專利名稱：納米顆粒、制備納米顆粒和使用納米顆粒進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
公開的主題內(nèi)容總體上涉及納米顆粒、制備納米顆粒和細(xì)胞標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
超順磁性氧化鐵(SPIO)是MRI造影劑，通常以納米顆粒形式用于干細(xì)胞標(biāo)記的 用途。這種納米顆粒可以用葡聚糖進(jìn)行包被并且可在臨床上用于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。于2003年 1月2日提交的、發(fā)明人為Gaw和Jowphson的PCT/US03/00051描述了胺官能化的超順磁 性納米顆粒和用葡聚糖包被納米顆粒。于2005年12月觀日公布的Persoons等的英國(guó)專 利第GBM15374號(hào)描述了將納米顆粒用于遞送生物活性物質(zhì)。Chunfu Zhang等于2006年 11月30日在美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志(American Chemical Society)發(fā)表的題目為“Silica-and Alkoxysilane-Coated Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide nanoparticles :A Promising Tool To Label Cells for Magnetic Resonance Imaging( 二氧化娃禾口燒氧 基硅烷包被的超小超順磁性氧化鐵納米顆粒用于核磁共振成像標(biāo)記細(xì)胞的有前景的工 具)”的文獻(xiàn)描述了將二氧化硅包被的納米顆粒用于細(xì)胞標(biāo)記。發(fā)明概述本公開提供的SPIO納米顆?？梢赃m用于標(biāo)記細(xì)胞。在實(shí)施方案中，該納米顆?？?以包含氧化鐵核心，可以包含包被并可以被官能化。多面體超順磁性納米顆粒包含金屬氧化物。在實(shí)施方案中，該多面體超順磁性納米顆?？梢跃哂羞x自以下的形狀簡(jiǎn)單立方 的、體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正交的、單面心正 交的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方的、以及斜方六 面體、單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三角面體、菱面體 和四面體。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒，其中金屬選自 鈷、鈦、錳、鎂、鎳、銅、鋅、釩、金、鈀、鉬和鐵。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆 粒被包被并且所述包被包含選自以下的材料二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇 酸、聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒，其中用選自以下 的官能性基團(tuán)將所述納米顆粒官能化胺、銨、烷基胺、二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、 巰基、硫醚、烯和炔。
在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆 粒通過(guò)包括將超順磁性金屬氧化物加熱至高于50°C、80°C、100°C、120°C、140°C、160°C、 180200或高于200°C的溫度以上的方法制備。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含超 順磁性氧化鐵。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中該納米顆?；旧鲜?立方體。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述納米顆粒的直徑 范圍選自以下約Inm-約500nm、約Inm-約300nm、約Inm-約150nm、約Inm-約50nm、約 Inm-約 IOnmjA 3nm-約 IOnm 和約 5nm-約 8nm。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述納米顆粒的直徑 為約3nm-約10nm。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述金屬氧化物被包 含在核心中并且其中所述納米顆粒還包含與所述核心相聯(lián)的二氧化硅包被。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述納米顆粒具有許 多反應(yīng)性伯胺基。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述金屬氧化物被包 含在核心中并且其中所述納米顆粒還包含與所述核心相聯(lián)的二氧化硅包被。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述納米顆粒具有許 多反應(yīng)性伯胺基。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的納米顆粒，其中所述納米顆粒與基團(tuán) 綴合，所述基團(tuán)包含選自以下的分子核酸、蛋白、抗體、凝集素、碳水化合物、抗生素、藥物、 抗癌藥和傷口愈合藥物。在實(shí)施方案中，公開了合成多面體超順磁性金屬氧化物納米顆粒的方法，所述方 法包括下述步驟制備超順磁性金屬氧化物的無(wú)定形納米顆粒并將所述無(wú)定形納米顆粒加 熱至大于約100°c，持續(xù)約8小時(shí)以上。在實(shí)施方案中，公開了合成多面體超順磁性金屬氧化物納米顆粒的方法，所述方 法包括下述步驟制備超順磁性金屬氧化物的無(wú)定形納米顆粒并將所述無(wú)定形納米顆粒高 壓滅菌。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述納米顆粒具有選自以 下的形狀簡(jiǎn)單立方的、體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體 心正交的、單面心正交的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心 六方的、以及斜方六面體、單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、 偏三角面體、菱面體和四面體。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述金屬選自鈷、鈦、錳、 鎂、鎳、銅、鋅、釩、金、鈀、鉬和鐵。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，所述方法還包括用材料包被所 述納米顆粒，所述材料包含選自以下的成分二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇 酸、聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。
在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，所述方法還包括用選自以下的 官能性基團(tuán)將所述納米顆粒官能化胺、銨、烷基胺、二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、巰 基、硫醚、烯和炔。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，所述方法還包括將第一金屬離 子和第二金屬離子的混合物共沉淀來(lái)制備所述無(wú)定形納米顆粒。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，所述方法包括在壓力下將所述 沉淀物加熱至至少約100°c并持續(xù)至少約10小時(shí)。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述第一金屬離子和第二 金屬離子是相同金屬的不同價(jià)態(tài)。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中第一金屬離子是!^e(II)離 子并且所述第二金屬離子是狗(III)離子。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，所述方法還包括用二氧化硅包 被所述納米顆粒。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，所述方法還包括用胺基包被所 述納米顆粒。包含聯(lián)合了藥學(xué)可接受的載體的納米顆粒的藥物組合物。標(biāo)記細(xì)胞的方法，包括(a)用多面體超順磁性納米顆粒標(biāo)記細(xì)胞；和(b)檢測(cè)所述納米顆粒。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述納米顆粒具有選自以 下的形狀簡(jiǎn)單立方的、體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體 心正交的、單面心正交的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心 六方的、以及斜方六面體、單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、 偏三角面體、菱面體和四面體。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述金屬選自鈷、鈦、錳、 鎂、鎳、銅、鋅、釩、金、鈀、鉬和鐵。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述納米顆粒被包被并且 所述包被包含選自以下的材料二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚N-異丙 基丙烯酰胺(PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中用選自以下的官能性基團(tuán) 將所述納米顆粒官能化胺、銨、烷基胺、二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、巰基、硫醚、烯 和炔。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述納米顆粒包含超順磁 性氧化鐵核心和具有伯胺基的二氧化硅包被。在實(shí)施方案中公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述納米顆粒的直徑為約 lnm-25nm。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述細(xì)胞選自間充質(zhì)細(xì) 胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、惡性腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨 細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腱細(xì)胞、足細(xì)胞、球旁細(xì)胞、球內(nèi)系膜細(xì)胞/球外系膜細(xì)胞、腎近端小管刷狀緣細(xì)胞(Kidney proximal tubule brush border cell)、致密斑細(xì)胞、胃粘膜主細(xì)胞、壁細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、帕內(nèi)特細(xì)胞(Paneth cell)、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞、APUD細(xì)胞、肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffer cell)、心肌細(xì) 胞、周細(xì)胞、肺細(xì)胞、I型肺細(xì)胞、II型肺細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形 膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、濾泡旁細(xì)胞、甲狀旁腺主細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、淋巴B/ T T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多葉核嗜中 性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、凝血細(xì)胞、巨核細(xì)胞和樹突細(xì) 胞。