自于小鼠抗體，而恒定區(qū)序列源自于人抗體的抗體。術(shù)語“抗體模擬物”或“抗體類似物”意于指的是能夠模擬抗體結(jié)合抗原的能力的分子，但它不局限于天然的抗體結(jié)構(gòu)。此類抗體模擬物的實(shí)例包括但不限于Adnectin(即基于纖連蛋白的結(jié)合分子)、親和體、DARPin、抗運(yùn)載蛋白(Anticalin)、高親合性多聚體和Versabody,盡管它們它們模擬傳統(tǒng)的抗體結(jié)合,它們?nèi)坎捎猛ㄟ^完全不同的機(jī)制產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)并通過完全不同的機(jī)制發(fā)揮作用。當(dāng)本發(fā)明的實(shí)施方式涉及抗體或其抗原結(jié)合部分時(shí)，它們也可以應(yīng)用于如上所述的抗體模擬物。本文中所用的“特異性結(jié)合” RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的抗體意指以1x10_7M或更低、更優(yōu)選5x 10_8M或更低、更優(yōu)選Ix 10_8M或更低、更優(yōu)選5x 10_9M或更低的的Kd結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的抗體。本文中所用的術(shù)語“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細(xì)胞表示不結(jié)合或不以高親和性結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即以Ix 10_6M或更高、更優(yōu)選Ix 10_5M或更高、更優(yōu)選Ix 10_4M或更高、更優(yōu)選Ix 10_3M或更高、甚至更優(yōu)選Ix 10_2M或更高的Kd結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞。本文中所用的術(shù)語"K^"或“Ka”意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而 本文中所用的術(shù)語"Kws"或“Kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文中所用的術(shù)語“KD”意指解離常數(shù)，其從Kd與Ka的比率(即Kd/Ka)獲得，并表示為摩爾濃度(M)。可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法確定抗體的Kd值。測定抗體的Kd的優(yōu)選方法是使用表面等離子體共振，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，例如Biacore 系統(tǒng)。本文中所用的術(shù)語“高親和性”在涉及IgG型抗體時(shí)，指的是對于RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，抗體具有10_8M或更低、更優(yōu)選10_9M或更低、甚至更優(yōu)選KTkiM或更低的Kd。然而，對于其它抗體同種型“高親和性”結(jié)合可能有所改變。例如，IgM同種型的“高親和性”結(jié)合指的是抗體具有10_7M或更低、更優(yōu)選10_8M或更低、更優(yōu)選10_9M或更低的Kd。技體本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如人受體酪氨酸激酶III型家族的成員。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與RTK單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合將胞外域鎖定在非活性狀態(tài)，例如單體狀態(tài)，并因此拮抗RTK 二聚化和激活下游信號傳導(dǎo)途徑的能力。例如，所述抗體可以阻斷配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶的酪氨酸自磷酸化和/或受體內(nèi)化。選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體以結(jié)合RTK的特定Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如人Kit的D4結(jié)構(gòu)域或D5結(jié)構(gòu)域或者VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)抗體或其抗原結(jié)合部分以結(jié)合與RTK(例如Kit受體或VEGF受體)的結(jié)構(gòu)域具有同源性的蛋白質(zhì)。例如，可以選擇或設(shè)計(jì)抗體以結(jié)合與Kit受體的結(jié)構(gòu)域(例如D4或D5結(jié)構(gòu)域)或者VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域具有至少50 %的同一性、至少60 %的同一性、至少70 %的同一性、至少80 %的同一性、至少90 %的同一性、或至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的同一性的結(jié)構(gòu)域。這樣的抗體或其抗原結(jié)合部分將能夠結(jié)合與Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域或者VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域在功能上類似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(可能在KU、VEGF受體和其它RTK中)。也可以選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分以結(jié)合由RTK(例如人III型RTK)的Ig樣結(jié)構(gòu)域衍生的特殊基序或共有序列，從而使抗體或其抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合人RTK III型家族的成員之間以及III型RTK和其它RTK (例如V型RTK)之間共有的表位或結(jié)構(gòu)域。例如，可以通過使用序列比對算法來比對各種RTK的結(jié)構(gòu)域(例如在RTK類型或各物種之間D4結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域)找到這類線性共有序列(參見圖6B)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以比對例如來自各種物種(例如人、小鼠、大鼠)的Kit D4結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列以確定在被比對的序列的至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少100%中哪些蛋白質(zhì)殘基是保守的。然后，這樣的共有序列可以用于產(chǎn)生特異性結(jié)合該共有序列的抗體或其它成分，并因此結(jié)合Kit RTK的最保守的殘基。類似地，人們也可以比對V型RTK的D7結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列(參見圖6)以獲得可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的成分的共有序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，最高度保守的殘基是哪些通過進(jìn)化保留并最可能對于蛋白質(zhì)功能具有重要性的殘基?；蛘?，如果比對在各種不同類的RTK之間進(jìn)行，對于這樣的共有序列產(chǎn)生的抗體將允許抗體結(jié)合多種RTK類型中的相似Ig樣結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的成分(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列=LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸，和X1'X2> X3> X4, X5, X6和X7是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，X1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；x3選自賴氨 酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；x6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的成分(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸；和Xp X2、X3和X4是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，X1選自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸(SEQ ID NO 1)0在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分(例如，抗體或其抗原結(jié)合部分)結(jié)合VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列L/I X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO :158)，其中L是亮氨酸，I是異亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；以及乂1、&、\34和&是任何氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，O是纈氨酸；X1選自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2選自于精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸；X3選自于賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸-J4選自于谷氨酸和纈氨酸；以及X5選自于谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺。本發(fā)明的抗體不結(jié)合RTK的配體結(jié)合位點(diǎn)，例如Kit受體的SCF結(jié)合位點(diǎn)。因此，本文中描述的抗體不拮抗受體結(jié)合其目標(biāo)配體的能力。在一些實(shí)施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人Kit受體的特定序列，例如人Kit 受體的殘基 309-413、殘基 410-519、381Arg 和 386Glu 或者 418Tyr 和 5°5Asn。在其它實(shí)施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合代表蛋白質(zhì)中三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基序或共有序列。這樣的基序或共有序列不代表氨基酸的連續(xù)鏈，而是導(dǎo)致RTK的三維折疊的非連續(xù)的氨基酸排列(即“結(jié)構(gòu)基序”或“非線性表位”)。這樣的基序的實(shí)例是Kit受體的D4-D4或D5-D5結(jié)合界面或VEGF受體D7-D7結(jié)合界面。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體結(jié)合例如D4-D4、D5-D5或D7-D7界面中的非線性表位，從而阻止RTK的活化。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合構(gòu)成表4(下文中)中描述的小腔或口袋的Kit受體中的一個(gè)或多個(gè)殘基。例如，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222 和來自 D4 結(jié)構(gòu)域的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分也可以結(jié)合構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面的一個(gè)或多個(gè)以下殘基:Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386 和 T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)中的口袋的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208 以及來自 D3 結(jié)構(gòu)域的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的近膜區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向進(jìn)行定位所需的運(yùn)動的分子楔的作用。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分也可以起到阻止同型D4或D5受體的相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合Kit受體上的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、 G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431 或 G432。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以容易地靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對或序列比對處于相同的位置的那些殘基。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合III型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK (例如人Kit受體或TOGF受體)的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由下面表4中所列的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在一種特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合由選自以下的氨基酸組之一的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238 和 S239 ;K127、A207、F208 和 T295 ;L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371 和Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398 ;K218、A219、S220、N367、E368 和 S369 ;K218、A220、E368 和 S369 ;G384、T385、T411、K412、E414 和 K471 ;Y408、F433、G470、K471和 L472 ;F324、V325、N326 和 N410 ;D327、N410、T41UK412 和 V497 ;G384、G387、V409 和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ;Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ;K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371 和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470 和 K471 ；D327、T411、K412、E414、A431、G432 和 K471 ;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390 ;Y350、R353和F355。如以上所指出的，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合形成在表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)說明本發(fā)明的抗體結(jié)合表位例如構(gòu)象表位時(shí)，意圖是抗體僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表4中確定的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述構(gòu)象表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種具體實(shí)施方式
中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述第一和第二肽組如下Ala219-Leu222和Thr304-Val308 ；Asp309-Gly31I 和 Arg224-Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367-Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和 Asn396_Val399 ；Ala339-Pro343 和Glu368-Arg372 ；Lys358-Tyr362 和 Val374_His378 ;Asp357_Glu360 和 Leu377-Thr380 ；Met351-Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和 Val323_Asp332 ；Val409-Ile415 和Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和 Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325_Asn330 ；Val409-Ile415 和 Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和Gly384-Gly388 ；Val325-Glu329 和 Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497-Ala502 ； Ile415-Leu421 和 Ala502_Ala507 ；Ala502-Ala507 和 Lys484_Thr488 ；以及 Ala502_Ala507和 Gly445-Cys450。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合形成前述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)說到本發(fā)明的抗體結(jié)合表位例如構(gòu)象表位時(shí)，意圖是抗體僅結(jié)合構(gòu)成該表位(例如表5中確定的特定肽)的那些特異性殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合由選自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370 和 G466 的 2 個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人I3DGFRP的氨基酸殘基385Arg和390Glu，或者TOGFR a中相應(yīng)的殘基。人TOGFR ^的殘基385Arg和390Glu類似于Kit受體的殘基381Arg和386Glu,并介導(dǎo)TOGFRP的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以通過阻止對于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以酪氨酸激酶活化必要的距離和定向進(jìn)行定位所必需的III型RTK的近膜區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人TOGFRP的385Arg和39°Glu之間形成的鹽橋)而發(fā)揮其對受體活化的抑制作用。本文中討論的實(shí)驗(yàn)證明同型D4-D4相互作用對于TOGFRP的二聚化不是必要的，而I3DGFRP 二聚化對于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以允許TOGFRP 二聚化而阻止活化。基于結(jié)構(gòu)的序列比對已經(jīng)表明在KU、PDGFR a、PDGFR P和CSFlR中，EF環(huán)的大小以及包含重要氨基酸的D4-D4界面是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人VEGF受體的特定序列，例如，VEGFRl 的殘基 718-727、VEGFRl 的 Arg720 和 Asp725、VEGFR2 的殘基 724-733、VEGFR2 的 Arg726 和 Asp731、VEGFR3 的殘基 735-744 或 VEGFR3 的殘基 Arg737 和 Asp742。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合VEGF受體的連續(xù)表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位由VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位是選自VEGFRl的672VAISSS6'VEGFRl的678TTLDCHA684、VEGFRI的 685NGVPEPq691、VEGFRl 的 700KIQQEPG706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl的 714STLFI718' VEGFRl 的 719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694, VEGFR3 的 695LEMQCLV701、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7CI8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN7'VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745、VEGFR2 的 678TSIGES683, VEGFR2 的684IEVSCta690, VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。在另外的實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分以特異性結(jié)合 突變體RTK。在優(yōu)選實(shí)施方式中，突變體RTK是致瘤的或致癌的突變體。在一種具體實(shí)施方式
