專利名稱：一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活疫苗免疫效能的佐劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及仙臺病毒囊膜(HVJ-E)作為免 疫佐劑的制備及應(yīng)用，尤其涉及到仙臺病毒囊膜作為豬繁殖與呼吸道障礙綜合征病毒滅活 疫苗免疫佐劑。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸道障礙綜合征(porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)自1987年在美國發(fā)生以來，以引起母豬流產(chǎn)、弱產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎以及所 有年齡豬的呼吸道障礙為主要癥狀，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。以中國為例，每年因 豬呼吸道與繁殖障礙綜合征造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)200多億元。PRRS的病原為豬繁殖與呼吸障 礙綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV在國際病毒分類委員會(huì)第六次會(huì)議報(bào)告中歸屬于冠狀病毒 科動(dòng)脈炎病毒屬，系正股單股RNA病毒，有囊膜，可分為兩個(gè)亞群，A亞群為歐洲型；B亞群為 美洲型，目前，我國所分離獲得的毒株大多屬于美洲型。目前用于預(yù)防PRRS的疫苗主要是滅活苗和弱毒苗。滅活苗在我國使用范圍廣，其 優(yōu)點(diǎn)是安全性好，缺點(diǎn)是免疫劑量大、免疫次數(shù)多、免疫產(chǎn)生期較長。由于PRRS滅活苗產(chǎn)生 抗體尤其是中和抗體速度較慢，而且滅活疫苗幾乎不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的產(chǎn)生，因此臨床上 常常會(huì)出現(xiàn)因接種滅活苗產(chǎn)生非特異性抗體而加速發(fā)病的報(bào)道，這主要是因?yàn)镻RRSV的抗 體依賴增強(qiáng)效應(yīng)(Antibody dependent effect，ADE)所引起。因此，研究有效提高PRRS滅 活苗免疫效能的免疫佐劑迫在眉睫。仙臺病毒(Hemagglutinating virus of Japan, HVJ)屬副粘病毒科，呼吸道病毒 屬，單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長15384bp，編碼核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、 融合蛋白(F)、血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)6種結(jié)構(gòu)蛋白和一些非結(jié)構(gòu)蛋 白。HVJ是細(xì)胞質(zhì)型單股負(fù)鏈RNA病毒，現(xiàn)已證實(shí)滅活的仙臺病毒囊膜(Hemagglutinating virus of Japan envelope，HVJ-E)仍可經(jīng)維甲酸基因誘導(dǎo)I型受體識別途徑激活樹突狀細(xì) 胞，激活天然免疫和獲得性免疫，刺激DC產(chǎn)生IL-12、IL-6、IFN- β和TNF- α等細(xì)胞因子， 其中IL-6尤為關(guān)鍵，它能抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)的活化，促進(jìn)CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖，阻止IL-10、TGF-i3等免疫抑制性細(xì)胞因子的分泌，此外，體內(nèi)注射HVJ-E后還 可誘導(dǎo)局部CXCL10的表達(dá)并全面激活NK細(xì)胞。因此，HVJ-E具備了全面提高自身免疫力 的潛能，并在抗腫瘤研究中發(fā)揮了重要的作用。