專利名稱：：楊梅素用于酪氨酸激酶抑制劑的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及楊梅素用于酪氨酸激酶(JAK酶)抑制劑的藥物的應(yīng)用，具體的說就是楊梅素在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：楊梅素(Myricetin)如(I)所示，為一黃酮醇類天然化合物，黃色針狀晶體，熔點(diǎn)為324.0325.5°C，溶于甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯，微溶于水，難溶于氯仿、石油醚，置于空氣中易氧化變綠。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>目前對(duì)楊梅素已進(jìn)行了較為廣泛的藥理研究，黃酮類天然產(chǎn)物是近年來天然藥物和人類健康產(chǎn)品研究開發(fā)的熱點(diǎn)，楊梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎抗菌等多種功效，科學(xué)家開始研究楊梅素用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品。國外保健品美國保健品藥FYI已將楊梅素作為添加劑用作治療預(yù)防關(guān)節(jié)炎和各種炎癥，尤其對(duì)妊娠及哺乳期婦女和嬰兒更加適合，由此楊梅素有望進(jìn)一步開發(fā)為特殊人群的消炎用藥，從而減輕西藥抗生素對(duì)人體的毒副作用。隨著楊梅素藥理作用的進(jìn)一步研究，市場(chǎng)對(duì)楊梅素的需求量將急劇增加，楊梅素的研究開發(fā)前景廣闊。已公開的有關(guān)楊梅素的專利有發(fā)明名稱為“楊梅素在制備尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子URATl抑制藥物中的應(yīng)用”的CN101181261A；公開了用作婦科炎癥且發(fā)明名稱為“楊梅素的制備方法、藥物制劑及醫(yī)藥新用途”的CN10150175A；公開了用作預(yù)防和治療老年癡呆癥且發(fā)明名稱為“蛇葡萄莖葉總黃酮及單一成分楊梅素的醫(yī)藥新用途，，的CN101297900A。但是，迄今為止有關(guān)楊梅素的更加高效和確切的作用靶點(diǎn)、機(jī)制等尚未被發(fā)現(xiàn)，楊梅素的準(zhǔn)確應(yīng)用有待研究，以便更好、更精準(zhǔn)的治療疾病，而降低不良反應(yīng)。缺血/再灌注(Ischemia/R印erfusion)是機(jī)體局部組織或器官循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)暫時(shí)性供血障礙時(shí)發(fā)生的一種應(yīng)急狀態(tài)，常常伴發(fā)于各種缺血性心腦血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中。缺血/再灌注(I/R)過程可分成兩個(gè)階段。第一階段為瞬時(shí)性缺血(Ischemia)，即局部組織出現(xiàn)低氧狀態(tài)和營養(yǎng)供己不足，導(dǎo)致組織或器官缺血性損傷。第二階段為再灌注(Reperfusion)，是指缺血組織中循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)短暫停滯后再疏通的過程。在再灌注過程中，受損組織內(nèi)部由于血液循環(huán)重建而觸發(fā)了一系列局部性應(yīng)急反應(yīng)。I/R過程中被激活的組織包括血管內(nèi)壁細(xì)胞、血液補(bǔ)體系統(tǒng)和淋巴細(xì)胞。被激活的淋巴細(xì)胞不但向周邊組織釋放各種強(qiáng)氧化自由基(no、H2O2、NO3)和各種炎性因子(干擾素、白介素、腫瘤壞死因子和巨噬細(xì)胞刺激因子)，還引發(fā)中性粒細(xì)胞向周邊組織聚集、浸潤等炎性反應(yīng)。另外，被激活的淋巴細(xì)胞同時(shí)還向周圍組織分泌多種影響細(xì)胞生長的因子從而誘導(dǎo)周邊細(xì)胞進(jìn)入非正常凋亡和壞死過程(參見Hilfiker-Kleineretal.JournalofAmericanCollegeofCardiology.2006，48:56-66)。因此由再灌注引發(fā)的二次損傷的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過由于缺血導(dǎo)致的損傷，是多種缺血性心腦血管系統(tǒng)創(chuàng)傷疾病發(fā)展過程中的主要病理過程，而淋巴細(xì)胞的超強(qiáng)活化是再灌注損傷的主要因素之一(參見KaminskiKAetal.InternationalJournalofCardiology.2002，86:41_59)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，淋巴細(xì)胞的活化則主要是通過一組分布細(xì)胞膜下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(JAK/STAT)的激活來完成，而同過恰當(dāng)?shù)乃幬锓肿痈蓴_JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活，可以達(dá)到調(diào)整或抑制淋巴細(xì)胞的過度活化的目的。因此、參與構(gòu)成JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的各種蛋白成為探索新一代治療各種缺血性心腦血管系統(tǒng)創(chuàng)傷疾病特效藥的最新研發(fā)靶點(diǎn)(參見MurrayPJ.Journaloflmmunology.2007,1782623-2629)。JAK/STAT是近年來科學(xué)家在研究干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)機(jī)理時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的信號(hào)傳遞系統(tǒng)(參見SchindlerCff.JClinInvest.2002，109:1133_1137)。