中，選擇或設(shè)計(jì)抗體或其抗原結(jié)合部分以結(jié)合致癌的Kit受體突變體?？梢员槐景l(fā)明的抗體靶向的幾種Kit受體突變體是具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸中的突變的Kit受體Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503 或 Ala502。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法將可以應(yīng)用于Kit中的其它突變或其它RTK中的突變。靶向突變體RTK的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是治療抗體可以僅結(jié)合包含突變的細(xì)胞上的RTK,從而保持健康細(xì)胞大部分或全部不受影響。因此，在突變是致瘤性突變的情況下，僅腫瘤細(xì)胞被作為治療靶標(biāo)，從而潛在地減少副作用和劑量要求。優(yōu)選地，抗體以5x 10_8M或更低的Kd、1x 10_8M或更低的Kd、5x 10_9M或更低的Kd，或者Ix KT8M至Ix 10,M之間或更低的Kd結(jié)合人RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域已知用于評價(jià)抗體對于RTK (例如Kit或VEGF受體)的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn),包括例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡和RIA?？贵w的結(jié)合動力學(xué)(例如結(jié)合親合力)也可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來評定，例如通過ELISA、Scatchard和Biacore分析。工稈化和修飾的抗體根據(jù)本發(fā)明的方法制備的抗體的Vh和/或\序列可以用作工程化修飾的抗體的起始材料，所述修飾的抗體可以具有從起始抗體發(fā)生改變的性質(zhì)。抗體可以通過修飾一個(gè)或兩個(gè)原始可變區(qū)(即Vh和/或內(nèi)(例如一或多個(gè)CDR區(qū)和/或一或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi))的一或多個(gè)殘基進(jìn)行工程化。另外地或者可選地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來進(jìn)行工程化，例如改變抗體的效應(yīng)子功能。一種可以進(jìn)行的可變區(qū)工程化是⑶R接枝?？贵w主要地通過位于6個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，在各抗體之間CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更加多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，可以通過構(gòu)建表達(dá)載體來表達(dá)模擬特定的天然存在抗體的性質(zhì)的重組抗體，所述表達(dá)載體包括來自特定的天然存在抗體的CDR序列，這些CDR序列被接枝到來自具有不同性質(zhì)的不同抗體的框架序列上(參見，例如Riechmann,L.等(1998)Nature 332 :323-327 ；Jones,P.等(1986)Nature 321 :522-525 ；Queen, C.等(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 亜10029-10033 ;授予Winter的美國專利No. 5，225，539，以及授予Queen等的美國專利No. 5，530，101 ；5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370)。可以從公共的DNA數(shù)據(jù)庫或包括種系抗體基因序列的發(fā)表的參考文獻(xiàn)來獲得抗體的框架序列。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以從“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫中找到(可在互聯(lián)網(wǎng)上在mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase網(wǎng)站獲得),以及在Kabat,E. A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 ;Tomlinson,I. M.等(1992)" The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Revealsabout Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol.Biol. 227 :776-798 和 Cox, J. P. L.等(1994) " A Directory of Human Germ-line VhSegments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. I. Immunol. 24 :827-836 中找到；每一篇文獻(xiàn)的內(nèi)容均通過引用的方式明確并入本文中。作為另一實(shí)例，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以從Genbank數(shù)據(jù)庫中找到。使用一種稱為Gapped BLAST的序列相似性檢索方法相對于編譯蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比較抗體蛋白質(zhì)序列(Altschul 等(1997)Nucleic Acids Research 25 :3389-3402),這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。BLAST是一種探試算法(heuristic algorithm),其中抗體序列和數(shù)據(jù)庫序列之間的統(tǒng)計(jì)上顯著的比對很可能含有比對字段(aligned word)的高分片段 對(high-scoring segment pair) (HSP)。不能通過延伸或者修剪提高分值的片段對稱為命中(hit)。簡言之，VBASE 來源的核苷酸序列(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.Php)被翻譯，且FR1-FR3框架區(qū)之間和包括上述框架區(qū)之間的區(qū)域得到保持。數(shù)據(jù)庫序列平均長度為98個(gè)殘基。去除在蛋白質(zhì)全長范圍內(nèi)精確匹配的重復(fù)序列。使用具有缺省的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(除了被關(guān)閉的低復(fù)雜性過濾器)的程序blastp和BL0SUM62的替代矩陣進(jìn)行蛋白質(zhì)的BLAST檢索過濾出產(chǎn)生序列匹配的前5個(gè)命中。核苷酸序列在所有6個(gè)框架中被翻譯，而在數(shù)據(jù)庫序列的匹配片段中沒有終止密碼子的框架被認(rèn)為是潛在的命中。這隨后使用BLAST程序tblastx進(jìn)行證實(shí)，其在所有6個(gè)框架中翻譯抗體序列，并將那些翻譯與在所有6個(gè)框架中動態(tài)地翻譯的VBASE核苷酸序列進(jìn)行比較?？梢匀缟纤鲱愃频貙BASE進(jìn)行其它人種系序列數(shù)據(jù)庫，例如可從IMGT(http://imgt. cines. fr)獲得的那些的檢索。同一性是在全長序列上抗體序列和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫之間的精確的氨基酸匹配。陽性結(jié)果(同一性+置換匹配)不是相同的，但是氨基酸置換由BL0SUM62替代矩陣指導(dǎo)。如果抗體序列以相同的同一性與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫序列相匹配，那么具有最多陽性結(jié)果的命中將被確定為匹配序列命中。確認(rèn)的Vh⑶R1XDR2和⑶R3序列以&Vk⑶R1XDR2和⑶R3序列可以接枝到構(gòu)架區(qū)上，所述框架區(qū)具有與框架序列所來源的種系免疫球蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的那些序列相同的序列，或者CDR序列可以接枝到與種系序列相比含有一或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些情況下，在構(gòu)架區(qū)內(nèi)的突變殘基對于維持或提高抗體的抗原結(jié)合能力是有益的(參見例如授予 Queen 等的美國專利 No. 5，530，101 ;5，585,089 ;5，693，762 和 6，180，370)。另一類型的可變區(qū)修飾是突變V1^P/或Vk CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改進(jìn)目的抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如親合性)。可以進(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變來引入突變，并且可以在本領(lǐng)域已知的體外或體內(nèi)試驗(yàn)中評價(jià)對抗體結(jié)合的影響或其它感興趣的功能性質(zhì)。例如，可以突變本發(fā)明的抗體來產(chǎn)生文庫，然后可以就與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如人Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域，的結(jié)合對文庫進(jìn)行篩選。優(yōu)選地，引入保守修飾(如以上討論的)。突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但優(yōu)選是置換。而且，一般⑶R區(qū)內(nèi)不超過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基被改變。另一種類型的框架修飾包括突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)、或者甚至一個(gè)或多個(gè)⑶R區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基以去除T細(xì)胞表位，從而降低抗體潛在的免疫原性。該方法也稱為“脫免疫(deimmunization) ”,并在Carr等人的美國專利公開No. 20030153043中更加詳細(xì)地進(jìn)行了描述。在框架或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾之外或者替代以上修飾，本發(fā)明的抗體可以工程化以包含F(xiàn)e區(qū)內(nèi)的修飾，從而通常改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，例如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、Fe受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。而且，本發(fā)明的抗體可以進(jìn)行化學(xué)修飾(例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以附著于抗體)或者進(jìn)行修飾以改變它的糖基化作用，而再改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)。在下文中更加詳細(xì)地描述這些實(shí)施方式中的每一個(gè)。Fe區(qū)中 殘基的編號是Kabat的EU索引的編號。在一種實(shí)施方式中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)從而改變(例如增加或減少)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)量。該方法在Bodmer等人的美國專利No. 5，677，425中進(jìn)一步描述。改變CHl鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目例如以幫助輕鏈和重鏈的組裝或者提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方式中，使抗體的Fe鉸鏈區(qū)突變以降低抗體的生物半衰期。更具體地說，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變引入Fe鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)，使得抗體相對于天然的Fe鉸鏈結(jié)構(gòu)域的葡萄球菌A蛋白(SpA)結(jié)合具有受損的SpA結(jié)合。該方法在Ward等人的美國專利No. 6，165，745中進(jìn)一步描述。在另一實(shí)施方式中，抗體經(jīng)修飾以增加其生物半衰期。多種方法均可行。例如，如授予Ward的美國專利No. 6，277，375中描述的，可以引入一個(gè)或多個(gè)以下突變T252L、T254S、T256F。或者，為了提高生物半衰期，如在Presta等人的美國專利No. 5，869，046和6，121，022中所述，可以在CHl或CL區(qū)內(nèi)改變抗體以包含從IgG的Fe區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)獲得的補(bǔ)救受體(salvage receptor)結(jié)合表位。只要抗體與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合不受損，這些策略將是有效的。在再其它實(shí)施方式中，通過以不同的氨基酸殘基來置換至少一個(gè)氨基酸殘基而改變Fe區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)子功能。例如，選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被不同的氨基酸殘基取代，從而抗體具有對效應(yīng)子配體的改變的親和性，但保持親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和性發(fā)生改變的效應(yīng)子配體可以是例如Fe受體或補(bǔ)體的Cl成分。該方法在Winter的美國專利No. 5，624，821和5，648，260中有進(jìn)一步的詳細(xì)描述。在另一實(shí)例中，選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被不同的氨基酸殘基置換，從而抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或降低的或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)。該方法在Idusogie等人的美國專利No. 6，194，551中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一實(shí)例中，改變氨基酸位置231和239內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改變抗體固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公開WO 94/29351中進(jìn)一步描述。在又一個(gè)實(shí)例中，通過修飾以下位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾Fe區(qū)以提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對Fe Y受體的親和力238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439。該方法在 Presta 的 PCT 公開 WO 00/42072中進(jìn)一步描述。人IgGl上與Fe Y Rl、Fe Y RH、Fe Y RIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且具有改進(jìn)的結(jié)合的變異體已經(jīng)描述(參見Shields，R.L.等(2001) T. Biol. Chem. 276 6591-6604)。位置256、290、298、333、334和339的特定突變顯示出提高了對Fe Y RIII的結(jié)合。另外，以下結(jié)合突變體顯示出提高了 Fe y RIII的結(jié)合T256A/S298A，S298A/E333A、S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。在再另一實(shí)施方式中，如美國臨時(shí)申請No. 60/957，271 (通過引用的方式將該專利以其全部內(nèi)容并入本文)中描述的那樣，通過引入半胱氨酸殘基來修飾本發(fā)明抗體的C-末端。這樣的修飾包括但是不局限于在全長重鏈序列的C-末端或其附近置換現(xiàn)有的氨基酸殘基，以及將含有半胱氨酸的延伸段引入全長重鏈序列的C-末端。在優(yōu)選實(shí)施方式中，含有半胱氨酸的延伸段包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(從N-末端至C-末端)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，這樣的C-末端半胱氨酸修飾的存在提供了結(jié)合伴體分子例如治療劑或標(biāo)記分子的位置。特別是，由于C-末端半胱氨酸修飾周到反應(yīng)性硫醇基的存在可如下文詳述的用于綴合使用二硫接頭的伴體分子。用這樣的方式結(jié)合抗體與伴體分子能夠提高對連接的特定位點(diǎn)的控制。此外，通過在C-末端處或其附近引入連接位點(diǎn)，可以優(yōu)化結(jié)合，從而降低或消除對抗體功能性質(zhì)的干擾，并能夠簡化對綴合物制劑的分析和質(zhì)量控制。在再另一實(shí)施方式中，抗體的糖基化作用被修飾。例如，可以產(chǎn)生無糖基化抗體(即抗體缺少糖基化)?？梢愿淖兲腔饔靡岳缣岣呖贵w對抗原的親和性。這樣的糖修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行導(dǎo)致消除一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)框架糖基化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，從而消除該位點(diǎn)的糖基化。這樣的無糖基化可以增加抗體對抗原的親和性。在授予Co等的美國專利No. 5，714，350和6，350, 861中進(jìn)一步詳細(xì)描述了這樣的方法。在授予Hanai等人的美國專利7，214，775、授予Presta的美國專利No. 6，737，056、授予Presta的美國公開No. 20070020260、授予Dickey 等的 PCT 公開 No. W0/2007/084926、授予 Zhu 等人的 PCT 公開 No. W0/2006/089294和授予Ravetch的PCT公開No. W0/2007/055916中進(jìn)一步詳細(xì)描述了用于改變糖基化的其它方法，上述每一篇文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均通過引用的方式并入本文。另外地或可選地，可以產(chǎn)生具有改變的糖基化類型的抗體，例如具有減少量的巖藻糖殘基的低巖藻糖化(hypofucosylated)抗體或具有增加的對開(bisecting)GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。通過例如在具有改變的糖基化機(jī)構(gòu)的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體可以實(shí)現(xiàn)這種糖修飾。具有改變的糖基化機(jī)構(gòu)的細(xì)胞在本領(lǐng)域中有描述，并且可用作表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，細(xì)胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8 ( a (1,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)，從而在Ms704、Ms705和Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在其糖類化合物上缺少巖藻糖。使用兩個(gè)置換載體通過靶向破壞CH0/DG44細(xì)胞中的FUT8基因來產(chǎn)生Ms704、Ms705和MS709FUT8+細(xì)胞系。(參見Yamane等人的美國專利公開No. 20040110704 和 Yamane-Ohnuki 等(2004)Biotechnol Bioeng 87 :614-22) 作為另一、實(shí)例，Hanai等的EP I, 176，195描述了具有功能受損的FUT8基因(其編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶)的細(xì)胞系，從而在這樣的細(xì)胞系中表達(dá)的抗體通過減少或消除a-1，6鍵-相關(guān)的酶而表現(xiàn)出低巖藻糖化。Hanai等也描述了具有將巖藻糖添加至N-乙酰葡糖胺(其結(jié)合抗體的Fe區(qū))的低的酶活性或不具有所述酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公開WO 03/035835描述了變異CHO細(xì)胞系、Lecl3細(xì)胞，其具有降低的將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的糖上的能力，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖化(也參見 Shields，R. L.等(2002) J. Biol. Chem. 277 :26733-26740)。 Umana 等的PCT公開WO 99/54342描述了工程化以表達(dá)糖蛋白-修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如P (I,4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的細(xì)胞系，使得在該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)出對開GlcNac結(jié)構(gòu)增加,這引起所述抗體的ADCC活性增加(也參見Umana等(1999)Nat. Biotech. 17 =176-180) 可選地，所述抗體的巖藻糖殘基可以使用巖藻糖苷酶切割。例如，巖藻糖苷酶ct-L-巖藻糖苷酶從抗體除去巖藻糖殘基。(Tarentino, A. L.等(1975)Biochem. 14 :5516-23)。另外地或可選地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，其中該改變涉及所述抗體的唾液酸化水平。