專利名稱：一種產(chǎn)靈菌紅素的微生物菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物材料，具體是一種產(chǎn)靈菌紅素的微生物菌株 及其應(yīng)用。經(jīng)檢測，本菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens ZSG)，并于2009-9-17 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209195。(二)現(xiàn)有技術(shù)靈菌紅素(Prodigiosins)是一類然紅色素家族的總稱，是由多 種放線菌(str印tomyces)和細(xì)菌(serratia，pseudomonas)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。自從 1929年Amako等人在研究Serraria生長時發(fā)現(xiàn)，并由HarashimaK等人在1960年首次分離 得到此類物質(zhì)以來，對該物質(zhì)性質(zhì)及生物活性的研究一直倍受相關(guān)研究人員的關(guān)注，隨著 研究的不斷深入，它的許多生物學(xué)活性被人們所認(rèn)識，包括抗細(xì)菌(antibaeterial)，抗瘧 疾(antimalarial)，抗真菌(antifungal和抗原生動物(antiprotozoal)的活性。但人們 最感興趣的是此物質(zhì)所具有的免疫抑制活性和引起的腫瘤細(xì)胞凋亡作用。靈菌紅素的生產(chǎn)現(xiàn)狀有生物合成與化學(xué)合成，主要以生物合成為主。靈菌紅素是 微生物的次級代謝產(chǎn)物，可由多種細(xì)菌和放線菌產(chǎn)生，包括鏈霉菌屬(StrePtomyce、)、沙雷 氏菌屬(serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，其中關(guān)于沙雷氏菌屬(Serratia)的研究 最多。對靈菌紅素的研究始于美國，而后在歐美一些發(fā)達(dá)國家有了長足的發(fā)展。1973年， Williams以粘質(zhì)沙雷氏菌(S. marcescen，)Nima株為出發(fā)菌株，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96h后得到 靈菌紅素的最高產(chǎn)量為0. 0235g/L。靈菌紅素的生產(chǎn)在化學(xué)合成上也取得了進展如1961年RapoportH與HoldenKo 首次通過全合成得到了靈菌紅素，開創(chuàng)了靈菌紅素全合成的先河。1987年Dale等人利用雜 環(huán)的Diels — Alder反應(yīng)，以二甲基一 1，2，3，4 一四嗦一 3，6 —聯(lián)苯雙酷為起始物成功合 成出了靈菌紅素。1996年意大利的AlessioRD和RossiA報道了一條新的途徑合成十烷靈 菌紅素，其中關(guān)鍵的步驟是合成二毗咯環(huán)的雜環(huán)交叉偶聯(lián)。靈菌紅素生理學(xué)作用美國國立癌癥研究所(NSI)MelVinMS(2000)等發(fā)現(xiàn)靈菌紅 素在平均IC5(I為2. 1微摩爾時對包括白血病、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、黑素瘤、乳腺癌、前列 腺癌、腎癌、卵巢癌在內(nèi)的八種癌細(xì)胞系中的57種不同的人癌細(xì)胞均有抗性作用。為了闡 明其活性機理，近年來，研究人員們展開了深入的研究，發(fā)現(xiàn)這與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性密 切相關(guān)。盡管靈菌紅素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機理尚有待進一步的研究證明，但醫(yī)學(xué)界目前 就其機理提出了四種可能作為PH調(diào)節(jié)器；作為細(xì)胞分裂周期抑制劑；作為DNA裂解因子； 作為胞外信號調(diào)節(jié)激酶調(diào)節(jié)器。近年，國內(nèi)也有研究人員涉足靈菌紅素的研究，但注意力大多集中在靈菌紅素潛 在的臨床應(yīng)用上面，而對靈菌紅素的生產(chǎn)研究較少。沈亞領(lǐng)、劉建文、魏東芝等人在靈菌紅 素對人胰腺癌細(xì)胞增殖抑制的實驗做了大量研究。研究表明靈菌紅素是一種很有潛力的抗 腫瘤藥物，靈菌紅素對人結(jié)腸腺癌細(xì)胞DLD與SW — 620及人胃癌細(xì)胞株HGT-1的實驗均證 實其對這些腫瘤細(xì)胞有誘凋亡作用。類似的研究還有張靖的靈菌紅素抗癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移作 用及MMps活性的影響。微生物資源極其豐富，從自然資源中篩選得到具有高產(chǎn)靈菌紅素的微生物仍然是 一條非常有應(yīng)用前景的途徑。本發(fā)明人從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株具有生產(chǎn)紅色素能力的紅色短桿菌，這種菌長期生活在此酸性土壤中，已適應(yīng)酸性環(huán)境，由生理 生化實驗和16S rRNA的序列分析表明該短桿菌為粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens，但 是該菌種生理生化實驗中的幾種次級產(chǎn)物酶如賴氨酸脫羧酶等與報道的粘質(zhì)沙雷氏菌的 結(jié)果不一致，并且該菌株與所有報道的粘質(zhì)沙雷氏菌的生長環(huán)境和篩選方法(在SM培養(yǎng)基 加入梯度濃度檸檬酸酸鈉進行富集分離)有很大的區(qū)別，且一般粘質(zhì)沙雷氏菌在酸性的環(huán) 境中產(chǎn)紅色素的量少，或者基本不產(chǎn)紅色素，而本菌株在PH5. 0-6. 0的酸性環(huán)境下能產(chǎn)生 大量的紅色素，推斷此紅色素可能是靈菌紅素，由此我們可能得到一株新的能在酸性環(huán)境 下產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌種Serratiamarcescens. zsg，并且將這株菌種用于工業(yè)上。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種在酸性環(huán)境中能高產(chǎn)靈菌紅素的菌 株，以及該菌株在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。菌種篩選(一)、材料準(zhǔn)備1.實驗土壤樣品取自湖北省黃石市興華生化有限公司糖化車間2、培養(yǎng)基SM培養(yǎng)基蛋白胨10g ；牛肉膏5g ；蒸餾水1000ml ；瓊脂20g(固)； CaCl2 15. 6g/L，調(diào) pH 至 5. 0-6. 5。( 二 )、菌株的篩選分離與純化1)初篩制備初篩菌懸液稱取土壤樣品lg。