整個(gè)系統(tǒng)由分布于細(xì)胞膜的受體(R)、細(xì)胞膜下的酪氨酸蛋白激酶(JAK)和與之緊密結(jié)合的信號(hào)轉(zhuǎn)遞激活蛋白(STAT)組成。JAK酪氨酸蛋白激酶屬于非受體型蛋白激酶，分布在細(xì)胞膜下。迄今為止，JAK酪氨酸蛋白激酶家族共有四個(gè)成員被鑒定出來JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。與JAK同時(shí)被鑒定而出還有與JAK在結(jié)構(gòu)上密切相連的激酶底物STAT(信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白，SignalTransducerandActivatorofTranscription,STAT)(參見MurrayPJ.Journaloflmmunology.2007，178=2623-2629)。在相關(guān)的組織和細(xì)胞中，受體激活物_受體_激酶信號(hào)轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)共同組成一個(gè)精致、有序的信息分析處理中心，使細(xì)胞外部的各種刺激信號(hào)可以迅速傳遞至細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞作出各種積極、準(zhǔn)確的應(yīng)急反應(yīng)。因此，JAK酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)在維系各種組織、細(xì)胞的正常生理功能起到及其重要的作用。然而在異常情況下，由于JAK酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活失控也在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用(參見SchindlerCff.JClinInvest.2002，109:1133_1137)。作為多種抗心腦血管損傷疾病中藥的主要活性成分，天然黃酮類化合物早已成為國內(nèi)藥界研發(fā)的重點(diǎn)之一。在國際上由于天然黃酮類化合物在結(jié)構(gòu)上超強(qiáng)抗氧化特點(diǎn)，以及近期關(guān)于氧化自由基的形成與諸多疾病發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系機(jī)理被逐一闡明，探討使用天然黃酮類化合物干預(yù)各種與超氧化物過度合成有關(guān)的疾癥，特別是與I/R密切相關(guān)的心腦血管系統(tǒng)疾病治療理念被重新激活(參見Akhlaghietal.Journalofmolecularandcellularcardiology.2009,46:309_317禾口LarsonA.J.etal.Pharmaceuticals.2010,3237-250)?；谌藗兡壳皩?duì)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度激活與I/R損傷的內(nèi)在聯(lián)系的認(rèn)知，我們使用兩個(gè)最新組建的藥選平臺(tái)(酶選模型和細(xì)胞模型)對(duì)楊梅素進(jìn)行了系統(tǒng)篩選和研究。我們意外發(fā)現(xiàn)楊梅素具有非常顯著的抗JAK抑制活性。酶模型分析資料表明楊梅素可以對(duì)JAK酪氨酸蛋白激酶發(fā)生強(qiáng)烈抑制作用，其酶學(xué)結(jié)合特性為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。使用細(xì)胞模型探討楊梅素對(duì)淋巴細(xì)胞的功能影響的研究表明，該化合物可以有效地透過細(xì)胞膜對(duì)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活產(chǎn)生阻竭，從而抑制淋巴細(xì)胞向周邊組織分泌細(xì)胞因子如干擾素的能力。細(xì)胞模型結(jié)果同時(shí)還提示楊梅素有較高的生物吸收率。因此，楊梅素有望研發(fā)出針對(duì)各種與JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活失調(diào)相關(guān)疾病的特效新藥。
發(fā)明內(nèi)容基于上述認(rèn)識(shí)，我們經(jīng)過創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)和研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素具有強(qiáng)烈的阻斷上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系激活的作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明(I)可以直接與這種特定的JAK酪氨酸蛋白激酶發(fā)生專一性結(jié)合，并對(duì)酶分子發(fā)生強(qiáng)大地抑制作用。因此，我們推斷上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系中的重要組成之一的JAK酪氨酸蛋白激酶是楊梅素的攻擊靶點(diǎn)。基于這一發(fā)現(xiàn)我們進(jìn)一步成功地組建了一個(gè)精確、高效的藥物識(shí)別酶篩平臺(tái)，對(duì)楊梅素進(jìn)行了篩選。在篩選過程中我們發(fā)明了能有效作為JAK酶抑制劑的化合物——楊梅素(Myricetin，I)，具有很強(qiáng)的JAK酶的抑制作用，并且可以有效的透過細(xì)胞膜對(duì)淋巴細(xì)胞免疫功能發(fā)生影響，降低I/R過程中免疫細(xì)胞對(duì)受損組織的攻擊。進(jìn)一步的藥理學(xué)研究還證明，楊梅素不僅對(duì)兔血小板聚集及凝血功能有一定抑制作用，而且對(duì)大鼠離體冠脈及腦基底動(dòng)脈收縮反應(yīng)的舒張作用非常顯著(可能通過抑制ACE機(jī)制)。