專利名稱：6-羥基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基庚烷及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及糖苷類化合物分離、制備和應(yīng)用，具體涉及6-羥 基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷及其制備方法和在抗炎、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。輪葉黨參(Codonopsis lanceolata)又名山海螺、羊乳、四葉參等，是桔?？贫嗄?生草本植物，主產(chǎn)于中國(guó)、日本和韓國(guó)。民間將輪葉黨參作為一味具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用的藥食 同源品。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，輪葉黨參中含有大量的三萜類成分，且具有一定的抗炎、抗腫瘤活 性。本領(lǐng)域的研究人員一直致力于輪葉黨參的分離工作，并分離得到了一系列小分子脂肪 醇葡萄糖苷類成分，6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷是輪葉黨參中分離的一種新的 化合物，且具有較好的抗炎和抗腫瘤活性。但現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有6-羥基-2-0- β -D-吡喃 葡萄糖基庚烷相關(guān)的提取分離研究以及抗炎抗腫瘤活性的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷，具有如下結(jié)構(gòu) 本發(fā)明還提供了 6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，通過(guò)以下兩 種方法中任意一種制備得到，方法一(1)輪葉黨參藥材粉碎后，經(jīng)溶劑提取法，采用50% -100%的乙醇或甲醇浸泡 后回流提取，提取2-3次，合并提取液，減壓回收提取液至醇濃度低于5 %，所含生藥濃度
背景技術(shù)：
20-40g/mL，濾過(guò)后取濾液或離心后取上清液；(2)步驟(1)中所得濾液或上清液經(jīng)非極性大孔樹(shù)脂柱色譜處理，依次用水和甲 醇或乙醇梯度洗脫，得到60% -90%醇洗脫部位，減壓回收溶劑；(3)步驟(2)所得醇洗物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇或氯仿、甲醇、水混合 溶劑梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)ODS柱色譜處理，以甲醇/水或乙腈/水為流動(dòng)相 洗脫得到洗脫流分；(5)上述步驟(4)中所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到目標(biāo)新化合物；方法二(1)輪葉黨參藥材粉碎后，經(jīng)溶劑提取法，采用50% -100%的乙醇或甲醇浸泡 后回流提取，提取2-3次，合并提取液，減壓回收提取液至醇濃度低于5 %，所含生藥濃度 20-40g/mL，濾過(guò)后取濾液或離心后取上清液；(2)步驟(1)中所得濾液或上清液經(jīng)以體積比1 1 1 2的正丁醇萃取2-4 次，減壓回收溶劑得到正丁醇萃取部位；(3)步驟⑵所得正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇或氯仿、甲醇、 水混合溶劑梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)ODS柱色譜處理，以甲醇/水或乙腈/水為流動(dòng)相 洗脫得到洗脫流分；(5)上述步驟(4)中所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到目標(biāo)新化合物；本發(fā)明提供的新的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，所述方法 一和方法二中的步驟(2)的醇為甲醇或乙醇，其梯度洗脫濃度為60%-90%。本發(fā)明提供的新的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，所述方法 一中的步驟(3)為醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為不同比例的氯仿/甲醇，氯仿 /甲醇/7jC，氯仿/甲醇混合比例為5 1 3 1的流分含有目標(biāo)化合物，氯仿/甲醇/ 水混合比例為12 3 1 7 3 1的流分含有目標(biāo)化合物。本發(fā)明提供的新的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，所述方法 二中的步驟(3)為正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為不同比例的氯仿/甲醇， 氯仿/甲醇/7jC，氯仿/甲醇混合比例為5 1 3 1的流分含有目標(biāo)化合物，氯仿/甲 醇/水混合比例為12 3 1 7 3 1的流分含有目標(biāo)化合物。本發(fā)明提供的新的6-羥基-2-0-β-D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，所述方 法一和方法二中的步驟(4)為步驟(3)所得流分經(jīng)ODS柱色譜進(jìn)一步分離，洗脫溶劑為 甲醇/水或乙腈/水。甲醇/水混合溶劑比例為1 9 8 2、乙腈/水混合溶劑比例 為1 20 2 1。甲醇/水混合溶劑比例為1 4 4 6、乙腈/水混合溶劑比例為 18 13的洗脫流分中含有目標(biāo)化合物。本發(fā)明提供的新的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，所述方法 一和方法二中的步驟(5)為步驟(4)所得洗脫流分經(jīng)高效液相色譜分離，流動(dòng)相為甲醇/ 水、乙腈/水或甲醇/乙腈/7Κ，從甲醇/水混合溶劑比例為1 5 3 7、乙腈/水混
