專利名稱：用于篩選擴(kuò)增的干細(xì)胞群的方法
用于篩選擴(kuò)增的干細(xì)胞群的方法技術(shù)領(lǐng)域和
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種篩選用于移植到需要其的受試者的造血細(xì)胞群的方法。將造血細(xì)胞群離體擴(kuò)增，并且根據(jù)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)篩選，以生產(chǎn)具有高移入概率的擴(kuò)增的造血細(xì)胞群。該方法可以進(jìn)一步包括篩選用于離體擴(kuò)增的細(xì)胞群。本發(fā)明還涉及所篩選的用于移植的細(xì)胞群在臨床環(huán)境中用于治療血液疾病、創(chuàng)傷性損傷和癌癥中的治療用途。臍帶血、骨髓和其他富含造血細(xì)胞的組織是干細(xì)胞的重要來源，特別是在不能在合理的時間內(nèi)找到匹配的非親緣供體的情況下。使用臍帶血的優(yōu)勢包括以下事實其容易獲得，攜帶較少的血源性傳染病的傳播風(fēng)險以及可跨越HLA屏障移植，其中與來自親緣或非親緣供體的外周血或骨髓的相似的不匹配干細(xì)胞相比具有降低的移植物抗宿主病的風(fēng)險。臍帶血的另一重要優(yōu)勢為一旦鑒定之后利用其可獲得可接受的臍帶血單位的速度。然而，造血細(xì)胞移植的主要臨床局限性是較低數(shù)量的可獲自諸如動員的外周血、 骨髓移植物和臍帶血的來源的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞。盡管臍帶血比成人骨髓具有更高的祖細(xì)胞百分比，但是最終衍生自臍帶血的固定細(xì)胞內(nèi)含物代表主要的挑戰(zhàn)，因為臍帶血具有最低數(shù)量的所有來源的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞。移植的臍帶血細(xì)胞還已表明具有較慢的移入時間以及較高的移入失敗率，盡管在功能上，來自人臍帶血的細(xì)胞表現(xiàn)出比來自骨髓或外周血的細(xì)胞以更少的細(xì)胞數(shù)量更好地移入免疫缺陷小鼠。大于ι. 7X IO5個⑶34+細(xì)胞/kg 的CD34+細(xì)胞劑量成為一致被認(rèn)為與移入率、中性粒細(xì)胞移入時間和存活率顯著相關(guān)的一個因素。對于接受大于1. 7 X IO5個⑶34+細(xì)胞/kg的患者，移植相關(guān)死亡率為20 %，而對于接收低于該閾值的細(xì)胞劑量的患者為75%。因此，推測通過用目前建議的細(xì)胞劑量和HLA 差異(分別為多于2X IO7個有核細(xì)胞/kg受體體重和6個HLA錯配中的兩個或更少)進(jìn)行移植可以改善結(jié)果。確實，在已經(jīng)鑒定出合適的臍帶血單位并且或者需要緊急移植或者不能獲得合適的骨髓單位的情況下，目前開發(fā)的臨床方案指向臍帶血移植。臨床試驗的目的在于通過使用多種臍帶血移植物加快移入，臍帶血干細(xì)胞的離體擴(kuò)增以及來自單倍體相同供體的 CD34+細(xì)胞的共移植正處于不斷發(fā)展中。有理由預(yù)期，在即將到來的數(shù)年內(nèi)臍帶血移植在成人和兒童患者中的使用將持續(xù)增加。用于惡性血液病的同種異體造血干細(xì)胞移植由于對HLA屏障的更好的理解和對患者外圍-移植期輔助護(hù)理的改進(jìn)，非親緣供體造血干細(xì)胞移植的結(jié)果在過去二十年中已被大大改善。因此，用于非親緣供體造血干細(xì)胞移植的適應(yīng)癥范圍被擴(kuò)大。如今，同種異體造血干細(xì)胞移植在多種高危惡性血液疾病中是一種治療選項，或者甚至是治療選擇。急性骨髓白血病(AML)在過去二十年中同種異體造血干細(xì)胞移植在患有AML的患者中的最佳用途一直備受爭論。對于處于第一次好轉(zhuǎn)期的患者，一些研究表明同種異體移植與改善的生存率相關(guān)。與處于第一次好轉(zhuǎn)期的患者相比，超過第一次好轉(zhuǎn)期、處于復(fù)發(fā)期或具有原發(fā)性誘導(dǎo)失敗的患者的結(jié)果較差。然而，研究表明同種異體移植對于這些患者是有用的挽救療法。
急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)臨床試驗表明對于患有高危 ALL (0h，H.，et al. Bone Marrow Transplant, 1998 ； 22 :253-7)和費城染色體陽性 ALL(Dombret，H.，et al. Blood ；2002，100 :2357-66)的成人中同種異體造血細(xì)胞移植優(yōu)于自體移植或化療。利用常規(guī)療法不可能在患有經(jīng)歷第一次復(fù)發(fā)的ALL患者中實現(xiàn)治愈，并且已證明利用造血細(xì)胞移植可提高生存率。當(dāng)不能獲得HLA-匹配的同胞，可以使用非親緣供體，導(dǎo)致改善的無病生存率。慢性骨髓白血病(CML)已廣泛驗證了同種異體干細(xì)胞移植的效力；在許多中心甲磺酸伊馬替尼被認(rèn)為是用于缺乏HLA-相同同胞供體的患者的一線療法。來自非親緣供體的移植結(jié)果劣于HLA-相同同胞的患者。CML中的臍帶血移植已描述在許多臨床系列(叢集)中。淋巴瘤在過去二十年中已經(jīng)使用高劑量化療和自體移植管理(治療)患有高危淋巴瘤的患者，然而，移植物對淋巴瘤作用的可能性使得用于淋巴瘤的同種異體移植更具有吸引力。 存在一些利用該方法改善生存率的證據(jù)。研究已表明同種干細(xì)胞移植可使一些患者受益， 取決于供體可獲得性、疾病緩解和性能狀況。骨髓增生異常綜合癥(MDS)已針對MDS研究了許多治療策略。至今為止，干細(xì)胞移植是對這些患者具有治愈可能的唯一治療。但是，由于MDS經(jīng)常表現(xiàn)出拖延期并且許多患者已60歲或更老，所以成髓性干細(xì)胞移植僅適合其中一些患者。用于惡性血液病的臍帶血移植臍帶血已被越來越多地用作患有惡性血液病患者的可替換的造血干細(xì)胞來源。至今為止，全世界已在兒童和成人中進(jìn)行了超過6000例臍帶血移植術(shù)。臍帶血受體中的較高的初次移植失敗率和延遲的供體髓細(xì)胞恢復(fù)歸因于低的移植物造血干細(xì)胞劑量，與骨髓或外周血供體移植物相比，其包含少于10倍的有核細(xì)胞和 CD34+細(xì)胞。對于供體髓細(xì)胞移入時間具有預(yù)測價值的臍帶血移植物變量包括冷藏和再輸注的總有核移植物細(xì)胞含量、CD34含量和輸注的克隆形成單位(CFU)。與常規(guī)同種移植物相比，供體髓細(xì)胞移入是延遲的，并且在22-30天的范圍內(nèi)。移入的幾率為65% -88%。盡管大多數(shù)采用在兩個或更多個HLA位點處完全不同的移植物， 但是急性II-IV級GvHD為35%至40%。無事件生存率落在較寬的范圍(22%-62% )內(nèi)。 高外圍移植死亡率部分歸因于延遲的供體髓細(xì)胞恢復(fù)。同種移植親緣臍帶血的患者的移植結(jié)果與非親緣臍帶血移植物的結(jié)果相似或略微更好。關(guān)于成人中的臍帶血移植的數(shù)據(jù)是更有限的，并且盡管大多數(shù)研究的高危分布， 兩項最近的研究推斷對于患有缺乏HLA-匹配的骨髓供體的急性白血病的成人而言，非親緣臍帶血是可接收的備選造血干細(xì)胞來源。白血病的復(fù)發(fā)率不存在差異。在臍帶血受體中， 結(jié)果在具有1個或2個HLA錯配的移植物之間是相似的。為了克服低數(shù)量干細(xì)胞和祖細(xì)胞的局限性，預(yù)期用生長因子的混合劑(雞尾酒， cocktail)離體擴(kuò)增臍帶血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。在早期和晚期作用細(xì)胞因子的組合的存在的情況下，用離體擴(kuò)增的細(xì)胞進(jìn)行的臨床實驗未被證明是有效的，因為由這些細(xì)胞因子的組合支持的擴(kuò)增細(xì)胞主要包含晚期祖細(xì)胞和分化細(xì)胞。已證明包括SCF、血小板生成素(TPO)、G-CSF和IL-3的早期和晚期作用細(xì)胞因子的組合僅導(dǎo)致晚期(CD34)和早期 (CD34CD38)祖細(xì)胞的微小的倍數(shù)擴(kuò)增，這可能是由于晚期作用細(xì)胞因子主要將培養(yǎng)物驅(qū)向加速分化的事實。然而，僅用早期作用細(xì)胞因子(SCF、TP0、IL-6和FLT-3配體)培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞導(dǎo)致晚期和早期祖細(xì)胞二者更好和更長時間的擴(kuò)增，這對于短期的早期三系 (trilineage)移入是重要的。本發(fā)明的發(fā)明人先前已證明了含有多胺銅螯合劑的離體培養(yǎng)物可增加來自臍帶血的祖細(xì)胞的長期擴(kuò)增和移入潛能(參見，例如美國專利第6，962，698,6, 887，704、 7，169，605和7，312，078號)。在培養(yǎng)過程中，銅螯合劑抑制細(xì)胞因子驅(qū)動的早期祖細(xì)胞分化的開始，導(dǎo)致CD34+CD38-和CD34+Lin_細(xì)胞的大量積累，其中對于更成熟的定型細(xì)胞 [CD34+Lin-和CFU培養(yǎng)物(CFUc)]的增殖和分化沒有作用。用多胺螯合劑TEPA對補(bǔ)充有早期作用細(xì)胞因子的臍帶血培養(yǎng)物的三周處理導(dǎo)致延長的且廣泛的CD34+細(xì)胞的離體擴(kuò)增以及更高百分比的早期祖細(xì)胞(⑶34+⑶38-、⑶34+⑶38-Lin-)。在長期培養(yǎng)物中TNC、 CFU-C和⑶34+細(xì)胞擴(kuò)增持續(xù)。與未處理的培養(yǎng)物相比，TEPA處理的培養(yǎng)物在N0D/SCID小鼠中的移入潛能增加。此外，與移植了未擴(kuò)增細(xì)胞的小鼠相比，在移植了 TEPA擴(kuò)增細(xì)胞的小鼠中，移入的人祖細(xì)胞以及髓樣和淋巴樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著更高。這些結(jié)果充分表明銅螯合劑支持自我更新分裂周期而不損害造血干細(xì)胞的分化能力。Peled等人(Cytotherapy，2004，6 =344-55)已調(diào)整了用多胺銅螯合劑來離體培養(yǎng)擴(kuò)增來自臍帶血的造血祖細(xì)胞的方法以符合臨床實踐的標(biāo)準(zhǔn)，并且已證明了根據(jù)該修改的方法臨床規(guī)模離體擴(kuò)增造血祖細(xì)胞，并且將所述離體擴(kuò)增的細(xì)胞移植到小鼠導(dǎo)致有效的長期移入。使用與未處理的臍帶血組合的在輸注前用銅螯合劑離體擴(kuò)增的臍帶血干細(xì)胞，本發(fā)明人已完成了接受高劑量化療的10名急性白血病和淋巴瘤受試者的I/II期試驗。然而，Peled等人未提供用于在離體擴(kuò)增之后篩選和排除造血祖細(xì)胞群以用于有效移入受體的臨床可驗證的方案。因此，需要使能夠在臨床環(huán)境中鑒定適合用于移植入需要其的受體的離體擴(kuò)增的造血細(xì)胞群的臨床驗證的方案。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供了一種篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群的方法，該方法包括(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個(i)該群中CD34+細(xì)胞的比例；(ii)該群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii) 該群中細(xì)胞的活力；以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值篩選或排除候選群，由此篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。還提供了一種根據(jù)所要求的方法篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供了一種在需要其的受試者中治療血液疾病或病癥的方法，該方法包括給予需要其的受試者通過以下方式篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個(i)該群中CD34+細(xì)胞的比例；(ii)該群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)該群中細(xì)胞的活力，以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值篩選或排除候選群，由此在受試者中治療和/或預(yù)防血液疾病。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，⑶34+細(xì)胞的比例為總細(xì)胞的約3%至約10%并且可選地為總細(xì)胞的約3%至約5%。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，⑶34+細(xì)胞的比例為總細(xì)胞的約4%。