由此，表明楊梅素在降低I/R損傷和改善血液循環(huán)上具有重大的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)對(duì)楊梅素制劑的研究，發(fā)明了楊梅素可制成醫(yī)療上可接受的用作JAK酶抑制劑的口服制劑、注射劑及其他給藥途徑的制劑。用于治療在異常情況下該系統(tǒng)激活失控也往往誘發(fā)多種疾病，或者在這些疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。如很有可能成為全新的、治療各種與心腦血管損傷關(guān)聯(lián)的疾病的特效藥。圖1是楊梅素抗酪氨酸激酶活性半數(shù)抑制劑量分析。圖2是楊梅素對(duì)外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。具體實(shí)施例方式發(fā)明人利用楊梅素和黃芩素針對(duì)JAK2酪氨酸蛋白激酶的半數(shù)抑制劑量(IC50)酶學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)中共選擇了十個(gè)不同的化合物濃度(0至0.3毫摩爾的待測(cè)楊梅素和黃芩素)，在加入ATP引發(fā)激酶反應(yīng)之前先將化合物與JAK2同溫5分鐘，之后按上述實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行。獨(dú)立測(cè)定一次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)平均值(參見圖1)，誤差使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％CV)。發(fā)明人利用楊梅素對(duì)外周血T-淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行檔案分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)洗滌處理的全血細(xì)胞種植于12-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，之后在指定的培養(yǎng)孔細(xì)胞旋浮液中加入楊梅素、楊梅苷或黃芩素(終濃度為100微摩爾)，在37C培養(yǎng)箱同溫60分鐘。之后于各孔中加入等劑量的IL-2以刺激全血細(xì)胞中T-淋巴細(xì)胞分泌干擾素。多次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一次測(cè)定(參考圖2)，誤差使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％CV)。檔案分析實(shí)驗(yàn)表明楊梅素與黃芩素對(duì)T-淋巴細(xì)胞的分泌干擾素能力有顯著抑制作用，但是楊梅苷的作用非常弱。通過本技術(shù)方案的實(shí)施，發(fā)現(xiàn)楊梅素具有強(qiáng)大的激酶抑制活性。進(jìn)一步的酶動(dòng)力學(xué)研究表明楊梅素這一特定的JAK酪氨酸蛋白激酶抑制強(qiáng)度和專一性均高。使用人體外周血T-淋巴細(xì)胞刺激模型初步證實(shí)楊梅素有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性的能力，并對(duì)T-細(xì)胞分泌各種炎性因子有強(qiáng)烈抑制作用。進(jìn)一步的藥理學(xué)研究證明，楊梅素不僅對(duì)兔血小板聚集及凝血功能有一定抑制作用，而且對(duì)大鼠離體冠脈及腦基底動(dòng)脈收縮反應(yīng)的舒張作用非常顯著。從目前的研究數(shù)據(jù)判斷，楊梅素的臨床適應(yīng)癥將包含缺血性心腦血管疾病、損傷性心腦血管疾病、腫瘤、及皮膚美白等適應(yīng)癥，楊梅素很有希望成為一種全新的、治療各種與心腦血管損傷關(guān)聯(lián)的疾病的特效藥等。實(shí)施例1楊梅素對(duì)JAK酶的抑制作用酶選模型測(cè)定原理酶選方法是根據(jù)Abukhalaf等在1993年報(bào)導(dǎo)的經(jīng)典方法(參見AbukhalafIKetal.JBiochemBiophysMethods.1993,26:95_104)經(jīng)適當(dāng)修改而設(shè)立。實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理為當(dāng)在反應(yīng)體系中有ATP存在時(shí)，JAK可以將ATP上的γ磷轉(zhuǎn)移至多肽底物上特定的酪氨酸上。由于反應(yīng)中使用的ATP的部分γ磷為標(biāo)記同位素32，能釋放出β射線。而參入多肽的Y磷的強(qiáng)度可以通過液閃爍儀精確測(cè)定，從而得以確定底物多肽分子磷酸化程度以及酪氨酸蛋白激酶活性。催化實(shí)驗(yàn)所用的兩種酪氨酸蛋白激酶為桿狀病毒傳染昆蟲細(xì)胞并表達(dá)合成的融合蛋白，表達(dá)蛋白經(jīng)過親和層析得以純化，純度達(dá)90%以上。激酶反應(yīng)中的底物為一段由十三個(gè)氨基酸構(gòu)成的人工合成多肽，其序列如下ΝΗ2-賴氨酸_賴氨酸_賴氨酸_賴氨酸_纈氨酸_白氨酸_谷氨酸_苯丙氨酸_酪氨酸_谷氨酸_谷氨酸_谷氨酸_谷氨酸_谷氨酸_甘氨酸-COOH實(shí)驗(yàn)操作步驟一試劑及溶液配置本發(fā)明中所有使用到的化學(xué)試劑和楊梅素和黃芩素均為純度超過99%的純品。楊梅素、楊梅甘和黃芩素均由昆明龍津藥業(yè)有限公司提供。樣品用DMSO溶解，配置成25毫摩爾儲(chǔ)液，之后用50%DMSO將楊梅素和黃芩素儲(chǔ)液稀釋至所要的濃度。底物和ATP則用去離子水分別配置成0.25毫摩爾和0.05毫摩爾(32P-ATP比活性:225yCi/ymol)的儲(chǔ)液。