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體的 細(xì)胞。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的方法，其中所述方法包括選自以下的 步驟體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞，離體標(biāo)記細(xì)胞，將納米顆粒進(jìn)行口服遞送、局部遞送、經(jīng)皮遞送、腹膜 內(nèi)遞送、眼內(nèi)遞送、顱內(nèi)遞送、腦室內(nèi)遞送、大腦內(nèi)遞送、陰道內(nèi)遞送、子宮內(nèi)遞送、鼻內(nèi)遞 送、直腸遞送、胃腸外遞送、皮下遞送、血管內(nèi)遞送，體內(nèi)觀察細(xì)胞，離體觀察細(xì)胞，定位納米 顆粒，用磁場(chǎng)定位納米顆粒和將含納米顆粒的細(xì)胞與不含納米顆粒的細(xì)胞分離。在實(shí)施方案中，治療需要治療的個(gè)體的方法，所述治療包括，給予所述個(gè)體聯(lián)合了 藥學(xué)可接受的實(shí)驗(yàn)的任何其他實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒，所述納米顆粒與治療上有效 的基團(tuán)綴合。在實(shí)施方案中，公開了任何其它實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒在制備藥物中的用 途。根據(jù)下文對(duì)所選的實(shí)施方案的詳細(xì)描述結(jié)合附圖，本文主題內(nèi)容的特征和優(yōu)勢(shì)將 更加清楚。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以在不同方面對(duì)本文所公開和要求保護(hù)的主題內(nèi)容進(jìn)行改動(dòng)，但 這不脫離本文權(quán)利要求的范圍。因此，附圖和描述應(yīng)當(dāng)認(rèn)為在本質(zhì)上是說(shuō)明性的，不是作為 限制性的，并且權(quán)利要求中給出本主題的全部范圍。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖IA是實(shí)施方案的納米顆粒的TEM視圖。圖IB是圖IA的納米顆粒的EDX譜。圖IC是圖IA的納米顆粒的XRD譜。圖ID是圖IA的納米顆粒的VSM譜。圖2A是間充質(zhì)干細(xì)胞群體中的納米顆粒分布的光學(xué)顯微鏡成像。圖2B是來(lái)自圖2中一部分的標(biāo)記的細(xì)胞的高倍視圖。圖3A是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的4，200XTEM成像。圖;3B是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的11，500XTEM成像。圖3C是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的16，500XTEM成像。圖3D是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的160，000ΧΤΕΜ成像。圖4A是未標(biāo)記的成骨分化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的100X光學(xué)顯微鏡成像。圖4B是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的成骨分化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的100X 光學(xué)顯微鏡成像。圖4C是未標(biāo)記的成脂分化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的200X光學(xué)顯微鏡成像。
圖4D是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的成脂分化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的200X 光學(xué)顯微鏡成像。圖4E是未標(biāo)記的成軟骨分化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的200X光學(xué)顯微鏡成像。圖4F是用實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記的成軟骨分化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 200 X光學(xué)顯微鏡成像。圖5A是用SPIO-SiA納米顆粒標(biāo)記的成團(tuán)的間充質(zhì)干細(xì)胞的一系列梯度回波磁 共振成像。圖5B是SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的成團(tuán)的間充質(zhì)干細(xì)胞的一系列梯度回波磁 共振成像。圖6A是剛植入MSC后，兔腦矢狀面的T2W 2D自旋回波成像。圖6B是植入后8周，圖6A的兔腦矢狀面的T2W 3D veno-BOLD成像。圖7A是SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC植入腦中后2天，在2D梯度回波T2W 成像上產(chǎn)生的信號(hào)空白(signal void)。圖7B是MSC植入后12周獲取的與圖7A相同的視圖。圖8A是SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC植入左側(cè)豎脊肌中后2天，在2D梯度 回波T2W成像上產(chǎn)生的信號(hào)空白。圖8B是MSC植入后12周獲取的與圖8A相同的視圖。圖9A是用SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記MSC后3周，MSC的光學(xué)顯微鏡視圖。圖9B與圖9A是相同的視圖，但顯示的是用PEG-6000包被的SPIO標(biāo)記后3周的 MSC。

圖10是SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC植入兔左側(cè)豎脊肌中后12周的顯微 鏡視圖。圖IOA是用SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記MSC后3周，MSC的光學(xué)顯微鏡視圖。圖IOB是與圖IOA相同的視圖，但顯示的是用SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記后3周的MSC。圖11是實(shí)施方案的納米顆粒(Fe3O4-NH2，無(wú)二氧化硅包被)的TEM視圖。圖12是實(shí)施方案的納米顆粒(Mr^e2O4-NH2,無(wú)二氧化硅包被)的TEM視圖。發(fā)明的詳細(xì)描述術(shù)語(yǔ)在本公開中，下述術(shù)語(yǔ)具有下文所述的含義。在本公開中，除非另作說(shuō)明，說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用的所有表示數(shù)量或成 分、性質(zhì)的測(cè)量等的數(shù)值在所有情況下應(yīng)當(dāng)理解為用術(shù)語(yǔ)“約”進(jìn)行修飾。因此，除非文中 說(shuō)明不是約數(shù)或根據(jù)上下文必然不能為約數(shù)，本公開所示的數(shù)值參數(shù)是近似值，該近似值 可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本公開的教導(dǎo)試圖獲得的所需性質(zhì)和測(cè)量和定量的誤差而 變化。并不是將等同物的教條的應(yīng)用限制到本權(quán)利要求的范圍，至少應(yīng)當(dāng)根據(jù)所報(bào)道的有 效位的數(shù)值并且通過(guò)應(yīng)用常規(guī)舍入方法來(lái)解釋每個(gè)數(shù)值參數(shù)。盡管闡明本公開的寬范圍數(shù) 值范圍和參數(shù)是近似值，但具體實(shí)例中所示的數(shù)值可以被寬泛地理解，但只能到符合本公 開的有效性以及所公開的和要求保護(hù)的主題內(nèi)容與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別的程度。在本公開中，詞語(yǔ)“包括”以其非限制性含義使用，表示包括該詞語(yǔ)后面的項(xiàng)，而不 排除未具體提及的項(xiàng)。不定冠詞“a”涉及的元件不排除存在多于一個(gè)的所述元件的可能性，除非文中明確要求有一個(gè)且僅有一個(gè)元件。在本公開中，通過(guò)端點(diǎn)表述的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)，其中包括 所有整數(shù)(whole number)，所有整數(shù)(Integer)和所有分?jǐn)?shù)的中間值(例如，1_5包括1、 1. 5、2、2. 75,3,3. 80,4 和 5 等)。在本公開中，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)形式，除非文中明確指示不包 括復(fù)數(shù)。因此，例如，當(dāng)涉及含有“化合物(a compound)”的組合物時(shí)，包括兩種或更多種化 合物的混合物。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“或”通常以包括“和/或”的含義使用，除非文中明確指示不是 這樣。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“包被(coat) ”、“包被(coating) ”、“包被(coated)，，或相似術(shù) 語(yǔ)是指部分地或全部地包圍或封裝納米顆粒的超順磁性核心的材料層。在實(shí)施方案中，所 述包被可以是或可以包含二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚N-異丙基丙 烯酰胺(PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和/或藻酸鹽。在實(shí)施方案中，所述包被可以 是二氧化硅包被以及可以包含包裹或部分包裹納米顆粒的磁性核心的二氧化硅層。二氧化 硅可以為任何形式，結(jié)晶的或無(wú)定形的，并且在實(shí)施方案中，其可以與其他化學(xué)品結(jié)合。在 實(shí)施方案中，可以用硅酸甲酯(TMOS)而不是硅酸乙酯(TEOS)處理金屬氧化物核心來(lái)實(shí)現(xiàn) 二氧化硅包被。對(duì)于二氧化硅包被的SPIO-SW2納米顆粒而言，可以使用TMO或TEOS。對(duì) 于胺和二氧化硅包被的SPIO-SiO2-NH2納米顆粒而言，可以使用氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙 基三甲氧基硅烷、氨丁基三乙氧基硅烷、氨丁基三甲氧基硅烷、氨戊基三乙氧基硅烷、氨戊 基三甲氧基硅烷和本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易選擇的任何其他的氨烷基三烷氧基硅烷。在本公開中，材料或結(jié)構(gòu)是“多面體的”或“結(jié)晶的”或是晶體形式等表述，包括可 以具有簡(jiǎn)單、體心或面心形式的和規(guī)則與不規(guī)則形式的材料或結(jié)構(gòu)，并且包括簡(jiǎn)單立方的、 體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正交的、單面心正交 的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方的和斜方六面體晶 體和晶格，并且可以是單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三 角面體、菱面體或四面體形式。