專利名稱：一種特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽及其篩選方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽及通過篩選獲得該 多肽的方法，屬動物病毒學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)引起豬的一種 傳染性疾病，其癥狀主要特點為懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或木乃伊胎等嚴重的繁殖障 礙，仔豬與育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀。我國于1995年底暴發(fā)此病，目前此病已成為危害我國 養(yǎng)豬業(yè)的最主要疫病。人們對PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的功能、病毒的致病機制、病毒 的持續(xù)感染機制、機體對病毒的免疫機制等進行了深入的研究。PRRSV感染豬體的巨噬細胞 系統(tǒng)，引起機體的細胞免疫功能低下，而體液免疫產(chǎn)生的高水平抗體不但不能中和病毒，在 一定程度上還加深了病毒的感染。本病尚無特效治療藥物，在臨床上只能采取防止繼發(fā)感 染和降溫及補充能量與營養(yǎng)等輔助治療。噬菌體展示技術(shù)是一種用于篩選功能性多肽的生物技術(shù)。Smith于1985年首次成 功將外源基因通過基因工程手段插入絲狀噬菌體基因組中，使表達的外源肽或蛋白與噬菌 體外殼蛋白一起展示在噬菌體表面，從而建立了噬菌體展示技術(shù)。用抗原去淘洗抗體或隨 機多肽構(gòu)成的噬菌體展示文庫，根據(jù)抗原-抗體反應原理，可以將與抗原緊密結(jié)合的抗體 或多肽片段篩選出來。目前，利用多克隆抗體進行間接免疫熒光檢測PRRSV，操作步驟繁瑣，特異性不強， 靈敏度不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽、篩選該多肽的方 法和該多肽的應用。本發(fā)明提供一種能與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列 如下His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser本發(fā)明還提供所述特異性結(jié)合多肽的篩選方法，包括如下步驟(1)純化PRRSV獲得純病毒；然后進行噬菌體隨機肽庫篩選，通過三輪篩選富集能 與PRRSV特異性結(jié)合的噬菌體。(2)將第三輪篩選產(chǎn)物稀釋后鋪平皿，挑取各噬菌體單克隆進行ELISA鑒定，篩選 出能與rassv有很高的親和力的噬菌體單克隆，并測出噬菌體單克隆的序列。(3)檢測由步驟(2)所得各序列的噬菌體單克隆對PRRSV的抑制能力，選取能明顯 抑制PRRSV復制的噬菌體單克隆，展示于該噬菌體單克隆表面的多肽即為能與特異性結(jié)合 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)的多肽。
所述的多肽在豬繁殖與呼吸綜合癥病毒檢測中的應用，優(yōu)選方案是，將所述多肽 采用FITC進行標記，然后應用于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的檢測。綜上所述，本發(fā)明通過篩選噬菌體隨機12肽庫，得到能特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸 綜合癥病毒的噬菌體，再從該噬菌體中篩選出能夠抑制病毒復制的噬菌體單克隆，該噬菌 體展示的多肽即能高效檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒。本發(fā)明采用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得可特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的 多肽，該方法周期短，操作簡單，與目前采用制作單克隆抗體的方法相比，更為方便，快捷； 篩選到的多肽能夠特異性的結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，用于檢測PRRSV，操作簡單，具 有高特異性和很高的靈敏度。