步驟二標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)的終體積為50微升，并包含以下各種反應(yīng)成分20ng酪氨酸蛋白激酶、15μMΑΤΡ、50μΜ底物多肽、20mMH印es、ρΗ7.5、IOmMMgCl2UmMEGTA.0.02%Brij35、0.02mg/mlBSA、0.ImMNa3VO4,2mMDTT.O.5%DMSO0若進(jìn)行IC50測(cè)定，則反應(yīng)中還應(yīng)包含以及0至0.3毫摩爾的待測(cè)楊梅素、楊梅甘和黃芩素。步驟三待以上各種成分加入到1.5毫升的反應(yīng)管后，在室溫預(yù)反應(yīng)5分鐘，最后加入ATP儲(chǔ)液以啟動(dòng)磷酸化酶學(xué)反應(yīng)。讓該反應(yīng)在室溫進(jìn)行60分鐘。步驟四于反應(yīng)管中加入25微升的2%磷酸，并立即混勻，以終止酶反應(yīng)。取10微升反應(yīng)樣品點(diǎn)至P81號(hào)磷酸纖維慮膜(P81，Disc,Waterman)上，空氣干燥5分鐘。步驟五將P81磷酸纖維慮膜移至多孔抽慮器(Millipore)，用兩毫升的150mM磷酸溶液抽慮洗滌慮膜四次，以再用兩毫升甲醇抽慮洗滌慮膜一次。將經(jīng)洗滌的慮膜在室溫空氣干燥5分鐘，之后移至液閃爍管，再加入兩毫升的閃爍液。步驟六使用液閃爍儀測(cè)定殘留在慮膜上同位素強(qiáng)度，用CPM值表示。測(cè)定及數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，專利中所述資料為其中一次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)獨(dú)立測(cè)定平均值，誤差使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％cv)。實(shí)驗(yàn)中無抑制劑對(duì)照組包含除抑制劑外的所有成份，而測(cè)試組含不同濃度的抑制劑。而空白組不加入激酶與抑制劑，而其他條件與測(cè)試組相同?；衔飳?duì)酪氨酸蛋白激酶抑制活性抗JAK酪氨酸蛋白激酶作用用相對(duì)百分比抑制率表示。y-磷參入量=實(shí)測(cè)CPM-空白CMP蛋白激酶相對(duì)活性=[測(cè)試組磷參入量/無抑制劑對(duì)照組磷參入量]X100結(jié)果與討論圖1顯示的是楊梅素和黃芩素針對(duì)JAK2酪氨酸蛋白激酶的半數(shù)抑制劑量(IC50)酶學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。楊梅素和黃芩素的抗JAK2酪氨酸蛋白激酶的50%抑制劑量分別為1.9微摩爾和5.0微摩爾(見表1)。楊梅素的抗JAK2酪氨酸蛋白激酶抑制活性比黃芩素約強(qiáng)兩倍左右。為了檢測(cè)這兩種黃酮化合物是否對(duì)酪氨酸蛋白激酶另一個(gè)成員JAK3有抑制效應(yīng)，我們進(jìn)行了針對(duì)JAK3酪氨酸蛋白激酶的半數(shù)抑制劑量(IC50)酶學(xué)測(cè)定。結(jié)構(gòu)表明楊梅素和黃芩素對(duì)JAK3也有強(qiáng)大的抑制作用，二者的半數(shù)抑制劑量(IC50)分別為1.4微摩爾和6.3微摩爾(表2)。但是糖化后的楊梅甘的50%抑制濃度卻上升至500微摩爾(表2)。因此、楊梅素和黃芩素對(duì)酪氨酸蛋白激酶的抑制作用有相同強(qiáng)度趨勢(shì)，即楊梅素抑制活性高于黃芩素，而配糖體的存在削弱了黃酮分子的抑制活性。表1楊梅素對(duì)JAK2的50%抑制劑量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1顯示的是楊梅素和黃芩素針對(duì)JAK2酪氨酸蛋白激酶的半數(shù)抑制劑量(IC50)酶學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立測(cè)定的平均值，誤差用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。表2楊梅素對(duì)JAK3的50%抑制劑量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2顯示的是楊梅素和黃芩素針對(duì)JAK3酪氨酸蛋白激酶的半數(shù)抑制劑量(IC50)酶學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立測(cè)定的平均值，誤差用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。實(shí)施例2細(xì)胞測(cè)定過程和結(jié)果細(xì)胞模型測(cè)定原理實(shí)驗(yàn)中使用新鮮制備的人體外周血T-淋巴細(xì)胞作為研究對(duì)象。由于外周血淋巴細(xì)胞膜分布有密集的細(xì)胞介素_2受體(IL2R)，而IL2R的激活主要通過JAK3的激活來轉(zhuǎn)遞。當(dāng)IL2R被細(xì)胞介素-2結(jié)合，立即激活與之結(jié)合的JAK，而JAK進(jìn)一步激活STAT5/STAT6。被激活的進(jìn)一步激活STAT5/STAT6隨即轉(zhuǎn)移之細(xì)胞核，啟動(dòng)由其控制的多個(gè)目的基因表達(dá)。而干擾素Y就是受控表達(dá)蛋白之一，它一經(jīng)合成便立即分泌到淋巴細(xì)胞外。通過測(cè)定全血中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素Y能力即可推算出藥物分子對(duì)細(xì)胞免疫功能的作用強(qiáng)度(參見ChangelianPSetal.Blood.2008,111:2155_2157)。實(shí)驗(yàn)操作步驟一取20毫升的健康人體新鮮血液于兩個(gè)10毫升試管(100微升0.3%檸檬酸鈉作為抗凝劑)。步驟二使用甩平頭離心機(jī)期125G離心10分鐘。仔細(xì)將上清(血漿)移走。所得沉淀全血細(xì)胞重新懸混于磷酸患沖液(PBS)中，使用125G離心10分鐘。如此重復(fù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PBS混懸、離心三次。之后將全血細(xì)胞混懸于培養(yǎng)液中(RPMI1640，10%人血清，50單位/毫升氨卞青霉素)。