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述群的總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增為約10至約70倍并且可選地約25至約60倍。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，所述群的總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增為約50倍。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的活力為約65% 至約95%，可選地在第21天培養(yǎng)時為約75%至約90%。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的活力為約 85%。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述擴(kuò)增群的活細(xì)胞總數(shù)為約15 X IO6至約60 X IO6 個活細(xì)胞，可選地約20 X IO6至約30 X IO6個活細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，所述擴(kuò)增群的活細(xì)胞總數(shù)為約23X IO6個活細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，根據(jù)至少兩個所述參數(shù)并且可選至少三個所述參數(shù)的數(shù)值來確定篩選。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，根據(jù)所有四個所述參數(shù)的數(shù)值來確定篩選。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，根據(jù)以下參數(shù)的數(shù)值來確定篩選(i)CD34+細(xì)胞的比例為總細(xì)胞的約4%; (ii)該群的總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增為約50倍；(iii)在第21天培養(yǎng)時該群中總細(xì)胞的活力為約85% ；以及(iv)擴(kuò)增群的活細(xì)胞總數(shù)為約23X IO6個活細(xì)胞。 還提供了一種根據(jù)所要求的方法篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，通過在細(xì)胞因子和銅螯合劑存在的情況下培養(yǎng)造血細(xì)胞通過離體增殖來擴(kuò)增造血干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述細(xì)胞因子為早期作用細(xì)胞因子，其可以選自由以下構(gòu)成的組干細(xì)胞因子、FLT3配體、白介素-1、白介素_2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、腫瘤壞死因子-α和血小板生成素。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，所述細(xì)胞因子是干細(xì)胞因子、血小板生成素、白介素-6和FLT3配體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，以50ng/ml的濃度提供所述細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述銅螯合劑為四亞乙基五胺(TEPA)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，以5μ M的濃度提供四亞乙基五胺。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，將擴(kuò)增的造血干細(xì)胞培養(yǎng)21天。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群在擴(kuò)增前包括至少IX IO5個細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述造血細(xì)胞群選自由臍帶血、外周血和骨髓組成的來源。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，所述造血細(xì)胞群為臍帶血。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述臍帶血是解凍的冷凍臍帶血。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在擴(kuò)增前使造血細(xì)胞群富含造血干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，在擴(kuò)增前使造血細(xì)胞群富含⑶34+或⑶133+細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述血液疾病選自由急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、慢性髓細(xì)胞白血病(CLL)、何杰金氏淋巴瘤(HL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及骨髓增生異常綜合癥(MDS)組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，治療血液病的方法還包括在將細(xì)胞給予受試者之前將擴(kuò)增的造血細(xì)胞與未擴(kuò)增的造血細(xì)胞混合。所述擴(kuò)增的和未擴(kuò)增的造血細(xì)胞可獲自相同的一個或多個臍帶血單位。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群之前給予未擴(kuò)增的造血細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在給予造血細(xì)胞之前用免疫抑制療法治療受試者。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方式，在給予造血細(xì)胞之后用免疫抑制療法治療受試
者ο根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，將擴(kuò)增的造血細(xì)胞與用于血液病的另外治療一起聯(lián)合給予。所述另外的治療可以選自由免疫抑制治療、化療和放療組成的組。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供了一種包括包裝材料和所選的離體擴(kuò)增的造血細(xì)胞群的制品，通過以下方式篩選適合于移植的造血細(xì)胞群(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個(i)該群中CD34+細(xì)胞的比例；(ii) 該群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)該群中細(xì)胞的活力，以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值篩選或排除候選群；并且其中所述包裝材料包括表明所述造血細(xì)胞群用于在需要其的受試者中治療血液疾病或病癥的標(biāo)簽或包裝說明書。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，根據(jù)所述參數(shù)的以下數(shù)值進(jìn)行篩選(i)CD34+細(xì)胞的比例為總細(xì)胞的約4%; (ii)該群的總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增為約50倍；(iii)第21天培養(yǎng)時該群中總細(xì)胞的活力為約85% ；以及(iv)擴(kuò)增群的活細(xì)胞總數(shù)為約23X IO6個活細(xì)胞。除非另外限定，否則本文中使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實施方式的實踐或檢測中可以使用與本文描述的那些相似或等價的方法和材料，但是下面描述示例性的方法和 /或材料。在沖突的情況下，將以包括定義的專利說明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例僅為示例性的并且不是限制性的。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種篩選用于移植入需要其的受試者中的造血細(xì)胞群的方法。具體地，根據(jù)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)來篩選離體擴(kuò)增的造血細(xì)胞群，以生產(chǎn)具有高移入幾率的擴(kuò)增的造血細(xì)胞群，用于治療血液疾病、創(chuàng)傷性損傷和癌癥。在詳細(xì)地闡述本發(fā)明的至少一個實施方式之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的應(yīng)用不一定受限于在以下描述中所列出的或通過實施例中所例證的細(xì)節(jié)。本發(fā)明還具有其他實施方式或以各種方式實踐或?qū)嵤?。同種造血干細(xì)胞移植對于患有血液疾病的患者而言是挽救生命的程序(手術(shù))； 但是該程序的廣泛應(yīng)用受到適當(dāng)HLA-匹配的供體的可用性的限制。僅30%可能受益于該程序的患者具有HLA-匹配的同胞。通過全球登記處可為約75%的高加索患者鑒定出非親緣匹配供體，但是對于匹配供體的長期研究會顯著延遲移植。此外，更少的少數(shù)民族患者找到適合的HLA-匹配供體。臍帶血越來越多地被用作干細(xì)胞的備選來源；然而，由于令人滿意的造血重建所需的不足細(xì)胞劑量，其在成人和青少年患者中的應(yīng)用受到限制。因此，臍帶血移植物常規(guī)地并且更成功地用于兒童移植環(huán)境中(根據(jù)推薦的閾值細(xì)胞劑量，庫中僅20%的臍帶血單位可以滿足75kg的患者)。因此，接受臍帶血移植的成人具有高風(fēng)險的早期死亡率(高達(dá)40-60%的第100天死亡率)和由于延遲移入引起的感染以及更高的移入失敗率。具有更高數(shù)量的有核細(xì)胞和更高數(shù)量的CD34+細(xì)胞的移植物導(dǎo)致更高的存活幾率。改善結(jié)果的策略包括使用兩個單位用于移植并且共移植來自第三方供體的CD34或 ⑶133-篩選的外周血干細(xì)胞和一個非親緣供體臍帶血單位。為了解決低祖細(xì)胞劑量的問題，建議進(jìn)行來自臍帶血的細(xì)胞的離體擴(kuò)增。迄今仍不清楚擴(kuò)增技術(shù)是否能夠提供可獲自臍帶血單一單位的祖細(xì)胞數(shù)量的可靠的、可重現(xiàn)的增加，從而導(dǎo)致成人患者中更優(yōu)的移入率和整體存活率。對于目前可用的移植物制備方法的重要挑戰(zhàn)是生成擴(kuò)增的定型造血祖細(xì)胞群而不損害低分化祖細(xì)胞(CD34+CD38-或 CD34+Lin-細(xì)胞)的數(shù)量的能力。在多胺銅螯合劑存在的情況下用早期作用細(xì)胞因子培養(yǎng)來自臍帶血的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞導(dǎo)致對未分化的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞群的分化和擴(kuò)增的顯著抑制。近期的研究已表明在細(xì)胞因子和銅螯合劑存在的情況下離體擴(kuò)增所需的造血細(xì)胞可適于移入需要其的受體的臨床可接受的標(biāo)準(zhǔn)(Peled et al, Cytotherapy 2004 ；6 :344)，并且移植了擴(kuò)增的臍帶血細(xì)胞的患者表現(xiàn)出改善的100天存活率，沒有急性毒性，沒有移植失敗或早期死亡，并且沒有繼發(fā)性移植失敗(di Lima et al, Bone Marrow Transplant, 2008, January 21, Epub)。本發(fā)明提供了用于篩選具有高的有效移入幾率的擴(kuò)增的造血細(xì)胞群的標(biāo)準(zhǔn)，所述標(biāo)準(zhǔn)包括CD34+細(xì)胞的比例、CD34+細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增、所述群中細(xì)胞的活力以及活細(xì)胞的總數(shù)。所篩選的群可在臨床環(huán)境中用于移植，用于治療血液疾病、創(chuàng)傷性損傷和癌癥。