在本公開中，材料采用或可以采用任何具體的晶體或多面體 結(jié)構(gòu)的形式的表述包括這樣的形式其本質(zhì)上采用這些結(jié)構(gòu)，但可以包括采用這些模型結(jié) 構(gòu)中的較小的偏差和不規(guī)則的情況。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“晶體”表示具有特征性內(nèi)部結(jié)構(gòu)并且被基本上對(duì)稱排列的平面 包圍的固體，所述平面以明確的并且特征性的角度相交。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“多面體”表示具有多個(gè)面的立體圖形。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“沉淀(precipitate)或沉淀物(precipitate) ”表示通過(guò)試劑 的方法從溶液中制備固體物質(zhì)的過(guò)程，或由此制備的固體或材料并且包括在從溶液中的任 何沉降或分離之前溶液中的由此制備的物質(zhì)。在本公開中，除非本文明確需要，否則“鹽”表示可溶性鹽。應(yīng)當(dāng)理解到，用于超順 磁性納米顆粒和材料的沉淀合適的金屬鹽包括任何常規(guī)的金屬鹽。合適的鹽的非限制性常 見實(shí)例可以包括在不同的實(shí)施方案中可以使用的硫酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽和硝酸鹽。在本公開中，當(dāng)表明金屬的價(jià)態(tài)形式或離子時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解到，在實(shí)施方案中這可以 包含在鹽的形式中。因此，作為示例，F(xiàn)e(II)表示可以與任何合適的鹽陰離子化合的或鹽陰離子的化合形式的二價(jià)狗離子。在本公開中，納米顆粒表示具有磁性材料“核心”的材料，在某些實(shí)施方案中，所述 磁性材料“核心”可以被封裝在不同材料的外部包被層內(nèi)。在實(shí)施方案中，所述納米顆粒可 以在所述核心上或所述包被上具有相關(guān)的反應(yīng)性伯胺基或其它基團(tuán)。這些基團(tuán)可以用于隨 后的反應(yīng)，例如，用于連接生物分子。在連接生物分子之前，所述納米顆粒的總體尺寸小于 約lOOnm。所述納米顆?；蚣{米顆粒的核心的總體直徑可以為約Inm-lOOnm、約l-50nm、約 l-20nm、約 5_15nm、約 50_100nm 或可以大于約 1、5、10、20、50 或 IOOnm 或小于約 100,150, 100、50、40、30、20、10 或 5nm，或者總體直徑可以高至或大于約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30nm。盡管寬范圍的尺 寸是可能的，但在具體的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有選自以下范圍的直徑約Inm-約 500nm、約 Inm-約 300nm、約 Inm-約 150nm、約 Inm-約 50nm、約 lnm-10nm、約 3nm-約 IOnm 禾口 約5nm-8nm。在實(shí)施方案中，平均納米顆粒尺寸(直徑)可以為約5-約15nm。在可選實(shí)施 方案中，所述納米顆粒的直徑可以為約1-2、2-4、5-7、8-10、10-12、12-15、16-18、18-21nm， 或直徑可以小于約Inm或大于約20nm?？梢酝ㄟ^(guò)原子力顯微鏡的激光散射或其它適合的技 術(shù)測(cè)定尺寸。當(dāng)本文使用術(shù)語(yǔ)“顆粒”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解到，除非文中明確說(shuō)明，否則該術(shù)語(yǔ)是指本文 所定義的“納米顆粒”并且可以與“納米顆?！被Q使用。在實(shí)施方案中，所述納米顆粒或納米顆粒核心可以是單分散性的(每個(gè)納米顆粒 單一磁性材料晶體，所述磁性材料例如金屬氧化物，例如超順磁性氧化鐵)或多分散性的 (每個(gè)納米顆粒多個(gè)晶體，例如2、3或4或更多個(gè))。所述金屬氧化物可以是或可以包含總 體直徑為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 沈、27、觀、四或30nm或更大的晶體。在實(shí)施方案中，可以用廣泛的材料包被所述納米顆粒，所述材料包括但不限于反 應(yīng)性的、惰性的、兩性的、極性的和非極性的、生物活性材料或化學(xué)活性材料，并且在實(shí)施方 案中，可能的包被可以由下述物質(zhì)組成或包含下述物質(zhì)二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳 酸、聚乙醇酸、藻酸鹽、聚N-異丙基丙烯酰胺(POTPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸 鹽。在其它的實(shí)施方案中，所述納米顆粒還可以包含造影劑或可以與造影劑相聯(lián)或綴合， 所述造影劑適于增強(qiáng)特定的檢測(cè)形式，例如用于MRI。在實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢园?含超順磁性形式的氧化鐵。超順磁性氧化鐵是高磁性形式之一(磁鐵礦、非化學(xué)計(jì)量的磁 鐵礦、Y三氧化二鐵)，在0. 5Tesla和約300K時(shí)，其具有大于約30EMU/gm Fe的磁矩。當(dāng) 在一系列磁場(chǎng)強(qiáng)度下測(cè)量磁矩時(shí)，其表現(xiàn)出在強(qiáng)磁場(chǎng)下磁性飽和并且當(dāng)去除磁場(chǎng)時(shí)缺乏磁 頑。在實(shí)施方案中，納米顆?；蚣{米顆粒核心的磁性金屬氧化物可以包括鐵、鈷、鈦、錳、鎂、 鎳、銅、鋅、釩、金、鈀或鉬或可選擇的金屬，或以上一種或多種的混合物或包含以上一種或 多種的混合物。為了特定目的，在考慮到金屬的物理性質(zhì)、費(fèi)用、毒性等后，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以容易地在這些金屬和金屬組合中作出選擇。在實(shí)施方案中，可以用醫(yī)療裝置將所述納 米顆粒遞送至生物體或組織或細(xì)胞，并且可以進(jìn)行注射或可以通過(guò)導(dǎo)管或任何其它常規(guī)方 法口服施用、局部施用、經(jīng)皮施用、腹膜內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、腦室內(nèi)施用、大腦內(nèi)施 用、陰道內(nèi)施用、子宮內(nèi)施用、口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用或胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、 脊柱內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))、皮下施用、血管內(nèi)施用。在實(shí)施方案中，可以用醫(yī)療裝置將所述納米顆粒或用其標(biāo)記的細(xì)胞遞送至生物體或組織或細(xì)胞，并且可以通過(guò)導(dǎo)管或任何其它常規(guī) 方法進(jìn)行胃腸外注射、皮下注射、血管內(nèi)注射。在可選擇的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人 員容易理解和實(shí)施的一系列常規(guī)方法，可以全身遞送或局部遞送所述納米顆粒或用其標(biāo)記 的細(xì)胞，或可以將其遞送限制于特定范圍的細(xì)胞類型或特性。在實(shí)施方案中，所述納米顆粒 的遞送可以包括或可以是通過(guò)內(nèi)部或外部施加的磁場(chǎng)進(jìn)行引導(dǎo)或定位。在實(shí)施方案中，可 以使用諸如表面修飾的各種技術(shù)將所述納米顆粒制成或使之成為水溶性的。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)容易理解和實(shí)施對(duì)納米顆粒的一系列修飾，例如用分子或聚合物或可生物降解的聚 合物對(duì)個(gè)體納米顆粒進(jìn)行額外的封裝和用所需的官能性基團(tuán)使該納米顆粒官能化，所述可 生物降解的聚合物諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLGA (PLA-co-PGA)、聚N-異丙基丙 烯酰胺(PNIPAM)、葡聚糖、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。在本公開中，將納米顆粒“官能化”的表述表示所述納米顆粒(有或無(wú)包被)經(jīng)過(guò) 處理而攜帶官能性基團(tuán)，在實(shí)施方案中，這些官能性基團(tuán)可以是或可以包括胺、銨、烷基胺、 二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、巰基、硫醚、烯、炔、NH2、N+HS、NHR、NR2、C (0) NHR、OH、OR、 C00H、C00R、SH、SR、C = CH2、C = CHR、C = CR2^C = CH, C = CR、芳香族(其中 R =包括直 烷基鏈和分支烷基鏈、環(huán)結(jié)構(gòu)及上述組合)。在本公開中，術(shù)語(yǔ)納米顆粒的“綴合(conjugate) ”或“綴合(conjugation) ”或相 似術(shù)語(yǔ)表示所述納米顆粒與化學(xué)品或材料的連接，并且術(shù)語(yǔ)“生物綴合(bioconjugate) ”或 “生物綴合(bioconjugation)”或相似術(shù)語(yǔ)表示所述納米顆粒與化學(xué)品、分子、復(fù)合物、結(jié) 構(gòu)、生物分子、生物活性化學(xué)品等綴合。在實(shí)施方案中，為了特定目的，所述納米顆?？梢耘c 一系列藥物、化學(xué)品或材料綴合，并且在具體實(shí)施方案中，被綴合的藥物可以包括抗癌藥。 合適的生物分子可以包括但不限于蛋白、核酸、DNA、RNA、碳水化合物、脂質(zhì)、抗體、凝集素、 鏈霉親和素、蛋白、酶、激素、維生素、配體、受體、藥物、阿霉素、泰素(Taxol)、傳統(tǒng)中藥和所 有形式的生物分子或生物活性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇包括生物綴合物在內(nèi) 的適合的綴合物和適合的綴合方法，從而適用于特定目的。通常，可以通過(guò)共價(jià)連接的手段 實(shí)現(xiàn)綴合，但在實(shí)施方案中，可以使用其他形式的連接進(jìn)行綴合。在實(shí)施方案中，所述納米 顆粒的綴合物或包被可以用于使所述納米顆粒靶向于特定的細(xì)胞類型和位置或?yàn)榱颂囟?目的修飾所述納米顆粒的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地理解如何進(jìn)行適合的修飾來(lái)實(shí) 現(xiàn)這些目的。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“磁性的”表示高正磁化率的材料。在本公開中，可以口服給予制劑的表述是指在包括以下的任何合適的劑型中使用 所述制劑膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(lozenges)(任選使用諸如蔗糖、阿拉伯膠或 黃蓍膠的調(diào)味基底)、粉劑、顆粒劑、或作為水性或非水性液體的溶液或懸液、或作為水包油 或油包水液體乳劑、或作為酏劑或糖漿劑、或作為錠劑(pastilles)(使用惰性堿，例如明 膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)和/或作為漱口劑等，每種劑型含有預(yù)定量的治療劑作為活 性成分。還可以以彈丸、干藥糖劑或糊劑給予化合物。用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué) 可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸液、糖漿劑和酏劑。