步驟三測(cè)定細(xì)胞濃度，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1-2XIO6細(xì)胞/毫升。步驟四使用所制備的淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞(1毫升)種至植于十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，之后定量加入待測(cè)化合物與細(xì)胞混勻。于37度細(xì)胞培養(yǎng)箱中(5%CO2)同溫60分鐘，之后加入IL-2(50ng/ml)刺激細(xì)胞。步驟五測(cè)定干擾素表達(dá)水平。等細(xì)胞在37度細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2)培養(yǎng)40小時(shí)后，取100微升細(xì)胞培養(yǎng)上清液測(cè)定干擾素含量。測(cè)定方法使用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行。步驟六測(cè)定及數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，所述數(shù)據(jù)為其中一次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)獨(dú)立測(cè)定平均值，誤差使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％CV)。實(shí)驗(yàn)中無抑制劑對(duì)照組包含除抑制劑外的所有成份，而測(cè)試組含不同濃度的抑制劑?；衔飳?duì)干擾素表達(dá)抑制作用強(qiáng)度使用干擾素相對(duì)合成百分率(％對(duì)照)表示干擾素相對(duì)合成百分率=[測(cè)試組干擾素含量/無抑制劑對(duì)照組干擾素含量X100]IC50值計(jì)算利用SIGMAPL0T作圖法，用化合物濃度對(duì)相應(yīng)的干擾素相對(duì)合成百分率作非線性回歸求得。結(jié)果與討論為了進(jìn)一步確認(rèn)在酶篩模型中發(fā)現(xiàn)的幾種對(duì)JAK有強(qiáng)烈抑制活性的楊梅素和黃芩素也能有效的作用于細(xì)胞，并干擾細(xì)胞的功能，實(shí)驗(yàn)中選擇了全血T-淋巴細(xì)胞模型。圖2所示為三種黃酮化合物(楊梅素、楊梅苷和黃芩素)在濃度為100微摩爾時(shí)對(duì)T-淋巴細(xì)胞分泌干擾素能力的抑制作用擋案分析。楊梅素在100微摩爾時(shí)對(duì)T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素抑制作用達(dá)到98%以上，黃芩素在同一濃度下對(duì)淋巴細(xì)胞分泌干擾素的能力也有明顯的影響(T-淋巴細(xì)胞分泌干擾素能力降低約45%左右)。而楊梅苷對(duì)淋巴細(xì)胞功能無顯著抑制作用。為了進(jìn)一步評(píng)估楊梅素在細(xì)胞上的作用強(qiáng)度，我們使用外周血T-淋巴細(xì)胞模型對(duì)楊梅素和黃芩素兩種化合物的IC50進(jìn)行了測(cè)定(表3)。楊梅素和黃芩素的50%抑制濃度分別為2.8微摩爾和57微摩爾。因此，細(xì)胞模型分析表明楊梅素對(duì)淋巴細(xì)胞功能的抑制活性遠(yuǎn)強(qiáng)于黃芩素。表3楊梅素對(duì)外周血T-淋巴細(xì)胞干擾素合成50%抑制劑量測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3是楊梅素對(duì)外周血T-淋巴細(xì)胞免疫功能的抑制作用的50%抑制劑量測(cè)定總結(jié)。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)洗滌處理的全血細(xì)胞種植于12-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，之后在指定的培養(yǎng)孔細(xì)胞旋浮液中加入不同濃度的楊梅素、楊梅甘或黃芩素(終濃度由0至100微摩爾)，在37C培養(yǎng)箱同溫60分鐘。之后于各孔中加入等劑量的IL-2以刺激全血細(xì)胞中T-淋巴細(xì)胞分泌干擾素。上述IC50為三次實(shí)驗(yàn)平均值，誤差用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。由于楊梅甘的作用極差，故而其IC50值在本研究設(shè)定條件下無法確定(n/a)。實(shí)施例3楊梅素對(duì)兔血小板聚集及凝血功能的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)日本大耳兔，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)滇實(shí)動(dòng)證2005-0008，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。供試樣品實(shí)驗(yàn)用樣品楊梅素、燈盞花乙素(S⑶)由昆明龍津藥業(yè)有限公司提供，臨用前用生理鹽水溶解配制成1.4mg/ml混懸液，然后2倍稀釋至一定體積備用。試劑及試劑盒二磷酸腺苷二鈉(ADPNa2)購自Solarbio公司；凝血酶原時(shí)間(PT)、纖維蛋白原(FB)、凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)試劑盒為法國STAGO公司進(jìn)口配套試劑盒。主要儀器設(shè)備四通道血小板聚集儀(LBY-NJ，北京普利生儀器有限公司)；全自動(dòng)凝血分析儀(STA-R，法國STAGO公司)；真空采血管(檸檬酸鈉91，湖南瀏陽醫(yī)用儀器廠)。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分組及給藥選用健康日本大耳白兔，雌雄兼用，體重2_3kg，分籠置動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室室溫飼養(yǎng)。