圖1表示噬菌體與PRRSV結(jié)合特異性ELISA檢測結(jié)果；圖2為FITC標記的多肽檢測PRRSV的圖示。
具體實施例方式實旅例1篩選與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒特異性結(jié)合的噬菌體1.PRRSV病毒的純化細胞方瓶中培養(yǎng)Marc-145細胞，37°C培養(yǎng)36小時加入PRRSV液500yL，用2% (ν/ ν)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(美國Gibcol公司)在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，出現(xiàn)典型病 變時，將培養(yǎng)病毒-20°C凍存。將凍存的PRRSV培養(yǎng)細胞反復凍融3次，5000轉(zhuǎn)離心10分 鐘，取上清，向其中加入10% (10g/100mL)的PEG-8000 (Sigma公司)4°C過夜。14000轉(zhuǎn)離 心20分鐘沉淀PRRSV。沉淀懸于PBS緩沖液得到PRRSV懸液，-80°C保存，留作病毒TCID5tl 測定。用NTE緩沖液制備蔗糖梯度(30%、45%、60% )，將PRRSV懸液緩慢加入梯度上面， 35000轉(zhuǎn)(L902K超高速離心機，美國Beck-man) 4°C，離心3小時，吸取45%至60%之間的 可見區(qū)帶，-80°C速凍保存。蔗糖梯度離心所得的PRRSV懸液，用PBS透析去蔗糖，PEG20000 濃縮，獲得純病毒，分裝到1. 5mL離心管，-80°C保存。采用紫外分光法，測定樣品蛋白濃度。2.噬菌體隨機肽庫篩選 2. 1第一輪篩選——PRRSV篩選噬菌體隨機肽庫 在150 μ L包被液中加入2 μ L純病毒，包被96孔酶標板，置于潮濕環(huán)境中于4°C過 夜。次日傾去包被液，每孔加入200 μ L濃度為lOmg/mL的BSA封閉液，37°C封閉2小時。傾 去封閉液，用 TBST (TBS+0. (v/v) Tween-20)洗滌 6 次，加入 1. 5 X IO11 個(100 μ L TBST 中)噬菌體(Ph. D.-12 Phage Display P印tide Library Kit，購自 NewEngland Biolabs 公司)，37°C反應60分鐘。傾去噬菌體，用TBST洗10次，加入100 μ L洗脫液，輕搖洗脫至 多10分鐘，將洗脫物轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中，立刻加入15 μ L濃度為IM的Tris-HCl (ρΗ9· 1) 中和，即為第一輪洗脫產(chǎn)物(篩選產(chǎn)物)。取10 μ L洗脫產(chǎn)物進行滴度測定，剩余洗脫物加 入 20mL 對數(shù)生長早期(OD600 0.3)的宿主菌 ER2738 (Ph. D.-12 Phage Display Peptide Library Kit，購自 New England Biolabs 公司)中，37°C 培養(yǎng) 4. 5 小時，10000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取上清，再離心一次，取80%上清至50mL離心管中，加入1/6體積PEG-NaCl，4°C沉淀 過夜。次日10000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取沉淀，用ImLTBS懸浮，轉(zhuǎn)到1. 5mL離心管中，離心5分鐘去掉殘余的細胞碎片，將上清轉(zhuǎn)至一新管中，加1/6體積PEG-NaCl沉淀1小時，離心1分 鐘，取沉淀，用200yL TBS,0. 02% (質(zhì)量濃度)NaN3懸浮，離心1分鐘去掉未溶的殘渣，將 上清轉(zhuǎn)至一新管中，即為第一輪洗脫產(chǎn)物的擴增液。2. 2噬菌體滴度測定將步驟2. 