專利名稱：鹿茸活性生物堿類化合物的提取方法及在醫(yī)藥上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于來源于動(dòng)物體活性生物堿類化合物的提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及與尿嘧啶、 尿苷和肌苷為立體異構(gòu)的生物活性物質(zhì)的提取技術(shù)。同時(shí)，也涉及來源于動(dòng)物體的有效成 分為主的醫(yī)藥配制品。
背景技術(shù)：
鹿茸作為一種保健藥具有很高的療效，歷史上它也被用于許多疾病的治療，包括 貧血癥、關(guān)節(jié)炎、健忘癥、創(chuàng)傷和疼痛。一般來說，鹿茸有增強(qiáng)機(jī)體代謝，保護(hù)和更新受損的 器官和組織，調(diào)節(jié)免疫和吞噬細(xì)胞功能，減緩衰老進(jìn)程，降低血壓和改善促性腺和甲狀腺功 能等作用。鹿茸產(chǎn)品眾多，制備方法各不相同。如果不清楚鹿茸的有效成分，不知道這些有效 成分的化學(xué)性質(zhì)，在提取過程中將帶有極大的盲目性，有可能造成有效成分的損失及資源 的浪費(fèi)。另外，以鹿茸為原料的藥品及食品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該以鹿茸的活性成分的化學(xué)性質(zhì) 相關(guān)，以保障用鹿茸為原料的藥品及食品的質(zhì)量及安全。目前，鹿茸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍以蛋 白含量為主，而氨基酸及多肽類也許并非鹿茸的主要活性成分。因此，鹿茸藥理作用的物質(zhì) 基礎(chǔ)研究尤為重要。鹿茸藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究由來已久，國(guó)內(nèi)1994年由楊秀偉等首次報(bào)道了從 鹿茸中提取尿嘧啶、尿苷，次黃嘌呤等核苷類化合物，但比較研究的結(jié)果卻是與標(biāo)準(zhǔn)品波譜 一致[1]。此后又對(duì)鹿茸中的尿嘧啶、尿苷，次黃嘌呤抑制單胺氧化酶的活性進(jìn)行比較，并認(rèn) 為次黃嘌呤抑制單胺氧化酶的活性最強(qiáng)[2]。1992年張志強(qiáng)等應(yīng)用凝膠過濾和離子交換層 析等技術(shù)，從鹿茸中提取純化出一種多肽，經(jīng)高壓液相色譜和N-末端氨基酸分析鑒定為單 一多肽。是由68個(gè)氨基酸組成，分子量為7200[3]。藥理研究證明，這個(gè)成分對(duì)大鼠角叉采 膠性足腫脹有明顯的抑制作用M。1995年霍玉書等應(yīng)用柱層析技術(shù)，從新鮮梅花鹿中分離 出一種多肽，這種多肽可以促進(jìn)雞胚神經(jīng)節(jié)的分化，據(jù)分析可能是神經(jīng)生長(zhǎng)因子類物質(zhì)[5]。 1999年王本祥、周秋麗等應(yīng)用凝膠過濾、高壓液相制備以及激光解析電離飛行質(zhì)譜分析等 技術(shù)，從新鮮梅花鹿鹿茸中提取出一種多肽，分子量5788[6]。藥理研究表明，這種多肽可以 促進(jìn)骨、軟骨細(xì)胞的分裂，有促進(jìn)骨折愈合的作用。隨后，該課題組在2001年應(yīng)用同樣的工 藝方法從新鮮馬鹿茸有提取出一種多肽，分子量3200[7_9]，并有氨基酸序列分析數(shù)據(jù)。藥理 研究表明，這種多肽可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的增殖，有促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的作用。 2003年他們又從馬鹿茸提取出一種分子量為3095的多肽，并對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行了分析 [1°]。目前，鹿茸多肽的化學(xué)和藥理研究盡管較多，但仍未見有關(guān)合成的多肽與天然的鹿茸 多肽比較研究的報(bào)道，也未見相關(guān)化合物專利。其他一些有關(guān)在鹿茸中提取的化合物，如多 胺、神經(jīng)節(jié)甙脂、膽固醇等，因不是鹿茸中特有的化合物，而較少深入研究。