5合溶劑比例為1 10 2 8、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1 1 12 1 1 6 的流分中分離得到化合物。本發(fā)明提供的新的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷化合物具有抗炎、抗腫 瘤活性，可用于抗炎和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例1(1)干燥輪葉黨參根10kg，粉碎后經(jīng)75%乙醇回流提取三次，每次1. 5小時(shí)，合并 提取液減壓回收提取液至醇濃度低于5%，所含生藥濃度30g/mL，過(guò)濾后取濾液；(2)濾液經(jīng)等體積正丁醇萃取三次，合并萃取液，減壓回收溶劑得正丁醇萃取物；(3)步驟⑵所得正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿甲醇8 1，7 1， 6 1,5 1,4 1,3 1,2 1 梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得氯仿甲醇4 1流分經(jīng)ODS柱色譜分離，以甲醇水 3 7,5 5,6 4,7 3,8 2 梯度洗脫。(5)步驟(4)中所得6 4洗脫流分，經(jīng)半制備HPLC色譜分離，以15%乙腈/水 為流動(dòng)相洗脫，保留時(shí)間16分鐘處得到新化合物，經(jīng)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)鑒定為 6-羥基-2-0- β -D-吡喃葡萄糖基庚烷。實(shí)施例2(1)干燥輪葉黨參飲片5kg經(jīng)70%乙醇回流提取兩次，每次2小時(shí)，減壓回收提取 液至醇濃度低于3%，所含生藥濃度40g/mL，離心后取上清液；(2)上清液經(jīng)HPD400大孔樹(shù)脂柱色譜處理，依次用水和60%乙醇、和90%乙醇梯 度洗脫；(3)步驟(2)所得60%乙醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿甲醇水 15 3 1,10 3 1,7 3 1,4 3 1 梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得氯仿甲醇水10 3 1流分經(jīng)ODS柱色譜分離，以 甲醇水1 9，2 8,3 7,5 5,6 4,7 3,8 2 梯度洗脫。(5)步驟(4)中所得6 4洗脫流分，經(jīng)半制備HPLC色譜分離，以23%甲醇/水 為流動(dòng)相洗脫，保留時(shí)間21分鐘處得到新化合物，經(jīng)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)鑒定為 6-羥基-2-0- β -D-吡喃葡萄糖基庚烷。 該化合物為無(wú)色針晶(甲醇)。FABMS譜中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z317[M+Na]+， HRFABMS 譜中給出 m/z 317. 1570 [M+Na]+ (calcd. 317. 1576)，由此確定分子量為 294，分子式
為 Ci3H26O7o表1化合物的NMR數(shù)據(jù) 實(shí)施例3化合物1 (6-羥基-2-0- β -D-吡喃葡萄糖基庚烷)的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)測(cè) 試實(shí)驗(yàn)方法(1)細(xì)胞的培養(yǎng)HL-60細(xì)胞株細(xì)胞株的培養(yǎng)條件均為RMPI 1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清，MCF-7細(xì) 胞株的培養(yǎng)條件為低糖DMEM培養(yǎng)液10%胎牛血清，HepG2細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為高糖DMEM 培養(yǎng)液10%胎牛血清，A549細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為RMPI 1640培養(yǎng)液，10%小牛血清。以上細(xì)胞株均培養(yǎng)于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中。(2)藥物的配制將所測(cè)定的6-羥基-2-0- β -D-吡喃葡萄糖基庚烷(1和2)配成濃度為50mmol/ L的母液，儲(chǔ)存于_20°C。細(xì)胞株使用無(wú)血清的RMPI 1640培養(yǎng)液將藥物的母液稀釋成lOOOumol/L， 500umol/L, 1 OOumo 1/L, 10umol/L,每孔加入 IOuL,使得藥物的終濃度為 1 OOumol/L, 50umol/L,10umol/L,lumol/L。(3) MTT 實(shí)驗(yàn)調(diào)整細(xì)胞密度至1. 0 1. 5X 105/ml，加入96孔培養(yǎng)板中每孔IOOul，培養(yǎng)24h后 加入上述各濃度藥物，每孔IOul。每濃度為6個(gè)復(fù)孔。孵育72h后，每孔加入lOuLMTT，在 培養(yǎng)箱中孵育4h后，進(jìn)行檢測(cè)。將上清液吸出，加入lOOulDMSO，振蕩均勻后，于酶標(biāo)儀上 492nm處測(cè)得OD值。細(xì)胞成活率％=給藥組OD值的平均值/空白乳組OD值的平均值X 100% (4)統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS(13.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果用〒士s表示。每種藥物針對(duì)三種細(xì)胞的篩選要重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2表2化合物1的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)施例4化合物1 (6-羥基-2-0- β -D-吡喃葡萄糖基庚烷)的抗炎活性測(cè)試采用二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型，測(cè)試化合物1的抗炎活性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重30 士 3g的雄性昆明小鼠試驗(yàn)方法按體重將小鼠隨機(jī)分成3組，每組8只，各組小鼠乙醚麻醉后，于左耳前 后兩面涂含有各化合物1或陽(yáng)性藥(阿司匹林)lmg/ml的二甲苯溶液各20 μ 1，模型對(duì)照組 直接涂20μ 1 二甲苯。三小時(shí)后將小鼠脫白處死，用直徑9mm打孔器在左右耳相同位置打 下耳朵片，稱重，左右耳朵片的重量差作為腫脹度，并比較組間差異顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3表3化合物1對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹度的影響 與模型對(duì)照組比較* :P < 0101, significantly different from control group