1獲得的第一輪洗脫產(chǎn)物的擴增液做10_8 10_"(洗脫產(chǎn)物ICT1到10_4) 四個連續(xù)10倍稀釋后，取10 μ L加入到200 μ L過夜培養(yǎng)的ER2738宿主菌，室溫作用5分 鐘，然后加入到3mL 60°C預熱的頂瓊脂中，快速鋪于LB/IPTG/X-gal平皿上，37°C培養(yǎng)過 夜，對藍斑進行記數(shù)，算出噬菌體滴度。2. 3進一步篩選重復步驟2. 1和2. 2的方法再進行兩輪篩選，每次的篩選對象為上一輪洗脫產(chǎn) 物或其擴增液，所用噬菌體含量為1.5X IO11PFU(利用噬菌體滴度算出所需擴增產(chǎn)物的體 積)，但是將篩選過程中用到的TBST中Tween-20的含量提高到0. 5% (ν/ν)。第三輪篩選 產(chǎn)物不做擴增，直接測定滴度，挑選單克隆用于ELISA鑒定。噬菌體隨機肽庫篩選結(jié)果如下表
輪次 PRRSV(ug)投入(PFU)產(chǎn)出(PFU)產(chǎn)出/投入~
7.5χ1010 8-ΟχΙΟ4 1.06x10"6 1.5xl0n 2.4xl06 1.60χ10"5 1.5x10"_8.7xl07_5.8QxlO'4_上表表示，三輪篩選的靶分子(PRRSV)的用量從30 μ g降低到1 μ g，而所得噬菌體 的產(chǎn)出與投入比例卻從10_6量級提高到10_4量級，說明通過篩選有效地富集了針對PRRSV 特異性結(jié)合的噬菌體。本實施例中所采用的試劑配方如下
包被液0. IM 的 NaHCO3 (ρΗ8· 6)溶液。封閉液0.IM 的 NaHCO3 (ρΗ8· 6)溶液，其中含有 5mg/mL BSA, 0. 02 % NaN3,過濾除 菌，4°C保存。TBS :50mM 的 Tris-HCl (pH7. 5)緩沖液，其中含有濃度為 150mM 的 NaCl，121°C 高溫 滅菌30分鐘，室溫(25 °C )保存。洗脫液0. 2M的甘氮酸-鹽酸(pH2. 2)緩沖液。PEG-NaCl 濃度為2. 5M的NaCl溶液，含有濃度為20% (w/v)的聚乙二醇8000， 121 °C高溫滅菌30分鐘，室溫(25 °C )保存。LB培養(yǎng)基10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，加水至1L，121 °C高溫滅菌30 分鐘，室溫(25 0C )保存。LB/IPTG/X-gal平皿在LB培養(yǎng)基中添加瓊脂粉至濃度為15g/L，121°C高溫滅菌 30分鐘，冷卻到< 70°C，加入IPTG和X-gal使IPTG終濃度為0. 05mg/mL, Χ-gal終濃度為 0. 04mg/mL。4°C 避光保存。頂瓊脂(AgaroseTop) :10g 胰化蛋白胨，5g 酵母提取物，5g NaCl, IgMgCl · 6H20， 7g瓊脂糖。121°C高溫滅菌30分鐘，室溫(25 °C )保存。NTE 緩沖液:50mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 5)，含有 150mmol/L 的 NaCl， lmmol/L 的 EDTA。
實施例2篩選到的噬菌體與PRRSV結(jié)合特性的鑒定1.挑單克隆進行ELISA鑒定將實施例1中的第三輪篩選產(chǎn)物(洗脫產(chǎn)物)稀釋后鋪平皿，挑取各噬菌體單克 隆分別接種對數(shù)生長早期(0D_ 約為 0.3)的 ER2738(Ph.D.-12 PhageDisplay Peptide Library Kit，購自New England Biolabs公司)中擴增4. 5個小時，離心取上清，測噬菌體 滴度，調(diào)整濃度為lO^pfu/lOyL。將純化的PRRSV包被ELISA板(陽性值P)，同時包被Marc_145細胞裂解上清做 陰性對照(陰性值N)，4°C包被過夜，次日用封閉液4°C封閉1小時后將同一個噬菌體克隆 分別加到兩種包被的孔中，然后依次次疊加兔抗M13噬菌體血清和羊抗兔酶標二抗，此后 洗滌、顯色、終止按常規(guī)方法進行。測定450nm處的吸光值，將？州值> 3的判為陽性克隆。 此實驗中，還需要設(shè)置野生型噬菌體對照。從檢測結(jié)果中挑取17個陽性結(jié)果，以一個野生型噬菌體作為對照，結(jié)果如圖1所 示圖1中，C是野生型噬菌體對照，N是噬菌體克隆針對Marc-145裂解上清包被的陰性值， 以白色柱表示；P是噬菌體克隆針對PRRSV的陽性值，以黑色柱表示； 州值> 3。篩選到的 克隆與PRSSV有很高的親和力。