在以往的鹿茸制劑的提取工藝中多采用醇浸、煮沸、超臨界CO2萃取、超濾濃縮等 技術(shù)[11_2°]。由于不清楚鹿茸的活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量、理化性質(zhì)等，各種提取工藝均 存在不同程度的缺陷。同時(shí)，由于不知道鹿茸有效成分藥理作用的有效劑量范圍，各種制劑的劑量無法定量，給臨床應(yīng)用帶來一定的盲目性。本發(fā)明在鹿茸活性成分清楚的前提下，對(duì) 其在藥材中的含量進(jìn)行了定量，對(duì)有效劑量范圍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)[1],楊秀偉，白云鵬·馬鹿茸化學(xué)成分的研究·中草藥，1994 ；25 (5) =229-65.[2].楊秀偉.花鹿茸-馬鹿茸堿基成分的HPLC定量分析和其MAO活性抑制作用， 中草藥，1995 ；26 (15) :17_9·[3]. Zhang ZQ, et al. Purification and partial characterization atanti-inflammatory peptide from piose antler Cervus nippon Temminck, Acta PharmSin (藥學(xué)學(xué)報(bào))，1992 ；27 :321_4·[4],張志強(qiáng)，等.鹿茸多肽的抗炎作用。中國(guó)藥理學(xué)報(bào)1994 ;15(3) :282_4·[5],霍玉書，霍虹.鹿茸神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性及促分化作用的研究.中藥新藥與臨 床藥理 1997,8(2)79-81.[6].Zhou Q L, Guo YJ, Wang L J,et al. Velvet Antler PolypeptidesPromoted Proliferation of Chondrocytes and Osteoblast Precursors and FractureHealing. Acta Pharm Sin (藥學(xué)學(xué)報(bào))，1999，20 (3) 279.[7],周秋麗，等。梅花鹿茸和馬鹿茸多肽化學(xué)性質(zhì)及生物活性比較，中國(guó)中藥雜 志，2001 ；26 (10) 702-5.[8]. Weng Liang, Zhou Qiuli, IKEJ IMA Takashi, Wang Benxiang. A newpolypeptide promoting epidermal cells and chondrocytes proliferation from cervuselaphus linnaeus, Acta Pharm Sin (藥學(xué)學(xué)報(bào))，2001，36 (12) :913_916·[9],翁梁，周秋麗，王麗娟等.鹿茸多肽促進(jìn)表皮和成纖維細(xì)胞增殖及皮膚創(chuàng)傷 愈合.Acta Pharm Sin (藥學(xué)學(xué)報(bào))，2001，36 (11) :817_820.[10].王豐，梅子青，周秋麗，等.鹿茸多肽的分離純化及藥理活性.吉林大學(xué)學(xué)報(bào) (理學(xué)版)2003，4(1) 111-4.[11][12] CN1631900A.[13]
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鹿茸生長(zhǎng)因子制劑和工藝公開號(hào)CN1104095A.
一種鹿茸多肽的制備方法，以其作為主要活性成分的藥物公開號(hào)
水溶性凍干鹿茸提取物提取方法公開號(hào)CN1481816A.
醇溶性凍干鹿茸提取物提取方法，公開號(hào)CN1481814A.
超臨界二氧化碳鹿茸精制備方法公開號(hào)CN1481815A.
鹿茸有效成分低溫超聲裂解浸提法，公開號(hào)CN1430971A.
一種鹿茸精注射液的制備方法，公開號(hào)CN1207296A.
鹿茸精注射劑新的給藥途徑及其制備工藝、新適應(yīng)癥，公開號(hào)CN1768762A.
一種鹿茸藥用成分的水解提取方法及產(chǎn)品，公開號(hào)CN1425387A.
綜合提取鮮鹿茸中活性成分的方法公開號(hào)CN1771993A.