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，提供了一種用于篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的方法，該方法包括在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定選自以下的至少一個參數(shù)所述群中CD34+細(xì)胞的比例；所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；所述群中總細(xì)胞的活力；以及所述擴(kuò)增細(xì)胞群中活細(xì)胞的總數(shù)；和根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值篩選或排除候選群；由此篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。如本文中所使用的，術(shù)語“離體”是指從活的有機(jī)體中除去細(xì)胞并且在有機(jī)體外 (例如在試管內(nèi)、在細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)等)增殖的過程。如本文中所使用的，術(shù)語“體外”是指在有機(jī)體外處理在實驗室中維持的源自一個或多個細(xì)胞系(例如胚細(xì)胞系等)的細(xì)胞的過程。這樣的細(xì)胞系通常為永生化細(xì)胞。如本文中所使用的，短語“細(xì)胞群”是指包括可能適合于移植的細(xì)胞群的同源或異源分離的細(xì)胞群。在本發(fā)明的一個實施方式中，至少一部分的本發(fā)明的該方面的細(xì)胞群在細(xì)胞表面上表達(dá)⑶；34和/或⑶133。如本文中所使用的，短語“干細(xì)胞”是指負(fù)責(zé)在組織或身體內(nèi)生成細(xì)胞團(tuán)的最早可更新的細(xì)胞群和極早期祖細(xì)胞二者，所述細(xì)胞稍微被更多分化但是還未定型并且可以容易地逆轉(zhuǎn)成最早可更新細(xì)胞群的一部分。造血干細(xì)胞是可重新生成血液的細(xì)胞組分例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等的干細(xì)胞。如本文中所使用的，短語“非干細(xì)胞”、“非祖細(xì)胞”和“定型細(xì)胞”是指處于各種分化階段的細(xì)胞，其通常不再保留逆轉(zhuǎn)成為可更新細(xì)胞群的一部分的能力。離體培養(yǎng)干細(xì)胞、 祖細(xì)胞和非干細(xì)胞、非祖細(xì)胞定型細(xì)胞的方法在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中是熟知的。就這一點而言， 可參見例如 Freshney，ffiley-Liss, N. Y.的教科書 “Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”(1994)，第三版，將其教導(dǎo)以引用方式并入本文。如本文中所使用的，術(shù)語“活力”是指活細(xì)胞和非活細(xì)胞之間的區(qū)別。細(xì)胞活力可通過形態(tài)學(xué)變化或通過膜滲透性和/或從排阻某些染料或攝入并保留其他染料推斷的生理狀態(tài)的變化來判斷。細(xì)胞活力測定在本領(lǐng)域中是熟知的，包括但不限于臺盼藍(lán)或碘化丙啶排阻和若丹明代謝染色(Coder，D. ,Current Protocols in Cytometry, 1997, John Wiley and Sons, Inc.，Unit 9. 2,9. 2. 1-9. 2. 14)。如本文中所使用的，術(shù)語“倍數(shù)增加”是指與擴(kuò)增特定時間后計數(shù)的該相同細(xì)胞相比，擴(kuò)增前存在于培養(yǎng)物中的所指細(xì)胞的比例。所指細(xì)胞的加倍例如為100%或1. 0倍倍數(shù)增加。倍數(shù)增加可以涉及群中的所有細(xì)胞(例如總有核細(xì)胞)或細(xì)胞群中的任何亞群(例如，CD34+細(xì)胞)。如本文中所使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”、“擴(kuò)增細(xì)胞”或“擴(kuò)增細(xì)胞群”是指與培養(yǎng)前或在另一之前的時間點的數(shù)量相比，在導(dǎo)致細(xì)胞或細(xì)胞群的數(shù)量增加的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞。擴(kuò)增可能涉及群中的所有細(xì)胞或涉及培養(yǎng)的細(xì)胞群內(nèi)的特定亞群。擴(kuò)增可表示為“倍數(shù)增加”、“百分?jǐn)?shù)增加”等。如本文中所使用的，術(shù)語“約”是指大于所指數(shù)值5%至小于所指數(shù)值5%范圍內(nèi)的數(shù)值。因此，例如“約50倍(50X)倍數(shù)增加”是指47. 5倍(47. 5X)至52. 5倍(52. 5X)范圍內(nèi)的倍數(shù)增加。根據(jù)如所要求的本發(fā)明的一個實施方式，在細(xì)胞因子和銅螯合劑存在的情況下， 通過以用于細(xì)胞增殖的條件培養(yǎng)造血細(xì)胞，通過離體增殖來擴(kuò)增造血干細(xì)胞。以用于細(xì)胞增殖的條件培養(yǎng)離體生長的細(xì)胞包括為細(xì)胞提供營養(yǎng)物。銅螯合劑的最終濃度可取決于具體應(yīng)用在微摩爾或毫摩爾范圍內(nèi)。例如，在約 0. 1 μ M至約IOOmM內(nèi)，優(yōu)選在約4 μ M至約50mM內(nèi)，更優(yōu)選在約5 μ M至約40mM內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述螯合劑為多胺螯合劑，例如但不限于乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、三乙烯二胺、四亞乙基五胺、氨乙基乙醇胺、氨乙基哌嗪、五乙烯六胺、三乙烯四胺-鹽酸鹽、四亞乙基五胺-鹽酸鹽、五乙烯六胺-鹽酸鹽、四乙基五胺、卡普多普瑞爾、青霉胺、N，N' -二(3-氨丙基)-1，3-丙二胺、N，N-二 O-氨乙基)-1，3_丙二胺、1，7- 二氧雜-4，10- 二氮雜環(huán)十二烷、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷_5，7- 二酮、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三鹽酸鹽、1-氧雜_4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷、1,4,8,12-四氮雜環(huán)十五烷或1， 4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷。在一個實施方式中，所述銅螯合劑為四亞乙基五胺。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，所述細(xì)胞因子為早期作用細(xì)胞因子，例如但不限于干細(xì)胞因子、FLT3配體、白介素-1、白介素_2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、腫瘤壞死因子-α和血小板生成素。在一個實施方式中，所述細(xì)胞因子為包括干細(xì)胞因子、FLT3配體、白介素-6和血小板生成素的細(xì)胞因子的組合。另外并且可選地，可以加入晚期作用細(xì)胞因子，例如但不限于粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子和促紅細(xì)胞生成素。細(xì)胞因子的最終濃度可根據(jù)具體應(yīng)用在毫克/毫升至約納克/毫升的范圍內(nèi)。例如，細(xì)胞因子的濃度可以在約0. lng/ml至約100μ g/ml內(nèi)，可選地在約Ing/ ml至20μβ/πι1內(nèi)，可選地在約5ng/ml至約1 μ g/ml內(nèi)。在一個實施方式中，細(xì)胞因子濃度為50ng/ml/細(xì)胞因子。應(yīng)當(dāng)理解，培養(yǎng)包括提供營養(yǎng)物、適合的生長培養(yǎng)基和適合于細(xì)胞生長的條件。能夠支持細(xì)胞的適合的培養(yǎng)基包括MEM-α、HEM、DMEM、RPMI、F-12等。如果需要，所述培養(yǎng)基可以包含細(xì)胞代謝所需的添加劑例如谷氨酰胺和其他氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和有用的蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清(胎牛、馬、牛)等。該培養(yǎng)基還可以包含用于防止酵母、細(xì)菌和真菌污染的抗生素，例如青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞時，條件應(yīng)接近生理條件 (優(yōu)選約6至約8的pH以及約30°C至約40°C的溫度)。在一個實施方式中，如所指出的，在包含最小必需培養(yǎng)基-α (ΜΕΜ-α)，10%胎牛血清(FCS辦0101^丄(^311，肌，舊4)，細(xì)胞因子干細(xì)胞因子41^3配體、白介素_6和血小板生成素以及四亞乙基五胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞?？墒乖煅?xì)胞在培養(yǎng)基中生長較短(數(shù)天或數(shù)周)或較長(數(shù)周至數(shù)月)的時間。為了維持用于移植的細(xì)胞足夠的活力，在為造血干細(xì)胞群提供顯著擴(kuò)增的機(jī)會的同時， 可將細(xì)胞培養(yǎng)2-5周。在一個實施方式中，通過培養(yǎng)21天(3周)來擴(kuò)增細(xì)胞。適合于培養(yǎng)用于擴(kuò)增的造血細(xì)胞群的許多容器在本領(lǐng)域中是熟知的，例如各種體積的細(xì)胞培養(yǎng)袋、燒瓶、生物反應(yīng)器等。在一個實施方式中，將細(xì)胞培養(yǎng)在72ml的VueLife Teflon PEP 細(xì)胞培養(yǎng)袋(American Fluoroseal Co.)中。當(dāng)臍帶血是用于擴(kuò)增的細(xì)胞的來源時，確保足量的用于擴(kuò)增的細(xì)胞是重要的，從而提供制備足夠大的用于成功移植的擴(kuò)增造血干細(xì)胞群的潛力。因此，根據(jù)一個實施方式， 在擴(kuò)增前篩選用于擴(kuò)增的臍帶血單位包含至少20X 105/kg體重細(xì)胞，可選地至少IOX IO5/ kg體重細(xì)胞并且可選地至少1 χ IO5Ag體重細(xì)胞。不考慮具有少于1X IO5Ag體重細(xì)胞的臍帶血單位。本發(fā)明的細(xì)胞群可以來自自體或非自體供體(同種或異種)。根據(jù)所要求發(fā)明的一個實施方式，根據(jù)群中CD34+細(xì)胞的比例來篩選或排除擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群，其中排除離體擴(kuò)增后具有少于至少10%⑶34+細(xì)胞的群的移植適合性。 在另一實施方式中，排除具有少于9%⑶34+細(xì)胞，可替換地具有少于8%⑶34+細(xì)胞，可替換地具有少于7%⑶34+細(xì)胞，可替換地具有少于6%⑶34+細(xì)胞，可替換地具有少于5% ⑶34+細(xì)胞，可替換地具有少于4%⑶34+細(xì)胞以及可替換地具有少于3%⑶34+細(xì)胞的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群的移植適合性。在另一實施方式中，篩選用于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群具有至少4%⑶34+細(xì)胞。根據(jù)所要求發(fā)明的一個實施方式，根據(jù)所述群中總有核細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增來篩選或排除擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群，其中排除離體擴(kuò)增后具有少于至少10倍(IOX)總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加的群的移植適合性。在另一實施方式中，排除具有少于20倍(20X)總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加，可替換地具有少于至少30倍(30X)總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加，可替換地具有少于至少40倍(40X)總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加，可替換地具有少于至少50倍(50X)總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加，可替換地具有少于至少60倍(60X)總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群的移植適合性。在另一實施方式中，篩選用于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群具有至少50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加。