隨機(jī)分為5組生理鹽水對(duì)照組，楊梅素樣品低、中、高劑量組(3.5、7、14mg/kg,日)，燈盞花乙素對(duì)照組(7mg/kg，日)。除生理鹽水對(duì)照組每天灌胃(ig.)給予生理鹽水外，各組每天ig給予相應(yīng)受試品一次，聯(lián)系7天。最后一次給藥結(jié)束1小時(shí)后，從清醒兔頸動(dòng)脈取血樣，進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)定。樣品楊梅素給藥劑量主要根據(jù)樣品提供單位提供的燈盞花乙素任用劑量(50mgX3次/日，按人60kg體重計(jì)，即2.5mg/kg，口服)為依據(jù)設(shè)計(jì)，以人用劑量為中劑量計(jì)算，兔中劑量(7mg/kg)約為人劑量的2.8倍。血小板最大聚集率測(cè)定將兔全血血樣分別經(jīng)800和3000rpm離心IOmin得富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。參照Born氏比濁法，按照四通道血小板聚集儀程序操作，加入ADP(IOuM)誘導(dǎo)血小板聚集，記錄血小板最大聚集率。凝血功能檢測(cè)按照有關(guān)試劑盒操作規(guī)程，在全自動(dòng)凝血分析儀上測(cè)定PT、TT、FB和APTT四項(xiàng)指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)處理采用SigmaStat3.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)行單因素方差分析(One-wayAN0VA)或秩和檢驗(yàn)(One-wayANOVAonRank)進(jìn)行組間差異分析，檢驗(yàn)水平為0.05。結(jié)果與討論如表4所示，楊梅素樣品(3.5、7、14mg/kg，日，ig)，對(duì)ADP誘導(dǎo)正常兔血小板聚集有一定的抑制作用趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)各組間無顯著差異。實(shí)驗(yàn)劑量的楊梅素樣品對(duì)正常兔凝血功能的TT、APTT及FB有一定的延長和增加的趨勢(shì)，對(duì)PT有一定縮短的作用趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上各組間沒有顯著差異。等劑量的樣品楊梅素與燈盞花乙素沒有明顯差異。在本次實(shí)驗(yàn)中，各組間沒有觀察到明顯差異，分析原因主要有1)藥物給藥劑量不夠；2)藥物口服灌胃效果不強(qiáng)。這些分析供以后實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考。表4灌胃給予樣品楊梅素對(duì)正常兔血小板聚集及凝血功能影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注血小板聚集采用腺苷二磷酸(ADP)(IOuM)誘導(dǎo)。各組數(shù)據(jù)表示為[±SE,采用SigmaSata3.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，先進(jìn)行方差齊性分析，然后進(jìn)行單因素方差分析(One-wayAN0VA)或秩和檢驗(yàn)(One-wayANOVAonRank)進(jìn)行組間差異分析，檢驗(yàn)水平為0.05。實(shí)施例4楊梅素對(duì)大鼠離體冠脈及腦基底動(dòng)脈收縮反應(yīng)的舒張作用動(dòng)物SD大鼠，體重250300g，雄性，許可證號(hào)SYXK(陜)2007-003，購西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。藥品及試劑楊梅素由昆明龍津藥業(yè)有限公司提供，用MOPS-PSS配制成不同濃度待用。NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4,Na2HPO4,EDTA,D-glucose均購自天津化學(xué)試劑三廠(分析純)，3-[N-morpholino]-propanesulfonicacid(MOPS)購自ShangHaiMdmyScience&Technologies.Ltd。血栓受體激動(dòng)劑(U46619)購自Cayman公司。WireMyographSystemDMT,DanishMyoTechnologyCo,PowerLab^igid錄和分析系統(tǒng)，澳大利亞Adinstruments公司；MoticSMZ168-TL解剖顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；維納斯眼科剪，江蘇蘇科醫(yī)療器械有限公司；顯微鑷WA3010，上海醫(yī)療器械集團(tuán)；MettlerToledoFE20計(jì)；MettlerToledoAL104電子天平等。工作液的配置MOPS-PSS含(mM)=NaCl,140.O；KCl，4.7；CaCl2,1.6；MgSO4,1.2；3-[N-morpholino]-propanesulfonicacid(MOPS)，1.2；Na2HPO4,1.4；EDTA,0.02；D-glucose，5.6，37°C調(diào)PH至7·4。M0PS-KPSS含(mM)=NaCl,84.7；KCl,60.O；CaCl2,1.6；MgSO4,1.2；3-[N-morphoIino]-propanesulfonicacid(MOPS)，1.2；Na2HPO4,1.4；EDTA,0.02；D-glucose,5.6，37°C調(diào)PH至7.4。血管環(huán)的制備SD大鼠麻醉處死，迅速取出腦組織和心臟，分別浸入冷MOPS-PSS液中，解剖顯微鏡下分離出腦基底動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈，剝離血管周圍黏附組織。將血管剪成約Imm長的動(dòng)脈環(huán)段。在顯微鏡下，用兩根直徑60um的鋼絲穿過動(dòng)脈環(huán)，掛置在DMT的8個(gè)浴槽中，每個(gè)浴槽有兩個(gè)相反方向固定的金屬裝置，其中一個(gè)連接張力換能器，另一個(gè)連接微調(diào)裝置(調(diào)節(jié)預(yù)負(fù)荷張力)。