這樣的改變被描述于Dickey等的PCT公開W0/2007/084926號和Ravetch等的PCT公開W0/2007/055916號，兩者都通過引用以其全部內(nèi)容并入本文。例如，可使用利用唾液酸酶(諸如產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafacens)唾液酸酶)的酶促反應(yīng)。這種反應(yīng)的條件被一般地描述于美國專利5，831，077中，其通過引用以其全部內(nèi)容由此并入。適當(dāng)?shù)拿傅钠渌窍拗菩詫?shí)例是神經(jīng)氨糖酸苷酶和N-糖苷酶F，如分別在Schloemer 等 J. Virology, 15 (4)，882-893 (1975)中和在 Leibiger 等，Biochem J.，338,529-538(1999)中描述的。去唾液酸化抗體可以通過使用親和層析進(jìn)一步純化?？蛇x地，可使用增加唾液酸化水平的方法，例如通過使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。這種反應(yīng)的條件被一般地描述于 Basset 等，Scandinavian Journal of Immunology, 51 (3), 307-311 (2000)中。在本文中本發(fā)明考慮的另一種抗體修飾是聚乙二醇化。例如，抗體可以被聚乙二醇化，以例如增加所述抗體的生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，所述抗體或其片段通常在其中一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)形成與所述抗體或抗體片段的連接的條件下與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG的活性酯或醛衍生物)反應(yīng)。優(yōu)選地，聚乙二醇化經(jīng)由與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的酰化反應(yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行。如本文所使用，術(shù)語“聚乙二醇”意圖包括已經(jīng)用于衍生其它蛋白質(zhì)的任何形式的PEG，諸如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方式，待乙二醇化的抗體是無糖基化抗體。用于蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以被應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。例如，參見Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。同樣，這里描述的聚乙二醇化方法也適用如下所述的本發(fā)明的肽類分子?？贵w片段和抗體模擬物本發(fā)明不限于傳統(tǒng)的抗 體，而是可以通過利用抗體片段和抗體模擬物進(jìn)行實(shí)施。如下文所詳述的，各種抗體片段和抗體模擬物技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)出來并且在本領(lǐng)域中是廣為人知的。盡管許多的這些技術(shù)，諸如結(jié)構(gòu)域抗體、納米體和UniBody，使用傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)的片段或?qū)鹘y(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)的其它修飾，但仍存在采用結(jié)合結(jié)構(gòu)的替代的技術(shù)，諸如Adnectin、親和體、DARPin、抗運(yùn)載蛋白、高親合性多聚體和Versabody,盡管它們模擬傳統(tǒng)的抗體結(jié)合，但是通過完全不同的機(jī)理產(chǎn)生并經(jīng)由不同的機(jī)理起作用。這些替代結(jié)構(gòu)的一些在 Gill 和 Damle (2006) 17 :653-658 中進(jìn)行了綜述。結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)是抗體的最小功能結(jié)合單元，相應(yīng)于人抗體的重(VH)鏈或輕(VL)鏈的可變區(qū)。結(jié)構(gòu)域抗體具有大約13kDa的分子量。Domantis已經(jīng)開發(fā)出完全人VH和VL dAb的一系列大的和高度功能性的文庫(在各文庫中超過一百億不同的序列)，并運(yùn)用這些文庫來選擇特異于治療靶標(biāo)的dAb。與許多常規(guī)抗體相反，結(jié)構(gòu)域抗體在細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中良好地表達(dá)。通過參考美國專利6，291，158,6, 582，915,6, 593，081、6，172，197,6, 696, 245 ;美國專利申請 No. 2004/0110941 ;歐洲專利申請 No. 1433846 和歐洲專利 0368684 和 0616640 ;TO05/035572、W004/101790、W004/081026, W004/05882UW004/003019和W003/002609可獲得結(jié)構(gòu)域抗體和其制備方法的更多細(xì)節(jié)，上述文獻(xiàn)每一篇通過引用以其全部內(nèi)容并入本文.·納米體是包含天然存在的重鏈抗體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)性和功能性特性的源自抗體的治療性蛋白質(zhì)。這些重鏈抗體包含單一可變結(jié)構(gòu)域(VHH)和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH2和CH3)。重要的是，克隆的和分離的VHH結(jié)構(gòu)域是具有原始重鏈抗體的完全的抗原結(jié)合能力的完全穩(wěn)定的多肽。納米體與人抗體的VH結(jié)構(gòu)域具有高同源性，并可以被進(jìn)一步人源化而沒有任何活性損失。重要的是，納米體具有低的致免疫能力，這已經(jīng)在采用納米體前導(dǎo)化合物的靈長類動物研究中得到了證實(shí)。納米體將常規(guī)抗體的優(yōu)點(diǎn)和小分子藥物的重要特征相結(jié)合。像常規(guī)抗體一樣，納米體顯示出高的靶特異性、對它們的靶的高親合力和低的固有毒性。然而，如小分子藥物一樣，它們可以抑制酶并容易地到達(dá)受體裂縫(receptor cleft)。而且，納米體極其穩(wěn)定，可以通過除了注射之外的方式進(jìn)行施用(例如，參見WO 04/041867，其通過引用以其全部內(nèi)容并入本文)并易于制造。納米體的其它優(yōu)點(diǎn)包括由于它們的小尺寸而識別不常見的或隱藏的表位，從而以高親合力、由于獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的選擇性及藥物形式靈活性結(jié)合到蛋白質(zhì)靶的空腔或活性部位，因而調(diào)整半衰期和藥物開發(fā)的容易度和速度。納米體通過單一基因進(jìn)行編碼并在幾乎所有的原核和真核宿主中高效產(chǎn)生，例如大腸桿菌(例如見u. S. 6，765，087，其通過引用以其全部并入本文)、霉菌(例如曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma))和酵母(例如酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤氏酵母屬(Pichia))(例如見美國6，838，254，其通過引用以其全部并入本文)。該產(chǎn)生方法可擴(kuò)大規(guī)模并已經(jīng)產(chǎn)生出數(shù)公斤量的納米體。因?yàn)榧{米體相比于常規(guī)抗體表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，所以它們可以被配制成長貯存期的即用溶液。Nanoclone法(例如見WO 06/079372，其通過引用以其全部并入本文)是基于B細(xì)胞的自動化高通量選擇的，用于產(chǎn)生針對期望靶的納米體的專用方法，并且可被用于本發(fā)明。UniBody是另一種抗體片段技術(shù)，然而這個(gè)技術(shù)是基于去除IgG4抗體的鉸鏈區(qū)。該鉸鏈區(qū)的缺失產(chǎn)生大小基本上為常規(guī)IgG4抗體的一半并具有單價(jià)結(jié)合區(qū)而不是IgG4抗體的二價(jià)結(jié)合區(qū)的分子。也眾所周知的是，IgG4抗體是惰性的，因此不與免疫系統(tǒng)相互作用，這對于其中不期望免疫應(yīng)答的疾病的治療可能是有利的，并且該優(yōu)點(diǎn)傳遞到UniBody。例如，UniBody可起到抑制或沉默而不是殺死它們所結(jié)合的細(xì)胞的作用。另外，結(jié)合癌細(xì)胞的UniBody不刺激它們增殖。而且，因?yàn)閁niBody的大小為常規(guī)IgG4抗體大小的一半左右，所以它們可以潛在有利的效力在較大的實(shí)體瘤上顯示出更好的分布。UniBody以與整個(gè)IgG4抗體相似的速率從機(jī)體清除，并且能夠以與全抗體相似的對抗原的親合性結(jié)合。通過參考專利申請W02007/059782——其通過引用以其全部并入本文，可獲得UniBody的更多細(xì)節(jié)。Adnectin分子是來源于纖連蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的工程化結(jié)合蛋白。纖連蛋白在人體 內(nèi)天然存在。它作為不溶性糖蛋白二聚物存在于細(xì)胞外基質(zhì)中并還充當(dāng)連接蛋白。它還以可溶的形式作為二硫連接的二聚體存在于血漿中。通過肝臟細(xì)胞(肝細(xì)胞)合成纖連蛋白的血漿形式,而通過軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮的一些細(xì)胞產(chǎn)生 ECM 形式(見 Ward M.和 Marcey, D. , callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fib ro.htm)。如早先提及，纖連蛋白可天然地作為細(xì)胞粘附分子發(fā)揮其作用，或者它可通過在細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行接觸而介導(dǎo)細(xì)胞的相互作用。通常，纖連蛋白由三個(gè)不同的蛋白質(zhì)模塊——I型、II型和III型模塊——組成。對于纖連蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的綜述，見 Pankov 和 Yamada (2002) J Cell Sci. ； 115 (Pt 20) =3861-3,Hohenester 和 Engel(2002) 21 :115_128，和 Lucena 等(2007)Invest Clin. 48 :249_262。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，adnectin分子通過改變由分布在兩個(gè)P折疊之間的多個(gè)^鏈組成的天然蛋白質(zhì)而衍生于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域。取決于起源的組織，纖連蛋白可包含多個(gè)III型結(jié)構(gòu)域，其可以被表示為例如午113、￥113、￥113等。uiFr^結(jié)構(gòu)域包含整聯(lián)蛋白結(jié)合基序，并進(jìn)一步包含連接所述P鏈的三個(gè)環(huán)。這些環(huán)可以被認(rèn)為相當(dāng)于IgG重鏈的抗原結(jié)合環(huán)，并且它們可以通過下文討論的方法加以改變以特異性結(jié)合目標(biāo)靶，例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，諸如人Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，可用于本發(fā)明的目的的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域是表現(xiàn)出與編碼纖連蛋白III型分子的結(jié)構(gòu)的序列(其可從 Protein Data Bank (PDB, rcsb. org/pdb/home/home. do)以登錄代碼lttg獲取)具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的序列。Adnectin分子還可來源于kiFM相關(guān)分子的聚合物，而不是簡單的單體uiFr^結(jié)構(gòu)。盡管天然kiFM結(jié)構(gòu)域通常結(jié)合整聯(lián)蛋白，但經(jīng)改裝變成adnectin分子的wFM蛋白被改變以結(jié)合目標(biāo)抗原，例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，諸如人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，對uiFr^分子的改變包括對P鏈的至少一個(gè)突變。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接kiFM分子的P鏈的環(huán)區(qū)被改變以結(jié)合人受體酪氨酸激酶(例如VEGF受體或III型受體酪氨酸激酶，諸如人Kit)的Ig樣結(jié)構(gòu)域。10Fn3中的改變可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，包括但不限于易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)誘變、DNA改組或在本文提及的其它類型的重組誘變。在一個(gè)實(shí)例中，編碼wFM序列的DNA的變異體可以直接體外合成，并且之后在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯?？蛇x地，天然kiFM序列可使用標(biāo)準(zhǔn)方法從基因組分離或克隆(如在例如美國專利申請No. 20070082365中進(jìn)行的)，然后使用本領(lǐng)域已知的誘變方法進(jìn)行突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶蛋白(例如，RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域如Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)可以固定在固相載體上，例如柱樹脂或微孔滴定板中的孔。然后，將靶與潛在結(jié)合蛋白的文庫接觸。該文庫可包含通過kiFM序列的誘變/隨機(jī)化或通過10Fn3環(huán)區(qū)(不是P鏈)的誘變/隨機(jī)化而來源于野生型wFM的wFM克隆或adnectin分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述文庫可以是通過Szostak等的美國專利申請No. 09/007, 005和09/247，190、Szostak等的W0989/31700 以及Roberts & Szostak(1997) 94 :12297-12302描述的技術(shù)產(chǎn)生的RNA-蛋白質(zhì)融合文庫。所述文庫也可以是DNA-蛋白質(zhì)文庫(例如，如描述于Lohse，美國專利申請No. 60/110，549、美國專利申請No. 09/459，190和WO 00/32823)。然后，所述融合文庫與固定的靶(例如人Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或人VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)一起溫育，并洗滌固相載體以除去非特異性結(jié)合的成分。然后，在嚴(yán)格條件下洗脫緊密結(jié)合物，并且使用PCR來擴(kuò)增遺傳信息或產(chǎn)生結(jié)合分子的新的文庫，以重復(fù)所述過程(有或者沒有另外的誘變)?？梢灾貜?fù)選擇/誘變過程，直到獲得對靶具有足夠的親合性的結(jié)合物。用于本發(fā)明的Adnectin分子可以使用Adnexus (Briston-Myers Squibb公司)采用的PROfusion 技術(shù)進(jìn)行工程化。PROfusion技術(shù)是基于上文所述的技術(shù)建立的(例如Roberts& Szostak(1997)94 =12297-12302) 產(chǎn)生改變的uiFr^結(jié)構(gòu)域的文庫和選擇可用于本發(fā)明的適當(dāng)結(jié)合物的方法被充分描述于下列美國專利和專利申請文件中并通過引用并入本文美國專利 7，115，396,6, 818，418,6, 537，749,6, 660，473,7, 195，880,6, 416，950、6，214，553、6623926、6，312，927、6，602，685、6，518，018、6，207，446、6，258，558、6，436，665,6, 281，344,7, 270，950,6, 951，725,6, 846，655,7, 078，197,6, 429，300、7， 125，669、6，537，749、6，660，473 號和美國專利申請 20070082365、20050255548、20050038229、20030143616、20020182597、20020177158、20040086980、20040253612、20030022236、20030013160、20030027194、20030013110、20040259155、20020182687、20060270604、20060246059、20030100004、20030143616 和 20020182597 號。纖連蛋白 III型結(jié)構(gòu)域(諸如kiFM)的多樣性的產(chǎn)生及隨后的選擇步驟可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行，諸如曬菌體展示、核糖體展示或酵母表面展示，例如Lipov§ek等(2007) Journal of Molecular Biology 368 :1024-1041 ；Sergeeva 等(2006)Adv Drug Deliv Rev. 58 1622-1654 ;Petty 等(2007)Trends Biotechnol. 25 :7-15 ;Rothe 等(2006)Expert OpinBiol Ther. 6 :177-187 ;和 Hoogenboom(2005) Nat Biotechnol. 23 :1105_1116。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，上文引用的參考文獻(xiàn)中的方法可用來從優(yōu)選的kiFM結(jié)構(gòu)域之外的蛋白質(zhì)衍生抗體模擬物?？捎糜诮?jīng)由上述引用的方法產(chǎn)生抗體模擬物的其他分子非限制性地包括人纖連蛋白模塊1FnS-9FnS和nFn3_17Fn3以及來自非人類動物和原核生物的相關(guān)Fn3模塊。此外，也可使用來自與kiFM具有序列同源性的其它蛋白
質(zhì)-諸如腱生蛋白(tenascin)和粗纖維調(diào)節(jié)素(undulin)-的Fn3模塊。具有免疫球
蛋白樣折疊(但是具有與Vh結(jié)構(gòu)域無關(guān)的序列)的其它示例性蛋白質(zhì)包括N-鈣粘蛋白、ICAM-2、肌聯(lián)蛋白(titin)、GCSF受體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、E-鈣粘蛋白和抗生素色蛋白。具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的其它結(jié)構(gòu)域可以來源于髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T細(xì)胞抗原受體、⑶I、VCAM-I的C2和I-組結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白-結(jié)合蛋白C的I-組免疫球蛋白折疊、肌球蛋白-結(jié)合蛋白H的I-組免疫球蛋白折疊、端蛋白(telokin)的I-組免疫球蛋白折疊、telikin、NCAM、twitchin、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長激素受體、紅細(xì)胞生成素受體、催乳素受體、GC-SF受體、干擾素-Y受體、^ -半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、^ -葡糖苷酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶?？蛇x地，包括一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白樣折疊的任何其他的蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生adnectin樣結(jié)合成分。這樣的蛋白質(zhì)可以例如使用程序SCOP加以確定(Murzin等，J. Mol. Biol. 247 :536(1995) ；Lo Conte 等，Nucleic Acids Res. 25 :257 (2000)。適體是本發(fā)明包括的另一種類型的抗體模擬物。適體通常是小的核苷酸聚合物，其結(jié)合特定的分子靶。適體可以是單鏈或雙鏈核酸分子(DNA或RNA)，盡管DNA基適體最通常是雙鏈的。對于適體核酸沒有限定的長度；然而，適體分子最常見具有在15和40個(gè)核苷酸之間的長度。適體經(jīng)常形成復(fù)合三維結(jié)構(gòu)，其決定它們對靶分子的親合性。適體相比于簡單的抗體可以提供許多優(yōu)勢，主要是因?yàn)樗鼈兛梢詭缀跬耆隗w外被工程化和被擴(kuò)增。而且，適體通常很少或不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。適體可以使用各種技術(shù)產(chǎn)生，但最初使用體外選擇(Ellington和Szostak.(1990)Nature. 346 (6287) :818-22)和SELEX法(通過指數(shù)富集導(dǎo)致系統(tǒng)性配體進(jìn)化)(Schneider等1992. J Mol Biol. 228(3) :862-9)——其內(nèi)容通過引用并入本文——進(jìn)行開發(fā)。制備和使用適體的其它方法已經(jīng)公開，包括Klussmann. The Aptamer Handbook Functional Oligonucleotides and Their Applications. ISBN :978-3-527-31059-3 ；Ulrich 等 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9(8) :619-32 ;Cerchia 和 deFranciscis. 2007. Methods Mol Biol. 361 :187-200 ;Ireson 和 Kelland. 2006. Mol CancerTher. 