除活性成分以外，所述液體劑型可以含 有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸 乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉 米油、胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。通過(guò)以下制備粉劑將化合物粉碎為合適的精細(xì)尺寸并與諸如可食用 的碳水化合物的相似粉碎的藥物載體混合，所述可食用的碳水化合物例如淀粉和甘露醇。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“癌”或“惡性腫瘤”或“腫瘤”表示并包括所有形式的癌，包括 但不限于膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、腎癌、 喉癌、白血病、唇癌、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺 癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌和甲狀腺癌。在本公開中，術(shù)語(yǔ)“載體”或“賦形劑”表示并包括從與組合物的其他成分相容的 意義上是可接受的并且對(duì)接受體沒(méi)有顯著害處的所有合適的組合物。所述載體或賦形劑可 以是固體或液體或兩者，并且優(yōu)選與本發(fā)明的化合物配制為諸如片劑的單位劑量組合物， 所述單位劑量組合物可以含有以重量計(jì)0. 05% -95%的活性化合物。這些載體或賦形劑包 括惰性填充劑或稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、溶液延緩劑、再吸收加速劑、吸收劑和著 色劑。合適的粘合劑包括淀粉、明膠、諸如葡萄糖或乳糖的天然糖、谷物增甜劑、諸如阿 拉伯膠、黃蓍膠或藻酸鈉的天然和合成的膠、羥甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。潤(rùn)滑劑包括油 酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、瓊 脂、膨潤(rùn)土、黃單胞菌膠等。具體實(shí)施方案的賦形劑的可能組分可以是或可以包括甘露醇、 預(yù)膠凝淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素醚衍生物、明膠、蔗糖、檸檬酸鹽、沒(méi)食子酸 丙酯、乳糖、綿白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、瓷土、結(jié)晶纖維素、硅酸、硅酸鈣、 磷酸鉀、可可脂、硬化植物油、瓷土等，以上所有對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在可選的實(shí)施方案中，使用本文公開的組合物和方法可治療的疾病狀況可以是或 可以包括細(xì)菌感染和霉菌??；寄生蟲病、病毒性疾病(即HIV)、肌肉骨骼疾??；消化系統(tǒng) 疾病(例如結(jié)腸炎、克羅恩氏病、肝炎)；口腔頌面疾病(例如腮腺炎、牙周病)；呼吸道疾病 (例如哮喘、支氣管炎)；耳鼻喉(耳、鼻、喉)疾??；神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如阿爾茨海默病、多 發(fā)性硬化癥)；眼病(例如青光眼)；泌尿生殖器疾病(例如腎病)；心血管疾病(例如心臟 病、高血壓)；血液和淋巴疾??；新生兒疾??；皮膚和結(jié)締組織疾病(例如關(guān)節(jié)炎、皮炎、牛 皮鮮、痤瘡、狼瘡、紅斑痤瘡)；營(yíng)養(yǎng)和代謝疾?。粌?nèi)分泌疾病(例如糖尿病)；免疫疾病(例 如變態(tài)反應(yīng)、甲狀腺功能紊亂、關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏癥)。第一實(shí)施方案在第一實(shí)施方案中，公開了單個(gè)或多個(gè)包含金屬氧化物的超順磁性納米顆粒，其 可以是多面體的并且可以用二氧化硅進(jìn)行包被并且可以具有胺基。在實(shí)施方案中，所述納 米顆?；蚣{米顆粒的核心可以具有下述形狀簡(jiǎn)單立方的、體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單 四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正交的、單面心正交的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、 單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方的、以及斜方六面體、單面、平行面、雙面、雙半面、 棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三角面體、菱面體、和四面體。在具體的實(shí)施方案中， 所述納米顆?？梢曰旧鲜橇⒎降摹Ｔ谝恍?shí)施方案中，金屬或金屬之一包含選自以下的金屬氧化物鈷、鈦、錳、鎂、 鎳、銅、鋅、釩、金和鐵。在實(shí)施方案中，可以包被所述納米顆粒并且所述包被可以包含選自 以下的材料二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸和藻酸鹽。在一些實(shí)施方案中， 可以將所述納米顆粒官能化。在實(shí)施方案中，可以通過(guò)包括以下的過(guò)程來(lái)制備所述納米顆粒將所述超順磁性金屬氧化物加熱至大于 50°C、80°CUOO0C>120°C>140°C>160°C> 180°C、200°C或大于 200°C 的溫度。在其他可選的實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢园槾判越饘傺趸锊⑶宜?過(guò)程還可以包括將所述超順磁性金屬氧化物高壓滅菌。在實(shí)施方案中，金屬氧化物可以被包含在核心中，并且可以包被所述納米顆粒并 可以用二氧化硅進(jìn)行包被并可以用含有胺基的官能性基團(tuán)將所述納米顆粒官能化。在其他 的實(shí)施方案中，可以用多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)將所述納米顆粒官能化。在其他的實(shí)施方案中，所述 金屬氧化物被包含在核心中并且所述納米顆粒還包含與所述核心相聯(lián)的二氧化硅包被。在 實(shí)施方案中，納米顆?？梢跃哂卸鄠€(gè)反應(yīng)性伯胺基。應(yīng)當(dāng)理解到，無(wú)論是否合并包被，都可 以將納米顆粒官能化并且可以將包被官能化或可以不將包被官能化。在實(shí)施方案中，納米 顆?？梢耘c選自以下的分子綴合核酸、蛋白、抗體、凝集素、抗生素、藥物、抗癌藥、診斷和 治療化合物，并且可以包括傷口愈合治療。在實(shí)施方案中，可以向所述納米顆粒摻入一系列金屬或可以用一系列金屬形成所 述納米顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易判斷出所有合適的金屬并且會(huì)容易地調(diào)整所公開的方 法用于制備包含這些金屬的納米顆粒。在實(shí)施方案中，可以對(duì)主要由第一金屬組成的納米 顆粒進(jìn)行摻入從而包含一定比例的一種或多種其它金屬。如果所述主要金屬是狗，可以通 過(guò)以下實(shí)現(xiàn)摻入金屬的超順磁性納米顆粒的形成將三價(jià)!^(III)鹽與所需摻入金屬的二 價(jià)鹽合并，在實(shí)施方案中，所述摻入金屬可以是鈷、鎳、銅、鋅等。應(yīng)當(dāng)理解到，具有不同化學(xué) 成分的納米顆?？梢跃哂胁煌亩嗝骟w結(jié)構(gòu)。在實(shí)施方案中，所用的組合物可以包含氧化鐵，可以包含二氧化硅，并可以包含用 二氧化硅包被的氧化鐵。在可選的實(shí)施方案中，可以使用備選的金屬和化合物。例如，但并 非限制上文，在某些實(shí)施方案中，可以用氮、磷或硫替代組合物中的一個(gè)或多個(gè)氧原子，并 且可以用備選過(guò)渡金屬替代一個(gè)或多個(gè)鐵原子。第二實(shí)施方案在第二實(shí)施方案中，公開了合成多面體超順磁性金屬氧化物納米顆粒的方法，所 述方法可以包括制備超順磁性金屬氧化物的無(wú)定形納米顆粒并將所述無(wú)定形納米顆粒加 熱至大于約100°c，持續(xù)大于約8小時(shí)。在實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢跃哂羞x自以下的形狀簡(jiǎn)單立方的、體心立方 的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正交的、單面心正交的、多面心 正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方的、以及斜方六面體、單面、平 行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三角面體、菱面體和四面體。在實(shí) 施方案中，所述金屬可以選自鈷、鈦、錳、鎂、鎳、銅、鋅、釩、金、鉬、鈀和鐵。在實(shí)施方案中，所述方法還包括將第一金屬離子和第二金屬離子的混合物共沉淀 以制備無(wú)定形納米顆粒。在實(shí)施方案中，所述第一金屬離子和所述第二金屬離子可以是相 同金屬的不同價(jià)態(tài)，并且在具體的實(shí)施方案中，所述第一金屬離子可以是狗(11)離子并且 所述第二金屬離子可以是狗(III)離子。在實(shí)施方案中，所述方法可以包括將所述沉淀物加熱至至少約100°C，持續(xù)至少約 10小時(shí)。在實(shí)施方案中，可以用二氧化硅和/或胺基包被所述納米顆粒。在實(shí)施方案中，可以通過(guò)常規(guī)方法制備無(wú)定形的超順磁性納米顆粒，并隨后進(jìn)行 處理來(lái)產(chǎn)生多面體的、包被的和官能化的形式以及作為其他實(shí)施方案中的部分而公開的任何其他形式。在實(shí)施方案中，所述超順磁性材料可以是鐵并且制備方法可以是 ^(ΙΙ)離子 與!^e(III)離子的共沉淀。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易理解很多其他的常規(guī)方法并容易實(shí)施 這些方法來(lái)產(chǎn)生可以是磁性納米顆粒的初步制備物，該初步制備物可以是球形的或無(wú)定形 的。在可選擇的實(shí)施方案中，所述無(wú)定形納米顆粒和/或所述多面體納米顆粒的直徑可以 為約1-約30nm、或約5-約15nm，并且納米顆粒的任何制備物可以包含直徑為約1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30nm 的納米顆?；蚩梢跃哂写笥诩s30nm的直徑。在實(shí)施方案中，可以將無(wú)定形納米顆粒加熱以產(chǎn)生多面體形式?？梢栽诟邏簻缇?器脫氧水中進(jìn)行所述加熱，并且可以產(chǎn)生結(jié)晶納米顆粒。當(dāng)磁性材料是鐵時(shí)，該處理可以產(chǎn) 生呈現(xiàn)為結(jié)晶的并且大體上立方的并且可以具有約8nm的總體直徑的多面體納米顆粒。盡管在實(shí)施方案中，可以在高壓滅菌器脫氧水中進(jìn)行所述加熱，但可選擇的實(shí)施 方案包括在不同的溶劑中進(jìn)行加熱?？梢匀コ跻苑乐顾黾{米顆粒的進(jìn)一步氧化。應(yīng) 當(dāng)理解到，在實(shí)施方案中，所述加熱條件在時(shí)間和溫度方面可以變化。例如，在可選擇的實(shí) 施方案中，所用的溫度可以高于約 40、50、60、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、 180、190、200、250、300、400、500、600 或更高攝氏度，并且可以低于約 100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600 攝氏度，并且可以落入這些可選值 所限定的任何范圍。在可選擇的實(shí)施方案中，可以將所述納米顆粒持續(xù)加熱約5小時(shí)-約 10小時(shí)、約10-約15小時(shí)、約15-約20小時(shí)、約20-約25小時(shí)、高達(dá)約30、40、50或更多小 時(shí)。在實(shí)施方案中，可以將所述未加工的納米顆粒加熱高至100-120°C持續(xù)12-24小時(shí)。應(yīng)當(dāng)理解到，在實(shí)施方案中，可以與沉淀過(guò)程同時(shí)進(jìn)行所述加熱，而在其他的實(shí)施 方案中，可以在收集沉淀物后進(jìn)行所述加熱。