浴槽含有MOPS-PSS液，恒溫37°C，持續(xù)通含95%02和5%CO2的混合氣體，pH保持7.4。調(diào)節(jié)腦基底動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈環(huán)的靜息負(fù)荷分別為1.5mN和ImN,每20min換液一次，穩(wěn)定1.5h后加M0PS-KPSS(含K+60mM)收縮血管，連續(xù)兩次，檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮性，兩次收縮幅度相差<10%的血管環(huán)用于實(shí)驗(yàn)(參見ZhangWetal.Basic&ClinicalPharmcaology&Toxicology.2007,101(6):401_406)。楊梅素的舒張作用實(shí)驗(yàn)血管平衡好檢測(cè)活性后，依次加入M0PS-KPSS(含K+60mM)5ml,U46619(IuM)預(yù)收縮血管，待收縮達(dá)峰值且穩(wěn)定時(shí)，用濃度累積法加入受試藥楊梅素(10IOOuM)，記錄楊梅素的舒張量效曲線。統(tǒng)計(jì)分析動(dòng)脈環(huán)的張力用其相對(duì)最大收縮值的百分?jǐn)?shù)表示，用SigmaPlot繪圖軟件進(jìn)行作圖，全部數(shù)據(jù)表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤。樣品楊梅素對(duì)M0PS-KPSS介導(dǎo)收縮的舒張作用楊梅素舒張大鼠冠狀動(dòng)脈的作用冠狀動(dòng)脈檢測(cè)合格之后，加入M0PS-KPSS(含K+60mM)5ml，待收縮達(dá)峰值且穩(wěn)定時(shí)，用濃度累積法加入受試藥楊梅素(10IOOuM)，由于SCU舒張作用不明顯，因此采用加入相應(yīng)體積溶劑為溶媒對(duì)照組。如表5所示，血管的相對(duì)收縮值降為19.06士4.72%。楊梅素能舒張KCl所致收縮，并呈濃度依賴性。EC50值為0.38士0.05mM。表5楊梅素在M0PS-KPSS介導(dǎo)冠狀動(dòng)脈收縮上的量效曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注Jltsem(標(biāo)準(zhǔn)誤)，control(對(duì)照)m=8；楊梅素n=8。樣品楊梅素舒張大鼠腦基底動(dòng)脈作用腦基底動(dòng)脈檢測(cè)合格之后，加入M0PS-KPSS(含K+60mmol·Γ1)5ml，待血管收縮達(dá)峰值且穩(wěn)定時(shí)，用累積濃度加樣法給浴漕中加入楊梅素(10IOOOuM)，由于S⑶舒張作用不明顯，因此采用加入相應(yīng)體積溶劑為溶媒對(duì)照組。如表6所示，血管的相對(duì)收縮值降為4.81士1.43%。楊梅素能舒張KCl所致收縮，并呈濃度依賴性。EC50值為0.21士0.02mM。表6楊梅素在M0PS-KPSS介導(dǎo)腦基底動(dòng)脈收縮上的量效曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注(標(biāo)準(zhǔn)誤)，control(對(duì)照)n=7；楊梅素n=8。樣品楊梅素舒張U46619介導(dǎo)的收縮反應(yīng)舒張大鼠冠脈作用加入U(xiǎn)46619(luM)，血管收縮達(dá)峰值且穩(wěn)定，用累積濃度加樣法給浴漕中加入楊梅素及SCU。如表7所示，楊梅素及SCU對(duì)冠狀動(dòng)脈的相對(duì)收縮值降為9.93士2.28%和43.52士6.97%。提示楊梅素與S⑶均能舒張U46619所致收縮，并呈濃度依賴性。EC50值為0.18士0.02mM和0.39士0.1ImM,二者有顯著性差異(P<0.05)。表7楊梅素、燈盞花乙素在U46619介導(dǎo)冠狀動(dòng)脈收縮上的量效曲線燈盞花乙素_楊梅素_濃度舒張濃度舒張(uM)(%luMU46619)(uM)(%luMU46619)1087.65±4.391093.73±2.023078.96±4.913086.17士3.0410068.91士7.3610070.51±5.9220062.29±8.7920045.75±7.4540055.43士8.2940022.81±3.19100043.52士6.9710009.93士2.28注〕±(標(biāo)準(zhǔn)誤)，control(對(duì)照)n=7；楊梅素n=8。舒張大鼠腦基底動(dòng)脈作用加入血栓素受體激動(dòng)劑U46619(luM)，血管收縮達(dá)峰值且穩(wěn)定，用累積濃度加樣法給浴漕中加入楊梅素及SCU。如表8所示，血管相對(duì)收縮值分別降為5.62士1.52%和18.93士5.39%。楊梅素與S⑶均能舒張U46619所致收縮，并呈濃度依賴性。EC50值為0.18士0.03mM禾口0.33士0.05mM，二者有顯著性差異(P<0.05)。能舒張KCl所致收縮，并呈濃度依賴性。EC50值為0.21士0.02mM。表8楊梅素在U46619介導(dǎo)腦基底動(dòng)脈收縮上的量效曲線燈盞花乙素楊梅素濃度舒張濃度舒張(uM)(%luMU46619)(uM)(%luMU46619)1089.95±4.461088.50±3.343085.32士6.333074.50±3.3410074.66±6.7110059.27士6.9020059.84±7.9720039.38±6.8840041.36±6.2240013.10±3.22100018.93士5.3910005.62±1.52注(標(biāo)準(zhǔn)誤)，control(對(duì)照)n=8；楊梅素n=8。結(jié)果與討論在本實(shí)驗(yàn)中，樣品楊梅素對(duì)兩種不同收縮劑所介導(dǎo)的離體大鼠冠狀動(dòng)脈、腦基底動(dòng)脈收縮均有舒張作用，在高濃度時(shí)幾乎能舒張90%，而且其舒張作用明顯強(qiáng)于SCU，提示楊梅素具有較SCU更強(qiáng)的心腦血管擴(kuò)張作用。說明下述實(shí)施例中5-11的楊梅素都是由龍津制藥自制和提供。