2006 5(12) :2957-62 ;美國專利 5582981 ；5840867 ；5756291 ；6261783；6458559 ；5792613 ；6111095 號；以及美國專利申請 11/482，671 ；11/102, 428 ；11/291, 610 ；和10/627，543號，其都通過引用并入本文。SELEX法明顯是最流行的并且以三個(gè)基本步驟進(jìn)行。首先，針對與特定分子靶的結(jié)合對候選核酸分子的文庫進(jìn)行挑選。其次，從非結(jié)合物分離出對于所述靶具有足夠親合性的核酸。第三，擴(kuò)增結(jié)合的核酸，形成第二文庫，并且重復(fù)該過程。在各次重復(fù)時(shí)，選擇對于靶分子具有越來越高的親合性的適體。SELEX法被更充分描述于通過引用并入本文的下列出版物中=Bugaut 等 2006. 4(22) :4082-8 ；Stoltenburg 等 2007 Biomol Eng. 200724(4)381-403 ;和 Gopinath. 2007. Anal Bioanal Chem. 2007. 387(1) :171_82。本發(fā)明的“適體”也包括由肽而不是核苷酸制成的適體。肽適體與核苷酸適體具有一些共同的性質(zhì)(例如，小的尺寸和以高親合性結(jié)合靶分子的能力)并且它們可以通過與用于產(chǎn)生核苷酸適體的選擇法具有相似原理的選擇法產(chǎn)生，例如Baines和Colas. 2006.Drug DiscovToday. 11(7-8) :334-41 ;和 Bickle 等 2006. Nat Protoc. I (3) :1066_91，其通過引用并入本文。親和體分子表示來源于葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的基于58個(gè)氨基酸殘基蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的一類新的親合性蛋白質(zhì)。這一種三螺旋束結(jié)構(gòu)域已經(jīng)用作構(gòu)建組合噬菌粒文庫的支架，可使用噬菌體展示技術(shù)從該文庫選擇靶向于期望分子的親和體變體(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA,Binding proteinsselected from combinatorial libraries of an a -helical bacterial receptordomain, Nat Biotechnol 1997 ； 15 :772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering ofprotein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55)。與它們的低分子量(6kDa)結(jié)合，親和體分子的簡單、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得它們適于各式各樣的應(yīng)用，例如作為檢測試劑(Ronmark J，Hansson M,Nguyen T^,Construction and characterization of affibody-Fc chimerasproduced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002 ；261 :199-211),以及用于抑制受體相互作用(Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of theCD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28_binding Affibody ligand developed bycombinatorial protein engineering,Protein Eng 2003 ; 16 :691-7)。通過參考美國專利No. 5，831，012 (其通過引用以其全部并入本文)可獲得親和體和其制備方法的更多細(xì)節(jié)。 DARPin(設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白質(zhì))是抗體模擬DRP(設(shè)計(jì)的重復(fù)序列蛋白質(zhì))技術(shù)的一個(gè)實(shí)例，該技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)為利用非抗體多肽的結(jié)合能力。重復(fù)序列蛋白質(zhì)如錨蛋白或富亮氨酸重復(fù)序列蛋白質(zhì)是遍在的結(jié)合分子，其在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外存在，這與抗體不同。它們的獨(dú)特的模塊結(jié)構(gòu)的特征在于重復(fù)結(jié)構(gòu)單元(重復(fù)序列)，其堆疊在一起以形成顯示出可變的和模塊的靶-結(jié)合表面的細(xì)長重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。基于該模塊性，具有高度多樣化結(jié)合特異性的多肽的組合文庫可以被產(chǎn)生。該策略包括展示可變表面殘基的自相容性重復(fù)序列的共有設(shè)計(jì)以及它們隨機(jī)裝配成重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。DARPin可以在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中以很聞的廣量廣生并且它們屬于已知的最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。對寬范圍的靶蛋白質(zhì)一包括人受體、細(xì)胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白質(zhì)——具有高度特異性、高親合性的DARPin已經(jīng)被選擇?？梢垣@得具有單數(shù)位納摩爾至皮摩爾范圍內(nèi)的親合性的DARPin。DARPin已經(jīng)用于各種各樣的應(yīng)用，包括ELISA、夾心ELISA、流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)、免疫組織化學(xué)(IHC)、芯片應(yīng)用、親和純化或蛋白質(zhì)印跡。DARPin也已證明在細(xì)胞內(nèi)空間具有高度的活性，例如作為融合于綠色熒光蛋白(GFP)的胞內(nèi)標(biāo)記蛋白。DARPin被進(jìn)一步用于以PM范圍內(nèi)IC50抑制病毒進(jìn)入。DARPin不僅對于阻斷蛋白質(zhì)相互作用是理想的，而且對于抑制酶也是理想的。蛋白酶、激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)被成功抑制，最經(jīng)常變構(gòu)性抑制模式。在腫瘤上的極快和特異性富集以及非常有利的腫瘤-血液比率使得DARPin很適于體內(nèi)診斷或治療方法。關(guān)于DARPin及其他DRP技術(shù)的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國專利申請公開No. 2004/0132028和國際專利申請公開No. WO 02/20565，兩者都通過弓I用以其全部內(nèi)容并入本文?？惯\(yùn)載蛋白是另外的抗體模擬技術(shù)，然而，在這種情況下，結(jié)合特異性源自于脂鈣蛋白(Iipocalin)——在人組織和體液中天然存在且大量表達(dá)的低分子量蛋白質(zhì)家族。月旨鈣蛋白已進(jìn)化為執(zhí)行與化學(xué)上敏感的或不溶性的化合物的生理運(yùn)輸和儲存有關(guān)的許多體內(nèi)功能。脂鈣蛋白具有穩(wěn)固的內(nèi)在結(jié)構(gòu)，其包含高度保存的P桶，該P(yáng)桶在所述蛋白質(zhì)一個(gè)末端支持四個(gè)環(huán)。這些環(huán)形成結(jié)合袋的入口，并且在所述分子的這個(gè)部分的構(gòu)象差異造成在各個(gè)脂鈣蛋白之間結(jié)合特異性的變化。盡管由保守P折疊框架支持的超變環(huán)的整體結(jié)構(gòu)類似于免疫球蛋白，但是脂鈣蛋白與抗體在大小、由160-180個(gè)氨基酸(其比單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域稍大)的單一多肽鏈組成方面顯著不同。脂鈣蛋白被克隆并且它們的環(huán)進(jìn)行工程化以產(chǎn)生抗運(yùn)載蛋白。結(jié)構(gòu)上多樣的抗運(yùn)載蛋白的文庫已經(jīng)被產(chǎn)生，并且抗運(yùn)載蛋白展示允許對結(jié)合功能進(jìn)行選擇和篩選，之后在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)和產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析的可溶性蛋白質(zhì)。研究已經(jīng)成功地證明，可以開發(fā)對于幾乎任何可以被分離的人靶蛋白特異性的抗運(yùn)載蛋白，并且可以獲得在納摩爾或以上的范圍內(nèi)的結(jié)合親合性。抗運(yùn)載蛋白還可以被設(shè)計(jì)成雙革巴向蛋白質(zhì),所謂的Duocalin。Duocalin結(jié)合在使用標(biāo)準(zhǔn)制造方法容易產(chǎn)生的一個(gè)單體蛋白質(zhì)中的兩個(gè)獨(dú)立的治療靶標(biāo)上，同時(shí)保持靶特異性和親合性，而無論它的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)取向如何。通過單一分子對多個(gè)靶的調(diào)節(jié)在已知涉及一種以上病因的疾病中是特別有利的。而且，二價(jià)或多價(jià)結(jié)合形式如Duocalin在祀向疾病中的細(xì)胞表面分子、介導(dǎo)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動效應(yīng)或誘導(dǎo)經(jīng)由細(xì)胞表面受體的結(jié)合和成簇而增強(qiáng)的內(nèi)化效應(yīng)方面具有顯著的能力。而且,Duocalin的高內(nèi)在穩(wěn)定性與單體抗運(yùn)載蛋白相當(dāng)，從而為Duocalin提供靈活的制劉和輸送可能。關(guān)于抗運(yùn)載蛋白的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國專利7，250，297和國際專利申請公布No. WO 99/16873中，兩者都通過引用以其全部內(nèi)容并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的另一個(gè)抗體模擬技術(shù)是高親合性多聚體。高親合性多聚體是通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人的細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域的大家族發(fā)展而來，從而產(chǎn)生具有結(jié)合和抑制性質(zhì)的多結(jié)構(gòu)域蛋白。連接多個(gè)獨(dú)立的結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)表明產(chǎn)生親合力(avidity),并且相比于常規(guī)的單一表位結(jié)合蛋白質(zhì),引起親合性和特異性的改善。其它潛在優(yōu)點(diǎn)包括在大腸桿菌中多靶特異性分子的簡單和有效的產(chǎn)生、熱穩(wěn)定性改善和蛋白酶抗性。已經(jīng)獲得針對各種靶的、具有亞納摩爾親合性的高親合性多聚體。關(guān)于高親合性多聚體的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國專利申請公開2006/0286603、2006/0234299、2006/0223 114、2006/0 17783 I、2006/0008844、2005/022 1384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756 號，其全部都通過引用以其全部內(nèi)容并入于此。Versabody是可用于本發(fā)明的另一個(gè)抗體模擬技術(shù)。Versabody是具有> 15%的半胱氨酸的3_5kDa的小蛋白質(zhì)，其形成高二硫化密度的骨架，取代典型蛋白質(zhì)具有的疏水核心。用少量二硫化物置換大量疏水性氨基酸(包括疏水核心)產(chǎn)生較小、更親水(較少聚集和非特異性結(jié)合)、更耐蛋白酶和更耐熱的蛋白質(zhì)，并且所述蛋白質(zhì)具有較低密度的T細(xì)胞表位，因?yàn)閷HC呈遞貢獻(xiàn)最大的殘基是疏水性的。這四個(gè)性質(zhì)已知全部影響免疫原性，并且預(yù)期它們一起引起大的免疫原性降低。Versabody的靈感來自通過水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蝸牛和?？a(chǎn)生的天然可注射生物藥物，其已知出乎意料地表現(xiàn)出低免疫原性。從選擇的天然蛋白質(zhì)家族開始，通過設(shè)計(jì)和通過篩選尺寸、疏水性、蛋白水解抗原加工和表位密度得以最小化至遠(yuǎn)低于天然可注射蛋白質(zhì)的平均水平。給定Versabody的結(jié)構(gòu)，這些抗體模擬物提供多種多樣的形式，包括多價(jià)、多特異性、半衰期機(jī)理的多樣性、組織祀向模塊和抗體Fe區(qū)的缺失。而且,Versabody在大腸桿菌中以高產(chǎn)率制造，并且因?yàn)樗鼈兊挠H水性和小尺寸，Versabody高度可溶并可以配制成高濃度。Versabody是異常耐熱的(它們可以被煮沸)，因而提供延長的貯存期。關(guān)于Versabody的其它信息可發(fā)現(xiàn)于美國專利申請公開No. 2007/0191272，其通過引用以其全部內(nèi)容由此并入。
SMIP (Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals)被工程化以保持并優(yōu)化靶結(jié)合、效應(yīng)子功能、體內(nèi)半衰期和表達(dá)水平。SMIPS由三個(gè)不同的模塊結(jié)構(gòu)域組成。首先，它們包含可以由賦予特異性的任何蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞表面受體、單鏈抗體、可溶蛋白質(zhì)等等)組成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其次，它們包含在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域之間充當(dāng)柔性接頭，以及幫助控制SMIP藥物的多聚化的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。最后，SMIP包含可以來源于各種分子的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，包括Fe結(jié)構(gòu)域或其它特別地設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。所述設(shè)計(jì)的模塊化(其允許采用各種不同的結(jié)合、鉸鏈和效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域簡單地構(gòu)建SMIP)提供了快速和個(gè)性化的藥物設(shè)計(jì)。關(guān)于SMIP的更多信息，包括如何設(shè)計(jì)它們的實(shí)例，可以發(fā)現(xiàn)于Zhao等(2007)Blood 110 :2569-77 和下列美國專利申請 20050238646、20050202534、20050202028、20050202023,20050202012,20050186216,20050180970 和 20050175614 號。
上文提供的抗體片段和抗體模擬物技術(shù)的詳細(xì)描述不意圖是可被用于本說明書的全部技術(shù)的完全列表。例如，并且非限制性地，各種另外的技術(shù)，包括可選的基于多肽的技術(shù)，諸如在 Qui 等，Nature Biotechnology, 25 (8) 921-929 (2007)(通過引用以其全部內(nèi)容由此并入)中概述的互補(bǔ)決定區(qū)的融合，以及基于核酸的技術(shù)，如描述于美國專利 5，789，157,5, 864，026,5, 712，375,5, 763，566,6, 013，443,6, 376，474,6, 613，526、6，114，120、6，261，774和6，387,620(全部通過引用由此并入)中的RNA適體技術(shù)，可用于本發(fā)明中。杭體的物理件質(zhì)本發(fā)明的抗體，其結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，可以進(jìn)一步通過各種物理特性加以表征。基于這些物理特性，各種測定方法可用來檢測和/或區(qū)別不同類的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)在可變區(qū)中的存在可以導(dǎo)致抗體的免疫原性增加或由于抗原結(jié)合改變而引起抗體的pK改變(Marshall等(1972) Annu Rev Biochem 41 :673-702 ；Gala FA和Morrison SL(2004) J Immunol 172 5489-94 ;Wallick等(1988) J Exp Medl68 1099-109 ；Spiro RG(2002)Glycobiology U:43R_56R ;Parekh 等(1985)Nature 316 452-7 ;Mimura 等(2000) Mol Immunol 37 :697-706) 已知糖基化在包含 N-X-S/T 序列的基序上發(fā)生。使用Glycoblot測定可檢測可變區(qū)糖基化，該測定切割抗體以產(chǎn)生Fab，然后使用測量高碘酸鹽氧化和希夫堿形成的測定方法檢測糖基化。可選地，可以使用Dionex薄層色譜(Dionex-LC)檢測可變區(qū)糖基化，其從Fab切割糖以成為單糖并分析各種糖含量。在一些情況下，可優(yōu)選具有不包含可變區(qū)糖基化的抗體。這可以通過選擇在可變區(qū)不包含糖基化基序的抗體或者通過使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在糖基化基序內(nèi)使殘基突變加以實(shí)現(xiàn)。各抗體具有獨(dú)特的等電點(diǎn)(pi)，但是通常抗體將落在6和9. 5之間的pH范圍內(nèi)。IgGl抗體的pi通常落入7-9. 5的pH范圍內(nèi)，而IgG4抗體的pi通常落入6-8的pH范圍內(nèi)?？贵w可具有在該范圍之外的Pi。盡管效應(yīng)通常是未知的，但推測具有在正常范圍之外的Pl的抗體可能在體內(nèi)條件下產(chǎn)生一些展開和不穩(wěn)定性?？梢允褂妹?xì)管等電聚焦分析檢測等電點(diǎn)，所述測定建立PH梯度并可利用激光聚焦以提高準(zhǔn)確度(Janini等(2002)Electrophoresis 23 :1605-11 ;Ma 等(2001) Chromatographia 53 S75-89 ;Hunt 等(1998)J Chromatogr A _ :355-67)。在一些情況下，優(yōu)選具有包含落于正常范圍內(nèi)的pi值的抗體。這可以通過選擇具有在正常范圍內(nèi)的Pl的抗體或者通過使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變帶電表面殘基加以實(shí)現(xiàn)。
各抗體具有作為熱穩(wěn)定性指標(biāo)的解鏈溫度(Krishnamurthy R和ManningMC(2002)Curr Pharm Biotechnol 2:361-71)。較高的熱穩(wěn)定性表示體內(nèi)總體抗體穩(wěn)定性更高。使用諸如差示掃描量熱法的技術(shù)可以測量抗體的熔點(diǎn)(Chen等(2003)Pharm Res迪1952-60 ;Ghirlando 等(1999) Immunol Lett 68 :47-52) Tmi 表示抗體最初展開的溫度。Tm2表示抗體完全展開的溫度。通常，優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體的Tmi大于60°C、優(yōu)選大于65°C、甚至更優(yōu)選大于70°C?？蛇x地，可以使用圓二色性測量抗體的熱穩(wěn)定性(Murray等(2002)J. Chromatogr Sci 40 :343-9)。在優(yōu)選的實(shí)施方式，可以期望不迅速地降解的抗體?？梢允褂妹?xì)管電泳(CE)和MALDI-MS測量抗體的斷裂，如本領(lǐng)域充分了解的(Alexander AJ和Hughes DE (1995) AnalChem 67 :3626-32)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇具有最小聚集效應(yīng)的抗體。聚集可能導(dǎo)致引發(fā)不需要的免疫應(yīng)答和/或?qū)е赂淖兊幕虿焕乃幬锎x動力學(xué)性質(zhì)。通常，具有25%或以下的聚集的抗體是可接受的，優(yōu)選20%或以下，甚至更優(yōu)選15%或以下，甚至更優(yōu)選10%或以下并且甚至更優(yōu)選5%或以下。可以通過本領(lǐng)域熟知的幾種技術(shù)測量聚集，包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色譜法(HPLC)和光散射以鑒定單體、二聚體、三聚物或多聚體。本發(fā)明多克隆抗體的制備本發(fā)明的多克隆抗體可以通過本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)產(chǎn)生。多克隆抗體源自于不同的B細(xì)胞系，因此可識別同一抗原上的多個(gè)表位。通常通過用目標(biāo)抗原(例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，諸如人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域或人VEGF的D7結(jié)構(gòu)域)免疫適當(dāng)?shù)牟溉閯游锂a(chǎn)生多克隆抗體。經(jīng)常被用來產(chǎn)生多克隆抗體的動物是雞、山羊、豚鼠、倉鼠、馬、小鼠、大鼠、綿羊和最常用的兔子。在下文的實(shí)施例14中，通過用Kit的第四(D4)或第五(D5)Ig樣結(jié)構(gòu)域或Kit的完整胞外域免疫兔子產(chǎn)生多克隆抗Kit抗體。產(chǎn)生多克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法是本領(lǐng)域廣泛熟知的，并可以與本發(fā)明的方法結(jié)合(例如research, cm. utexas. edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/Immunology/PAb. html ；美國專利 4，719，290、6，335，163、5，789，208,2, 520，076,2, 543，215和3，597，409號，其完整內(nèi)容通過引用并入本文)。