目前，免疫佐劑的研究是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，然而以HVJ-E作為免疫佐劑的研究 尚未見報(bào)道，基于這一事實(shí)現(xiàn)狀，本發(fā)明采用HVJ-E作為新型免疫佐劑，觀察到其不僅能促 進(jìn)動(dòng)物抗PRRSV抗體水平的提高，還能高效誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕動(dòng)物接受強(qiáng)毒攻擊 后的臨床癥狀，減少動(dòng)物病毒血癥的產(chǎn)生和病毒排泄時(shí)間和數(shù)量。這一技術(shù)可以用于動(dòng)物 疫苗的制備，尤其是豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活苗的制備和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上缺陷，本發(fā)明提供了一種能提高PRRSV滅活苗免疫效能的免疫佐劑。本發(fā)明還提供了一種能提高PRRSV滅活苗免疫效能的HVJ-E免疫佐劑的制備方法。本發(fā)明還提供了含所述HVJ-E的藥物組合物。本發(fā)明還提供了所述HVJ-E在提高PRRS滅活苗免疫效能中的用途。一方面，本發(fā)明提供了一種可用于提高PRRSV滅活苗免疫效能的HVJ-E佐劑，其中 所述HVJ-E為經(jīng)HVJ接種10日齡SPF雞胚后經(jīng)紫外線滅活而成。本發(fā)明制備HVJ-E免疫佐劑的步驟如下第一步HVJ繁殖用含青鏈霉素雙抗的PBS溶液稀釋種毒1000倍，接種雞胚絨 毛尿囊膜腔，72h后，收集雞胚尿囊液。第二步HVJ濃縮PEG6000 濃縮 HVJ。第三步HVJ粒子計(jì)算以血凝試驗(yàn)測量仙臺病毒的效價(jià)，根據(jù)仙臺病毒的血凝價(jià) 和IHAU(血凝價(jià)單位) 3X IO6的公式推算出純化的仙臺病毒的粒子數(shù)。第四步HVJ-E的制備用紫外線滅活HVJ，形成HVJ-E。另一方面，本發(fā)明提供了包括HVJ-E免疫佐劑和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合 物，該組合物可用于提高PRRSV滅活苗的免疫效能。其中所述的藥物學(xué)上可接受的載體可以是本領(lǐng)域配制藥物組合物常用任一種稀 釋劑、溶劑或賦形劑，包括但不限于葡萄糖注射液、滅菌重蒸水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液 (PBS)及磷酸鈉緩沖液，優(yōu)選為PBS。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明所述的 HVJ-E溶于PBS注射液。本發(fā)明對所述HVJ-E對提高PRRSV滅活苗接種仔豬后抗體水平和細(xì)胞因子分泌量 等進(jìn)行了研究。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以PRRSV陰性豬為研究對象，同時(shí)肌肉注射本發(fā)明 的HVJ-E和PRRS滅活苗進(jìn)行免疫(同時(shí)注射相應(yīng)劑量的滅活苗作為對照)。收集免疫前和 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)(例如免疫前0天和免疫后7、14、21和28天)的外周血，通過外周血單 核淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ELISA檢測，詳細(xì)研究了 PRRSV陰性豬經(jīng)免疫后血清中抗PRRSV抗體 的水平及細(xì)胞因子的變化情況。免疫28天后，對免疫豬進(jìn)行攻毒，收集攻毒前后不同時(shí)間 點(diǎn)(攻毒前0天、攻毒后3、7、14和21天)的外周血和鼻腔分泌物，通過RT-PCR研究了實(shí) 驗(yàn)豬在強(qiáng)毒攻擊后的排毒及病毒血癥情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的HVJ-E可加速抗PRRSV 抗體的產(chǎn)生；促進(jìn)IL-6和IFN-Y的產(chǎn)生和釋放，抑制IL-4的產(chǎn)生，提高了機(jī)體的免疫力； 攻毒后，HVJ-E能顯著改善攻擊后實(shí)驗(yàn)豬的臨床癥狀，降低實(shí)驗(yàn)豬產(chǎn)生病毒血癥并減少病毒 的排泄，因而本發(fā)明的HVJ-E在提前誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和提高細(xì)胞因子產(chǎn)生水平等方面有顯著 的保護(hù)作用，并能有效減輕強(qiáng)毒攻擊所帶來的發(fā)熱、病毒血癥和排毒等癥狀。