根據(jù)所要求發(fā)明的另外的實施方式，根據(jù)所述群中總細(xì)胞的活細(xì)胞比例來篩選或排除擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群，其中排除離體擴(kuò)增后具有少于至少90%活細(xì)胞的群的移植適合性。在另一實施方式中，排除具有少于85%活細(xì)胞，可替換地具有少于80%活細(xì)胞，可替換地具有少于75%活細(xì)胞，可替換地具有少于70%活細(xì)胞，可替換地具有少于65%活細(xì)胞， 可替換地具有少于60%活細(xì)胞的擴(kuò)增造血干細(xì)胞群的移植適合性。在另一實施方式中，篩選用于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群具有來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少70%或更多的活細(xì)胞。在另一實施方式中，根據(jù)可用于輸注的CD34+細(xì)胞的絕對數(shù)量來篩選或排除離體擴(kuò)增的細(xì)胞群，所述絕對數(shù)量根據(jù)所述群中CD34+細(xì)胞的比例和該群中的活細(xì)胞總數(shù)的參數(shù)的組合來確定。在另一實施方式中，根據(jù)可用于輸注的CD34+細(xì)胞的數(shù)量來篩選或排除離體擴(kuò)增的細(xì)胞群，所述數(shù)量根據(jù)接種到培養(yǎng)物中的CD133+細(xì)胞的數(shù)量和擴(kuò)增群中總有核細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增的參數(shù)的組合來確定。根據(jù)所要求發(fā)明的另一實施方式，根據(jù)所述群中活細(xì)胞的總數(shù)來篩選或排除擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群，其中排除離體擴(kuò)增后具有少于至少60X IO6個活細(xì)胞的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群的移植適合性。在另一實施方式中，排除具有少于50X IO6個活細(xì)胞，可替換地具有少于40 X IO6個活細(xì)胞，可替換地具有少于30 X IO6個活細(xì)胞，可替換地具有少于25 X IO6個活細(xì)胞，可替換地具有少于20 X IO6個活細(xì)胞，可替換地具有少于15 X IO6個活細(xì)胞的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群的移植適合性。在另一實施方式中，篩選用于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群具有來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少23X IO6個或更多的活細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，可根據(jù)選自所述群中CD34細(xì)胞的比例；所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；所述群中總細(xì)胞的活力；以及所述擴(kuò)增細(xì)胞群中活細(xì)胞總數(shù)中的每一個參數(shù)來篩選或排除擴(kuò)增的細(xì)胞群，或者可替換地根據(jù)參數(shù)的組合來篩選或排除擴(kuò)增的細(xì)胞群。因此，在本發(fā)明的另一實施方式中，可根據(jù)包括所述群中CD34+細(xì)胞的比例；所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；所述群中總細(xì)胞的活力；以及所述擴(kuò)增細(xì)胞中活細(xì)胞的總數(shù)的至少兩個、可選至少三個或可選根據(jù)所有四個參數(shù)以它們的任意組合來篩選或排除離體擴(kuò)增的細(xì)胞群。舉例而言，經(jīng)篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群可包含具有至少4%⑶34+細(xì)胞和至少 50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞倍數(shù)增加的群，或者具有至少50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞倍數(shù)增加并且具有來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少23 X IO6個或更多的活細(xì)胞的群，或者具有至少4%⑶34+細(xì)胞和至少50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞倍數(shù)增加以及來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少23X IO6個或更多的活細(xì)胞的群。在一個實施方式中，根據(jù)所有四個所述參數(shù)篩選或排除離體擴(kuò)增的細(xì)胞群，篩選用于移植的離體擴(kuò)增的細(xì)胞群具有至少4% CD34+細(xì)胞和至少50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加和來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少70%或更多的活細(xì)胞以及來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少23X IO6個或更多的活細(xì)胞。在一個實施方式中，用于移植的細(xì)胞是干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，并且干細(xì)胞群的來源是未分級的單核細(xì)胞群，其未富集⑶；34+、⑶133+或其他造血干細(xì)胞。在另一實施方式中，通過干細(xì)胞標(biāo)記例如⑶；34+、⑶;34+/⑶38-、⑶133+、⑶;34+/Lin_和本領(lǐng)域中已知的其他干細(xì)胞標(biāo)記來鑒定干細(xì)胞。在又一實施方式中，干細(xì)胞群的來源是通過根據(jù)干細(xì)胞標(biāo)記的篩選富集了造血干細(xì)胞的干細(xì)胞。通常通過FACS或免疫磁性分離進(jìn)行篩選，但是還可以通過核酸方法例如PCR(參見，下文中的材料和實驗方法)進(jìn)行篩選。胚胎干細(xì)胞以及它們的修復(fù)方法在本領(lǐng)域中是熟知的并且描述在例如Trounson AO(Reprod Fertil Dev(2001) 13 523),Roach ML(Methods Mol Biol (2002) 185 1)和 Smith AG(Annu Rev Cell Dev Biol (2001) 17 :435)中。成人干細(xì)胞是衍生自成人組織的干細(xì)胞并且在本領(lǐng)域中也是熟知的。分離或富集臍帶血和成人干細(xì)胞的方法描述在例如Miraglia， S.et al. (1997) Blood 90 :5013, Uchida, N. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14720, Simmons, P.J.et al. (1991)Blood 78 :55, Prockop DJ(Cytotherapy (2001)3 393)，Bohmer RM(Fetal Diagn Ther(2002) 17 :83)禾口 Rowley SD et al. (Bone Marrow Transplant (1998)21 :1253), Stem Cell Biology Daniel R. Marshak(Editor)Richard L. Gardner(Editor), Publisher :Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001) 以及 Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Anthony D. Ho (Editor)Richard Champlin(Editor), Publisher =Marcel Dekker (2000)中。例如，本發(fā)明的干細(xì)胞可來自選自由造血細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞和永生化外周血細(xì)胞組成的組中的來源。根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施方式，提供了一種通過所要求的方法篩選的適合于移植的一個或多個擴(kuò)增的造血細(xì)胞群。這樣的篩選的細(xì)胞群可在篩選之后用于移植或保存?zhèn)溆谩１４嬖煅杉?xì)胞群的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，例如超低溫保存、凍干等(參見， Watts et al, Cryopreservation and Freeze—Drying Protocols, Methods in Molecular Biology, 2007 ；368 :237-259)。在一個實施方式中，擴(kuò)增細(xì)胞群包含離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群，其具有至少4% CD34+細(xì)胞和至少50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加以及來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少70%或更多的活細(xì)胞和來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少23X 106個或更多的活細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明方法篩選的造血干細(xì)胞群可用于移植入需要其的受試者，例如患有血液疾病或病癥的受試者。因此，根據(jù)所要求發(fā)明的另一方面，提供了一種在需要其的受試者中治療血液疾病或病癥的方法，該方法包括給予需要其的受試者通過以下方式篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個(i)所述群中CD34+細(xì)胞的比例；(ii)所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)所述群中所述細(xì)胞的活力，以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值來篩選或排除候選群，由此在所述受試者中治療和/或預(yù)防所述血液疾病。在一個實施方式中，所述擴(kuò)增的細(xì)胞群包含離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群，其具有至少4% CD34+細(xì)胞和至少50倍(50X)或更大的總有核細(xì)胞的倍數(shù)增加以及來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少70%或更多的活細(xì)胞和來自擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)的至少23 X IO6個或更多的活細(xì)胞。下文總結(jié)了可根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)實施的一些臨床應(yīng)用。造血細(xì)胞移植在具有完全消融骨髓的受體中恢復(fù)造血作用以及在常規(guī)的放療或化療之后提供縮短受體骨髓恢復(fù)的輔助措施。最近的報導(dǎo)已證明了移植的或輸注的干細(xì)胞增強(qiáng)非同源組織中而不是衍生所述干細(xì)胞的組織中的再生的能力。因此，篩選的細(xì)胞群可用于組織再生、再生藥物、重建手術(shù)、 組織工程、再生新組織和自然治愈患病的或受損的器官?？稍谂囵B(yǎng)物中擴(kuò)增之前、之中或之后將所篩選群的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。向新鮮的干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的效率極低。離體保存并加工篩選的細(xì)胞群并且增強(qiáng)它們的歸巢和移入潛能的能力可以提供增加的成功使用用于基因療法的遺傳修飾細(xì)胞移植的可能性。 造血細(xì)胞的遺傳操作的方法，例如使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本領(lǐng)域中是熟知的(參見，例如 Larochelle et al，Semin. Hemato1. 2004 ；41 :257-71)。