本發(fā)明的單克隆抗體的制備本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)可以通過多種技術(shù)產(chǎn)生，包括常規(guī)單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein (1975) Nature 256 :495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管體細(xì)胞雜交法是優(yōu)選的，但原則上，其它產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)可以被使用，例如B淋巴細(xì)胞的病毒性或致癌性轉(zhuǎn)化。應(yīng)該注意到，抗體(單克隆或多克隆)或其抗原結(jié)合部分可以針對RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域、更優(yōu)選人Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域上的任何表位而產(chǎn)生，或者針對在本文論述的共有序列而產(chǎn)生，或者針對在本文描述的任何構(gòu)象、非連續(xù)或線性表位而產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的幾種方法可用于特異性選擇特異性結(jié)合目標(biāo)非連續(xù)表位的抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，在通過引用并入本文的美國公開No. 2005/0169925中公開的技術(shù)允許選擇結(jié)合蛋白質(zhì)序列內(nèi)兩個(gè)不同的肽的抗體。這樣的方法可根據(jù)本發(fā)明用于特異性靶向于在本文公開的構(gòu)象和非連續(xù)表位。如果構(gòu)象表位是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)通常很容易在較小的肽(例如<50個(gè)氨基酸)中形成。因此，用較小的肽免疫動物可以捕獲一些構(gòu)象表位?？蛇x地，包含構(gòu)象表位的兩個(gè)小肽(例如表5中確定的肽)可以經(jīng)由柔性、接頭(例如，聚乙二醇或一段極性的、不帶電的氨基酸)連接。所述接頭允許肽試探各種相互作用取向。采用這種構(gòu)建體進(jìn)行免疫，繼之以適當(dāng)?shù)暮Y選，可允許鑒定針對構(gòu)象表位的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過用RTK的特定結(jié)構(gòu)域(例如，Kit胞外域的結(jié)構(gòu)域4或結(jié)構(gòu)域5或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)免疫動物，接著篩選結(jié)合目標(biāo)表位的抗體，可以產(chǎn)生針對特定構(gòu)象或線性表位的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，冷凍電鏡術(shù)(Jiang等(2008)Nature451,1130-1134 Joachim(2006) Oxford University Press ISBN :0195182189)可用來鑒定由本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RTK或其結(jié)構(gòu)域可以與結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段一起結(jié)晶并通過X-射線晶體衍射法分析，以確定被結(jié)合的精確表位。此外，可以通過用來自小鼠或另一個(gè)物種的相應(yīng)序列替換RTK序列的部分對表位進(jìn)行作圖。針對目標(biāo)表位的抗體選擇性地結(jié)合人序列區(qū)，因此，有可能對靶表位進(jìn)行順序作圖。該基于嵌合體的表位作圖技術(shù)已經(jīng)成功地用于鑒定各種情況下的表位(參見Henriksson 和 Pettersson(1997)Journal of Autoimmunity. 10(6) :559-568 ;Netzer 等(1999)J Biol Chem. 1999 Apr 16 ；274(16) :11267-74 ;Hsia等(1996)Mol. Microbiol. 19，53-63，其完整內(nèi)容通過引用并入本文)。
·
據(jù)認(rèn)為，靶RTK(例如Kit RTK或VEGF受體)中的目標(biāo)表位未被糖基化。然而，如果目標(biāo)RTK被糖基化，抗體或其抗原結(jié)合部分(及本發(fā)明的其他成分)可被產(chǎn)生以使得它們結(jié)合有關(guān)的氨基酸和/或糖殘基。例如，本領(lǐng)域已知Kit蛋白質(zhì)具有最少10個(gè)潛在的 N-連接糖基化位點(diǎn)。(Morstyn, Foote, Lieschke (2004)Hematopoietic GrowthFactors in Oncology Basic Science and Clinical Therapeutics. Humana Press. ISBN 1588293025)。進(jìn)一步認(rèn)為，Kit可表現(xiàn)出0-連接糖基化以及與唾液酸殘基的連接(WypychJ等(1995) Blood. 85 (I) :66-73)。因此，本發(fā)明考慮，抗體或其抗原結(jié)合部分(及本發(fā)明的其他成分)可被產(chǎn)生以使得它們也結(jié)合可以連接于在本文鑒定的任何表位的糖殘基。出于該目的，可以在動物細(xì)胞中產(chǎn)生抗原性目標(biāo)肽以使得它被適當(dāng)糖基化，并且然后糖基化的抗原肽可用于免疫動物。產(chǎn)生糖基化肽的適當(dāng)?shù)募?xì)胞和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在下文進(jìn)一步描述(參見例如，可從 GlycoFi, Inc.，Lebanon, NH and Bioffa ；Princeton, NJ 獲得的技術(shù))?？墒褂萌魏螛?biāo)準(zhǔn)方法諸如等電點(diǎn)聚焦(IEF)、酸水解(以確定單糖組成)、化學(xué)或酶促裂解和質(zhì)譜法(MS)鑒定聚糖而檢測肽的適當(dāng)糖基化。也可使用由Procognia(procognia.com)提供的技術(shù)——其使用基于植物凝血素的陣列來加速聚糖分析。特別地，可以使用如還原性堿性裂解或“ P -消除”、肽作圖、液相色譜和質(zhì)譜或這些技術(shù)的任何組合的技術(shù)檢測0-糖基化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是非常完善的方法。免疫方案和分離用于融合的免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合伴體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是已知的。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列進(jìn)行制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從感興趣的的鼠雜交瘤獲得并工程化以包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，為產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法(例如見Cabilly等的美國專利No. 4,816, 567)將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)。為產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入人框架中(例如，見Winter的美國專利5，225，539和Queen等的美國專利5，530，101,5, 585,089、5，693，762和6，180, 370)。可選地，在已知人和非人序列的情況下，可以在DNA或蛋白水平設(shè)計(jì)人源化抗體。這樣的抗體可以直接進(jìn)行化學(xué)合成，或者DNA可以被合成并進(jìn)行體外或體內(nèi)表達(dá)以產(chǎn)生人源化抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體?？梢允褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)的這類人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文被分別稱為HuMAb小鼠和KM mice 的小鼠，并且在本文被統(tǒng)稱為“人Ig小鼠”。HuMAb mouse (Medarex, Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(U和Y )和k輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，連同滅活內(nèi)源性ii和K鏈基因座的靶向突變(見例如Lonberg等(1994)Nature 368(6474) :856-859)。因此，所 述小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或K的表達(dá)減少，并且響應(yīng)于免疫時(shí)引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親合性人IgGK單克隆(Lonberg，N.等(1994)，同上；在 Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101 中綜述；Lonberg, N.和 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93,以及 Harding, F.和Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 7M :536-546)。HuMab 小鼠的制備和使用以及這樣的小鼠攜帶的基因組修飾被進(jìn)一步描述在Taylor, L.等(1992)Nucleic Acids Research20 :6287-6295 ；Chen, J.等(1993)International Immunology & :647-656 ;Tuaillon 等(1993)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 :3720-3724 ；Choi 等(1993)Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等(1993)EMBO J. U:821-830 ;Tuaillon 等(1994)I. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor, L.等(1994) International Immunology 6 :579-591 ；和 Fishwild，D.等(1996) Nature Biotechnology 14 :845-851中，其全部內(nèi)容都通過引用明確地由此并入。進(jìn)一步參見美國專利 5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，789，650 ；5，877，397 ;5，661，016 ;5，814，318 ;5，874，299 ;和 5，770，429，其全部授予 Lonberg 和 Kay ；授予 Surani 等的美國專利 5，545，807 ;PCT 公開 WO 92/03918,WO 93/12227,WO 94/25585、WO 97/13852,WO 98/24884 和 WO 99/45962，其全部授予 Lonberg 和 Kay ;和授予 Korman 等的 PCT 公開 WO 01/14424。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用在轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠(如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠)產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這類小鼠，在本文稱為“KM mice ”，被詳細(xì)描述于授予Ishida等的PCT公開WO 02/43478中。更進(jìn)一步，可選擇的表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是可獲得的，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如,稱為Xenomouse (Abgenix, Inc.)的可選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可被使用；這樣的小鼠被描述于例如授予Kucherlapati的美國專利5，939，598、6,075，181,6, 114，598,6, 150，584 和 6，162,963 中。而且，可選擇的表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是可獲得的，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，稱為“TC小鼠”，可以被使用；這類小鼠被描述于Tomizuka等(2000)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97 :722-727中。而且，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的母牛已經(jīng)在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述(Kuroiwa 等(2002)Nature Biotechnology 20 :889-894)并且可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的人單克隆抗體還可以使用用于篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法加以制備。用于分離人抗體的這類噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中被建立。例如，參見授予Ladner等的美國專利5，223，409,5, 403，484和5，571，698號；授予Dower等的美國專利 5，427，908 和 5，580，717 號；授予 McCafferty 等的美國專利 5，969，108 和 6，172，197號；以及授予 Griffiths 等的美國專利 5,885, 793,6, 521,404,6, 544，731,6, 555，313、6，582，915 和 6，593，081 號。本發(fā)明的人單克隆抗體還可以使用SCID小鼠進(jìn)行制備，其中人免疫細(xì)胞已經(jīng)被重構(gòu)以使得在免疫時(shí)可以產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這樣的小鼠被描述在例如授予Wilson等的美國專利 5，476，996 和 5， 698，767 中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以使用熟知的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生，如描述于 Marks，J. D.等((1991) J. Mol. Biol. 222，581)，Nissim，A.等((1994) EMBO J. 13，692)以及美國專利 6，794，132、6562341、6057098、5821047 和 6512097 中。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可使用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)進(jìn)行尋找，如在例如美國專利6，423，538,6, 300，065,6, 696，251,6, 699，658號中所描述的。制備本發(fā)明人類單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生為產(chǎn)生制備本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，來自免疫小鼠的脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞可以被分離并且融合到適當(dāng)?shù)臒o限增殖化細(xì)胞系，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？梢詫Φ玫降碾s交瘤進(jìn)行抗原特異性抗體產(chǎn)生的篩選。例如，可以采用50% PEG將來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液融合于六分之一數(shù)目的P3X63-Ag8. 653非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL 1580)?？蛇x地，可以使用基于電場的電融合法，使用CytoPulse大室細(xì)胞融合電感受器(CytoPulse Sciences, Inc. , Glen Burnie Maryland)對來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液進(jìn)行融合。在平底微孔滴定板上以大約2x IO5接種細(xì)胞，接下來在含有20%胎兒克隆血清、18% “653”條件培養(yǎng)基、5% origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0. 055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和IX HAT (Sigma; HAT在融合之后24小時(shí)添加)的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。在大約兩周之后，可以在HAT被替換為HT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后，可以通過ELISA對各細(xì)胞進(jìn)行人單克隆IgM和IgG抗體篩選。一旦大規(guī)模的雜交瘤生長發(fā)生，則通常可以在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。分泌抗體的雜交瘤可以被重新接種，再次篩選，并且如果仍然是人IgG陽性的，則單克隆抗體可以通過有限稀釋進(jìn)行至少兩次分種。然后，體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的用于鑒定的抗體。為純化人單克隆抗體，可以將選擇的雜交瘤在兩升旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)以用于單克隆抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia,Piscataway,N. J.)進(jìn)行親和層析之前,可以過濾并濃縮上清液。洗脫的IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜進(jìn)行檢驗(yàn)以確保純度。緩沖溶液可以被替換成PBS，并且可以使用1.43的消光系數(shù)通過OD■確定濃度。單克隆抗體可以被等分并且儲存在_80°C。制備本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的產(chǎn)生也可以使用例如本領(lǐng)域所熟知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤(雜交瘤的一種類型)中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
