專利名稱：一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法
一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，研究、開發(fā)用于修復(fù)、增進(jìn)或改善人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的生物替代品的一門新興科學(xué)。它的核心內(nèi)容是體外三維細(xì)胞培養(yǎng)，基本方法是將細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與可降解生物材料相結(jié)合形成細(xì)胞——可降解生物材料復(fù)合體，用以替代受損組織器官。它具有形成具有生命力的活體組織，少量細(xì)胞修復(fù)大塊缺損，并可按組織、器官缺損情況任意塑型等特點(diǎn)。目前有報(bào)道，體外構(gòu)建組織工程化軟骨、皮膚已獲得成功，但組織工程化氣管替代品尤其是帶有完整上皮組織的氣管替代品尚未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法。本發(fā)明在體外構(gòu)建有上皮層和真皮層的上皮組織，所述的真皮層中包含由血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞)。并將之貼附于氣管替代品內(nèi)面，制備組織工程化氣管。本發(fā)明還可在組織工程化氣管外層包裹大網(wǎng)膜，制備成類似“三明治”結(jié)構(gòu)的氣管替代品。
完整的上皮組織是理想的氣管替代品所必須的，它可以阻止肉芽組織長入，防止管腔阻塞。而充足的血供是上皮組織存活的前提，正常氣管粘膜下層有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)。 正常組織再血管化主要有血管生成、血管發(fā)生兩種形式。血管生成即局部血管再生是指正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞通過降解血管基底膜，出芽生長進(jìn)入再生組織基質(zhì)，經(jīng)過增生形成毛細(xì)血管。血管發(fā)生則由骨髓中血管內(nèi)皮細(xì)胞在某些細(xì)胞因子刺激下游離至再生組織生成毛細(xì)血管。本發(fā)明同時(shí)利用上述兩種再血管化方法，短時(shí)間內(nèi)與受體血供再通，從而為組織工程化氣管上皮提供血供。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。先取患者皮膚標(biāo)本，分離培養(yǎng)表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞可由患者骨髓、脂肪組織以及取動(dòng)靜脈血管獲得。上述種子細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增至所需細(xì)胞量后，先將成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞混合接種于各類組織工程化皮膚支架材料上，構(gòu)建成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞——支架材料復(fù)合物。體外培養(yǎng)7-10 天后再于其表面接種表皮細(xì)胞，構(gòu)建組織工程化上皮組織。然后將所的組織工程化上皮組織貼附于各類人工氣管代用品內(nèi)側(cè)面，構(gòu)建組織工程化氣管替代患者氣管。
本發(fā)明組織工程化氣管具有如下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.組織工程化氣管內(nèi)層具有組織工程化上皮組織；2.組織工程化上皮組織，表皮層種植有上皮細(xì)胞(纖毛上皮細(xì)胞或鱗狀上皮細(xì)胞)，真皮層種植有成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞；3.組織工程化上皮組織真皮層中可加入VEGF、ECGF、BFGF等促血管生成因子，促進(jìn)豁膜下層毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，為上皮組織提供血供，防止上皮壞死肉芽組織增生；4.外層是各類氣管替代品，如組織工程管狀軟骨、人工合成材料氣管替代品等；5.組織工程化上皮組織中的支架材料包括脫細(xì)胞基質(zhì)等生物材料，和聚輕基乙酸( PGA )等各類人工合成材料。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
組織工程化上皮組織的構(gòu)建 1)分離與培養(yǎng)表皮角朊細(xì)胞取患者表皮修剪成寬l_2mm的條狀，無鈣鎂PBS漂洗兩次，表皮面朝上浸于0.5 % 中性蛋白酶(Dispase II)中4 0C過夜。將表皮從真皮上撕下后，剪碎，用0.05 %胰酶-0. 53mM EDTA在37 V消化20分鐘，IOml胰酶抑制劑終止消化。經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過濾、離心、計(jì)數(shù)后制成單細(xì)胞懸液，按3X 106/75cm2密度接種培養(yǎng)，無血清表皮細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBRO，USA)，另加牛垂體提取物和重組表皮細(xì)胞生長因子，在37 °C，5 % CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液3天換一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60-75 %密度融合時(shí)，經(jīng) 0. 05 %胰酶37 0C消化10分鐘，按1 3的比例傳代培養(yǎng)。
2 )真皮成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)分離消化將上述真皮碎塊，在0.2 %的膠原酶37 V消化2小時(shí)，經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，以1200r / min離心5分鐘，棄去上清，加入無鈣鎂PBS清洗3次。加入含10 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液IOml，混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。