發(fā)明內(nèi)容
與以往鹿茸中核酸類物質(zhì)的概念截然不同，本發(fā)明提出鹿茸活性成分是生物堿類 物質(zhì)的新概念。本發(fā)明的主要目的是一、提供一種有效的分離方法分離出鹿茸的幾種活性成分的化合物，公開它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及活性特征。二、提供這些活性成分在藥 物領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是一、采用膜分離技術(shù)提取和濃縮提取物，以保證化合物不受 劇烈外界條件影響。二、使用純水作溶劑，不存在其他離子摻入的問題。三、使用離子交換 層析技術(shù)脫色素，并純化活性成分，以最大限度的保留活性成分，減少有機(jī)溶劑的使用和殘
&3 甶ο具體分離的操作步驟取鹿茸粉加5-10% (g/v)的蒸餾水，室溫至40°C攪拌4h， 置冰箱冷藏過夜。浸出液經(jīng)SOOOrpm離心40nim，棄沉渣。浸出液上清過0.8 μ濾膜過濾。 濾液過超濾膜超濾(3KD)，超濾外液(內(nèi)液棄去)再過納濾膜納濾，得納濾內(nèi)液。納濾內(nèi)液 56°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得納濾濃縮液。將其過CM-cellulose陽離子柱，洗脫液為蒸餾水，取活 性峰，活性峰溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。再過DEAE-sephadexA25陰離子柱層析，流動(dòng)相為蒸餾 水，取活性峰。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得凍干粉(即為鹿茸總提取物，簡(jiǎn)稱LR，下同)。其 中含三種活性成分PAA1、PAA2和PAA3。同時(shí)，上述操作中，在將其過CM-cellulose陽離子柱，蒸餾水洗脫，取活性峰，活 性峰溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。用Tris鹽酸緩沖液pH9. 0平衡DEAE-s印hadeXA25陰離子柱， 將以上濃縮液層析，緩沖液洗脫，棄穿透峰。再用2%甲酸洗脫，取解吸附部分。56°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)濃縮至干，加蒸餾水再溶解。冷凍干燥，也能得凍干粉(鹿茸總提取物，LR)。其中含三種 活性成分PAA1、PAA2和PAA3。如果在上述提取步驟中，用Tris鹽酸緩沖液pH9. 0平衡DEAE_s印hadex A25陰 離子柱，緩沖液洗脫，棄穿透峰。繼續(xù)用蒸餾水洗脫，取穿透峰，其主要活性成分為PAAl和 PAA2，活性成分占42%。再用2%甲酸洗脫，取解吸附部分，56°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加蒸餾 水再溶解，主要活性成分為PAA3。將凍干粉用液相色譜制備得到三種活性成分PAA1、PAA2和PAA3{分別為已知化 合物尿嘧啶(uracil)、尿苷(uridine)和肌苷(inosine)的立體異構(gòu)物的簡(jiǎn)稱}。經(jīng)過對(duì)PAA1、PAA2和PAA3樣品的波譜解析，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別為PAAl分子式為C4H4N2O2 ；分子量=112. 3 ；白色粉末，m. p302 304°C。結(jié)構(gòu)式為
H
% ψ
WI ^ 其中“*”代表未定義立體鍵。
權(quán)利要求
鹿茸活性生物堿類化合物提取方法，其特性在于含有以下結(jié)構(gòu)的化合物其中“*”所處的N H或C H鍵代表未定義的立體鍵；提取方法按以下步驟進(jìn)行(1)取鹿茸粉，按5 10％(g/v)加蒸餾水，室溫至40℃攪拌4h，置冰箱冷藏過夜，浸出液經(jīng)8000rpm離心40nim，棄沉渣；(2)浸出液上清過0.8μ濾膜過濾，濾液過3KD超濾膜超濾，超濾外液再過納濾膜納濾濃縮，得納濾濃縮液；(3)納濾濃縮液經(jīng)56℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；(4)將其過CM cellulose陽離子柱，洗脫液為蒸餾水，取活性峰，活性峰溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；再過DEAE sephadexA25陰離子柱層析，流動(dòng)相為蒸餾水，取活性峰；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得含有PAA1、PAA2和PAA3的凍干粉。