例如，為表達(dá)所述抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR擴(kuò)增或使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行cDNA克隆)獲得并且所述DNA可以被插入表達(dá)載體中以使得基因被可操作地連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。在本文中，術(shù)語“可操作地連接”意圖指抗體基因被接合入載體以使得在所述載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)所述抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列以與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入獨(dú)立的載體中，或者更通常地，兩種基因被插入同一表達(dá)載體中。所述抗體基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如在抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)的接合，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的話通過平端連接)被插入所述表達(dá)載體中。所描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可用于通過將它們插入已經(jīng)編碼需要的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中以使得Vh片段被可操作地連接于所述載體內(nèi)的Ch片段，而Vk片段被可操作地連接于所述載體內(nèi)的Q片段而產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因。另外地或替代地，重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號肽?？贵w鏈基因可以被克隆入所述載體以使得信號肽在框架內(nèi)(in-frame)被連接到抗體鏈基因的氨基端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異 源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的信號肽)。除了所述抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶調(diào)控序列，其調(diào)控所述抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)控序列”意圖包括啟動子、增強(qiáng)子及其他控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達(dá)調(diào)控元件(例如多腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)控序列被描述在例如 Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA (1990))中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解,表達(dá)載體的設(shè)計(jì),包括調(diào)控序列的選擇，可取決于如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)控序列包括指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子。可選地，可以使用非病毒調(diào)控序列，如遍在啟動子或￠-球蛋白啟動子。更進(jìn)一步，由來自不同來源的序列組成的調(diào)控元件，如SRa啟動子系統(tǒng)，其包含來自SV40早期啟動子和人T細(xì)胞白血病毒I型的長末端重復(fù)序列的序列(Takebe, Y.等(1988)Mol. Cell. Biol. 8 :466-472) 除了抗體鏈基因和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜帶另外的序列，諸如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因幫助選擇所述載體已經(jīng)被引入的宿主細(xì)胞(參見例如Axel等的美國專利4，399，216、4，634，665和5，179，017)。例如，通常，選擇性標(biāo)記基因賦予所述載體已經(jīng)被引入的宿主細(xì)胞對藥物諸如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于以氨甲喋呤進(jìn)行選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意圖包括常用來將外源性DNA引入真核或原核宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。盡管理論上在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體是可能的，但是在真核細(xì)胞中表達(dá)抗體是最優(yōu)選的，并且最優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞，因?yàn)檫@類真核細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌適當(dāng)折疊的免疫活性抗體。已經(jīng)報(bào)告，抗體基因的原核生物表達(dá)對于以高產(chǎn)量產(chǎn)生活性抗體是無效的。(Boss,M.A.和 Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6 12-13) 表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)(包括 dhfr-CHO 細(xì)胞，其描述于 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77 =4216-4220中，與DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，如描述于R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 :601-621)中)、NS0 骨髓瘤細(xì)胞、COS 細(xì)胞和 SP2 細(xì)胞。特別地，對于采用NSO骨髓瘤細(xì)胞，另一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是GS基因表達(dá)系統(tǒng)，其公開于WO87/04462、W0 89/01036和EP 338，841中。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被引入哺乳動物宿主細(xì)胞時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段足以允許所述抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或更優(yōu)選所述抗體分泌入宿主細(xì)胞在其中生長的培養(yǎng)基中的一段時(shí)間產(chǎn)生所述抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。結(jié)合RTK的Igr樣結(jié)構(gòu)域的抗體的表征通過例如標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以檢測本發(fā)明的抗體與胞外域例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域 (或任何選擇的區(qū)域，如在本文論述的共有序列)的結(jié)合。簡言之，用在PBS中的0. 25 ii g/ml純化的Ig樣結(jié)構(gòu)域(或優(yōu)選的受體結(jié)構(gòu)域)包被微孔滴定板，然后用在PBS中的5%牛血清白蛋白封閉?？贵w的稀釋物(例如，來自免疫小鼠——例如用人Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域免疫的小鼠——的血漿的稀釋物)被添加至每一孔并在37°C溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌所述板，然后與偶聯(lián)于堿性磷酸酶的第二試劑(例如對于人抗體，為山羊抗人IgG Fe特異性多克隆試劑)在37°C溫育I小時(shí)。在洗滌之后，用pNPP底物(lmg/ml)對所述板進(jìn)行顯色，并在405-650的OD下分析。優(yōu)選地，顯示出最高滴度的小鼠將用于融合。如上所述的ELISA測定還可以用來篩選顯示出與免疫原的陽性反應(yīng)性的雜交瘤。以高親合力結(jié)合例如RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域的雜交瘤被分種并進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。來自各雜交瘤的一個(gè)克隆(其保持親本細(xì)胞的反應(yīng)性(通過ELISA))可以被選擇來用于制備儲存于_140°C的5-10小瓶細(xì)胞庫和用于抗體純化。為純化抗RTK抗體，可以使選擇的雜交瘤在兩升旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)用于單克隆抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)進(jìn)行親和層析之前,可以過濾并濃縮上清液。洗脫的IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜進(jìn)行檢驗(yàn)以確保純度。緩沖溶液可以被替換成PBS，并且可以使用I. 43消光系數(shù)通過OD■測定濃度。單克隆抗體可以被等分并且儲存在_80°C。為確定所選擇的單克隆抗體是否結(jié)合獨(dú)特表位，可以使用市售試劑(Pierce，Rockford, IL)生物素化各抗體?？梢允褂萌缟纤鲆訰TK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如Kit_D4結(jié)構(gòu)域、Kit-D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域)包被的RTK包被ELISA板進(jìn)行使用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體的競爭研究。生物素化mAb結(jié)合可以采用鏈霉-抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針進(jìn)行檢測。為確定純化抗體的同種型，可以使用對于具有特定同種型的抗體具有特異性的試劑進(jìn)行同種型ELISA。例如，為確定人單克隆抗體的同種型，可以用lug/ml的抗人免疫球蛋白在4°C包被微孔滴定板的孔過夜。在用1% BSA封閉之后，所述板與liig/ml或更低的測試單克隆抗體或純化的同種型對照在環(huán)境溫度反應(yīng)一至兩個(gè)小時(shí)。然后，所述孔與人IgGl或人IgM-特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述對板進(jìn)行顯色和分析。
可以通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步測試抗RTK人IgG與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或在本文給出的共有序列的反應(yīng)性。簡言之，RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，如Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或者VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域，可以被制備并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳之后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、用10%胎牛血清封閉、并用待測試的單克隆抗體探測。可以使用抗人IgG堿性磷酸酶檢測人IgG結(jié)合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co. , St. Louis, Mo.)進(jìn)行顯色。表位作圖可用來確定本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合位點(diǎn)?？色@得進(jìn)一步允許構(gòu)象表位作圖的幾種方法。例如，可以使用公開于Timmerman等(MolDivers. 2004 ；8 (2) :61-77)的方法。Timmerman 等能夠使用兩種新的技術(shù) Domain Scan和Matrix Scan成功地對非連續(xù)/構(gòu)象表位作圖。也可以使用公開于Ansong等(JThromb Haemost. 2006. 4(4) :842-7) 中的技術(shù)。Ansong 等使用親合性定向質(zhì)譜(affinitydirected mass spectrometry)來對抗體R8B12識別的非連續(xù)表位進(jìn)行作圖。此外,成像技術(shù)如Protein Tomography可用于使革E RTK的抗體或肽結(jié)合成像。Protein Tomography先前已經(jīng)用于觀察分子相互作用，并用來顯示抑制性抗體通過結(jié)合EGFR的結(jié)構(gòu)域III起作用，從而將EGFR鎖定為非柔性和非活性的構(gòu)象(Lammerts等Proc Natl Acad Sci U SA. 2008. 105(16) :6109-14)。更多的傳統(tǒng)方法諸如定點(diǎn)誘變也可被用于對非連續(xù)表位作圖。據(jù)認(rèn)為參與非連續(xù)表位的氨基酸區(qū)可以被選擇性突變并分析其與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合。當(dāng)任一個(gè)區(qū)被突變時(shí)，所述抗體喪失結(jié)合能力可表明所述結(jié)合取決于兩個(gè)氨基酸片段。如上所述，一些線性表位的特征在于為了結(jié)合本發(fā)明的成分必須存在的特定三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)RTK處于其天然或折疊狀態(tài)時(shí)以及再次當(dāng)RTK變性時(shí)，這樣的表位可以通過分析所述抗體(或另一成分)的結(jié)合發(fā)現(xiàn)。結(jié)合僅僅在折疊狀態(tài)發(fā)生這一觀察結(jié)果表明所述表位或者是特征在于特定折疊結(jié)構(gòu)的線性表位或者是僅僅存在于折疊蛋白質(zhì)中的非連續(xù)表位。除了在本文描述的活性分析之外,Protein Tomography還可用來確定本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段是否能結(jié)合和滅活受體酪氨酸激酶。結(jié)合相互作用的可視化可表明，所述抗體的結(jié)合可影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面的定位或者改變或阻止在所述受體酪氨酸激酶中的構(gòu)象變化。II.結(jié)合人受體酪氨酸激酶的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的小分子在本發(fā)明的另一個(gè)方面，結(jié)合人受體酪氨酸激酶的胞外域例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的成分是小分子。本發(fā)明的小分子的特征在于特定功能特征或性質(zhì)。例如，所述小分子結(jié)合RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域，例如Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域或者VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域，或者RTK的鉸鏈區(qū)，例如Kit RTK的D3-D4或D4-D5鉸鏈區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式，小分子抑制劑與D3-D4或D4-D5鉸鏈區(qū)的結(jié)合將阻止使得近膜D4和D5結(jié)構(gòu)域能夠處于允許酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的反式自磷酸化和活化，隨后是下游信號傳導(dǎo)通路的募集和活化的距離和取向(位置)的運(yùn)動。在一些實(shí)施方式中，小分子結(jié)合可允許受體酪氨酸激酶的胞外域二聚化，但影響在兩個(gè)單體的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如，III型受體酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5結(jié)構(gòu)域或者V型受體酪氨酸激酶的D7-D7結(jié)構(gòu)域)之間的定位、取向和/或距離，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性。換句話說，所述成分或小分子可允許配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶胞外域的二聚化，但影響兩個(gè)胞外域在細(xì)胞表面界面的定位，從而抑制受體酪氨酸激酶的活性(例如，抑制受體內(nèi)化作用和/或抑制所述受體的酪氨酸自磷酸化和/或抑制所述受體激活下游信號傳導(dǎo)通路的能力)。術(shù)語“小分子化合物”、“小分子藥物”、“小分子”或“小分子抑制劑”在本文可互換使用以用來指對其對RTK的影響和它們抑制RTK (例如Kit RTK或VEGF受體)的二聚化或活性的能力進(jìn)行篩選的本發(fā)明的化合物。這些化合物可包含在PubChem數(shù)據(jù)庫(pubchem.ncbi. nlm. nih. gov/) > Molecular Libraries Screening Center Network(MLSCN)數(shù)據(jù)庫中的化合物、相關(guān)數(shù)據(jù)庫中的化合物、或者它們的衍生物和/或功能類似物。如本文所使用，“類似物”或“功能類似物”是指化合物或小分子抑制劑，其在結(jié)構(gòu)上類似于母體化合物，但在組成上稍微不同(例如，一個(gè)或多個(gè)原子或功能團(tuán)被添加、除去或改變)。相比于初始化合物，類似物可具有或不具有不同的化學(xué)或物理特性，并可具有或不具有改善的生物學(xué)和/或化學(xué)活性。例如，與母體化合物相比，類似物可以是更疏水性的或者它可具有改變的活性(增加、降低或與母體化合物相同)。所述類似物可以是初始化合物的天然或非天然發(fā)生(例如重組)的變體。其它類型的類似物包括化合物的異構(gòu)體(對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體等等)和其它類型的化合物手性變體，以及結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。所述類似·物可以是線性化合物的分支或環(huán)狀變體。例如，線性化合物可具有支化的或另外取代以賦予某些期望的性質(zhì)(例如改善的親水性或生物利用度)的類似物。如本文所使用，“衍生物”是指化合物或小分子抑制劑的化學(xué)上或生物學(xué)上的改良形式，其結(jié)構(gòu)上類似于母體化合物并且(實(shí)際上或理論上)可衍生于該母體化合物?！把苌铩迸c“類似物”或“功能類似物”的區(qū)別在于母體化合物可以是產(chǎn)生“衍生物”的起始物質(zhì)，而母體化合物不是必須被用作產(chǎn)生“類似物”或“功能類似物”的起始物質(zhì)。衍生物可以具有或不具有與所述母體化合物不同的化學(xué)或物理特性。例如，與母體化合物相比，衍生物可以是更親水性的或者它可具有改變的反應(yīng)性。衍生化(即，通過化學(xué)或其它手段修飾)可包括在分子內(nèi)一個(gè)或多個(gè)部分的取代(例如，官能團(tuán)的改變)。例如，氫可以用鹵素如氟或氯取代，或者羥基(一0H)可以用羧酸部分(一C00H)取代。術(shù)語“衍生物”也包括偶聯(lián)物和母體化合物的前藥(即化學(xué)修飾衍生物，其在生理?xiàng)l件下可轉(zhuǎn)化為原始化合物)。例如，前藥可以是活性劑的無活性形式。在生理?xiàng)l件下，前藥可以轉(zhuǎn)化為所述化合物的活性形式。例如，可以通過用?；鶊F(tuán)(酰基前藥)或氨基甲酸酯基團(tuán)(氨基甲酸酯前藥)置換氮原子上的一個(gè)或兩個(gè)氫原子形成前藥。關(guān)于前藥的更多詳細(xì)信息可例如發(fā)現(xiàn)于Fleisher等，Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115 ；Design of Prodrugs, H. Bundgaard (編輯)，Elsevier, 1985 ;和 H. Bundgaard, Drugs of the Future 16(1991)443。術(shù)語“衍生物”也用于描述全部溶劑合物，例如水合物或加合物(例如與醇的加合物)、活性代謝物和母體化合物的鹽?？梢灾苽涞柠}的類型取決于在化合物內(nèi)的部分的性質(zhì)。例如，酸性基團(tuán)如羧酸基團(tuán)可以形成堿金屬鹽或堿土金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽)和與生理上可容許的季銨離子的鹽以及與氨水和生理上可容許的有機(jī)胺如三乙胺、乙醇胺或三(2-羥乙基)胺)的酸加成鹽。堿性基團(tuán)可以例如與無機(jī)酸如鹽酸(“HC1”)、硫酸或磷酸形成酸加成鹽，或者與有機(jī)羧酸和磺酸如乙酸、檸檬酸、苯甲酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、甲磺酸或?qū)妆交撬嵝纬伤峒映甥}。除了堿性氮原子之外同時(shí)包含堿性基團(tuán)和酸性基團(tuán)(如羧基)的化合物可以作為兩性離子存在?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的慣用方法獲得鹽，例如通過在溶劑或稀釋劑中結(jié)合化合物和無機(jī)或有機(jī)酸或堿，或者通過陽離子交換或陰離子交換從其它鹽獲得所述鹽。小分子已知具有1200或以下、1000或以下、900或以下、800或以下、700或以下、600或以下、500或以下、400或以下、300或以下、200或以下、100或以下、50或以下、25或
以下或者10或以下的分子量。本發(fā)明的小分子抑制劑被選擇或設(shè)計(jì)來結(jié)合RTK的胞外域，例如Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)。在一些實(shí)施方式中，小分子抑制劑被選擇或設(shè)計(jì)來結(jié)合人KU、人VEGF受體或TOGFR的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)，例如人Kit受體的D4或D5結(jié)構(gòu)域、或D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)，從而拮抗受體二聚化和轉(zhuǎn)變成活性形式的能力，例如自磷酸化和活化細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。在其它實(shí)施方式中，小分子抑制劑被選擇來結(jié)合與Kit受體或VEGF受體的結(jié)構(gòu)域具有同源性的結(jié)構(gòu)域。例如，本發(fā)明的小分子可以針對與RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域(例如Kit的D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)、RTK的鉸鏈區(qū)(例如Kit或TOGFR受體的D3-D4或D4-D5鉸鏈區(qū))具有至少50%同一性、至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、或至少95%或99%同一性的結(jié)構(gòu)域。這樣的小分子將能夠結(jié)合在功能上類似于例如Kit或TOGF受體的D4、D5或D7結(jié)構(gòu)域或D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)的蛋白結(jié)構(gòu)域——可能在KU、VEGF受體和其它RTK中本發(fā)明的小分子抑制劑也可結(jié)合來源于RTK(例如人VEGF受體或人III型RTK)的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)的特定基序或共有序列，這允許所述小分子抑制劑特異性結(jié)合RTK家族的成員(例如人RTK的III型家族的成員)中共有的結(jié)構(gòu)域。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的小分子結(jié)合D4相互作用位點(diǎn)的以下共有序列LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸，和X”\、X3> X4, X5, X6和X7是任何氨基酸。在一種具體實(shí)施方式