可通過根據(jù)本發(fā)明篩選的造血干細(xì)胞群的移植治療或預(yù)防的血液疾病或病癥包括但不限于白血病、鐮狀細(xì)胞病、骨髓增生異常綜合癥、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、尤文氏肉瘤、纖維組織增生性小圓細(xì)胞瘤、霍奇金病、非何杰金氏淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤。接受所篩選的造血干細(xì)胞群移植的候選者在移植之前、之中或之后可能需要處理或其他護(hù)理，例如但不限于在輸注之前輔助消除患者疾病并且抑制免疫反應(yīng)的成髓性或非成髓性劑量的化療(環(huán)磷酰胺、白消安)和/或輻射、用于預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)的他克莫司和甲氨喋呤、用于輔助護(hù)理的抗生素和血液制品。可以自身，與包含所述細(xì)胞群的培養(yǎng)基一起，與所述培養(yǎng)基分離以及與藥用載體以及與可促進(jìn)細(xì)胞移入和/或器官功能的另外的藥劑(例如，免疫抑制劑、抗生素、生長因子)一起提供本發(fā)明的篩選的細(xì)胞群。因此，可在藥用載體或稀釋劑例如無菌鹽水和含水的緩沖液中給予本發(fā)明的細(xì)胞群。這樣的載體和稀釋劑的使用在本領(lǐng)域中是熟知的。如果期望，將本發(fā)明的組合物提供在包裝或分配器中，例如FDA批準(zhǔn)的試劑盒，其可包括包含所述活性成分(例如細(xì)胞)的一個或多個單位劑型。所述包裝例如可以包含金屬或塑料箔，例如鋁箔包裝。所述包裝或分配器可附有給藥說明。所述包裝或分配器還可附有由管理藥物的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的通告，該通告可反映該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人或獸給藥的所述組合物的形式。這樣的通告例如可包括由美國食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于處方藥的標(biāo)簽或者經(jīng)批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書。還可制備包含配制在藥用載體中的本發(fā)明的制劑的組合物，其置于適合的容器內(nèi)并且標(biāo)注用于指定病癥的治療，如上文另外詳述的?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞自身或在將其與合適的載體或賦形劑混合的藥物組合物中給予受試者。如本文中所使用的，“藥物組合物”是指本文所述的一種或多種活性成分與其他化學(xué)組分例如生理學(xué)上可接受的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的在于輔助將化合物給予有機(jī)體。在下文中，可互換使用的短語“生理學(xué)上可接受的載體”和“藥用載體”是指不會對有機(jī)體引起明顯的刺激并且不會破壞所給藥化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。 這些短語包括佐劑。在本文中，術(shù)語“賦形劑”是指加入到藥物組合物中以進(jìn)一步輔助活性成份的給藥的惰性物質(zhì)。用于藥物的制劑和給藥的技術(shù)可在最新版的“Remington’ s Pharmaceutical Sciences, ”Mack Publishing Co.，Easton, PA中找到，將其全部以引用方式并入本文。因此用于根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體以常規(guī)方式進(jìn)行配制，所述載體包括輔助將活性成分加工成可作為藥物使用的制劑的賦形劑和佐劑。合適的制劑取決于所選擇的給藥途徑。對于注射，可將藥物組合物的活性成分配制在水溶液中，優(yōu)選配制在生理相容的緩沖液例如Hank溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。適合用于本發(fā)明背景中的藥物組合物包括其中包含可有效實現(xiàn)預(yù)期目的的量的活性成分的組合物。更具體地，“治療有效量”是指可有效預(yù)防、緩解或改善疾病(例如白血病)的癥狀或延長被治療受試者的存活時間的活性成分(例如擴(kuò)增的造血干細(xì)胞)的量。治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開。可通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序在體外、在細(xì)胞培養(yǎng)物中或?qū)嶒瀯游镏袦y定本文所述的活性成分的毒性和治療效力。從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)物測定以及動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于制定用于人的多種劑量。所述劑量可隨著所使用的劑型和所采用的給藥途徑而變化。單獨的醫(yī)生考慮到患者的病癥來選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量(參見，例如，F(xiàn)ingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics，，，Ch· 1，ρ· 1·)。根據(jù)預(yù)治療病癥的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，劑量可為單次給藥或多次給藥。然而，通常受試者接受單個移植，其中多個移植是極罕見的。但是，預(yù)給予的組合物的量當(dāng)然將取決于被治療的受試者、痛苦的嚴(yán)重度、給藥方式、處方醫(yī)師的判斷等。應(yīng)當(dāng)理解，為了清楚起見，描述在不同實施方式背景中的本發(fā)明的某些特征還可以組合提供在單個實施方式中。相反，為了簡略起見，描述在單個實施方式中的本發(fā)明的各種特征還可以單獨地或以任何合適的亞組合或適合地在本發(fā)明的任何其他所述實施方式中提供。不應(yīng)認(rèn)為在各種實施方式的背景中描述的某些特征是那些實施方式的必要特征， 除非在沒有這些要素的情況下無法實施該實施方式。對于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員來說，在考察下面的不是限制性的實施例之后，本發(fā)明的另外的目的、優(yōu)點和新特征將變得顯而易見。此外，如上文所述中以及如下文權(quán)利要求部分中所要求的本發(fā)明的各種實施方式和方面可在以下實施例中找到實驗支持。實施例現(xiàn)在參考以下實施例，其與上面的描述一起以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實施方式。通常，本文中使用的命名法和本發(fā)明中采用的實驗室程序包括分子、生物化學(xué)、 微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)全面地闡述在文獻(xiàn)中。參見，例如，“Molecular Cloning :A laboratory Manual " Sambrook et al.， (1989) ； " Current Protocols in Molecular Biology “ Volumes I-III Ausubel, R. Μ. , ed. (1994) ；Ausubel et al. , " Current Protocols in Molecular Biology " , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons， New York(1988) ；Watson et al. , “ Recombinant DNA “， Scientific American Books, New York ；Birren et al. (eds) " Genome Analysis A Laboratory Manual Series" , Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；如在美國專利號 4，666，828 ；4，683，202 ；4，801，531 ；5，192，659 and 5,272,057 中闡述的方法；“Cell Biology :A Laboratory Handbook “，Volumes I-III Cellis, J. Ε. , ed. (1994) ； “ Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique " by Freshney, ffiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition ； " Current Protocols in Immunology " Volumes I-III Coligan J.Ε. , ed. (1994) ；Stites etal. (eds), “ Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ；Mishell and Shiigi (eds), “ Selected Methods in Cellular Immunology " , W. H. Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫測定廣泛描述在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見，例如，美國專利號3，791,932 ；3, 839, 153 ；3, 850, 752 ；3, 850, 578 ； 3，853，987 ；3，867，517 ；3，879，262 ；3，901，654 ；3，935，074 ；3，984，533 ；3，996，345 ； 4, 034, 074 ；4, 098, 876 ；4, 879, 219 ；5, 011, 771 and 5, 281, 521 ； “ Oligonucleotide Synthesis “ Gait, M.J. , ed. (1984) ；"Nucleic Acid Hybridization “ Hame s, B. D., and Higgins S.J., eds. (1985) ； " Transcription and Translation " Hames, B. D. , and Higgins S. J. , eds. (1984) ； " Animal Cell Culture " Freshney, R. I.，ed. (1986) ； “ Immobilized Cells and Enzymes “ IRL Press, (1986) ； “ A Practical Guide to Molecular Cloning " Perbal, B. , (1984)and " Methods in Enzymology" Vol. 1-317,Academic Press ； " PCR Protocols :A Guide To Methods And Applications" ,Academic Press,San Diego,CA(1990) ；Marshak et al. , " Strategies for Protein Purification and Characterization-Α Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；其均通過引用結(jié)合在本文中，如同在本文中完全闡述的。其他的一般性參考文獻(xiàn)提供在整個該文獻(xiàn)中。其中的程序被認(rèn)為在本領(lǐng)域中是熟知的并且為了方便讀者而提供。其中包含的所有信息均通過引用并入本文。實施例1用離體擴(kuò)增的臍帶血的篩選群治療惡性血液病為了測定設(shè)定細(xì)胞群篩選標(biāo)準(zhǔn)對于在臨床環(huán)境中成功進(jìn)行來自臍帶血的造血干細(xì)胞移植的作用，與接收單次未處理的(immanipulated)臍帶血單位移植的相似的受試者比較，在患有惡性血液病(AML、ALL、CML、MDS、HD或NHL)并與未擴(kuò)增的臍帶血細(xì)胞一起接受篩選的離體擴(kuò)增的臍帶血HSC移植的受試者中監(jiān)測諸如移移入時間、百分比移入、副作用和存活率的結(jié)果。材料和方法受試者群包括患有惡性血液病并且對其而言成髓性干細(xì)胞移植是目前建議的并且為可能挽救生命的治療的受試者。僅使不具有足夠的備選骨髓供體的成人和12歲及以上的青少年入選。治療組中包括的受試者標(biāo)準(zhǔn)為A 血液疾病，包括1.急性髓細(xì)胞白血病(AML)第二次完全好轉(zhuǎn)(CM)期或后續(xù)完全好轉(zhuǎn)期或具有包括以下中的任何一個的高危特征的CRl 干細(xì)胞或雙表型分類 (AML-MO)、紅白血病(AML-M6)、急性巨核細(xì)胞性白血病(AML-M7)、高危細(xì)胞遺傳學(xué)或標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)療法之后未達(dá)到CR或呈現(xiàn)出髓外?。换駼M中具有< 10%母細(xì)胞復(fù)發(fā)并且沒有循環(huán)母細(xì)胞。2.急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL) :CR2或后續(xù)CR或具有以下高危特征的CR1，包括高危細(xì)胞遺傳學(xué)或在標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)療法之后未達(dá)到CR或呈現(xiàn)有WBC升高(< 17歲，50，000或17歲，20，000)或呈現(xiàn)出髓外病。