應(yīng)當(dāng)理解到，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易理解和實(shí)施常規(guī)方法通過(guò)摻入、包 被、官能化、綴合等對(duì)按照該實(shí)施方案的方法產(chǎn)生的多面體納米顆粒進(jìn)行修飾。第三實(shí)施方案在另一實(shí)施方案中，公開了用任何其他實(shí)施方案的納米顆粒標(biāo)記細(xì)胞的方法。所 述方法可以包括用多面體超順磁性納米顆粒標(biāo)記細(xì)胞，并檢測(cè)所述納米顆粒。在實(shí)施方案 中，所述納米顆粒可以與化學(xué)品或生物品綴合，包括對(duì)細(xì)胞膜上的受體或其它結(jié)構(gòu)具有選 擇性親和力的那些，例如治療性抗體、放射性同位素標(biāo)記的生物品和一系列藥物。在實(shí)施 方案中，待標(biāo)記的細(xì)胞可以是吞噬細(xì)胞、非吞噬細(xì)胞，并且可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且可以是 非人細(xì)胞、人細(xì)胞，并且可以是干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、 成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腱細(xì)胞、足細(xì)胞、球旁細(xì)胞、球內(nèi)系 膜細(xì)胞/球外系膜細(xì)胞、腎近端小管刷狀緣細(xì)胞細(xì)胞、致密斑細(xì)胞、胃粘膜主細(xì)胞、壁細(xì)胞、 杯狀細(xì)胞、帕內(nèi)特細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞、APUD細(xì)胞、肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、心肌細(xì) 胞、周細(xì)胞、肺細(xì)胞(I型肺細(xì)胞、II型肺細(xì)胞)、克拉拉細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星 形膠質(zhì)細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、甲狀腺上皮細(xì)胞、濾泡旁細(xì)胞、甲狀旁腺主細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、 淋巴的B/T T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞(嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞 /多葉核嗜中性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞(網(wǎng)狀細(xì)胞)、肥大細(xì)胞、凝血細(xì)胞/ 巨核細(xì)胞、樹突細(xì)胞。在實(shí)施方案中，可以在體外、體內(nèi)或離體將所述方法應(yīng)用于細(xì)胞。在 具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)并且可以在人體內(nèi)。在具體的實(shí)施方案中，所述方法可以包括選自以下的步驟體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞、離體標(biāo)記細(xì)胞、注射納米顆粒、口服 遞送納米顆粒、胃腸外遞送納米顆粒、或通過(guò)導(dǎo)管遞送納米顆粒。在實(shí)施方案中，可以用醫(yī) 療裝置將納米顆粒標(biāo)記的細(xì)胞遞送至生物體或組織或細(xì)胞，并且可以通過(guò)導(dǎo)管或任何其他 常規(guī)方法進(jìn)行胃腸外注射、皮下注射、血管內(nèi)注射。體內(nèi)觀察細(xì)胞、離體觀察細(xì)胞、定位納米 顆粒、用磁場(chǎng)定位納米顆粒以及將含有納米顆粒的細(xì)胞與不含納米顆粒的細(xì)胞分離。在具 體的實(shí)施方案中，所述方法可以包括選自以下的步驟體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞、離體標(biāo)記細(xì)胞、注射 納米顆粒、口服遞送納米顆粒、胃腸外地遞送納米顆粒、體內(nèi)觀察細(xì)胞、離體觀察細(xì)胞、定位 納米顆粒、用磁場(chǎng)定位納米顆粒以及將含有納米顆粒的細(xì)胞與不合納米顆粒的細(xì)胞分離。在具體的實(shí)施方案中，待標(biāo)記的細(xì)胞可以是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，并且應(yīng)當(dāng)理解 到，如果納米顆粒能在標(biāo)記的細(xì)胞中長(zhǎng)期存在，那么其對(duì)于標(biāo)記處于重復(fù)分裂的細(xì)胞群體 是特別有價(jià)值的，這樣祖細(xì)胞的標(biāo)記可以傳給其后代。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地調(diào)整祖 細(xì)胞的標(biāo)記密度以適應(yīng)特定目的。在具體的實(shí)施方案中，所述納米顆粒可以定位于靶細(xì)胞的溶酶體中，但是顯而易 見的是其他細(xì)胞定位是可能的。在一些實(shí)施方案中，可以使用Tan Weihong等人于2005年 7 月 25 日提交的 11/188,459 號(hào)，“Method of making nanoparticles (制備納米顆粒的方 法)”中所述的方法或?qū)ζ溥M(jìn)行改動(dòng)來(lái)制備具體實(shí)施方案的納米顆粒，所述改動(dòng)包括用諸如 硅酸乙酯(TE0Q的硅酸鹽試劑對(duì)納米顆粒施用二氧化硅包被。在實(shí)施方案中，可以用納米顆粒離體標(biāo)記細(xì)胞，并隨后將該細(xì)胞植入個(gè)體體內(nèi)。在 其他的實(shí)施方案中，用納米顆粒標(biāo)記細(xì)胞可以被用作組織學(xué)標(biāo)記技術(shù)或體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)。在 實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)將與納米顆粒相聯(lián)的細(xì)胞或生物材料與未與納米顆粒 相聯(lián)的那些細(xì)胞或生物材料分離而用于磁分選細(xì)胞或生物材料。第四實(shí)施方案在第四實(shí)施方案中，公開了包含其他實(shí)施方案的納米顆粒的藥物組合物，所述納 米顆?？梢耘c阿霉素、泰素、傳統(tǒng)中藥、藥物或本領(lǐng)域技術(shù)人員容易選擇和使用的其他試劑 綴合或組合或相聯(lián)?？梢园凑杖魏螌?shí)施方案所公開的對(duì)所述納米顆粒進(jìn)行包被、或綴合、或 包被并且綴合。第五實(shí)施方案在第五實(shí)施方案中，提供了治療需要治療的個(gè)體的方法，所述治療包括給予個(gè)體 多面體超順磁性納米顆粒?？梢园凑毡疚乃鲋苽浜托揎椝黾{米顆粒，并且所述所述納 米顆粒可以與一系列生物活性試劑綴合。同樣，公開了任一實(shí)施方案的超順磁性納米顆粒 在制備用于治療需要所述治療的病人的藥物中的用途。在其他的實(shí)施方案中，公開了實(shí)施 方案的納米顆粒在個(gè)體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞從而診斷或治療需要這種診斷或治療的患者中的用途。
實(shí)施例下文的實(shí)施例舉例說(shuō)明用于實(shí)踐所公開的主題的材料、方法和操作。應(yīng)當(dāng)理解到， 本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為示例性目的，并且根據(jù)其進(jìn)行的各種修改或改變對(duì)于本 領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且這些修改或改變將包括在本申請(qǐng)的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)。材料和方法使用前，用高純氮使純水冒泡持續(xù)至少30分鐘。所有的化學(xué)反應(yīng)都在高純氮下進(jìn)行。對(duì)于透射電子顯微鏡(TEM)分析，將1滴乙醇中的樣品添加至碳包被的銅網(wǎng)上，并 允許揮發(fā)至干燥。通過(guò)將大量材料定位于區(qū)域( 20nmX20nm)進(jìn)行內(nèi)置能量散射X射 線(EDX)光譜。對(duì)于電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)分析，將樣品溶解在滴入數(shù)滴 SnCl2溶液的2%的HCl溶液中。于238. 204nm處觀察鐵吸收。實(shí)施例1SPIO納米顆粒的制備使用2當(dāng)量氯化鐵和1當(dāng)量氯化亞鐵的氫氧化鈉水溶液，通過(guò)化學(xué)共沉淀方法制 備無(wú)定形的SPIO納米顆粒。該共沉淀混合物包含0. 17mMFe (II)和0. 33mM Fe (III)，并且 在搖動(dòng)下，將該混合物緩慢調(diào)節(jié)至30nmNa0H以產(chǎn)生沉淀物。通過(guò)離心分離沉淀物并用脫氧 水洗滌。通過(guò)在高壓滅菌器中高于120°C的水中加熱12小時(shí)來(lái)修飾該SPIO納米顆粒，從而 提供尺寸為6nm的近似立方體的SPIO納米顆粒。通過(guò)離心分離該沉淀物，并用脫氧水洗滌 2次、無(wú)水乙醇洗滌4次，隨后于50°C下過(guò)夜真空干燥，從而提供再結(jié)晶的!^e3O4 SPIO納米 顆粒。實(shí)施例2SPIO-SiO2納米顆粒的制備通過(guò)再結(jié)晶的SPIO納米顆粒的表面上硅酸乙酯(TE0Q的水解來(lái)制備二氧化硅包 被的SPIO(SPIO-SiO2)納米顆粒。首先，通過(guò)超聲使近似立方體的SPIO納米顆粒在含有乙 醇和水混合物的溶液中重新分散。用氨水溶液將PH值調(diào)整至9。在用力攪拌下逐滴添加 TE0S，然后加熱至回流。通過(guò)離心分離沉淀物并用水和乙醇洗滌數(shù)次以提供尺寸為IOnm的 SPIO-SiO2納米顆粒。通過(guò)使用不同量的TEOS可以調(diào)整包被厚度。實(shí)施例3SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的制備通過(guò)近似立方體的SPIO納米顆粒表面上氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ的水解來(lái) 制備SPIO-SiO2-NH2納米顆粒。首先，通過(guò)超聲使近似立方體的SPIO納米顆粒在含有乙 醇和水混合物的溶液中重新分散。用氨水溶液將PH值調(diào)整至9。在用力攪拌下逐滴添加 APTES，并隨后加熱至回流。通過(guò)離心分離沉淀物，并用水和乙醇洗滌數(shù)次以提供尺寸為Snm 的SPIO-SiO2-NH2納米顆粒。實(shí)施例4SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的制備通過(guò)SPIO-SiO2納米顆粒表面上氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ的水解來(lái)制備 SPIO-SiO2-NH2納米顆粒。首先，通過(guò)超聲使IOnm的SPI0_Si&納米顆粒在含有乙醇和水 混合物的溶液中重新分散。用氨水溶液將PH值調(diào)整至9。在用力攪拌下逐滴添加APTES， 并隨后加熱至回流。通過(guò)離心分離沉淀物，并用水和乙醇洗滌數(shù)次以提供尺寸為12nm的 SPIO-SiO2-NH2 納米顆粒。納米顆粒的特征用透射電子顯微鏡(TEM)、能量散射X射線(EDX)光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光 譜(ICP-0EQ、X射線衍射(XRD)和振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)進(jìn)行SPIO納米顆粒的物理特性 的評(píng)估。