該試驗(yàn)結(jié)果 證實(shí)了本發(fā)明的HVJ-E對PRRS滅活苗免疫增強(qiáng)保護(hù)作用，促進(jìn)了生豬生產(chǎn)性能提高，并能 有效避免現(xiàn)常用佐劑中造成的炎癥反應(yīng)等不良副作用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜 合征滅活疫苗免疫效能的佐劑，用仙臺病毒制備仙臺病毒囊膜，作為免疫佐劑。本發(fā)明所述的病毒包括如下毒株
Fushimi 株，Aritsugn 株，MN 株，Z 株，BBl 株，TianJin 株。所述的毒株用于制備動(dòng)物免疫佐劑，尤其是豬繁殖與呼吸障礙綜合征滅活苗的免 疫佐劑。本發(fā)明所述的制備方法包括如下步驟1)制備含仙臺病毒的雞胚尿囊液；2)將步驟1)中制備的尿囊液經(jīng)PEG6000濃縮后，以20%蔗糖墊底，20000r/min離 心2h ；3)收集沉淀，PBS洗滌沉淀，20000r/min再次離心2h去除蔗糖；4)收集沉淀，懸浮于無熱原生理鹽水中；5)以99mJ/cm2的紫外線強(qiáng)度滅活收集的仙臺病毒2h ；6)滅活的仙臺病毒命名為仙臺病毒囊膜，將仙臺病毒囊膜接種9日齡SPF雞胚， 72h后，收集雞胚尿囊液，測定尿囊液的血凝價(jià)。所述的滅活方法為99mJ/cm2的紫外線滅活2h。采用以上技術(shù)方案后，本發(fā)明的優(yōu)勢之處在于1.本發(fā)明所述的HVJ-E及含HVJ-E的藥物組合物能夠激發(fā)受試者的非特異性和特 異性免疫力，增強(qiáng)受試者自身的抵抗能力，因而對不同病原微生物具有廣譜抵抗作用，可用 于提高疫苗的免疫效果，具有適用范圍廣的特點(diǎn)。2.與其他佐劑相比，本發(fā)明所述的HVJ-E及含HVJ-E的藥物組合物不具備感染 性，具有安全性高和副作用小的特點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。圖1. pCpG誘導(dǎo)PRRSV特異性的PBMC反應(yīng)。圖2.免疫后第14天與第28天細(xì)胞因子IFN- γ，IL-6的表達(dá)情況。圖3. ELISA法檢測免疫和攻毒后PRRSV特異性抗體水平。圖4.攻毒后豬的平均直腸體溫。圖5.攻毒后各組豬的體重增加情況。
具體實(shí)施例方式如圖所示，一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活疫苗免疫效能的佐劑，用仙 臺病毒制備仙臺病毒囊膜，作為免疫佐劑。本發(fā)明所述的病毒包括如下毒株Fushimi 株，Aritsugn 株，MN 株，Z 株，BBl 株，TianJin 株。所述的毒株用于制備動(dòng)物免疫佐劑，尤其是豬繁殖與呼吸障礙綜合征滅活苗的免 疫佐劑。本發(fā)明所述的制備方法包括如下步驟1)制備含仙臺病毒的雞胚尿囊液；2)將步驟1)中制備的尿囊液經(jīng)PEG6000濃縮后，以20%蔗糖墊底，20000r/min離 心2h ；
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3)收集沉淀，PBS洗滌沉淀，20000r/min再次離心2h去除蔗糖；4)收集沉淀，懸浮于無熱原生理鹽水中；5)以99mJ/cm2的紫外線強(qiáng)度滅活收集的仙臺病毒2h ；6)滅活的仙臺病毒命名為仙臺病毒囊膜，將仙臺病毒囊膜接種9日齡SPF雞胚， 72h后，收集雞胚尿囊液，測定尿囊液的血凝價(jià)。所述的滅活方法為99mJ/cm2的紫外線滅活2h。實(shí)施例1. HVJ-E的制備1. HVJ的繁殖從-70°C冰箱中取一支凍存的HVJ毒種(Z株)，于冰上緩慢溶解， 待溶解后，以2000r/min離心lOmin，收集上清液。