接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中， 30-37°C連續(xù)培養(yǎng)30天進行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20 u 1涂布于固體SM培養(yǎng) 基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進一步進行涂布 分離，經(jīng)多次純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng) 基中，30°C恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2) 二次篩選制備復(fù)篩菌懸液，在一定濃度氯化銨SM培養(yǎng)基內(nèi)，加入初篩分離菌 的分離菌懸液50ia，30°C恒溫振搖5-7天，得復(fù)篩菌懸液；取復(fù)篩菌懸液20 iil涂于固體 SM培養(yǎng)基，30°C恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細(xì)菌生長情況以及菌落形態(tài)；然后挑取單菌落 在SM培養(yǎng)基中逐級加入一定梯次濃度的檸檬酸三鈉，分離得到純的此菌株。觀察菌落的形態(tài)為菌落呈紅色、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，紅色菌落 周圍是乳白色的菌株，推測紅色是菌株的次級代謝產(chǎn)物，可能為靈菌紅素；最適生長溫度 25 37°C。對上述菌株及紅色代謝物的鑒定首先，將上述所分離的微生物菌株送中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進行保 藏，并分別進行生理生化特性、全細(xì)胞脂肪酸組分、16S rDNA基因序列的測定分析，最終確 定此菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，其菌株生理生化特性及16S rDNA基因 序列的分析報告如下菌株生理生化特性 16S rDNA序列分析主要按照以下步驟進行1)提取細(xì)菌核DNAa)集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內(nèi)培養(yǎng)18小時，取其菌懸液 lml于1. 5ml的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。b)力卩STE lml洗一次，振蕩重懸細(xì)菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
5
c)加600 ill TE，劇烈振蕩重懸細(xì)菌，加入10%的SDS 65 yl，65°C水浴5-lOmin。d)加等體積酚氯仿抽提三次。e)小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc，12000rpm離心 lOmin。徹底棄上清。f)DNA沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)干后溶于20 yl TE備用。TE 緩沖液:10mmol/L Tris-Cl (pH8. 0) ； lmmol/L EDTA_Na2 (pH8. 0)，STE 緩沖液0. lmol/L NaCl lOmmol/L Tris-Cl (pH8. 0) lmmol/L EDTA (pH8. 0)，2) 16S rDNA 基因的 PCR 擴增，PCR擴增引物參照Weisburg等人的方法合成。P1 正向引物 5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，P2 反向引物 5，GGTTACCTTGTTACGACTT3，在50 ii L反應(yīng)體積中，加入1 y L模板DNA (0. 1 u g), 0. 5 u L PI和P2 (終濃度為 0. 5 u M), 1 U L dNTP (每種 NTP 0. 2mM), 0. 5 u L Taq 聚合酶(2U)禾口 5 ii L 10 XPCR 緩沖液。 PCR擴增條件為94°C預(yù)變性5min ；在94°C變性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán) 30次；最后72°C終延伸lOmin。3) PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠， 放入1. 5ml離心管中加2倍體積TE，65°C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后 取上層水相再用酚_氯仿_異戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍體積的lOmol/L乙酸銨和 2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70%乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。4) 16S rDNA的全序列測定和分析PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。P-f :CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；P-r :GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。加入1 y L 模板 DNA( < 0. 1 ii g), PCR 擴增 30 個循環(huán)(94°C lmin, 55°C 30s, 72°C 2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分 析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。二、16S rDNA 序列測定本發(fā)明采用對16S rRNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進行分子水平的鑒定。以 細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到 長度為1484bp的擴增帶(用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列。1) 16S rRNA 基因序列GTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTMTGTCTGGGAMCTGCCTGATGGAGGGGGATMCTACTGGAMCGGTAGCTMTACCGCATMCTGTCGCMGAGRYCAMGAGGGGAGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTRGTAGGTGGGGTMTGGCTCACCTAGGCGACGATYCCTAGCCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCMACACTGGMCTGAGACMCGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTGCACMTGGGCGCMGCCTGATGCAGCCATGSCGCGTGTGTGGMGMGGCCTTCGGGTTGTAMGCACTTTCAGCGAGGAGGMGGTGGTGMCTTMTACGTTCATCMTTG
