專利名稱：制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型的制作方法
制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。主要涉及制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。
背景技術(shù)：
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenef ic protein，簡稱 BMP)是一種具有獨(dú)特誘導(dǎo)成骨功能的機(jī)體蛋白因子，在機(jī)體骨組織再生和修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可使斷骨快速再接，缺骨快速再生修復(fù)，在骨科和口腔科中具有廣泛和應(yīng)用前景。
目前，制備BMP有兩種方法一種是利用生化提取法直接從牛、馬、豬、羊、兔、鼠等畜牲骨或骨肉瘤中提取混合型BMP ；另一種是利用基因重組法合成單一型的人BMP?；蛑亟MBMP的誘骨或骨活性強(qiáng)，比生化提取法制備的BMP高10 3—106倍。BMP雖具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨活性，但植入人體時(shí)，吸收代謝快，作用時(shí)間短，難以充分發(fā)揮其誘導(dǎo)成骨效應(yīng)；， 另外，BMP在修復(fù)大尺寸骨缺損時(shí)無支架作用。因此，BMP在臨床應(yīng)用時(shí)還需要與某一載體材料復(fù)合，才以使其自身得到緩釋與支撐。
羥基磷灰石(Hydoxyapatite，簡稱HA)是磷酸鈣基生物陶瓷的一種，其化學(xué)式為 CalO (P04) 6 (OH) 2，它是構(gòu)成骨和牙的主要無機(jī)質(zhì)，植入人體后，可在其表面與骨和軟組織形成化學(xué)鍵合，具有良好的生物活性和生物相容性，是BMP理想的載體材料之一。將BMP與 HA復(fù)合，既有利于BMP誘導(dǎo)成骨效應(yīng)的充分發(fā)揮，又能使羥基磷灰石的骨修復(fù)作用得到加強(qiáng)。
在現(xiàn)有技術(shù)中，《材料科學(xué)技術(shù)百科金書》第742— 74 3頁報(bào)導(dǎo)了磷酸鈣基生物陶瓷與骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料及其制備方法。其制備方法是將BMP溶于4M的鹽酸胍中，再將多孔羥基磷灰石陶瓷顆粒置于BMP鹽酸胍溶液中，然后將混合物用去離子水透析，除盡鹽酸胍；透析后的混合物在容器中經(jīng)負(fù)壓抽干，再經(jīng)凍干后用環(huán)氧乙烷消毒，備用。
該制造方法并未詳細(xì)介紹其工藝流程及相應(yīng)的工藝參數(shù)，另一方面，該方法還存在如下不足之處即鹽酸胍的離子強(qiáng)度高，難以使。BMP在羥基磷灰石表面吸附，導(dǎo)致BMP吸附率低，這種復(fù)合型材料植入人體時(shí)，帶入的BMP量也少，BMP的積極效果得不到充分發(fā)揮。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)問題，提供一種制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。根據(jù)上述目的，本發(fā)明以尿素為媒體來實(shí)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石的良好復(fù)合，具體的藝步驟如下(1)將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶解于含有磷酸緩沖液的尿素中，形成含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的尿素溶液；磷酸緩沖液的濃度為5 — 50mM，酸堿度為PH6— 8，尿素的濃度為5 — 8M。
磷酸緩沖液的加入量(體積比)為尿素量的1_10%，骨形態(tài)發(fā)生蛋白加入尿素中的加入量為0. 01-0. 05mg / ml ； (2)將粒狀的羥基磷灰石加入上述步驟所形成的含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的尿素溶液中， 并在2 ο — 30°C溫度下攪拌后，靜置0. 5— 2小時(shí)；
羥基磷灰石的加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白尿素溶液中的加入量為0. 1-1. Og / ml ； 羥基磷灰石為顆粒狀，其粒度為50-500um。加入后進(jìn)行攪拌并靜置一定時(shí)間，是使骨形態(tài)發(fā)生蛋白盡可能的都吸附在羥基磷灰石顆粒的表面，提高吸附率。(3)將乙醇加入上述工藝所形成的含有羥基磷灰石和骨形態(tài)發(fā)生蛋白的尿素溶液中，混合均勻后，在-60--80°C，存置0. 5—2小時(shí)，隨后采用離心方法，去除溶液中的液體部分，獲得沉淀物。即表面吸附骨形態(tài)發(fā)生蛋白的羥基磷灰石。乙醇加入量為尿素溶液的的1. 5—3倍，加入乙醇的目的是為了加速骨形態(tài)發(fā)生蛋白從尿素溶液中的析出，然后附著或沉積在羥基磷灰石表面，進(jìn)一步提高吸附效率，