利用TEM、EDX、XRD 和 VSM 表征 SPIO-SiO2 和 SPIO-SiO2-NH2 納米顆粒。例如， SPIO納米顆粒的TEM分析表明其接近單分散性近似立方體的晶體，其中SPIO-SiA納米顆 粒的平均尺寸為10. 7士2. 6nm并且SPIO-SiO2-NH2的平均尺寸為8. 5士3. Onm0作為舉例， SPIO-SiO2-NH2的TEM成像(圖IA所示)顯示出具有單一二氧化硅殼(黑點(diǎn)周圍的薄的白 色層)結(jié)構(gòu)的單一氧化鐵核心(黑點(diǎn))，而不是具有單一二氧化硅殼結(jié)構(gòu)的多核心，這表明 均勻的薄二氧化硅包被成功地沉積于每個(gè)單獨(dú)的SPIO納米顆粒上。EDX分析顯示出，SPIO-SiA和SPIO-SiO2-NH2 (圖IB所示)納米顆粒的鐵含量分 別為22. 0士0. 2%和48. 3士0. 3%，該結(jié)果與ICP-OES在不變的納米顆粒濃度中測(cè)定的值 (SPIO-SiO2 為 21. 6士0. 以及 SPIO-SiO2-NH2 為 44. 8士0. 2% )相當(dāng)。考慮到 SPIO-SiO2 和SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的氧化鐵核心尺寸相同，SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的更高的鐵含 量8% )表明該納米顆粒比SPIO-SW2納米顆粒具有更薄的二氧化硅殼層。此外，EDX 分析允許測(cè)定SPIO-SiO2-NH2納米顆粒中存在的硅(Si，10.6% )、碳(C，11.3% )和氮(N， 4.5% )元素(圖 1B)。SPIO-SiOdP SPIO-SiO2-NH2的XRD譜形(圖IC所示)表明，所述納米顆粒表現(xiàn)出 對(duì)應(yīng)于尖晶石結(jié)構(gòu)的特征晶面間距220、311、400、422、511和400的的數(shù)個(gè)峰，這些峰分別 為20、29. 5,34. 7,42. 3,52. 4,56. 1和61. 7。這些信號(hào)表明磁鐵礦核心的特征。在相同磁鐵 礦核心上使用TEOS或APTES進(jìn)行的表面修飾過(guò)程不影響原始形態(tài)和磁鐵礦核心的結(jié)晶性。圖ID顯示出相比于施加的磁場(chǎng)的磁化強(qiáng)度(emu g-1) (Β/Τ)。SPIO-SiO2-NH2納 米顆粒的磁滯回線證實(shí)(圖ID所示)不存在矯頑力，從而賦予超順磁性的行為特征。 SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的飽和磁化強(qiáng)度是52. 5emu g—1 Fe，這稍低于可購(gòu)得的造影劑菲立 磁(Feridex)( 70emu g^Fe)。SPIO-SiO2納米顆粒的飽和磁化強(qiáng)度測(cè)定為43. 5emu g—1 Fe。高飽和磁化強(qiáng)度對(duì)T2加權(quán)MRI是必要的，因?yàn)榧{米顆粒中的高度磁自旋促進(jìn)周圍水分 子中的質(zhì)子的自旋-自旋弛豫過(guò)程。圖1顯示出A 平均尺寸為8. 5nm的近似立方體的SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的TEM 成像。觀察到的二氧化硅殼為每個(gè)氧化鐵納米顆粒(黑點(diǎn))周圍的薄的白色層，得到單一 氧化鐵納米顆粒核心/單一二氧化硅殼結(jié)構(gòu)。B =EDX譜顯示SPIO-SiO2-NH2納米顆粒中存 在的元素(Fe、Si、0、C和N)。C SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的XRD譜指示出歸因于磁鐵礦核 心的晶格的特征信號(hào)。D =SPIO-SiO2-NH2納米顆粒的VSM譜顯示出超順磁性行為，磁滯回線 中不存在矯頑力。在我們的實(shí)施例中，用臨床的1. 5T全身MR系統(tǒng)進(jìn)行SPIO納米顆粒的MR弛豫時(shí) 間測(cè)定。在MR SPIO納米顆粒處于水中和室溫下的情況下，弛豫率(rf)測(cè)定為=SPIO-SiO2 納米顆粒為 18. 9 士 3. 6mM_1 秒 SPIO-SiO2-NH2 納米顆粒為 43. 5 士9. ImT1 秒 ΛSPIO間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記使用20周齡的，體重為3. 5-4kg的雄性新西蘭白兔。用18G BD注射器從兔髂骨中 抽出骨髓。用達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM，Gibco 31600)清洗骨髓(骨髓DMEM =1:4)。將混合物離心。然后移去脂肪殘?jiān)蜕锨?。?0% FCS (胎牛血清Gibco 16140) 的DMEM重懸沉淀團(tuán)。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至75cm2的組織培養(yǎng)燒瓶中。于37°C、5% CO2下孵 育細(xì)胞培養(yǎng)物。4天后，更換一半的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并且再過(guò)3天更換全部培養(yǎng)基。貼壁的間 充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)以集落生長(zhǎng)。5-7天后，將細(xì)胞傳代至其他的培養(yǎng)燒瓶中用于細(xì)胞擴(kuò)增。
作為實(shí)例，將兔骨髓來(lái)源的MSC與SPIO-SiA或SPIO-SiO2-NH2納米顆粒在無(wú)血清 的DMEM培養(yǎng)基中、在4. 5 μ g/mL的固定的鐵濃度下孵育18小時(shí)。即將進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，將SPIO 納米顆粒超聲15分鐘。上述操作后，將SPIO納米顆粒標(biāo)記入MSC。為了確認(rèn)標(biāo)記效率， 可以進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，其中用2. 5%的戊二醛(Sigma G4004)固定后，將細(xì)胞于的亞 鐵氰化鉀(Sigma P3289)和2%的HCl中孵育10-15分鐘，隨后添加的中性紅(Sigma N8002)對(duì)核進(jìn)行染色。普魯士藍(lán)染色顯示，用兩種SPIO納米顆粒(SPIO-SiA和SPIO-SiO2-NH2)均可以 使MSC標(biāo)記效率達(dá)到100%。所有MSC吸納了很多SPIO納米顆粒(圖2)。用SPIO-SiO2和 SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記后，TEM顯示這些納米顆粒定位于溶酶體和囊泡中，但在核或 其他結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)。未觀察到凋亡和壞死改變，具有清晰正常的核形態(tài)(圖3)。圖2顯示普魯士藍(lán)染色的MSC的光學(xué)顯微鏡成像，表明了 MSC中SPIO-SiO2-NH2納 米顆粒的分布(初始放大率200X)。圖A顯示100%的標(biāo)記效率。MSC呈現(xiàn)正常的細(xì)胞形 態(tài)。圖B顯示在4個(gè)MSC中有很多SPIO納米顆粒。圖3顯示TEM成像(A-D)，表明很多SPIO-SiO2-NH2納米顆粒分布于MSC的溶 酶體和囊泡中，而在核和其他超微結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)(A :4200 X , B :11500X, C :16500 X，D 160000X)。單分散性的SPIO-SiO2-NH2納米顆粒在MSC中仍然是良好分離的。細(xì)胞具有明 顯正常的核形態(tài)，并未觀察到凋亡和壞死。SPIO納米顆粒標(biāo)記后33天評(píng)估MSC，即標(biāo)記后7代正常MSC，MSC于37°C、5% CO2 下培養(yǎng)，沒(méi)有其他干預(yù)并允許正常分裂。標(biāo)記后33天，TEM顯示SPIO-SiOjP SPIO-SiO2-NH2 納米顆粒存在于標(biāo)記的MSC的溶酶體和囊泡中，盡管存在的量較第1天少。ICP-OES用于對(duì)鐵含量進(jìn)行定量。如上文所述，用SPIO-SiR和SPIO-SiO2-NH2納 米顆粒標(biāo)記兔MSC。用培養(yǎng)基洗滌后，將100，000細(xì)胞置于Eppendorf管中。將細(xì)胞團(tuán)溶解 于滴有幾滴濃縮SnCl2溶液的2% HCl水溶液中，對(duì)此總鐵濃度為10-40ppm。于238. 204nm 處觀察鐵吸收。用一系列FeCl3S準(zhǔn)稀釋溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ICP-OES表明剛標(biāo)記后， SPIO-SiO2標(biāo)記的MSC的總鐵含量為17. 4士3. 9pg/細(xì)胞，而SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記的MSC的總 鐵含量為68. 7士 11. 2pg/細(xì)胞。如上文所述進(jìn)行SPIO納米顆粒標(biāo)記后，即4. 5 μ gFe/mL持續(xù)18小時(shí)，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán) 排除測(cè)定(Sigma T6146)以評(píng)估MSC的活力。為了評(píng)估標(biāo)記后的細(xì)胞生長(zhǎng)，將MSC以5000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)于96孔板中，用含10% FCS的DMEM孵育。標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記操作后，將SPIO 納米顆粒從板中移除，并用PBS漂洗殘余的鐵納米顆粒。再次添加新鮮的含10% FCS的 DMEM用于正常生長(zhǎng)。進(jìn)行3-G，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)測(cè) 定(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind)來(lái)檢測(cè) SPIO 納米顆粒標(biāo)記的MSC 生長(zhǎng)。按照以下評(píng)估SPIO納米顆粒標(biāo)記后的MSC的分化潛能1)對(duì)于成骨分化，將SPIO納 米顆粒標(biāo)記的MSC與抗壞血酸、β -甘油磷酸和地塞米松孵育。誘導(dǎo)后四周，進(jìn)行茜素紅染 色以檢測(cè)鈣節(jié)結(jié)；幻對(duì)于成脂分化，將SPIO納米顆粒標(biāo)記的MSC與地塞米松、胰島素、異丁 基甲基黃嘌呤和吲哚美辛孵育4周。然后進(jìn)行油紅0染色以檢測(cè)MSC中的脂質(zhì)泡；幻對(duì)于 成軟骨分化，將SPIO納米顆粒標(biāo)記的MSC在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的存在下培養(yǎng)4周，然后進(jìn)行 甲苯胺藍(lán)染色以檢測(cè)糖胺聚糖表達(dá)。臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)定結(jié)果表明，SPIO-SiO2* SPIO-SiO2-NH2 標(biāo)記后的細(xì)胞活力分別為95. 7士2%和94. 2士3%。SPIO納米顆粒標(biāo)記后，未觀察到明顯的MSC生長(zhǎng)抑制。SPIO-SW2和SPIO-SiO2-NH2納米顆粒處理后，MSC保留了成骨、成脂和成軟 骨分化潛能(圖4)。圖4顯示SPIO-SiO2-NH2對(duì)兔骨髓來(lái)源的MSC的成骨、成軟骨和成脂分化的影響。 首先用4. 5μ g[Fe]/mL的SPIO-SiO2-NH2處理MSC 18小時(shí)，然后分別于成骨(B, 100X)、成 脂(D，200X)和成軟骨(F，200X)培養(yǎng)基中孵育4周。A、C和D分別是對(duì)于B、D和E的未 經(jīng)SPIO處理的對(duì)照MSC。與誘導(dǎo)后的對(duì)照MSC相似，SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記的MSC表現(xiàn)出成骨 (B)、成脂(D)和成軟骨(F)分化。SPIO的毒性可能與標(biāo)記濃度有關(guān)，并且對(duì)于單獨(dú)的具體應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化該濃度。