或在BM中具有< 10%母細(xì)胞復(fù)發(fā)并且沒有循環(huán)母細(xì)胞。3.慢性髓細(xì)胞白血病(CML)處于慢性第一期(CPl)并且對格列衛(wèi)(Gleevec)具有抗性或耐受性或處于CP2或后續(xù)CP ；或處于加速期。4.何杰金氏病(HD)對最后的化療療程敏感并且具有以下之一-第二次復(fù)發(fā)或-自體移植失敗或-處于第一次復(fù)發(fā)并且由于廣泛的骨髓累及不適合自體移植。5.非何杰金氏淋巴瘤(NHL)對最后的化療療程敏感并且具有以下之一-第二次復(fù)發(fā)或-自體移植失敗或-處于第一次復(fù)發(fā)并且由于廣泛的骨髓累及不適合自體移植。6.具有中等2-或高危IPSS評分的骨髓增生異常綜合癥(MDS)B:年齡 >12 并且 <55C 滿足以下要求的臍帶血單位的可用性1.在 4、5、6/6HLA I 型(HLA-A&HLA-B，低分辨率)和 II 型(HLA-DRB1，高分辨率)
上匹配。2.在低溫貯藏前使臍帶血單位經(jīng)歷體積減小并且以兩個部分保存，其中較多的 (或相等的)部分包含最少1. OX IO7個總有核細(xì)胞/kg (解凍前)。3.臍帶血單位獲自公用臍帶血庫，在那里遵循適用的地方性要求和規(guī)章檢測它們的傳染性藥劑。D 通過Kamofsky的受試者的行為評分為70% (13歲)或者Lansky Play-行為評分為70% (年齡< 13)。E 受試者具有足夠的生理儲備，包括1.左心室射血分?jǐn)?shù)40%。2.肺功能測試表明預(yù)測的50%的校正(X)2彌散量。3.血清肌酸酐 < 1.6mg/dl。4.血清膽紅素< 2. Ox正常范圍的上限。5. SGPT (ALT) _3. Ox 正常范圍的上限。F 在移入失敗的情況下受試者具有至少一個后備干細(xì)胞來源1.在移入失敗的情況下受試者愿意接受骨髓收獲或外周血祖細(xì)胞(PBPC)收集以備用(當(dāng)臨床上可適用時)。2.受試者具有第二個臍帶血單位作為可能的后備。3.已鑒定出受試者的單倍體相同家族成員并且在移入失敗的情況下同意(通過簽署書面的知情同意書)捐獻(xiàn)造血干細(xì)胞。G.在了解受試者疾病的性質(zhì)后受試者或監(jiān)護(hù)人簽署書面知情同意書并且在被告知備選治療、潛在風(fēng)險、利益和不適之后自愿同意治療方案。從治療組中排除的受試者標(biāo)準(zhǔn)為
A.從處理(除了羥基脲)前患者的最后一次放療或化療起少于21天B. HIV 陽性C.懷孕或哺乳D.未控制的細(xì)菌、真菌或病毒感染。E.具有活動中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的體征和癥狀的受試者。F.合適的親緣性和自愿的干細(xì)胞供體的可用性，所述供體在5或6/6抗原處被 HLA-匹配。G.先前的同種細(xì)胞移植。H.對?；蛉魏萎a(chǎn)品過敏，這可能會干擾治療。I.入選另一臨床實驗或在最后30天期間接受研究性治療。受試者篩選在鑒定了可接受的臍帶血單位之后，在移植前3-5周篩選合格的受試者。使受試者或他/她的合法監(jiān)護(hù)人完全知情并且簽署書面知情同意書。篩選活動包括常規(guī)基線評價-病史，包括原發(fā)和伴發(fā)疾病以及合并用藥，以及之前的放療和化療進(jìn)程。-行為狀態(tài)=Karnofsky量表(歲數(shù)>13)或Lansky評分(13歲)。-物理檢查和生命體征(包括高度和體重)。-常規(guī)實驗室CBC、血液化學(xué)、PT、PTT、尿分析、血清βHCG (女性)(來自篩選前最后一周的測試是可接受的)-免疫表型分型一淋巴細(xì)胞亞型⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶16/56-免疫球蛋白水平(IgG、IgA、IgM、IgE)-胸腔X射線(來自篩選前最后一個月的測試是可接受的)。疾病狀態(tài)評價-BM (吸入/活檢，如臨床上指出的)形態(tài)學(xué)-對于白血病或MDS外周血和BM(吸入/活檢，如臨床上指出的)形態(tài)學(xué)FACS 測定、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子標(biāo)記。-對于NHL和HDCT腹部、骨盆和胸部(來自篩選前最后一個月的測試是可接受的)。-竇CT(來自篩選前最后一個月的測試是可接受的)。臍帶血配型-受試者和臍帶血單位ABO和1 分型。-受試者HLAI型和II型高分辨率分型。-用于嵌合體實驗室的外周血基線樣品。-適用時備用白細(xì)胞清除術(shù)/BM收獲。血清學(xué)篩選-HIV 1 和 2Ab、HTLV 1 和 2Ab、HbsAg、HbcAb、HCV Ab, HSV Ab, VZV Ab, EBV Ab、弓形病Ab、CMV Ab、牙科咨詢(建議，可選)的血清學(xué)檢測。免疫表型分型一淋巴細(xì)胞亞型:CD3、CD4、CD8、CD19、CD16/56
免疫球蛋白水平(IgG、IgA、IgM、IgE)牛理儲備評價-包括一氧化碳彌散量(DLCO)的肺功能測試(來自篩選前最后一個月的測試是可接受的)。-12導(dǎo)線ECG(來自篩選前最后一個月的測試是可接受的)。-超聲心動描記術(shù)或具有左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的MUGA(來自篩選前最后一個月的測試是可接受的)。-對于具有自體干細(xì)胞備用的受試者，從受試者收獲備用干細(xì)胞(白細(xì)胞清除術(shù)或 BM)。所有上述活動均在清髓性(骨髓根除，myeloablative)準(zhǔn)備方案開始之前完成。清髓性(myeloablative)處理在臍帶血移植之前用如下選擇的三種清髓性方案之一對患者進(jìn)行清髓性處理方案A 馬法蘭/噻替派/氟達(dá)拉濱/抗胸腺細(xì)胞球蛋白(Mel/Thio/Flu/ATG)處理的日程-9水化療法-8馬法蘭140mg/m2，IV(靜脈內(nèi)注射)-7 噻替派 10mg/kg, IV-6 氟達(dá)拉濱 40mg/m2，IV-5 氟達(dá)拉濱 40mg/m2，IV-4 氟達(dá)拉濱 40mg/m2，IV-3 氟達(dá)拉濱 40mg/m2，IV，ATG 1. 50mg/kg，IV-2ATG 1. 25mg/kg, IV-IATG 1. 25mg/kg, IV方案B :白消安/環(huán)磷酰胺/ATG (Bu/Cy/ATG)建議基于藥物動力學(xué)的白消安的劑量調(diào)整(方案B. 1)，或者使用固定的劑量方案 (方案B. 2).方案B. 1 Bu/Cy/ATG,具有I3K劑量調(diào)整的BU處理的曰程-11水化療法-10 白消安 32mg/m2，IV-9 暫停-8通過PK調(diào)整*的白消安劑量至AUC 6，000，IV (3小時輸注)-7通過1 調(diào)整*的白消安劑量至AUC 6，000, IV (3小時輸注)-6通過1 調(diào)整*的白消安劑量至AUC 6，000，IV(3小時輸注)-5通過PK調(diào)整*的白消安劑量至AUC 6，000，IV (3小時輸注)-4 暫停-3 環(huán)磷酰胺 60mg/Kg，IVATG 1. 50mg/kg, IV-2 環(huán)磷酰胺 60mg/Kg，IVATG 1. 50mg/kg, IV-IATG 1. 25mg/kg, IV
方案B. 2 固定劑量的白消安(具有固定劑量BU的Bu/Cy/ATG)治療的日程-9水化療法-8 白消安 130mg/m2，IV (3-小時輸注)-7 白消安 130mg/m2，IV (3-小時輸注)-6 白消安 130mg/m2，IV (3-小時輸注)-5 白消安 130mg/m2，IV (3-小時輸注)-4 暫停-3 環(huán)磷酰胺 60mg/Kg，IVATG 1. 50mg/kg, IV-2 環(huán)磷酰胺 60mg/Kg，IVATG 1. 25mg/kg, IV-IATG 1. 25mg/kg, IV方案C =TBI/ 環(huán)磷酰胺 / 氟達(dá)拉濱 /ATG (TBI/Cy/Flu/ATG)除之前接受自體移植的患有HD的受試者之外，該方案還可用于所有受試者。日程、藥劑和給藥途徑-10水化療法小時)-9FTBri50cGy χ 2-8FTBri50cGy χ 2-7FTBri50cGy χ 2-6FTBri50cGy χ 2-5 環(huán)磷酰胺 60mg/Kg/ 天，IV 氟達(dá)拉濱 30mg/m2，IV-4環(huán)磷酰胺60mg/Kg/天，IV氟達(dá)拉濱30mg/m2-3 氟達(dá)拉濱 30mg/m2，IV ATG 1. 50mg/kg/ 天，IV-2 氟達(dá)拉濱 30mg/m2，IV ATG 1. 25mg/kg/ 天，IV-IATG 1. 25mg/kg/ 天，IV*可將分次全身照射(FTBI)劑量分成每天一次或3X/天。最大總劑量不應(yīng)超過 1200cGy。GVHD 預(yù)防在開始前第1天進(jìn)行以下兩種GvHD預(yù)防方案之一方案A他克莫司/MMF 從開始前第2天直到第180天，他克莫司(KF506，普樂可復(fù))0. 03mg/kg/ 天 IV 或 0. 10-0. 15mg/kg/ 天 PO0麥考酚酯(mycophenolate) (MMF)從開始前第2天直到第100天，MMF的劑量為 15mg/Kg，每日口服兩次，其中最大劑量為1克每日兩次(即，最大總?cè)談┝繛?克)。根據(jù)片劑大小來調(diào)整劑量。如果P0( 口服)不耐受，則使用靜脈內(nèi)途徑(具有相同的劑量)。方案B環(huán)孢菌素/MMF 從開始前第2天直到第180天，環(huán)孢菌素A(IV或P0) 1. 5mg/kg BID。麥考酚酯(MMF)從第2天開始直到第100天，MMF的劑量為15mg/Kg，每日口服兩次， 其中最大劑量為1克每日兩次(即，最大總?cè)談┝繛?克)。根據(jù)片劑大小來調(diào)整劑量。如果P0( 口服)不耐受，則使用靜脈內(nèi)途徑(具有相同的劑量)。
移植前基線評價安全性評價在移植前，如通過身體檢查、CBC、血液化學(xué)、尿分析、生命體征(體溫、血壓、脈搏、 呼吸頻率和飽和度以及體重)、心臟狀態(tài)(1導(dǎo)聯(lián)檢測器在移植前，開始心臟監(jiān)測(1-導(dǎo)聯(lián))并且持續(xù)直到篩選的擴(kuò)增干細(xì)胞群移植后M小時)來評價受試者。臍帶血單位將對其研究獲得匹配臍帶血單位的用于臍帶血輸注的潛在候選者鑒定為用于研究的篩選候選者。在低溫貯藏前使臍帶血單位經(jīng)歷體積減小并且以兩部分進(jìn)行冷凍保存。 較多的(或相等的)部分具有至少IxlO7個總有核細(xì)胞/kg受試者體重。要求至少4/6位點的HLA I型和II型匹配(低分辨率HLA-A和HLA-B，高分辨率HLA-DRB1)。臍帶血單位獲自公用庫，在那里根據(jù)地方適用的要求和規(guī)章來檢測它們的傳染性藥劑。臍帶血的離體擴(kuò)增將冷凍的臍帶血單位保存在液氮中直到使用。將其分成兩份，并且對較少的或相等的一份進(jìn)行解凍，用10% w/v葡聚糖和5% w/v人血清白蛋白(Aventis，Bridgewater NJ, USA)洗滌。將細(xì)胞與0. 15% w/v靜脈內(nèi)免疫球蛋白(Ivlg，Baxter, Deerfield II， USA)在室溫下溫育10分鐘，離心并且再懸浮在包含0.4%檸檬酸鈉、1 %人血清白蛋白和 0. 2mg/ml rHu-DNase (Genentech, San Francisco, CA, USA)的 PBS 中。然后用 CliniMACS CD133+磁性細(xì)胞分離劑(Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA)標(biāo)記細(xì)胞并且根據(jù)制造商使用說明通過CliniMACS來分離。通過⑶133篩選后，將細(xì)胞用臺盼藍(lán)染色、計數(shù)、測定CFUc并且進(jìn)行免疫表型分型以確定純度。然后在培養(yǎng)袋(American Fluoroseal Co., Gaithersburg MD, USA)內(nèi)以1 X IO4個細(xì)胞/ml的濃度將純化的CD133+細(xì)胞培養(yǎng)在最小必需培養(yǎng)基-a (MEM- α )和10%胎牛血清(FCS，Hyclone Logan UT, USA)中，其包含最終濃度為50ng/ml的以下細(xì)胞因子干細(xì)胞因子、TPO、IL-6和FLT-3 (R&D Systems, Minneapolis MN, USA)以及 5 μ M 四亞乙基五胺(TEPA) (Sigma, St Louis, MO, USA)。