原代培養(yǎng)計(jì)數(shù)后制成單細(xì)胞懸液，按1-2 X 106/75cm2密度接種培養(yǎng)，含10 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 °C，5 % CO2，100 %相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液3天換一次。當(dāng)細(xì)胞融合到60 % -75 %密度時(shí)，用IOml無鈣鎂PBS沖洗，經(jīng)0.25 %胰酶37 V消化5分鐘，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。棄去上清液，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 IOml，混勻，計(jì)數(shù)，按1 3的比例傳代培養(yǎng)。2-3日換一次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞融合至60 % "75 %密度時(shí)，再傳代培養(yǎng)。
3 )血管內(nèi)皮細(xì)胞提取(下述方法可單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用)骨髓來源血管內(nèi)皮細(xì)胞提取方法抽取骨髓5-10ml，PBS清洗，離心速度1 500g XlOmin。Ficoll 分離(5ml 細(xì)胞懸液+ Ficoll 5ml，離心速度 200g X25min )，提取有核細(xì)胞，PBS + EDTA清洗兩次。加入標(biāo)有磁珠的⑶31抗體6_12 V放置15min ； 每108細(xì)胞+ 5-10ccPBS清洗兩次。
MACS分離MS + / RS +柱，預(yù)先500ulPBS浸潤，細(xì)胞懸液過柱后PBS500ul 清洗濾柱3次。ImlPBS沖洗濾柱得⑶31 +細(xì)胞。
靜脈血管、動(dòng)脈血管來源血管內(nèi)皮細(xì)胞提取方法取靜脈血管、動(dòng)脈血管5-10CM，兩端結(jié)扎，管腔內(nèi)灌注經(jīng)0.25-0. 5 %胰酶或0.5 % 中性蛋白酶(Dispase II )，37°C, 5 % CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘，放開4一端，倒出內(nèi)容物，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。PBS清洗兩次。
脂肪組織來源血管內(nèi)皮細(xì)胞提取方法將抽取的脂肪組織移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。棄去上清液，加入含 10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液IOml，混勻。分離脂肪組織中毛細(xì)血管。0.25-0.5 % 胰酶或0.5 %中性蛋白酶(Dispase II)，37 0C , 5 % CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置 5-10分鐘。加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min 離心5分鐘。PBS清洗兩次。
4 )構(gòu)建組織工程化上皮組織收集體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞，將其接種于組織工程化皮膚支架材料上，接種密度IXlO5 -IO8。培養(yǎng)液3天換一次，培養(yǎng)7-10天后，按上述方法收集表皮細(xì)胞，將其接種在血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞一可降解支架材料復(fù)合物表面。一周后將復(fù)合物表面暴露，形成氣一液界面，促進(jìn)上皮細(xì)胞的進(jìn)一步角化。
構(gòu)建組織工程化氣管將按上述方法構(gòu)建的組織工程化皮膚卷曲成桶狀，放置于各種人造氣管替代品或組織工程化管狀軟骨內(nèi)側(cè)，并在管腔內(nèi)置金屬支架，使兩者緊密結(jié)合，構(gòu)建成類似“三明治”組織工程化氣管。
權(quán)利要求
1.一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法，由組織工程化上皮組織和氣管支架替代品構(gòu)成，其特征在于(1)上皮組織由支架材料和種子細(xì)胞所構(gòu)成；(2)上皮組織包含表皮層和真皮層；(3)上皮組織支架材料包括生物材料和人工合成材料；(4)上皮組織支架材料是脫細(xì)胞基質(zhì)；(5)上皮組織支架材料是豬真皮脫細(xì)胞基質(zhì)；(6)上皮組織種子細(xì)胞包含成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角朊細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法，其特征是所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞提取自骨髓，或靜脈血管、或動(dòng)脈血管、或脂肪組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法，其特征是所述真皮層包含血管內(nèi)皮細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法，其特征是所述血管內(nèi)皮細(xì)胞用于黏膜下毛細(xì)血管網(wǎng)的重建。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種體外構(gòu)建的氣管替代品及其制備方法。本發(fā)明體外構(gòu)建組織工程化上皮組織，并將之種植于氣管替代品內(nèi)側(cè)面，制成組織工程化氣管。本發(fā)明利用各種來源血管內(nèi)皮細(xì)胞重建組織工程化上皮組織真皮層毛細(xì)血管網(wǎng)，同時(shí)利用兩種再血管化方法，短時(shí)間內(nèi)與受體血供再通，從而為組織工程化氣管上皮提供血供。本發(fā)明解決氣管替代品上皮化這一難題。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102475911SQ20101055343
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者杜沖 申請人:大連創(chuàng)達(dá)技術(shù)交易市場有限公司