在標(biāo)記操作剛剛結(jié)束和結(jié)束后33天，對(duì)SPIO納米顆粒標(biāo)記的MSC團(tuán)進(jìn)行兩次體 外MR成像。如上文所述用SPIO-SiO2或SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記兔MSC。用培養(yǎng)基漂 洗后，將105、5X104、104、5X103和IO3個(gè)細(xì)胞分別置于1. 5mL Eppendorf管中。離心后，將 Eppendorf管在20X 12X8em的水浴中與主磁感應(yīng)場(chǎng)(BO)垂直放置。在3. O-T臨床全身MR 單元(Achieva ;Philips Medical Systems, Best, the Netherlands)上使用收發(fā)兩用頭部 線圈進(jìn)行MRI。MR序列是2D梯度回聲序列，其中TR/TE = 400/48毫秒、偏轉(zhuǎn)角度=18、矩 陣=512X256、分辨率=0. 45X0. 45mm、層面厚度=2mm,NEX = 2。通過(guò)Eppendorf 管底端 橫切獲得矢狀圖像。用兩種SPIO納米顆粒標(biāo)記MSC后，對(duì)于IO5和5 X IO4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)， 觀察到大量負(fù)反差(黑色MR信號(hào))，得到“球囊(ballooning)，，效應(yīng)。來(lái)自SPIO-SiO2-NH2 納米顆粒標(biāo)記的細(xì)胞團(tuán)的“球囊”效應(yīng)的黑色區(qū)域的大小在IO5和5X104的濃度時(shí)分別為 SPIO-SiO2納米顆粒標(biāo)記的細(xì)胞團(tuán)的“球囊”效應(yīng)的黑色區(qū)域的大小的1.8-1. 9倍。對(duì)于 SPIO-SiO2納米顆粒標(biāo)記的MSC，可檢測(cè)到彡5000的MSC團(tuán)，而對(duì)于SPIO-SiO2-NH2納米顆粒 標(biāo)記的MSC，可檢測(cè)到彡1000的MSC團(tuán)(圖5)。用SPIO納米顆粒標(biāo)記MSC后33天，對(duì)于 SPIO-SiO2納米顆粒標(biāo)記的細(xì)胞的彡5X IO4的細(xì)胞團(tuán)，觀察到明顯負(fù)反差。另一方面，對(duì)于 SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSCW> IO4的細(xì)胞團(tuán)，觀察到明顯負(fù)反差。應(yīng)當(dāng)注意到，此 處描述的MRI掃描技術(shù)對(duì)于檢測(cè)少量的SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞可能不是最佳的。圖5顯示Eppendorf管的培養(yǎng)基中的SPIO納米顆粒標(biāo)記后的MSC團(tuán)的梯度回波 MR成像。Eppendorf管中的細(xì)胞數(shù)量(從左向右)是1 X 105、5X 104、104、5，000和1，000。 A排中的MSC用SPIO-SiA標(biāo)記，而B排中的MSC用SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記。對(duì)于用 SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC團(tuán)的負(fù)反差(黑色)信號(hào)而言，其面積大于用SPIO-SW2 納米顆粒標(biāo)記的MSC團(tuán)的負(fù)反差信號(hào)面積約2倍。對(duì)于SPIO-SiO2標(biāo)記的MSC沉淀，^ 5，000 個(gè)細(xì)胞是可觀察到的，而對(duì)于SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記的MSC團(tuán)，彡1000個(gè)細(xì)胞是可觀察到的。植入兔腦中的SPIO標(biāo)記的MSC的縱向監(jiān)測(cè)如上文所述用SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記兔MSC。將SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo) 記的MSC以IX IO5的數(shù)量植入新西蘭雄性白兔的腦的右半球。每?jī)芍軐?duì)兔腦進(jìn)行MRI以監(jiān) 測(cè)SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC。8或12周以后，無(wú)痛處死兔并收獲腦用于組織學(xué)， 所述組織學(xué)包括HE染色和普魯士藍(lán)染色。在3. O-T臨床全身MR單元(Achieva ；Philips Medical Systems, Best, the Netherlands)上使用膝線圈進(jìn)行MRI。腦成像的采集參數(shù)包 括2D梯度回波序列，TR/TE = 328/16毫秒、FOV = 80X80mm、偏轉(zhuǎn)角度=18、面內(nèi)實(shí)際分辨 率為0. 29X0. 37mm表觀分辨率為0. 16X0. 16mm、層面厚度=1mm、NEX = 10。植入腦中后 2天，SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC在2D梯度回波T2W成像上產(chǎn)生信號(hào)空白。MSC植入后8-12周，同一位置的信號(hào)空白仍清晰可見，盡管在尺寸上略有減小(圖6、7)。普魯士 藍(lán)染色的組織切片提示，SPIO納米顆粒主要定位于干細(xì)胞和干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞中。腦中的 植入位置中不存在明顯的吞噬細(xì)胞。圖6顯示矢狀面的兔腦T2W 2D自旋回波成像。圖6A顯示剛植入MSC后的切面。 SPIO標(biāo)記的MSC產(chǎn)生信號(hào)空白區(qū)(箭頭)。圖6B顯示植入后8周獲得的相同兔腦的矢狀 面T2W 3D veno-BOLD成像?？梢杂^察到SPIO標(biāo)記的MSC產(chǎn)生的信號(hào)空白區(qū)(箭頭)。圖7顯示SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC，圖中示出在2D梯度回波T2W成像 上產(chǎn)生的信號(hào)空白。圖7A顯示植入腦中后2天的標(biāo)記。圖7B顯示MSC植入后12周的標(biāo) 記，同一位置的信號(hào)空白清晰可見，盡管尺寸上略有減小。植入兔豎脊肌中的SPIO標(biāo)記的MSC的縱向監(jiān)測(cè)如上文所述用SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記兔MSC。將SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo) 記的MSC以5X IO4的數(shù)量植入新西蘭雄性白兔左側(cè)豎脊肌中。每?jī)芍軐?duì)兔左側(cè)豎脊肌進(jìn)行 MRI以監(jiān)測(cè)SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC。12周后，無(wú)痛處死兔并收獲左側(cè)豎脊肌用 于組織學(xué)，所述組織學(xué)包括HE染色和普魯士藍(lán)染色。在3. O-T臨床全身MR單元(Achieva ； Philips Medical Systems, Best, the Netherlands)上使用膝線圈進(jìn)行 MRI。用于兩側(cè)豎 脊肌成像的采集參數(shù)包括2D梯度回波序列，TR/TE = 930/16毫秒、FOV = 80 X 80mm、偏轉(zhuǎn)角 度=18、面內(nèi)實(shí)際分辨率為0. 8X0. 8mm表觀分辨率為0. 5X0. 5mm、層面厚度=0. 8mm,NEX =8。植入左側(cè)豎脊肌中后2天，SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC在2D梯度回波T2W成 像上產(chǎn)生信號(hào)空白。MSC植入后12周，同一位置的信號(hào)空白仍可見，盡管在尺寸上略有減小 (圖8)。普魯士藍(lán)染色的組織切片提示，SPIO納米顆粒主要定位于干細(xì)胞和干細(xì)胞來(lái)源的 細(xì)胞中。豎脊肌中的植入位置中不存在明顯的吞噬細(xì)胞。圖8顯示SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC在2D梯度回波T2W成像上產(chǎn)生的信 號(hào)空白。圖8A是植入左側(cè)豎脊肌中后2天的圖像。圖8B是植入MSC后12周采集的圖像。將SPIO標(biāo)記的MSC植入兔豎脊肌，并且將SPIO作為組織學(xué)標(biāo)志物。如上文所述用SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記兔MSC。將SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo) 記的MSC以5X IO4的數(shù)量植入新西蘭雄性白兔左側(cè)豎脊肌中。12周后，無(wú)痛處死兔并收獲 左側(cè)豎脊肌用于組織學(xué)，所述組織學(xué)包括HE染色和普魯士藍(lán)染色。HE加普魯士藍(lán)染色能夠 顯示預(yù)期來(lái)源于植入的干細(xì)胞的含鐵細(xì)胞。圖9A是SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記后3周的MSC的光學(xué)顯微鏡視圖。圖9B是圖9A的等 同視圖，但顯示的是用PEG-6000包被的SPIO標(biāo)記后3周的MSC。在第0天時(shí)，9A和9B中 的MSC具有相似的初始鐵負(fù)載。圖10是SPIO-SiO2-NH2納米顆粒標(biāo)記的MSC植入兔左側(cè)豎脊肌中后12周的顯微 鏡視圖。HE和普魯士藍(lán)雙重染色顯示含鐵(SPIO)的細(xì)胞。認(rèn)為這些細(xì)胞來(lái)源于植入的MSC 并分化為平滑肌細(xì)胞。圖IOA是SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記后3周的MSC的光學(xué)顯微鏡視圖。圖 IOB是圖IOA的等同視圖，但顯示的是SPIO-SiO2-NH2標(biāo)記后3周的MSC。圖11是實(shí)施方案的納米顆粒(Fe3O4-NH2，無(wú)二氧化硅包被)的TEM視圖。圖12是實(shí)施方案的納米顆粒(Mr^e2O4-NH2，無(wú)二氧化硅包被)的TEM視圖。本文提出的實(shí)施方案和實(shí)施例是對(duì)要求保護(hù)的主題的概括性質(zhì)的舉例說(shuō)明而不 是進(jìn)行限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到如何容易地以各種方式修改和/或調(diào)整這些實(shí)施方案用于不同的應(yīng)用，這不脫離要求保護(hù)的公開的主題的實(shí)質(zhì)和范圍。本發(fā)明的權(quán)利要求 應(yīng)當(dāng)理解為包括而不限制所有的可選實(shí)施方案和本發(fā)明主題的等同物。本文所用的短語(yǔ)、 詞語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)是示例性的而不是限制性的。在法律許可的情況下，通過(guò)引用的方式將所引用 的所有參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容并入本文。應(yīng)當(dāng)理解到，本文公開的不同的實(shí)施方案的任何方 面可以合并在一系列可能的備選實(shí)施方案和備選的特征組合中，所有這些改變的特征組合 都應(yīng)當(dāng)理解為構(gòu)成要求保護(hù)的主題的一部分。
權(quán)利要求
1.包含金屬氧化物的多面體超順磁性納米顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的多面體超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒具有選自以下的 形狀簡(jiǎn)單立方的、體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正 交的、單面心正交的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方 的，以及斜方六面體、單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三 角面體、菱面體和四面體。