中，X1選自蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺或賴氨酸；X2選自亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3選自賴氨酸、組氨酸、天門冬酰胺和精氨酸；X4選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5選自蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6選自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合VEGF受體家族成員的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G，其中I是異亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸；和X1、X2、X3和X4是任何氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，X1選自谷氨酸、精氨酸 和谷氨酰胺；X2選自精氨酸和蘇氨酸；X3選自谷氨酸和賴氨酸；以及X4選自谷氨酸和丙氨酸(SEQ ID NO :1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的成分(例如，小分子)結(jié)合VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列L/I X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO : 158)，其中L是亮氨酸，I是異亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；以及Xp&、\、乂4和X5是任何氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，O是纈氨酸A1選自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2選自于精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸；X3選自于賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸；X4選自于谷氨酸和纈氨酸；以及X5選自于谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺。在其它實(shí)施方式中，小分子抑制劑結(jié)合代表蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基序或共有序列。這樣的基序或共有序列不表示氨基酸的連續(xù)鏈，而是產(chǎn)生于RTK的三維折疊的非線性的氨基酸排列(即“結(jié)構(gòu)基序”)。這樣的基序的實(shí)例是基于Kit受體的D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)設(shè)計(jì)的基序。這樣的基序和共有序列可以根據(jù)關(guān)于抗體的章節(jié)I中論述的方法設(shè)計(jì)。重要的是，本發(fā)明的小分子抑制劑不結(jié)合RTK的配體結(jié)合位點(diǎn)，例如Kit受體的SCF結(jié)合位點(diǎn)。換言之，小分子抑制劑不結(jié)合負(fù)責(zé)配體結(jié)合的RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子抑制劑結(jié)合VEGF受體的連續(xù)表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位由VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)表位是選自VEGFRl的672VAISSS6' VEGFRl的678TTLDCHA684、VEGFRl的685NGVPEPq691、VEGFRl 的 700KIQQEPG706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的714STLFI718, VEGFRl 的 719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694, VEGFR3 的 695LEMQCLV701、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7CI8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN7'VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745、VEGFR2 的 678TSIGES683, VEGFR2 的684IEVSCta690, VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。在另外的實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的小分子抑制劑來特異性結(jié)合RTK的突變胞外域，例如突變Ig樣結(jié)構(gòu)域或突變鉸鏈區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，突變體RTK是致瘤的或致癌的突變體。在一種具體實(shí)施方式
中，選擇或設(shè)計(jì)小分子抑制劑來結(jié)合致癌的Kit受體突變體?？梢员槐景l(fā)明的小分子靶向的Kit受體突變體具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸中的突變的 Kit 受體Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503 或 Ala502。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于Kit中的其它突變或其它RTK中的突變。靶向于突變體RTK的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是治療性小分子可以僅結(jié)合包含突變的細(xì)胞上的RTK，而使得健康細(xì)胞大部分或全部不受影響。因此，在突變是致瘤性突變的情況下，僅腫瘤細(xì)胞將被用作治療靶標(biāo)，潛在地減少副作用和劑量要求。在一些實(shí)施方式中，所述小分子結(jié)合人Kit受體的特定序列，例如人Kit受體的殘基309-413、殘基410-519、381Arg和386Glu或418Tyr和5°5Asn。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合人VEGF受體的特定序列，例如，VEGFRl的殘基718-727、VEGFRl的Arg720和 Asp725、VEGFR2 的殘基 724-733、VEGFR2 的 Arg726 和 Asp731、VEGFR3 的殘基 735-744 或VEGFR3 的殘基 Arg737 和 Asp742。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合Kit受體中構(gòu)成在表4(下文中)中所描述的小腔或口袋的一個(gè)或多個(gè)殘基。例如，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合Kit受體的D3-D4鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D3結(jié)構(gòu)域的K218、S220、Y221、L222和來自D4結(jié)構(gòu)域的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371、Y373。本發(fā)明的小分子也可以結(jié)合構(gòu)成Kit受體的D4結(jié)構(gòu)域中的凹面的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合形成Kit受體的D2-D3鉸鏈區(qū)中的口袋的一個(gè)或多個(gè)以下殘基來自D2結(jié)構(gòu)域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206 和 F208 以及來自 D3 結(jié)構(gòu)域的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘、基，并起到阻止RTK的近膜區(qū)以使酪氨酸激酶能夠活化的距離和定向來定位所需的運(yùn)動的分子楔的作用。本發(fā)明的小分子也可以起到阻止同型D4或D5受體相互作用或使配體-受體相互作用位點(diǎn)不穩(wěn)定的作用。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合Kit受體上的的一個(gè)或多個(gè)以下殘基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431 或 G432。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以容易地被靶向于其它III型RTK中的相應(yīng)殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結(jié)構(gòu)比對或序列比對處于相同的位置的那些殘基。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的小分子結(jié)合III型RTK或V型RTK上的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由來自III型RTK (例如人Kit受體或TOGF受體)的D3、D4或D5結(jié)構(gòu)域或者D4-D5或D3-D4鉸鏈區(qū)的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成，或者由來 自VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。例如，所述構(gòu)象表位或非連續(xù)表位可以由下表4中所列的兩個(gè)或更多個(gè)殘基組成。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的小分子結(jié)合由選自 Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位。在相似的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合由選自以下氨基酸組之一的2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的構(gòu)象表位P206、F208、V238 和 S239 ;K127、A207、F208 和 T295 ;L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371 和 Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371 ;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398 ;K218、A219、S220、N367、E368 和 S369 ;K218、A220、E368 和 S369 ;G384、T385、T411、K412、E414 和 K471 ;Y408、F433、G470、K471和 L472;F324、V325、N326 和 N410 ；D327、N410、T411、K412和 V497 ;G384、G387、V409 和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ;Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ;K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371 和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和 K471 ;D327、T411、K412、E414、A431、G432 和 K471;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390 ;Y350、R353和F355。如以上所指出的，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合形成在表4中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成口袋或空腔的殘基的一部分。應(yīng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)涉及結(jié)合表位(例如構(gòu)象表位)的本發(fā)明的小分子時(shí)，意圖是所述小分子僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表4中確定的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合構(gòu)象表位，其中所述構(gòu)象表位由選自表5中所列的肽的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基組成。在一種具體實(shí)施方式
中，構(gòu)象表位由選自第一肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和選自第二肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一和第二肽選自表5中所列的肽的組。因而，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合其中第一和第二肽組如下的構(gòu)象表位Ala219-Leu222 和 Thr304_Val308 ；Asp309-Gly311 和 Arg224_Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367_Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和Asn396-Val399 ；Ala339-Pro343 和 Glu368-Arg372 ；Lys358-Tyr362 和 Val374_His378 ；Asp357-Glu360 和 Leu377-Thr380 ;Met351_Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和Val323-Asp332 ；Val409-Ile415 和 Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和 Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325_Asn330 ；Val409-Ile415 和Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和 Gly384-Gly388 ；Val325-Glu329 和 Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497_Ala502 ;Ile415_Leu421 和 Ala502-Ala507 ；Ala502-Ala507 和Lys484-Thr488 ;及Ala502_Ala507和Gly445_Cys450。本發(fā)明的小分子可以結(jié)合形成上述第一和第二肽組的所有氨基酸殘基，或者它們可以結(jié)合形成第一和第二肽組的殘基的一部分。應(yīng)理解，在某些實(shí)施方式中，當(dāng)涉及結(jié)合表位(例如構(gòu)象表位)的本發(fā)明的小分子時(shí)，意圖是所述小分子僅結(jié)合那些構(gòu)成該表位(例如表5中確定的特定肽)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以結(jié)合由2個(gè)或多個(gè)選自E33、P34、D72、 E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370 和 G466 的氨基酸組成的構(gòu)象表位或非連續(xù)表位。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子結(jié)合人TOGFRP的氨基酸殘基385Arg和39°G1u或TOGFRa中的相應(yīng)殘基。人TOGFRP的殘基385Arg和390Glu類似于Kit受體殘基381Arg和386Glu并介導(dǎo)TOGFRP的同型D4-D4相互作用。本發(fā)明的小分子可以通過阻止III型RTK的近膜區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用(例如人TOGFRP的385Arg和39°Glu之間形成的鹽橋)發(fā)揮其對受體活化的抑制作用，所述近膜區(qū)之間的關(guān)鍵同型相互作用對于將胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域定位在對于酪氨酸激酶活化至關(guān)重要的距離和定向是是必要的。本文中論述的實(shí)驗(yàn)表明，同型D4-D4相互作用對于TOGFRP 二聚化不是必要的，而I3DGFRP 二聚化對于受體活化是必要的然而并非足夠的。因此，本發(fā)明的小分子可以允許TOGFRP的二聚化而同時(shí)阻止活化。基于結(jié)構(gòu)的序列比對已經(jīng)表明EF環(huán)的大小以及包含關(guān)鍵氨基酸的D4-D4界面在KitJDGFRa、PDGFR^和CSFlR中是保守的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子可以靶向于III型RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的小分子以高親和性結(jié)合Kit的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)(例如Kit受體的D3-D4和/或D4-D5鉸鏈區(qū)或D4-D4和/或D5-D5界面結(jié)合位點(diǎn))，例如Kd為Ix IO-7M或更低、Kd為5x10_8M或更低、Kd為Ix KT8M更低、Kd為5x 10_9M更低、或者Kd為Ix 10_8M和Ix KTkiM之間或更低的親和性。本發(fā)明的小分子抑制劑可以通過本領(lǐng)域已知的幾種方法進(jìn)行制備或選擇。篩選方法可用于從文庫鑒定結(jié)合希望的RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)(例如人Kit RTK的D4或D5結(jié)構(gòu)域)的小分子。一種方法(Chemetics (Nuevolutions))利用文庫中各分子的DNA標(biāo)簽來輔助選擇。Chemetics 系統(tǒng)允許篩選用于靶向結(jié)合的數(shù)百萬化合物。涉及基于小分子文庫和標(biāo)簽的篩選的專利是美國專利申請20070026397 ；20060292603 ；20060269920 ；20060246450 ；20060234231 ；20060099592 ；20040049008 ;20030143561，將這些專利以其全文通過引用的方式并入本文。其它可以用于從文庫鑒定結(jié)合希望的RTK的Ig樣結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)(例如人KitRTK D4或D5結(jié)構(gòu)域或VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域)的小分子的公知方法包括利用其中文庫成員以鑒定標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記(即，文庫中存在的各個(gè)標(biāo)記與文庫中存在的不同化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)，從而鑒別標(biāo)記得知標(biāo)記分子的結(jié)構(gòu))的文庫的方法。標(biāo)記的文庫的一種方法利用寡核苷酸標(biāo)簽，如在例如以下文獻(xiàn)中描述PCT公開TO 2005/058479A2 (Direct Select 技術(shù))和美國專利 5，573，905 ;5，708，153 ;5，723，598，6，060，596 號；公開的 PCT 申請 WO 93/06121 ；WO 93/20242 ；W0 94/13623 ；W0 00/23458 ；W0 02/074929 和 WO 02/103008，以及 Brenner和 Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5381-5383 (1992) ；Nielsen 和 Janda(Methods A Companion to Methods in Enzymology 6,361-371 (1994);以及 Nielsen、Brenner 和Janda (J. Am. Chem. Soc. 115,9812-9813 (1993)),每一篇文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均通過引用的方式并入本文中。這樣的標(biāo)簽可以使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生很多標(biāo)簽拷貝并通過測序鑒定所述標(biāo)簽。然后標(biāo)簽的序列確認(rèn)結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)合分子可以純化形式進(jìn)行合成并測試活性。