如果富集之后回收的細(xì)胞數(shù)量等于或少于19父104，則在721111￥1161^作Teflon PEP細(xì)胞培養(yǎng)袋 (American Fluoroseal Co)中進(jìn)行擴(kuò)增，并且如果細(xì)胞的數(shù)量在20至70X IO4之間，則在 270ml VueLife Teflon PEP 細(xì)胞培養(yǎng)袋(American Fluoroseal Co)中進(jìn)行擴(kuò)增。在空氣中在5% CO2的加濕氣氛中在37°C下將培養(yǎng)物溫育3周。每周用相同體積的新鮮培養(yǎng)基、FCS、生長因子和TEPA將培養(yǎng)物加滿。在第3周，將細(xì)胞洗滌并重懸在IOOml PBS/EDTA/人血清白蛋白輸注緩沖液中。將輸注緩沖液中擴(kuò)增細(xì)胞的樣品在活體染色(臺盼藍(lán))后計數(shù)，測定CFUc并且進(jìn)行免疫表型分型用于表面抗原分析(⑶34、⑶38、⑶133)。 如本文詳述的，將細(xì)胞給予受體。在整個過程中檢測等分試樣的支原體、內(nèi)毒素、無菌性和革蘭氏染色。未擴(kuò)增臍帶血的解凍和輸注將臍帶血單位洗滌以除去DMS0，或者稀釋至2. 5%的最終DMSO濃度。如果洗掉了 DMS0，則將冷凍的臍帶血單位部分置于無菌的自封袋中。將該袋浸沒在37°C的水浴中并且搖動直至幾乎所有的冰晶溶解。向單位中緩慢注射10%葡聚糖-40(9. 5ml)，然后注入5% 人血清白蛋白(HSA) (9. 5ml)。將該混懸液轉(zhuǎn)移至150ml轉(zhuǎn)移袋中并且用40ml的10%葡聚糖-40進(jìn)一步稀釋，然后離心。然后丟棄上清，并將臍帶血細(xì)胞沉淀重懸在50ml包含50%的10%葡聚糖-40和50%的5% HSA的溶液中。測量并記錄該樣品的準(zhǔn)確體積并且取一份以測量該部分中細(xì)胞的總數(shù)。取出另外的500 μ 1樣品以通過用熒光抗體標(biāo)記并且通過 FACS分析檢測來測定⑶34+和⑶133+群的百分?jǐn)?shù)。然后將臍帶血混懸液轉(zhuǎn)移到適合的輸注袋內(nèi)用于經(jīng)受試者的中心靜脈導(dǎo)管以l-3ml/min的速度輸注(沒有照射)。如果受試者出現(xiàn)胸部緊迫感或其他癥狀，在繼續(xù)進(jìn)行剩余輸注之前需要短暫間歇(1-2分鐘)。在完成臍帶血輸注之后需要維持水化(2. 5-3.0ml/kg/hr)12小時。如果出現(xiàn)容量超負(fù)荷或減少的尿排出量，則可以給予利尿磺胺(0. 5-1. Omg/kg/劑量)。移植后隨訪和擴(kuò)增的篩選HSC移植前的安全性評價安全性評價包括移植后第15、30、60分鐘和第2、4和M小時的生命體征(體溫、 血壓、脈搏、呼吸頻率和飽和度)、CBC、血液化學(xué)、尿分析、心臟(1導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測儀)和不良反應(yīng)記錄。輔助細(xì)胞因子療法起始從第0天開始直到ANC > 2. 5X 109/L，以5 μ g/kg/天的劑量每日SC給予G-CSF (粒細(xì)胞集落刺激因子，非格司亭)。篩選的擴(kuò)增HSC群的移植進(jìn)行質(zhì)量控制檢測，包括生物測定和安全性檢測、內(nèi)毒素和革蘭氏染色檢測。如果擴(kuò)增的篩選HSC群不能滿足任何安全性檢測規(guī)格(內(nèi)毒素含量和格蘭式染色)，則將其銷毀。但是，如果所篩選的擴(kuò)增HSC群不能滿足生物測定的規(guī)格，則可將其運至臨床地點， 并且可以使用。在通過具有管線過濾器的受試者中心靜脈導(dǎo)管以l-3ml/min的速度輸注之前，通過按壓將擴(kuò)增的篩選HSC袋充分但是溫和地混合。當(dāng)需要時，根據(jù)具體的擴(kuò)增的篩選HSC群中內(nèi)毒素的水平，將輸注速率調(diào)節(jié)至較低的速率從而使內(nèi)毒素輸注不超過5Eu/ kg/hr。如果待輸注較大(或相等)體積的擴(kuò)增的篩選HSC(> 15ml/kg)，則輸注一半體積， 接著間歇30分鐘，然后輸注剩余體積。在完成臍帶血輸注之后，維持水化O. 5-3. 0ml/kg/ hr)12小時。如果出現(xiàn)容量超負(fù)荷或尿排出量減少，則可以給予利尿磺胺(0. 5-1. Omg/kg/ 劑量)。移植后的安全性評價包括第15、30、60分鐘和第2、4和對小時的生命體征(體溫、 血壓、脈搏、呼吸頻率和飽和度)、CBC、血液化學(xué)、尿分析、心臟(1導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測儀)和不良反應(yīng)記錄。隨訪在最后一次移植后在預(yù)定的日期隨訪訪問標(biāo)準(zhǔn)評價和他克莫司/環(huán)孢菌素水平、 免疫建立、不良反應(yīng)、CMV和GvHD評價、骨髓和外周血評價(對于嵌合體，分子標(biāo)記和細(xì)胞遺傳學(xué))、免疫分型、CT(僅淋巴瘤)。從骨髓吸入和外周血樣品評價第+35天的移入。利用第+42天或之前宿主造血作用的證據(jù)，通過不存在供體造血作用來定義移植物排斥。統(tǒng)計學(xué)前述結(jié)果(具有10名受試者)表明接受擴(kuò)增HSC的患者具有20%的第100天死亡率。NCBP和國際血液和骨髓移植研究(CIBMTR)登記處中心的組合結(jié)果(共431名年齡在12-55歲具有所述適應(yīng)癥(AML，ALL，HD，NHL)之一的臍帶血移植受體)的初步分析顯示在第100天46%的死亡率。保守起見，在我們的統(tǒng)計學(xué)功率計算中在歷史對照組中我們使用43%作為第100天總體死亡率。因此，與對照組中43%的死亡率相比，各種水平的移植的受試者的第100天死亡率(20^^25^^27^^30% )在5%顯著性水平的雙側(cè)似然比檢驗的統(tǒng)計功效分別對應(yīng)于讓步比 0. 33,0. 44,0. 49 和 0. 57。移入失敗監(jiān)測是基于對中性粒細(xì)胞移入失敗率超過17%的貝葉斯后驗概率的計算(約為對照患者所經(jīng)歷的)。急性GvHD監(jiān)測是基于對III-IV級GvHD率超過19%的貝葉斯后驗概率的計算(約為對照患者所經(jīng)歷的)?；诘?00天整體死亡率超過0. 43的貝葉斯后驗概率計算100天整體死亡率監(jiān)測(約為對照患者所經(jīng)歷的)。使用對數(shù)回歸和似然比檢驗，整體顯著性水平為單尾2.5%。這相當(dāng)于雙尾5%顯著性水平。擴(kuò)增的造血細(xì)胞群的評價基于未擴(kuò)增的臍帶血部分中的輸注前計數(shù)來估算祖細(xì)胞/干細(xì)胞群的擴(kuò)增參數(shù)。 所測定的參數(shù)包括冷藏的總有核細(xì)胞細(xì)胞劑量/kg受體體重輸注細(xì)胞未擴(kuò)增細(xì)胞和擴(kuò)增的群細(xì)胞劑量(總細(xì)胞)/kg受體體重。僅擴(kuò)增細(xì)胞的倍數(shù)增加。CD34+細(xì)胞僅未擴(kuò)增的細(xì)胞群絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重。擴(kuò)增和未擴(kuò)增部分絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重。僅擴(kuò)增部分絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重；來自總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；倍數(shù)擴(kuò)增。CD133+細(xì)胞僅未擴(kuò)增的細(xì)胞群細(xì)胞劑量/kg受體體重。擴(kuò)增和未擴(kuò)增部分絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/Kg受體體重。僅擴(kuò)增的細(xì)胞絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重；來自總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；倍數(shù)擴(kuò)增。⑶38-細(xì)胞僅擴(kuò)增的細(xì)胞絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重。⑶38+細(xì)胞僅擴(kuò)增的細(xì)胞絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重。CXCR4+細(xì)胞僅擴(kuò)增的細(xì)胞絕對細(xì)胞劑量；細(xì)胞劑量/kg受體體重。CFU細(xì)胞僅擴(kuò)增的細(xì)胞細(xì)胞劑量/Kg受體體重。倍數(shù)增加。使用回歸分析，然后使所述參數(shù)與如本文詳述的臨床結(jié)果(移入時間、百分比移入、GvHD、毒性、100天、180天存活率、無病存活率、中性粒細(xì)胞移入、血小板移入、感染)相關(guān)。首先建立單變量關(guān)系，然后針對每一個臨床結(jié)果，基于以下參數(shù)構(gòu)建模型(i)CD34+細(xì)胞的比例；(ii)總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)第21天培養(yǎng)時總細(xì)胞的百分比活力；以及(iv) 活細(xì)胞的總數(shù)。結(jié)果篩選對移入效力的作用以及在血液病中用擴(kuò)增的造血臍帶血干細(xì)胞群進(jìn)行移植的臨床結(jié)果對接受未擴(kuò)增和擴(kuò)增的臍帶血細(xì)胞群二者的患有惡性血液病的受試者與僅接受未擴(kuò)增臍帶血的受試者的臨床結(jié)果(GvHD、毒性、100天、180天存活率、無病存活率、感染) 和移入?yún)?shù)(移入時間、百分比移入、中性粒細(xì)胞移入、血小板移入)的比較表明加入的擴(kuò)增HSC對移入效力的作用。根據(jù)CD34+細(xì)胞的比例、倍數(shù)擴(kuò)增、總細(xì)胞活力和活細(xì)胞的總數(shù)來篩選擴(kuò)增的臍帶血群，并且其特征為CD34+細(xì)胞的比例為總細(xì)胞的約4% ；群的總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增為約50倍；第21天培養(yǎng)時群中總細(xì)胞的活力為約85% ；并且擴(kuò)增群的活細(xì)胞總數(shù)為23 X IO6個活細(xì)胞，這預(yù)期產(chǎn)生更優(yōu)的臨床結(jié)果和改進(jìn)的移入?yún)?shù)。盡管已結(jié)合其具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是許多備選方案、修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，預(yù)期包括屬于所附權(quán)利要求的精神和寬范圍內(nèi)的所有這樣的備選方案、修改和變化。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請以其整體通過引用而結(jié)合在本說明書中，正如具體并且單獨指明每一個單獨出版物、專利或?qū)＠暾堃砸梅绞浇Y(jié)合在本文中的程度。此外，本說明書中任何參考文獻(xiàn)的引用或識別不應(yīng)理解為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)獲得。就所使用章節(jié)標(biāo)題而言，它們不應(yīng)被解釋為必要的限制。參考文獻(xiàn)的列表Coder,D. ,Current Protocols in Cytometry,1997,John Wiley and Sons,Inc., Unit 9. 2,9. 2. 1-9. 2. 14di Lima et al, Bone Marrow Transplant, 2008, January 21, Epub.Dombret, H.，et al. Blood ；2002，100 :2357-66Larochelle et al, Semin. Hemato 1. 2004 ；41 :257-71Oh, H.，et al. Bone Marrow Transplant, 1998 ；22 :253-7Peled et al(Cytotherapy，2004，6 :344-5權(quán)利要求