3.如權(quán)利要求1所述的超順磁性納米顆粒，其中所述金屬選自鈷、鈦、錳、鎂、鎳、銅、 鋅、釩、金、鈀、鉬和鐵。
4.如權(quán)利要求1所述的超順磁性納米顆粒，其中將所述納米顆粒被包被并且所述包被 包含選自以下的材料二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚N-異丙基丙烯酰 胺(PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。
5.如權(quán)利要求1所述的超順磁性納米顆粒，其中用選自以下的官能性基團(tuán)將所述納米 顆粒官能化胺、銨、烷基胺、二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、巰基、硫醚、烯和炔。
6.如權(quán)利要求1所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒通過(guò)包括將超順磁性金 屬氧化物加熱至高于 50°c、80°c、i0(rc、i2(rc、i4(rc、i6(rc、i8(rc、20(rc 或高于 2oo°c 的 溫度以上的方法制備。
7.如權(quán)利要求1所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒包含超順磁性氧化鐵。
8.如權(quán)利要求3所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒基本上是立方的。
9.如權(quán)利要求2所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒具有選自以下的直徑范 圍約 Inm-約 500nm、約 Inm-約 300nm、約 Inm-約 150nm、約 Inm-約 50nm、約 Inm-約 10nm、 約 3nm-約 IOnm 和約 5nm-約 8nm。
10.如權(quán)利要求6所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒的直徑為約3nm-約 IOnm0
11.如權(quán)利要求1所述的超順磁性納米顆粒，其中所述金屬氧化物被包含在核心中并 且其中所述納米顆粒還包含與所述核心相聯(lián)的二氧化硅包被。
12.如權(quán)利要求9所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒具有多個(gè)反應(yīng)性伯胺基。
13.如權(quán)利要求6所述的超順磁性納米顆粒，其中所述金屬氧化物被包含在核心中并 且其中所述納米顆粒還包含與所述核心相聯(lián)的二氧化硅包被。
14.如權(quán)利要求11所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒具有多個(gè)反應(yīng)性伯胺基。
15.如權(quán)利要求9所述的超順磁性納米顆粒，其中所述納米顆粒與基團(tuán)綴合，所述基團(tuán) 包含選自以下的分子核酸、蛋白、抗體、凝集素、碳水化合物、抗生素、藥物、抗癌藥和傷口 愈合藥物。
16.合成多面體超順磁性金屬氧化物納米顆粒的方法，所述方法包括下述步驟制備 超順磁性金屬氧化物的無(wú)定形納米顆粒并將所述無(wú)定形納米顆粒加熱至高于約100°C，持 續(xù)大于約8小時(shí)。
17.合成多面體超順磁性金屬氧化物納米顆粒的方法，所述方法包括下述步驟制備 超順磁性金屬氧化物的無(wú)定形納米顆粒并將所述無(wú)定形納米顆粒高壓滅菌。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述納米顆粒具有選自以下的形狀簡(jiǎn)單立方的、 體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正交的、單面心正交 的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方的，以及斜方六面 體、單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三角面體、菱面體和 四面體。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述金屬選自鈷、鈦、錳、鎂、鎳、銅、鋅、釩、金、 鈀、鉬和鐵。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括用材料包被所述納米顆粒，所述材料包含選 自以下的成分二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚N-異丙基丙烯酰胺 (PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括用選自以下的官能性基團(tuán)將所述納米顆粒官能 化胺、銨、烷基胺、二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、巰基、硫醚、烯和炔。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括將第一金屬離子和第二金屬離子的混合物共沉 淀以制備所述無(wú)定形納米顆粒。
23.如權(quán)利要求16所述的方法，包括在壓力下將沉淀物加熱至至少約100°C持續(xù)至少 約10小時(shí)。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一金屬離子和第二金屬離子是相同金屬的 不同價(jià)態(tài)。
25.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第一金屬離子是!^e(II)離子并且所述第二金 屬離子是I^e(III)離子。
26.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括用二氧化硅包被所述納米顆粒。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，還包括用胺基包被所述納米顆粒。
28.藥物組合物，其包含聯(lián)合了藥學(xué)可接受的載體的權(quán)利要求1所述的超順磁性納米 顆粒。
29.標(biāo)記細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)用多面體超順磁性納米顆粒標(biāo)記所述細(xì)胞；和(b)檢測(cè)所述納米顆粒。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述納米顆粒具有選自以下的形狀簡(jiǎn)單立方的、 體心立方的、面心立方的、簡(jiǎn)單四方的、體心四方的、簡(jiǎn)單正交的、體心正交的、單面心正交 的、多面心正交的、簡(jiǎn)單單斜的、單面心單斜的、簡(jiǎn)單三斜的、單面心六方的、以及斜方六面 體、單面、平行面、雙面、雙半面、棱柱、棱錐、雙棱錐、偏方三八面體、偏三角面體、菱面體和 四面體。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述金屬選自鈷、鈦、錳、鎂、鎳、銅、鋅、釩、金、 鈀、鉬和鐵。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中將所述納米顆粒進(jìn)行包被并且所述包被包含 選自以下的材料二氧化硅、葡聚糖、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚N-異丙基丙烯酰胺 (PNIPAM)、羥磷灰石、層狀雙氫氧化物和藻酸鹽。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中用選自以下的官能性基團(tuán)將所述納米顆粒官能 化胺、銨、烷基胺、二烷基胺、酰胺、羥基、醚、羧基、酯、巰基、硫醚、烯和炔。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述納米顆粒包含超順磁性氧化鐵核心和具有伯 胺基的二氧化硅包被。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述納米顆粒的直徑為約lnm-25nm。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述細(xì)胞選自間充質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌 肉細(xì)胞、惡性腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成軟骨 細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腱細(xì)胞、足細(xì)胞、球旁細(xì)胞、球內(nèi)系膜細(xì)胞/ 球外系膜細(xì)胞、腎近端小管刷狀緣細(xì)胞、致密斑細(xì)胞、胃粘膜主細(xì)胞、壁細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、帕 內(nèi)特細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞、APUD細(xì)胞、肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、心肌細(xì)胞、周細(xì)胞、 肺細(xì)胞、I型肺細(xì)胞、II型肺細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小 膠質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、濾泡旁細(xì)胞、甲狀旁腺主細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、淋巴的B/T T細(xì)胞、 自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多葉核嗜中性粒細(xì) 胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、凝血細(xì)胞、巨核細(xì)胞和樹突細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體的細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述方法包括選自以下的步驟體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞，離 體標(biāo)記細(xì)胞，將所述納米顆粒進(jìn)行口服遞送、局部遞送、經(jīng)皮遞送、腹膜內(nèi)遞送、眼內(nèi)遞送、 顱內(nèi)遞送、腦室內(nèi)遞送、大腦內(nèi)遞送、陰道內(nèi)遞送、子宮內(nèi)遞送、鼻內(nèi)遞送、直腸遞送、胃腸外 遞送、皮下遞送、血管內(nèi)遞送，體內(nèi)觀察細(xì)胞，離體觀察細(xì)胞，定位納米顆粒，用磁場(chǎng)定位納 米顆粒和將含納米顆粒的細(xì)胞與不含納米顆粒的細(xì)胞分離。
39.治療需要治療的個(gè)體的方法，所述治療包括給予所述個(gè)體聯(lián)合了藥學(xué)可接受的實(shí) 驗(yàn)的權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的超順磁性納米顆粒，所述納米顆粒與治療有效的基團(tuán)圣雙口 ο
40.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的超順磁性納米顆粒在制備藥物中的用途。
全文摘要
公開了多面體超順磁性納米顆粒及制備和使用所述納米顆粒的方法。還公開了所述納米顆粒的包被形式和官能化形式、使用納米顆粒的方法和使用納米顆粒的治療方法。
文檔編號(hào)A61K49/18GK102105175SQ200980128680
公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者梁湛輝, 王毅翔, 秦岺 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)