權(quán)利要求
具有如下結(jié)構(gòu)的6 羥基 2 O β D 吡喃葡萄糖基庚烷，F(xiàn)SA00000193955700011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的6-羥基-2-0-0 -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，其特征在 于包括如下步驟(1)輪葉黨參藥材粉碎后，經(jīng)溶劑提取法，采用50%-100%的乙醇或甲醇浸泡后回流 提取，提取2-3次，合并提取液，減壓回收提取液至醇濃度低于5%，所含生藥濃度20-40g/ mL，濾過(guò)后取濾液或離心后取上清液；(2)步驟(1)中所得濾液或上清液經(jīng)非極性大孔樹(shù)脂柱色譜處理，依次用水和甲醇或 乙醇梯度洗脫，得到60% -90%醇洗脫部位，減壓回收溶劑；(3)步驟(2)所得醇洗物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇或氯仿、甲醇、水混合溶劑 梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)0DS柱色譜處理，以甲醇/水或乙腈/水為流動(dòng)相洗脫 得到洗脫流分；(5)上述步驟⑷中所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/7jC，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到6-羥基-2-0-0 -D-吡喃葡萄糖基庚烷。
3.如權(quán)利要求1所述的6-羥基-2-0-0 -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，其特征在 于包括如下步驟(1)輪葉黨參藥材粉碎后，經(jīng)溶劑提取法，采用50%-100%的乙醇或甲醇浸泡后回流 提取，提取2-3次，合并提取液，減壓回收提取液至醇濃度低于5%，所含生藥濃度20-40g/ mL，濾過(guò)后取濾液或離心后取上清液；(2)步驟(1)中所得濾液或上清液經(jīng)以體積比1 1 1 2的正丁醇萃取2-4次，減 壓回收溶劑得到正丁醇萃取部位；(3)步驟(2)所得正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇或氯仿、甲醇、水混 合溶劑梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)0DS柱色譜處理，以甲醇/水或乙腈/水為流動(dòng)相洗脫 得到洗脫流分；(5)上述步驟(4)中所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈/ 水或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到目標(biāo)新化合物。
4.按照權(quán)利要求2所述的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，其特征 在于所述步驟(2)中所用的醇為乙醇或甲醇，其梯度洗脫濃度為60% -90%。
5.按照權(quán)利要求2或3所述的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，其 特征在于所述步驟(3)為醇洗脫物或正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為氯 仿/甲醇或氯仿/甲醇/水(氯仿/甲醇混合比例為8 1 1 1;氯仿/甲醇/水混 合比例為15 3 1 4 3 1)，氯仿/甲醇混合比例為5 1 3 1的流分含有目 標(biāo)化合物，氯仿/甲醇/水混合比例為12 3 1 7 3 1的流分含有目標(biāo)化合物。
6.按照權(quán)利要求2或3所述的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，其 特征在于所述步驟(4)為(3)所得流分經(jīng)ODS柱色譜處理，洗脫溶劑為甲醇/水或乙腈/ 水甲醇/水混合溶劑比例為1 9 8 2、乙腈/水混合溶劑比例為1 20 2 1; 在甲醇/水混合溶劑比例為1 4 4 6、乙腈/水混合溶劑比例為1 8 1 3的洗 脫流分中含有目標(biāo)化合物。
7.按照權(quán)利要求2或3所述的6-羥基-2-0-β -D-吡喃葡萄糖基庚烷的制備方法，其特 征在于所述步驟(5)為步驟(4)所得洗脫流分經(jīng)高效液相色譜分離，流動(dòng)相為甲醇/水、 乙腈/水或甲醇/乙腈/水，從甲醇/水混合溶劑比例為1 5 3 7、乙腈/水混合溶 劑比例為1 10 2 8、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1 1 12 1 1 6的流 分中分離得到化合物。
8.權(quán)利要求1所述6-羥基-2-0-β-D-吡喃葡萄糖基庚烷在制備抗炎、抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了6-羥基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基庚烷及其制備方法和應(yīng)用，所述的化合物具有如下結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了該化合物的制備方法。體外抗腫瘤及抗炎試驗(yàn)證明，該化合物具有較好的抗炎、抗腫瘤活性，可用于抗炎、抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101891775SQ20101022896
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者李寧, 李銑, 李雪征, 肖皖 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)