實(shí)施例5:楊梅素顆粒配方楊梅素2000g蔗糖5000g糊精400g乙醇適量按普通制粒法制粒，分裝成1000袋(每袋約7.4g)，每袋含楊梅素2000mg。每次食用一袋，每日13次。實(shí)施例6:楊梅素膠丸配方楊梅素75g聚乙二醇-400300g按普通膠丸(軟膠囊)劑制備方法制備，每粒內(nèi)容物重約375mg，可得1000粒，每粒含楊梅素75mg。每次1-2粒，每天1-3次。實(shí)施例7楊梅素凍干粉針配方楊梅素25g甘露醇IOOg按普通凍干法制備成凍干制劑，可制得1000支25mg之規(guī)格的楊梅素凍干粉針。實(shí)施例8楊梅素凍干粉針配方楊梅素IOOg卵磷脂85g甘露醇IOOg按普通凍干法制備成凍干制劑，可制得1000支IOOmg之規(guī)格的楊梅素凍干粉針。實(shí)施例9復(fù)方楊梅素口服液配方楊梅素360g阿魏酸155g蜂蜜IOOOg蒸餾水加至IOkg按普通口服液制備方法制備，可得1000支(每支約重15g)的口服液。實(shí)施例10楊梅素滴丸配方楊梅素IOgPEG-6000200g按普通滴丸劑制備方法制備，每丸重約22.8mg，可得約10000粒，每丸含楊梅素約lmg，每次服用1-20丸。實(shí)施例11楊梅素口腔速崩片配方(1000片)楊梅素(粒徑<35μm)20g微晶纖維(100目)120g乳糖(120目)54g羧甲纖維素鈉(80目)IOg聚乙二醇-10000(60目)8g山梨醇(120目)40g草莓香精0.Ig制備工藝將楊梅素和上述各種原料進(jìn)行超細(xì)化，按配方充分混勻后直接壓片，即得每片含楊梅素(規(guī)格)20mg的口腔速崩片。本發(fā)明提供的產(chǎn)品經(jīng)藥學(xué)研究，其結(jié)果如下楊梅素制劑的穩(wěn)定性用實(shí)施例5、6、7、8、9的樣品在室溫下避光保存，分別放置1、2、3、6、12個(gè)月，按時(shí)檢查，外觀基本不變，有效成分楊梅素經(jīng)檢驗(yàn)也未發(fā)生變化。因此，該楊梅素制劑各種處方制得的產(chǎn)品均可達(dá)到1年的保質(zhì)期。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定和鑒別等參照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表9所示表9樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果~17~“樣品含量、鑒別“<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例7合格合格合格合格合格實(shí)施例8合格合格合格合格合格實(shí)施例9合格合格__^_合格結(jié)果表明本發(fā)明提供的樣品，經(jīng)過初步穩(wěn)定性考察，產(chǎn)品質(zhì)量基本穩(wěn)定，可達(dá)一年以上。雖然本發(fā)明以示例性實(shí)施例和實(shí)施方式進(jìn)行描述，但所公開的系統(tǒng)和方法并不局限于這些示例性實(shí)施例/實(shí)施方式。而且，可以理解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可以從以上描述中，且在沒有背離目前公開的精神和范圍的情況下，對(duì)所公開的系統(tǒng)和方法進(jìn)行修飾、改變和改善。因此，本發(fā)明明顯地包括包含上述在其范圍內(nèi)的所有修飾、改變和改善。權(quán)利要求一種如(I)所示的化合物的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療或預(yù)防因酪氨酸激酶活躍而引起的疾病的藥物FSA00000099527800011.tif2.據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療因酪氨酸激酶活躍而引起的缺血性心腦血管疾病的藥物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療因酪氨酸激酶活躍而引起的損傷性心腦血管疾病的藥物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療因酪氨酸激酶活躍而引起的腫瘤疾病的藥物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療因酪氨酸激酶活躍而引起的皮膚疾病的藥物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療因酪氨酸激酶活躍而引起的疾病的藥物的組合和/或配方。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物用于制備治療因酪氨酸激酶活躍而引起的疾病的藥物時(shí)，有效劑量的范圍在lmg-2000mg。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物可制成醫(yī)療上可接受的用作酪氨酸激酶抑制劑的口服制劑、注射劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑、噴霧劑、洗劑、栓劑、滴丸劑、合齊U、擦劑、貼劑、膜劑、紙型劑、混懸劑、酊劑、干糖漿劑、泡騰片、硬膏劑、軟膏劑、糖漿劑、乳劑、散劑、緩釋、控釋制劑、靶向制劑及其它給藥途徑的制劑和化妝品。全文摘要本發(fā)明涉及楊梅素用于酪氨酸激酶(JAK)抑制劑的藥物的應(yīng)用，具體的說就是楊梅素在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，本發(fā)明也提供了楊梅素的不同劑型，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的理化試驗(yàn)。文檔編號(hào)A61P9/00GK101804046SQ20101016710公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年5月10日優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日發(fā)明者樊獻(xiàn)俄申請(qǐng)人:樊獻(xiàn)俄