1.一種篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群的方法，所述方法包括(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個 (i)所述群中CD34+細(xì)胞的比例；( )所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)所述群中所述細(xì)胞的活力；以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值來篩選或排除所述候選群， 由此篩選適合于移植的離體擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述CD34+細(xì)胞的所述比例是總細(xì)胞的約3%至約 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述CD34+細(xì)胞的所述比例是總細(xì)胞的約3%至約5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述CD34+細(xì)胞的所述比例是總細(xì)胞的約4%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述群的總細(xì)胞的所述倍數(shù)擴(kuò)增是約10至約70倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述群的總細(xì)胞的所述倍數(shù)擴(kuò)增是約25至約60倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述群的總細(xì)胞的所述倍數(shù)擴(kuò)增是約50倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的所述活力為約65%至約95%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的所述活力為約75%至約90%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的所述活力為約 85%。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的群的活細(xì)胞的所述總數(shù)是約 15 X IO6至約60 X IO6個活細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的群的活細(xì)胞的所述總數(shù)是約 20 X IO6至約30 X IO6個活細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的群的活細(xì)胞的所述總數(shù)是約 23 X IO6個活細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述篩選根據(jù)所述參數(shù)中的至少兩個的值來確定。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述篩選是根據(jù)所述參數(shù)中的至少三個的值。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述篩選是根據(jù)所有四個所述參數(shù)的值。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述篩選是根據(jù)所述參數(shù)的以下值 (i)所述CDiM+細(xì)胞的所述比例為總細(xì)胞的約4% ；( )所述群的總細(xì)胞的所述倍數(shù)擴(kuò)增是約50倍；(iii)在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的所述活力為約85%；以及(iv)所述擴(kuò)增的群的活細(xì)胞的所述總數(shù)為約23XIO6個活細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過在細(xì)胞因子和銅螯合劑存在的情況下培養(yǎng)造血細(xì)胞通過離體增殖來擴(kuò)增所述造血干細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是早期作用細(xì)胞因子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述早期作用細(xì)胞因子選自由干細(xì)胞因子、 FLT3配體、白介素-1、白介素_2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、腫瘤壞死因子-α和血小板生成素組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是干細(xì)胞因子、血小板生成素、 白介素-6和FLT3配體。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，以50ng/ml的濃度提供所述細(xì)胞因子。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述銅螯合劑是四亞乙基五胺(TEPA)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，以5μ M的濃度提供所述四亞乙基五胺。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的造血干細(xì)胞已被培養(yǎng)21天。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群在擴(kuò)增前包括至少 IXlO5個細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述造血細(xì)胞群選自由臍帶血、外周血和骨髓組成的來源。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述造血細(xì)胞群是臍帶血。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述臍帶血是解凍的冷凍臍帶血。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述造血細(xì)胞群在擴(kuò)增前已被富集造血干細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述造血細(xì)胞群在擴(kuò)增前已被富集CD34+或 CD133+細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。
33.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群。
34.一種在需要其的受試者體內(nèi)治療血液疾病或病癥的方法，所述方法包括給予需要其的受試者通過以下篩選的適合于移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個 (i)所述群中CD34+細(xì)胞的比例；( )所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)所述群中所述細(xì)胞的活力；以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值來篩選或排除所述候選群， 由此在所述受試者中治療和/或預(yù)防所述血液疾病。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述篩選是根據(jù)所述參數(shù)的以下值 (i)所述CD34+細(xì)胞的所述比例是總細(xì)胞的約4% ；( )所述群的總細(xì)胞的所述倍數(shù)擴(kuò)增是約50倍；(iii)在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的所述活力為約85%；以及(iv)所述擴(kuò)增的群的活細(xì)胞的所述總數(shù)是約23XIO6個活細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，通過在細(xì)胞因子和銅螯合劑存在的情況下培養(yǎng)造血細(xì)胞通過離體增殖來擴(kuò)增所述造血干細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是早期作用細(xì)胞因子。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述早期作用細(xì)胞因子選自由干細(xì)胞因子、 FLT3配體、白介素-1、白介素_2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、腫瘤壞死因子-α和血小板生成素組成的組。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是干細(xì)胞因子、血小板生成素、 白介素-6和FLT3配體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，以50ng/ml的濃度提供所述細(xì)胞因子。
41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述銅螯合劑是四亞乙基五胺(TEPA)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，以5μ M的濃度提供所述四亞乙基五胺。
43.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的造血干細(xì)胞已被培養(yǎng)21天。
44.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述血液疾病選自由急性髓細(xì)胞白血病 (AML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、慢性髓細(xì)胞白血病 (CLL)、何杰金氏淋巴瘤(HL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及骨髓增生異常綜合癥(MDS)組成的組。
45.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在將所述細(xì)胞給予所述受試者之前，將所述擴(kuò)增的造血細(xì)胞與未擴(kuò)增的造血細(xì)胞混合。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的造血細(xì)胞和所述未擴(kuò)增的造血細(xì)胞獲自相同的一個或多個臍帶血單位。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中，在所述擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群之前給予所述未擴(kuò)增的造血細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，在所述造血細(xì)胞的所述給予之前用免疫抑制治療來治療所述受試者。
49.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，在所述造血細(xì)胞的所述給予之后用免疫抑制治療來治療所述受試者。
50.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，將所述擴(kuò)增的造血細(xì)胞與用于血液疾病的另外的治療結(jié)合共給予。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述另外的治療選自由免疫抑制治療、化療和放療組成的組。
52.一種制品，包括包裝材料和所篩選的離體擴(kuò)增的造血細(xì)胞群，通過以下來篩選適合于移植的所述造血細(xì)胞群(a)在給藥前在擴(kuò)增造血細(xì)胞的候選群中確定以下參數(shù)中的至少一個(i)所述群中CD34+細(xì)胞的比例；( )所述群中總細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增；(iii)所述群中所述細(xì)胞的活力，以及(iv)活細(xì)胞的總數(shù)；和(b)根據(jù)所述參數(shù)中的至少一個的預(yù)定值來篩選或排除所述候選群；并且其中，所述包裝材料包括指明所述造血細(xì)胞群是用于在需要其的受試者中治療血液疾病或病癥的標(biāo)簽或包裝說明書。
53.根據(jù)權(quán)利要求M所述的制品，其中，所述篩選是根據(jù)所述參數(shù)的以下值(i)所述⑶34+細(xì)胞的所述比例是總細(xì)胞的約4%；(ii)所述群的總細(xì)胞的所述倍數(shù)擴(kuò)增是約50倍；(iii)在第21天培養(yǎng)時所述群中總細(xì)胞的所述活力為約85%；以及(iv)所述擴(kuò)增的群的活細(xì)胞的所述總數(shù)是約23XIO6個活細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選用于同種異體移植的擴(kuò)增的造血干細(xì)胞的方法和標(biāo)準(zhǔn)，所篩選的細(xì)胞群具有高移入幾率和積極的臨床結(jié)果。
文檔編號A61K35/44GK102317447SQ201080007315
公開日2012年1月11日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者多里特·哈拉蒂, 托尼·佩勒德 申請人:加米達(dá)細(xì)胞有限公司