實驗中用到的試劑按照如下方法配制包被液0.IM 的 NaHCO3 (pH8. 6)；封閉液0.IM 的 NaHCO3 (pH8. 6)，含有濃度為 5mg/mL 的 BSA ；洗滌液:50mM的 Tris-HCl (ρΗ7· 5)，含有濃度為 150mM 的 NaCl 和 0. 5% (ν/ν)的 Tween-20 ；底物液底物液A 0. 006 % (v/v) H2O2 緩沖液；底物液 B 取 Na2HPO4 · 12H2014. 2g， 檸檬酸10. 5g，用雙蒸水定容至500mL配成0. IM磷酸鹽檸酸級沖液(pH5. 0)，然后加上聯(lián)苯 二胺(T' MB)。使用時將A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。終止液2MH2SO4。2.陽性噬菌體的測序取步驟1得到的陽性噬菌體克隆上清500 μ L加入200 μ L的PEG-NaCl溶液，顛倒 混勻，室溫靜置10分鐘，離心10分鐘，去上清，瞬離一下，用槍頭將殘余上清吸干，用100 μ L 的Iodide Buffer溶解沉淀，再加入250 μ L無水乙醉，室溫孵育10分鐘，離心10分鐘，去 上清，70% (ν/ν)乙醇洗，真空干燥后用30μ L的TE緩沖液溶解，即得測序模板。使用自動測序儀進行測序，測序引物(Ph.D.-12ΤΜ Phage Display PeptideLibrary Kit，購自 New England Biolabs公司)如下5，_CCC TCA TAG TTA GCGTM CG-3，。對17個陽性克隆進行序列測定，結(jié)果如下表所示 從表中可見，克隆9和12為同一序列；克隆4、8、13和14為同一序列；表中“共有 序列”欄內(nèi)所列的HWW、Gffff、QSS、SLT等，表示其為多個噬菌體克隆所共有的基序。本實施例中使用的試劑配方如下Iodide Buffer 濃度為 IOmM 的 Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液，含有濃度為 ImM 的 EDTA，濃度為4M的Nal，室溫(25°C )避光保存。PEG-NaCl 濃度為 2. 5M 的 NaCl 溶液，含有濃度為 20% (w/v)聚乙二醇 8000，121 °C 高溫滅菌30分鐘，室溫(25°C )保存。TE緩沖液濃度為IOmM的Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液，含有濃度為ImM的EDTA，室 溫(25 °C )保存。 實施例3陽性噬菌體對PRRSV的抑制能力的檢測1.陽性噬菌體克隆的擴增取實施例2步驟1得到的陽性噬菌體克隆上清5 μ L，加入到20mL對數(shù)生長早期 (OD600 0.3)的宿主菌ER2738(Ph. D.-12 Phage Display Peptide Library Kit，購自 New England Biolabs公司)中，擴增4小時，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清，用PEG-NaCl溶液 沉淀兩次，最后用200 μ L的TBS溶解，得到擴增的陽性噬菌體克隆，再檢測它的滴度，方法 同實施例1中步驟2. 2的操作。2.半數(shù)組織感染量(TCID50)的測定預先接種Marc-145細胞于96孔板中，待單層細胞貼壁鋪滿孔的80 %，將10 μ L的 1. 0 X IO11PFU的噬菌體與90 μ L的10倍連續(xù)梯度稀釋的PRRSV混合，感染96孔板中培養(yǎng)的 細胞。37°C孵育1小時后棄感染液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗3次，去除游離的病毒粒子。加入2% 小牛血清的DMEM培養(yǎng)液37°C繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)4天觀察記錄病變，并按Reed and Munch公式 計算各組的TCID5tl，實驗結(jié)果如下表。