組合化學(xué)文庫的預(yù)備和篩選是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可用于鑒定本發(fā)明的成分的這類組合化學(xué)文庫包括但不局限于肽文庫(參見，例如美國專利No. 5，010，175，F(xiàn)urka,Int. J. Pept. Prot. Res. 37 :487493 (1991)和 Houghton 等，Nature 354:8488(1991))。用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的其它化學(xué)物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的并且可以使用。這樣的化學(xué)物包括但不局限于類肽(例如PCT公開No. WO 91/19735)，編碼肽(例如PCT公開WO93/20242)，隨機(jī)生物寡聚物(例如PCT公開No. WO 92/00091)，苯并二氮草(例如美國專利 No. 5, 288, 514)，diversomer 如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮草和二肽(Hobbs 等，Proc. Nat.Acad. Sci. USA 90:6909 6913 (1993)),插烯多妝(vinylogous polypeptide) (Hagihara等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽類肽模擬物(Hirschmann等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :9217 9218 (1992))，小化合物文庫的類似有機(jī)合成(Chen等，J. Amer. Chem. Soc. 116 :2661 (1994))、寡氛酷(oligocarbamate) (Cho 等，Science 261 1303(1993))和 / 或肽基膦酸酯(Campbell 等，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))、核酸文庫(參見Ausubel, Berger和Russell & Sambrook,所有同上)、肽核酸文庫(參見例如美國專利 No. 5，539，083)、碳水化合物文庫(參見例如 Liang 等，Science, 274 :1520 1522(1996)和美國專利No. 5，593，853)、小有機(jī)分子文庫(參見例如苯并二氮草，Baum C&EN, Jan18，33頁(1993);類異戊二烯，美國專利5，569，588號；噻唑烷酮和間噻嗪酮，美國專利5，549,974號；吡咯烷，美國專利5，525，735和5，519，134號；嗎啉代化合物，美國專利5，506，337號；苯并二氮草，5，288，514等)。各前述出版物通過引用的方式并入本文。公眾數(shù)據(jù)庫也是可利用的，并常用于小分子篩選，例如PubChem(pubchem. ncbi. nlm. nih. gov)，Zinc (Irwin 和 Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1) :177-82)和 ChemBank (Seiler 等(2008) Nucleic Acids Res. 36 (數(shù)據(jù)庫發(fā)行號):D351_D359)。用于制備組合文庫的裝置是市場上可買到的(見，例如357 MPS, 390 MPS,Advanced Chem Tech， Louisville Ky. ， Symphony, Rainin， Woburn, Mass. ，433A AppliedBiosystems, Foster City, Calif. ,9050 Plus，Millipore, Bedford, Mass.)。此外，許多組合文庫本身是市場上可買到的(見例如，ComGenex, Princeton, N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis， Mo. ，3D Pharmaceuticals， Exton, Pa. ， Martek Biosciences, Columbia， Md.，等)。而且，因?yàn)楹Y選方法被非常好地限定，通常與專業(yè)公司簽訂合同以鑒定用于目標(biāo)靶的特定化合物(例如 BioFocus DPI (biofocus, com)和 Quantum Lead (q-lead. com))。本領(lǐng)域眾所周知的并且可應(yīng)用于本發(fā)明的方法的其它選擇小分子的方法是Huang和 Stuart L. Schreiber (1997)Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25) 13396-13401 ;Hung 等(2005) Science 310 :670-674 ;Zhang等(2007) Proc Natl Acad Sci 104 :4606-4611 ;或者在Gordon(2007)ACS Chem. Biol. 2 :9-16中綜述的任何一種方法，其全部都通過引用以其全部內(nèi)容并入本文。除了實(shí)驗(yàn)篩選法之外，本發(fā)明的小分子還可以使用虛擬篩選法加以選擇。虛擬篩選技術(shù)使用統(tǒng)計(jì)分析和蛋白質(zhì)對接(docking)模擬來預(yù)測來自文庫的哪些小分子將結(jié)合蛋白質(zhì)或其中的特定表位。最常見地，虛擬篩選方法比較蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和文庫中小分子的三維結(jié)構(gòu)。使用對蛋白質(zhì)-分子相互作用進(jìn)行建模的不同策略，盡管常用的是模 擬在原子之間的結(jié)合能——包括氫鍵、靜電力和范德瓦耳斯相互作用——的算法。通常，虛擬篩選方法可以掃描超過一百萬個(gè)化合物的文庫并返回可能是強(qiáng)結(jié)合物的小分子的短的名單。對虛擬篩選的若干綜述可以獲得，其詳述了可用來鑒定本發(fā)明的小分子的技術(shù)(Engel 等(2008) J. Am. Chem. Soc. ,130(15),5115-5123 ；McInnes. (2007). Curr Opin ChemBiol. Oct ；11(5) :494-502 ;Reddy 等(2007) Curr Protein Pept Sci. Aug ；8(4) :329-51;Muegge 和 Oloff. (2006)Drug Discovery Today. 3(4) :405-411 ;Kitchen 等(2004)NatureReviews Drug Discovery 3,935-949)。小分子篩選的進(jìn)一步的實(shí)例可以在美國專利申請2005/0124678中找到，其通過引用并入本文。本發(fā)明的小分子可以包含在下表中描繪的骨架結(jié)構(gòu)之一。在該表中引用的參考文獻(xiàn)均通過引用的方式以其全文并入本文中?；鶊F(tuán)&、1 2、1 3和R4的僅限制于它們不應(yīng)干擾或顯者抑制所指出的反應(yīng)，并且可以包括氫！、燒基、取代燒基、雜燒基、取代雜燒基、環(huán)燒基、雜環(huán)燒基、取代環(huán)燒基、取代雜環(huán)燒基、芳基、取代芳基、芳燒基、雜芳燒基、取代芳燒基、取代雜芳烷基、雜方基、取代雜芳基、鹵素、烷氧基、芳氧基、氨基、取代氨基和本領(lǐng)域已知的其它基團(tuán)。適宜的取代基包括但不局限于燒基、燒氧基、硫代燒氧基、硝基、輕基、疏基、芳氧基、芳基-S-、鹵素、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、氰基、氰酸酯、腈、異氰酸酯、硫氰酸酯、氨基甲?；腿〈被柞；?。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF受體)的胞外域的成分，其中所述成分拮抗VEGF受體的活性。
2.權(quán)利要求I的成分，其中所述的成分結(jié)合人VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的成分，其中所述Ig-樣結(jié)構(gòu)域不負(fù)責(zé)配體與所述VEGF受體的結(jié)合。
4.權(quán)利要求2的成分，其中所述Ig-樣結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)配體與所述VEGF受體的結(jié)合。
5.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分不阻斷所述VEGF受體和VEGF受體配體之間的相互作用。
6.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分阻斷所述VEGF受體和VEGF受體配體之間的相互作用。
7.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分不阻止所述VEGF受體的二聚化。
8.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分阻止所述VEGF受體的二聚化。
9.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分阻止所述胞外域的近膜區(qū)與所述VEGF受體的各原體之間的相互作用。
10.權(quán)利要求9的成分，其中所述相互作用是同型的。
11.權(quán)利要求9的成分，其中所述相互作用是異型的。
12.權(quán)利要求9的成分，其中所述胞外域的近膜區(qū)是VEGF受體的第七Ig-樣結(jié)構(gòu)域(D7)。
13.權(quán)利要求12的成分，其中所述成分結(jié)合VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域的以下共有序列 L/1 X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO :158)，其中 L 是亮氨酸，I 是異亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；和Xp X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。
14.權(quán)利要求13的成分，其中O是纈氨酸A1選自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2選自于精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸；X3選自于賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸；X4選自于谷氨酸和纈氨酸；和X5選自于谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺(SEQ ID NO :159)。
15.權(quán)利要求9的成分，其中所述成分使得所述胞外域的近膜區(qū)與VEGF受體的各原體分隔大于16人的距離。
16.權(quán)利要求I的成分，其中所述VEGF受體是VEGFRl。
17.權(quán)利要求I的成分，其中所述VEGF受體是VEGFR2。
18.權(quán)利要求I的成分，其中所述VEGF受體是VEGFR3。
19.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分將VEGF受體的胞外域鎖定在非活性狀態(tài)。
20.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726。
21.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Asp731。
22.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726和Asp731。
23.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合選自于VEGFR2的氨基酸殘基724、725、726、727、728、729、730、731、732和733的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
24.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Arg720。
25.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Asp725。
26.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Arg720和Asp725。
27.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合選自于VEGFRl的氨基酸殘基718、719、720、.721、722、723、724、725、726和727的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
28.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Arg737。
29.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Asp742。
30.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Arg737和Asp742。
31.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合選自于VEGFR3的氨基酸殘基735、736、737、.738、739、740、741、742、743和744的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
32.權(quán)利要求I的成分,其中所述成分結(jié)合VEGF受體上的構(gòu)象表位。
33.權(quán)利要求32的成分，其中所述構(gòu)象表位由VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基構(gòu)成。
34.權(quán)利要求32的成分，其中所述構(gòu)象表位包含氨基酸殘基Arg726和Asp731；Arg.720 和 Asp 725 ;或者 Arg737 和 Asp742。
35.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分阻斷配體誘導(dǎo)的VEGF受體酪氨酸自磷酸化。
36.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分阻礙配體誘導(dǎo)的VEGF受體內(nèi)化。
37.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分結(jié)合VEGF受體上的連續(xù)表位。
38.權(quán)利要求37的成分，其中所述連續(xù)表位由VEGF受體D7結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基構(gòu)成。
39.權(quán)利要求38的成分，其中所述連續(xù)表位是選自于VEGFRl的672VAISSS6'VEGFRl的.678TTLDCha684,VEGFRl 的 685NGVPEPQ691、VEGFRl 的 7ciciKIQQEPG7'VEGFR I 的 7ci7IILG7'VEGFRl的 711pgs713,vegfri 的 714Stlfi718,vegfri 的 719ervteedegv728、vegfr3 的 689vnvsds69\vegfr3的 695LEMQCLV7ci1、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7。8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA727、VEGFR3的 728DSN730,VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745,VEGFR2 的 678TSIGES683,VEGFR2的 684IEVSCTA_、VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 713IVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。
40.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分是分離的抗體或其抗原結(jié)合成分。
41.權(quán)利要求40的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合成分選自于人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體。
42.權(quán)利要求41的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合成分包含選自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。
43.權(quán)利要求42的成分，其中所述抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。
44.權(quán)利要求40的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合成分選自于Fab片段、F(AB')2片段、單鏈Fv片段、SMIP、親和體、親和性多聚體、納米抗體以及單域抗體。
45.權(quán)利要求40的成分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合成分以選自于Ix10_7M或更低、更優(yōu)選地5x 10_8M或更低、更優(yōu)選地Ix 10_8M或更低、更優(yōu)選地5x 10_9M或更低的KD結(jié)合受體酪氨酸激酶的Ig-樣結(jié)構(gòu)域。
46.一種產(chǎn)生權(quán)利要求40至45中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合成分的雜交瘤。
47.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分是小分子。
48.權(quán)利要求47的成分，其中所述成分結(jié)合選自于氨基酸殘基VEGFR2的Arg726、VEGFR2 的 Asp731、VEGFRl 的 Arg720、VEGFRl 的 Asp725、VEGFR3 的 Arg737 和 VEGFR3 的Asp742中的至少一個(gè)氨基酸殘基。
49.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分是肽類分子。
50.權(quán)利要求49的成分，其中所述肽類分子是基于VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的。
51.權(quán)利要求50的成分，其中所述肽類分子是基于人VEGF受體的D7結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的。
52.權(quán)利要求51的成分，其中所述肽類分子包含結(jié)構(gòu)L/IX1 R O X2 X3 X4 D/E X5G (SEQ ID NO :158)，其中L是亮氨酸，I是異亮氨酸，R為精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；以及W X3> X4和X5是任何氨基酸。
53.權(quán)利要求52的成分，其中O是纈氨酸A1選自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2選自于精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸；x3選自于賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸；x4選自于谷氨酸和纈氨酸；X5選自于谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺(SEQ ID NO:159)。
54.權(quán)利要求50的成分，其中所述肽類分子包含與人VEGFR2的氨基酸殘基724-733至少80%相同的結(jié)構(gòu)。
55.權(quán)利要求50的成分，其中所述肽類分子包含與人VEGFRl的氨基酸殘基718-727至少80%相同的結(jié)構(gòu)。
56.權(quán)利要求50的成分，其中所述肽類分子包含與人VEGFR3的氨基酸殘基735-744至少80%相同的結(jié)構(gòu)。
57.權(quán)利要求50的成分，其中所述肽類分子包含至少一個(gè)D-氨基酸殘基。
58.權(quán)利要求I的成分，其中所述成分是adnectin。
59.一種結(jié)合人VEGF受體的第7Ig-樣結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象表位的成分，其拮抗人VEGF受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位包含VEGFR2的殘基Arg726和Asp731 ；VEGFRl的殘基Arg720 和 Asp725 ;或 VEGFR3 的殘基 Arg737 和 Asp742。
60.一種結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基Arg726和Asp731 ;VEGFR1的氨基酸殘基Arg720和Asp725 ;或VEGFR3的氨基酸殘基Arg737和Asp742，從而拮抗人VEGF受體的活性的成分。
61.—種包含權(quán)利要求I至權(quán)利要求60中任一項(xiàng)的成分和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
62.有效量的權(quán)利要求I至60中任一項(xiàng)的成分在制備用于治療或預(yù)防受試者中VEGF受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病的藥物中的用途。
63.權(quán)利要求62的用途，其中所述VEGF受體酪氨酸激酶相關(guān)疾病選自于癌癥、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、淋巴疾病和疼痛相關(guān)疾病。
64.權(quán)利要求63的用途，其中所述癌癥選自于GIST、AML、SCLC、腎癌、結(jié)腸癌、淋巴癌和乳腺癌。
65.一種用于鑒定結(jié)合VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域的成分的方法，該方法包括 將VEGF受體與候選成分接觸； 同時(shí)地或相繼地將所述VEGF受體與VEGF受體的配體接觸；和 測定所述成分是否影響配體誘導(dǎo)的二聚VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定結(jié)合VEGF受體的Ig-樣結(jié)構(gòu)域的成分。
66.權(quán)利要求65的方法,其中所述成分鎖定VEGF受體的胞外域于非活性狀態(tài)。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述成分結(jié)合VEGF受體的第七Ig-樣結(jié)構(gòu)域(D7)。
68.—種結(jié)合人VEGF受體的第7Ig-樣結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象表位的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分拮抗人VEGF受體的活性，并且其中所述構(gòu)象表位包含 VEGFR2 的殘基 Arg726 和 Asp731 殘基；VEGFRl 的殘基 Arg720 和 Asp725 ;或 VEGFR3 的殘基 Arg737 和 Asp742。
69.一種結(jié)合VEGFR2的氨基酸殘基724-733從而拮抗VEGFR2的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
70.一種結(jié)合VEGFRl的氨基酸殘基Arg720和Asp725從而拮抗VEGFRl的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
71.一種結(jié)合VEGFR3的氨基酸殘基Arg737和Asp742從而拮抗VEGFR3的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
72.—種結(jié)合選自于人VEGF受體的Arg726和Asp731的至少一個(gè)氨基酸殘基從而拮抗人VEGF受體的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
73.一種結(jié)合選自于人VEGF受體的Arg720和Asp725的至少一個(gè)氨基酸殘基從而拮抗人VEGF受體的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
74.一種結(jié)合選自于人VEGF受體的Arg737和Asp742的至少一個(gè)氨基酸殘基從而拮抗人VEGF受體的活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
全文摘要
本發(fā)明提供了與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體胞外域(D7)的最近膜Ig-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的成分，其中該成分拮抗該VEGF受體的活性。
文檔編號A61K39/395GK102724996SQ201080059967
公開日2012年10月10日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者J·施勒辛格, 楊艷 申請人:耶魯大學(xué)