FSA00000238600300011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸活性生物堿類化合物的提取方法，其特征在于所述含有 PAA1、PAA2和PAA3的凍干粉經(jīng)液相制備色譜分離分別得到PAA1、PAA2和PAA3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸活性生物堿類化合物的提取方法，其特征在于在步驟(4) 將其過CM-cellulose陽離子柱，洗脫液為蒸餾水，取活性峰，活性峰溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮； 再過用Tris鹽酸緩沖液pH9. O平衡的DEAE-sijphadex A25陰離子柱層析，緩沖液洗脫，棄穿 透峰后，用2% (ν/ν)甲酸洗脫，取解吸附部分，56°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加蒸餾水再溶解，冷凍干燥，得含有PAA1、PAA2和PAA3的凍干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸活性生物堿類化合物的提取方法，其特征在于在步驟(4) 將其過CM-cellulose陽離子柱，洗脫液為蒸餾水，取活性峰，活性峰溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮； 再過用Tris鹽酸緩沖液pH9. 0平衡的DEAE-sijphadex A25陰離子柱層析，緩沖液洗脫，棄 穿透峰后，蒸餾水洗脫，取穿透峰，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到主要活性成分為PAAl和PAA2的凍 干粉；繼續(xù)用2%甲酸洗脫，取解吸附部分，56°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加蒸餾水再溶解，冷凍 干燥，得主要活性成分為PAA3的凍干粉。
5.鹿茸活性生物堿類化合物在醫(yī)藥上的應(yīng)用，其特征在于治療貧血、創(chuàng)傷及疲勞的恢 復(fù)、心絞痛及冠心病發(fā)作后修復(fù)期、免疫功能低下和化療后的“升高白細(xì)胞”疾病的潛在用 途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述鹿茸活性生物堿類化合物在醫(yī)藥上的應(yīng)用，其特征在于用于治 療貧血、創(chuàng)傷及疲勞的恢復(fù)、心絞痛及冠心病發(fā)作后修復(fù)期、免疫功能低下、化療后的“升高 白細(xì)胞”等，所用的含有PAA1、PAA2和PAA3凍干粉有如下醫(yī)藥劑型(1)注射劑，0.075mg/只，敷料為注射用水，用于肌肉或靜脈注射；(2)片劑，0.075mg/片，敷料為藥用淀粉，用于內(nèi)服；(3)膠囊劑，0.075mg/粒，用藥用膠囊裝入，用于內(nèi)服；(4)栓劑，0.050mg/枚，輔料為水溶性基質(zhì)，用于肛門及陰道；(5)氣霧劑，0.010mg/ml，輔料為拋射劑，用于呼吸道；(6)滴眼劑，0.010mg/ml，輔料為緩沖液，用于眼部疾患的水劑和軟膏；(7)微球，0.075mg/粒，輔料為包衣材料，用于消化道疾患；(8)貼劑，0.020mg/片，輔料為沾合劑，用于口腔粘膜疾患。
全文摘要
鹿茸活性生物堿類化合物的提取方法及在醫(yī)藥上的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種利用膜分離技術(shù)提取鹿茸中生物堿類化合物的提取方法。取鹿茸粉加蒸餾水室溫?cái)嚢瑁帽淅洳剡^夜，浸出液經(jīng)離心，棄沉渣；上清液過濾膜過濾，濾液過超濾膜超濾；超濾外液經(jīng)納濾膜濃縮，得納濾濃縮液；濃縮液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)再濃縮。將其過陽離子柱，蒸餾水洗脫，取活性峰；再過陰離子柱層析，流動(dòng)相為蒸餾水，取活性峰；蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得含有PAA1、PAA2和PAA3的凍干粉。實(shí)驗(yàn)證明該類物質(zhì)有治療貧血、創(chuàng)傷及疲勞的恢復(fù)、心絞痛及冠心病發(fā)作后修復(fù)期、免疫功能低下、化療后的“升高白細(xì)胞”等潛在用途。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101948439SQ20101025955
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者劉平 申請(qǐng)人:劉平