(4)將上述經(jīng)離心分離所得沉淀物用溫度為1-0°C的、濃度為85%的乙醇溶液沖洗2— 3遍，之后再用溫度為1-10°C、濃度100 %的乙醇沖洗一遍，并涼干，無菌保存，即成為本發(fā)明所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。兩次用不同的濃度的乙醇對(duì)沉淀物進(jìn)行沖洗，是為了將混沉淀物中的尿素完全沖洗掉。剩余的則為純凈骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、所制備的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石的復(fù)合劑型植入人體后，可使骨形態(tài)發(fā)生蛋白得到有效的緩釋，同時(shí)使骨的修復(fù)過程加快。實(shí)驗(yàn)顯示，術(shù)后7—21天就有大量新骨和軟骨形成，術(shù)后21后可見成熟骨和骨髓形成。2、尿素的離降強(qiáng)度低，使骨形態(tài)發(fā)生蛋白易于吸附在羥基磷灰石顆粒的表面，即 BMP吸附效率高，吸附量大，使BMP的作用得以充分發(fā)揮。
具體實(shí)施例方式
采用本發(fā)明所述的制造方法，制備了三批骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。首先將一定量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶解于含有磷酸緩沖液的尿素中， 接著在上述尿素溶液中加入粒狀的羥基磷灰石，經(jīng)進(jìn)行攪拌后在-60--80°C靜置一定時(shí)間，再離心分離，將溶液中的液體部分分離出去，得到沉淀物。最后將所得的沉淀物用不同濃度的乙醇沖洗兩次，并涼干，即得到骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。采用本發(fā)明所制備的BMP 與HA復(fù)合劑型用于由于骨囊腫造成的骨缺損，經(jīng)清理后，在骨缺損處充填該復(fù)合劑型，縫合，一個(gè)月后即基本愈合。
權(quán)利要求
1.制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型，其特征在于該方法包括如下工藝步驟(1)將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶解于含有磷酸緩沖液的尿素中，形成含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白尿素溶液；磷酸緩沖液的濃度為5 — 50mM，酸堿度為PH6— 8， 尿素的濃度為4一9M，磷酸緩沖液的加入量(體積比)為尿素量的1 一 10%， 骨形態(tài)發(fā)生蛋白加入尿素中的加入量為0. 01-0. 05mg / ml ；(2)將粒狀的羥基磷灰石加入上述步驟所形成的含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的尿素溶液中， 并在20-30°C溫度下攪拌，并靜置0. 5-2小時(shí)羥基磷灰石的加入量為尿素的0. 1-1. Og / ml ；(3)將乙醇加入上述工藝所形成的含有羥基磷灰石和骨形態(tài)發(fā)生蛋白的尿素溶液中， 混合均勻后，在-60--80°C存置0. 5—2小時(shí)，隨后采用離心方法，去除溶液中的液體部分， 獲沉淀物。其乙醇加入上述所得尿素溶液的加入量為尿素溶液的1. 5-3倍(體積比)；(4)將上述經(jīng)離心分離所得沉淀物用溫度為卜10°C的、濃度為85%的乙醇溶液沖洗 2—3遍，之后再用溫度為1-1 0°C、濃度1 00%的乙醇沖洗一遍，并涼干，無菌保存，即成為本發(fā)明所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型；(5)羥基磷灰石的粒度為50—500 u m。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。主要制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。本發(fā)明所述的方法首先是將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于含有磷酸緩沖液的尿素中，隨后將羥基磷灰石也加入其中，接著再加入乙醇，使骨形態(tài)發(fā)生蛋白從尿素溶液中析出，附著在羥基磷灰口顆粒的表面，經(jīng)離心分離，并清洗涼干后，獲得所需的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型。
文檔編號(hào)A61L27/54GK102475916SQ20101055344
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者王爽 申請(qǐng)人:大連創(chuàng)達(dá)技術(shù)交易市場有限公司