收集的上清液用含100U/ml青霉素和 0. lmg/ml鏈霉素等的PBS溶液稀釋1000倍，用一次性無菌注射器吸取100 μ L稀釋的病毒 也接種于10日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜腔。24h后觀察雞胚死亡情況，棄去24h內(nèi)死亡的SPF 雞胚。72h后，無菌收集雞胚尿囊液。2. HVJ的濃縮將收集的尿囊液經(jīng)IOOOOrpm離心Ih去除尿囊液中的雜質(zhì)，收集 去除雜質(zhì)后的雞胚尿囊液，裝入透析袋并置于含PEG 6000的燒杯中進(jìn)行濃縮，收集濃縮尿 囊液緩慢加于20 %蔗糖溶液表面，20000rpm離心2h，棄去上清，收集沉淀，PBS重懸沉淀， 20000rpm離心2h收集病毒并去除蔗糖。3. HVJ病毒粒子計(jì)算以血凝試驗(yàn)測量仙臺病毒的效價(jià)。具體步驟為(1)用微量進(jìn)樣器向96孔“V”型板每孔加0. 05ml生理鹽水，共加24孔。(2)用微量進(jìn)樣器向“V”型板每排第一孔加0. 05ml仙臺病毒，然后做倍比稀釋，稀 釋至第23孔后棄去，最后一孔不加病毒作為對照孔。(3)用微量進(jìn)樣器于各孔中加入(V/V)雞紅細(xì)胞。(4)將V型凝集板在震蕩器上震蕩1-2分鐘后，室溫(20_25°C )靜置15_30分鐘 后判斷結(jié)果。(5)根據(jù)仙臺病毒的血凝價(jià)和IHAU(血凝價(jià)單位)=3X IO6HVJ病毒粒子的公式 推算出純化的仙臺病毒的粒子數(shù)。4. HVJ-E的制備將仙臺病毒溶液懸浮于無熱原的PBS，均勻鋪放于IOcm平皿中 并置于紫外透射儀下。以99mJ/cm2的紫外線照射仙臺病毒溶液2h。將滅活后的仙臺病毒 (HVJ-E)用含青鏈霉素雙抗的PBS溶液稀釋1000倍，接種100 μ L于SPF雞胚絨毛尿囊膜， 72h后收集尿囊液，檢測血凝價(jià)，判斷HVJ-E的感染性。所制備的HVJ-E接種雞胚后，其尿囊 液不能夠凝集雞的紅細(xì)胞，失去感染性，具有很好的生物安全性。實(shí)施例2. HVJ-E增強(qiáng)豬繁殖與障礙綜合征病毒滅活苗免疫效果的研究1.試劑培養(yǎng)基(RPMI-1640)，刀豆球蛋白A(ConA)，聚乙烯亞胺(PEI，25kDa)，MTT (購自 Sigma公司)；胎牛血清(購自Hyclone) ；PRRSV抗體檢測試劑盒(購自IDEXX公司)；豬 IFN-Y 免疫試劑盒(購自 Invitrogen International Inc.)豬 IL-10 和 IL-12 免疫試劑 盒(購自R&D International Inc.)，含有肝素鋰抗凝劑的真空抽血管為湖南醫(yī)藥公司產(chǎn) 品，96 孔板(購自 Corning Co. LTD.) Ficoll-Paque (購自 DingGuo Biotech), DNA/RNA 抽 提試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒均購自TAKARA公司。2.試驗(yàn)方法
選取15頭斷奶仔豬，采集血清，事先用豬PRRS抗體檢測試劑盒(IDEXX，美 國)檢測，結(jié)果表明所有試驗(yàn)豬的血清中均無抗PRRSV抗體，同時(shí)經(jīng)RT-PCR檢測(上 游引物5 ‘ -GAGTTTCAGCGGAACAATGG-3,下游引物5 ‘ -GCCGTTGACCGTAGTGGAG-3 ‘)， 均為PRRSV陰性，另外，進(jìn)行了豬瘟病毒(上游引物5 ‘ -AACATGGATGGTGTAACTGGT-3， 下游引物5 ‘ -TTCTCTATAGTGTTGGTCATTCC-3 ‘)、豬圓環(huán)病毒2型(上游引物 5 ‘ —CGAGAAAGCGAAAGGAACAGA-3 ‘，下游弓丨物5 ‘ -GGTAACCATCCCACCACTT-3 ‘) 和豬細(xì)小病毒(上游引物5 ‘ -AGTTAGAATAGGATGCCGAGGAA-3 ‘，下游引物 5' -AGAGTCTGTTGGTGTATTTATTGG-3‘)的PCR檢測，結(jié)果均為陰性。將仔豬隨機(jī)分為3組 全劑量PRRSV滅活苗對照組、HVJ-E+全劑量滅活苗組和PBS對照組，每組5頭豬。免疫前，前腔靜脈采血。PBS對照組每頭豬于耳后頸部肌肉注射2ml PBS(pH 7.2)； 全劑量滅活苗對照組每頭豬于相同位置肌內(nèi)注射等體積的PRRSV滅活苗，實(shí)驗(yàn)組(HVJ-E+ 全劑量滅活苗組)注射含本發(fā)明所述的含1X IO6病毒樣粒子HVJ-E的PBS緩沖液，總體積 為2ml。