表中可見11個展示不同多肽序列的噬菌體克隆對PRRSV復制能力(TCID5tl)的影 響，其中，噬菌體克隆2、4體外能明顯抑制PRRSV的復制，使TCID5tl由10_7_2/0. ImL分別降至 10_3 2、10_3 6/0. lmL，其余克隆能夠抑制病毒復制，但效果不明顯。實施例4 FITC標記短肽檢測I3RRSV1、FITC標記段肽的人工合成綜合比較ELISA、TCID50檢測結(jié)果，選取噬菌克隆Ph. D-PRRSV-4，其展示的短肽序 列為 His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser，因此人工合成短肽His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser-FITC。2、直接免疫熒光檢測PRRSVMarc-145細胞在24孔細胞培養(yǎng)板上以5. 0 X IO6個細胞/孔鋪板，24h長成單層 細胞后每孔加入200個TCID5tl的PRRSV病毒，另留兩個孔作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48h至明顯病 變。棄掉培養(yǎng)液后用PBS沖洗3次，乙醇固定lOmin，PBS沖洗3次。0.3% (v/v)Triton裂 解5min，PBS沖洗3次，加入FITC標記的多肽于37°C孵育lh，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡觀 察。結(jié)果如圖2所示該多肽在5 μ g/mL濃度時就能在Marc-145細胞對PRRSV進行檢測。 圖2的A圖可見細胞表面有熒光信號，這是由于細胞固定后經(jīng)Triton處理，其表面膜解構(gòu) 被破壞，多肽分子可以滲透到細胞內(nèi)部與病毒粒子結(jié)合，故在細胞內(nèi)部也有可見的熒光信 號；圖2的B圖為細胞對照，沒有可見熒光。
權(quán)利要求
一種能特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽，其氨基酸序列如下His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser
2.—種權(quán)利要求1所述特異性結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽的篩選方法，包括 如下步驟(1)純化PRRSV獲得純病毒；然后進行噬菌體隨機肽庫篩選，通過三輪篩選富集能與 PRRSV特異性結(jié)合的噬菌體。(2)將第三輪篩選產(chǎn)物稀釋后鋪平皿，挑取各噬菌體單克隆進行ELISA鑒定，篩選出能 與PRSSV有很高的親和力的噬菌體單克隆，并測出被篩選出的噬菌體單克隆的序列。(3)檢測由步驟(2)所得各序列的噬菌體單克隆對PRRSV的抑制能力，選取能明顯抑 制PRRSV復制的噬菌體單克隆，展示于該噬菌體單克隆表面的多肽即為能與特異性結(jié)合豬 繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽。
3.—種權(quán)利要求1所述的多肽在豬繁殖與呼吸綜合癥病毒檢測的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于將所述多肽采用FITC進行標記，然后應用 于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合PRRSV的多肽及其篩選方法，屬動物病毒學領(lǐng)域。該多肽為His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser；本發(fā)明還提供該多肽篩選方法獲得純病毒；采用噬菌體隨機肽庫篩選出能與PRSSV有很高親和力的噬菌體單克隆，并測序。檢測各噬菌體單克隆對PRRSV的抑制能力，選取能明顯抑制PRRSV復制的噬菌體單克隆，所含多肽就是目的多肽。所述多肽能應用于PRRSV的檢測；可以將該多肽用FITC標記后用于檢測PRRSV。本發(fā)明篩選多肽的方法，周期短，操作簡單，與制作單克隆抗體的方法相比，更為方便快捷；篩選到的多肽能用于檢測PRRSV，操作簡單，具有高特異性和很高的靈敏度。
文檔編號C07K1/04GK101885759SQ201010209009
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者于轍, 侯繼波, 呂芳, 徐海 申請人:國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心