然后于免疫后1周、2周、3周和4周分別于前腔靜脈采血，分離血清。測量外周血 單核淋巴細(xì)胞增殖情況、血清中細(xì)胞因子含量和抗PRRSV抗體效價(jià)。免疫4周后，用PRRSV強(qiáng)毒株(JXAl)進(jìn)行攻毒，每頭豬于頸部肌肉注射 10_4 5TCID50的強(qiáng)毒株，每頭豬注射2ml。攻毒后，每天測量豬的體溫，觀察豬的行為，并于攻 毒后3天、1周、2周和3周前腔靜脈采血，分離血清用于病毒血癥檢測；同時(shí)采集鼻粘膜棉 拭，用于檢測PRRSV的排毒情況，3.試驗(yàn)結(jié)果與討論 3. IpCpG誘導(dǎo)PRRSV特異性的PBMC反應(yīng)參見圖1 :MTT法檢測HVJ-E介導(dǎo)的外周淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果表明PRRSV滅活 疫苗組與PBS組的外周淋巴細(xì)胞增殖沒有明顯差異，而HVJ-E+PRRSV滅活疫苗組免疫后第 14天和28天的淋巴細(xì)胞增殖則明顯高于PRRSV滅活疫苗組與PBS組(ρ < 0. 05)，免疫后 第14天的刺激指數(shù)(Si)要高于攻毒后第28天的Si，但二者間無明顯差異。3. 2HVJ-E促進(jìn)I3RRS滅活苗抗體水平的產(chǎn)生參見圖2 各實(shí)驗(yàn)組和對照組免疫后，前腔靜脈采血分離血清，血清中的抗PRRSV 抗體經(jīng)試劑盒檢測后的結(jié)果，從圖2中可以看出，仔豬經(jīng)HVJ-E和全劑量PRRSV滅活苗共同 免疫后，抗體水平大幅最高，并于28天內(nèi)一直呈現(xiàn)上升趨勢，與全劑量滅活疫苗組相比，差 異顯著(P < 0. 05)。該試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的HVJ-E可有效提高疫苗的免疫效果。免疫 28天后，用PRRSV強(qiáng)毒株(JXAl)攻擊，并于攻毒后3天，1周、2周和3周采血，測量血清中 抗PRRSV抗體水平，結(jié)果表明，HVJ-E和全劑量PRRS滅活苗免疫組的抗體水平在攻毒后呈 下降趨勢，提示在攻毒時(shí)已經(jīng)產(chǎn)生了中和抗體，中和抗體對攻擊強(qiáng)毒株進(jìn)行了中和，造成了 血清中的抗體ELISA效價(jià)下降，而單獨(dú)全劑量滅活苗免疫組的抗體水平呈現(xiàn)上升趨勢，證 明在攻毒時(shí)，單獨(dú)滅活苗免疫組并未產(chǎn)生中和抗體。PBS對照組于攻毒前始終表現(xiàn)為ELISA 抗體陰性，而攻毒后抗體效價(jià)迅速上升，提示了機(jī)體急性感染后的自身保護(hù)作用開始發(fā)揮。 總之，從該結(jié)果可以判斷出HVJ-E可提前誘導(dǎo)免疫豬中和抗體的產(chǎn)生，有效地保護(hù)免疫動(dòng) 物免受病毒侵害。3. 3細(xì)胞因子測定結(jié)果參見圖3 :IL-6和IFN- γ參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能夠促進(jìn)吞噬細(xì)胞及血液
7中分泌IgG細(xì)胞的循環(huán)，刺激Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒及殺菌作用。 ELISA測定血清中細(xì)胞因子的結(jié)果。如圖3所示，仔豬經(jīng)HVJ-E和全劑量PRRS滅活苗共同 免疫后，其血清中細(xì)胞因子含量IL-6和IFN-Y大幅升高，與全劑量滅活苗組相比，差異顯 著(P <0. 05)，全劑量滅活疫苗組和PBS免疫組產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平相當(dāng)，二者間無顯著差 異。本實(shí)施例試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的HVJ-E通過刺激機(jī)體產(chǎn)生了高水平的IL-6和IFN-γ， 對調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)起著至關(guān)重要的作用，其中IFN-Y是非常好的抗病毒制劑，而IL-6則 能抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的，促進(jìn)Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，充分說明了 IL-6和IFN-Y在在抗 PRRSV感染的過程中發(fā)揮著非常重要的作用，這也從臨床結(jié)果中得到了證實(shí)。3. 4攻毒后的臨床觀察結(jié)果攻毒后，對各組試驗(yàn)豬進(jìn)行臨床打分，打分結(jié)果見表1，從中可以看出本發(fā)明的 HVJ-E可顯著地提高仔豬的存活率，有效改善強(qiáng)毒攻擊后的臨床表現(xiàn)。PBS對照組的5頭豬 經(jīng)攻毒后全部死亡，而添加含HVJ-E的全劑量滅活疫苗免疫組則全部存活。全劑量滅活疫 苗單獨(dú)免疫組在攻毒后21天存活3頭。表1.攻毒后的臨床表現(xiàn)打分
權(quán)利要求
一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活疫苗免疫效能的佐劑，用仙臺病毒制備仙臺病毒囊膜，作為免疫佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活疫苗免疫效能的 佐劑，其特征在于所述的病毒包括如下毒株Fushimi 株，Aritsugn 株，MN 株，Z 株，BB1 株，Tianjin 株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活疫苗免疫效能的 佐劑，其特征在于所述的毒株用于制備動(dòng)物免疫佐劑，尤其是豬繁殖與呼吸障礙綜合征滅 活苗的免疫佐劑。
4.一種制備仙臺病毒囊膜的方法，該制備方法包括如下步驟1)制備含仙臺病毒的雞胚尿囊液；2)將步驟1)中制備的尿囊液經(jīng)PEG6000濃縮后，以20%蔗糖墊底，20000r/min離心2h ；3)收集沉淀，PBS洗滌沉淀，20000r/min再次離心2h去除蔗糖；4)收集沉淀，懸浮于無熱原生理鹽水中；5)以99mJ/cm2的紫外線強(qiáng)度滅活收集的仙臺病毒2h；6)滅活的仙臺病毒命名為仙臺病毒囊膜，將仙臺病毒囊膜接種9日齡SPF雞胚，72h 后，收集雞胚尿囊液，測定尿囊液的血凝價(jià)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備仙臺病毒囊膜的方法，其特征在于所述的滅活方法 為99mJ/cm2的紫外線滅活2h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高豬繁殖與呼吸道障礙綜合征滅活疫苗免疫效能的佐劑及其制備方法和用途，其涉及仙臺病毒囊膜(HVJ-E)的制備方法和步驟，以及增強(qiáng)PRRSV滅活苗免疫效能的藥物用途。它是用SPF雞胚繁殖仙臺病毒(HVJ)，然后將病毒進(jìn)行濃縮、純化、計(jì)數(shù)及滅活制備仙臺病毒囊膜(HVJ-E)。將HVJ-E與PRRSV滅活苗共同免疫PRRSV陰性豬，同時(shí)設(shè)PBS對照組及PRRSV滅活苗組，與對照組相比，HVJ-E與PRRSV滅活苗免疫組能顯著提高免疫豬的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。免疫后，用PRRSV強(qiáng)毒株(JXA1)進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明，與對照組相比，HVJ-E與PRRSV滅活苗免疫組的臨床表現(xiàn)及體重增加均優(yōu)于對照組，且產(chǎn)生的病毒血癥率、排毒率及病毒分布率均明顯下降。本發(fā)明生產(chǎn)方便，價(jià)格低廉、適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61K39/39GK101940787SQ20101027082
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者左偉勇, 張泉, 徐向明, 成大榮, 朱善元, 楊海峰, 洪偉鳴, 王健, 王安平, 王永娟, 秦楓, 蔣春茂, 郁杰, 黃文強(qiáng) 申請人:朱善元;張泉;徐向明