ACGTTACTCGCAGMGMGCACCGGCTMCTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGGAGGGTGCMGCGTTMTCGGMTTACTGGGCGTAMGCGCACGCAGGCGGTTTGTTMGTCAGATGTGAMTCCCCGGGCTCMCCTGGGMCTGCATTTGAMCTGGCMGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGMTTCCAGGTGTAGCGGTGAMTGCGTAGAGATCTGGAGGMTACCGGTGGCGMGGCGGCCCCCTGGACGMGACTGACGCTCAGGTGCGAMGCGTGGGGAGCAMCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAMCGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTMCGCGTTAMTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCMGGTTMMCTCAMTGMTTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGATGCMCGCGMGMCCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGMCTTTCCAGAGATGGCATTGGTGCCTTCGGGMCTCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAMTGTTGGGTGTMGTYCCGCMCGAGCGCMCCCTTATYCTTTGKTGCCAGCGRTTCGGCCGGGMCCTCAMGGAGACTGCMAGTGATAAMCTGRAGGMGGTGGGGATGACGTCMGTCATCATGGCCCTTACGAGATAGGGCTACACACGTGCTACMTGCGCGTATACAWAGAKAAGCGACYTCGCKAGAGCMGCGGGACCTCATAMGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCMCTCGACTCCATGMGTCGGMTCGCTAGTMTCGTAGATCAGMTGCTACGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAMGMGTAGGTAGCTTMCCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGT2)16S rRNA 基因測序 BLAST 結(jié)果gb I F.T360759. 11 Serratia marcescens strain PSB19 16S ribosomal RNAgene, partial sequenceLength = 1457Score = 2534bits (1372)，Expect = 0. 0Identities = 1422/1453(97% )，Gaps = 12/1453(0% )Strand = Plus/PlusQuery 1 CATGCMGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGAOGAGOGGCGGACGGG 60| | | | | | | | | | | | | | || || || || || | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | || || || || ||Sbjct 8 CATGCMGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGAOGAGOGGCGGACGGG 67Query 61 TGAGTMTGTCTGGGMACTGCCTGATGGAGGGGGATMCTACTGGMAOGGTAGCTMT 120| | | | | | | | | | ||||||||||||||| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 68 TGAGTMTGTCTGGGMACTGCCTGATGGAGGGGGATMCTACTGGMAOGGTAGCTMT 127Query 121 ACOGCATMCTGTCGCMGAGRYCMAGAGGGGAGACCTTOGGGCCTCTTGCCATCAGATG 180II II II II II III II II I II II II I II II II II II II II II II II II II IISbjct 128 ACOGCATMC"GTCGC-MGACCMAGAGGGG"GACCTTOGGGCCTCTTGCCATCAGATG 184Query 181 TGCCCAGATGGGATTAGCTRGTAGGTGGGGTMTGGCTCACCTAGGCGAOGATYCCTAGC 240|| | | | | | | | | || || || | | | || || | | | | | | | | | || || | | | | | | | | | | || || | | | | | |Sbjct 185 TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTMTGGCTCACCTAGGCGAOGATCCCTAG- 243Query 241 CTGGTCTGAGAGGATGACCAGCMACACTGGMCTGAGACMCGGTCCAGACTCCTAOGGGA 300| | | | | | | | | | |||||||||||| || | | | | | | | | | | | | | | ||| | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 244 CTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGMCTGAGACACGGTCCAGACTCCTAOGGGA 303Query 301 GGCAGCAGTGGGGMTATTGCACMTGGGOGCMGCCTGATGCAGCCATGSOGOGTGTGT 360|||| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 304 GGCAGCAGTGGGGMTATTGCACMTGGGOGCMGCCTGATGCAGCCATGCOGOGTGTGT363 Query 361 GGMGMGGCCTTCGGGTTGTMAGCACTTTCAGCGAGGAGGMGGTGGTGMCTTMTA 420
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 364 "GMGMGGCCTTCGGGTTGTMAGCACTTTCAGCGAGGAGGMGGTGGTGMCTTMTA 422 Query 421 OGTTCATCMTTGAOGTTACTCGCAGMGMGCACOGGCTMCTCOGTGCCAGCAGCOGC 480
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 423 OGTTCATCMTTGAOGTTACTCGCAGMGMGCACOGGCTMCTCOGTGCCAGCAGCOGC 482 Query 481 GGTMTACGGAGGGTGCMGOGTTMTOGGMTTACTGGGCGTMAGOGCAOGCAGGOGG 540
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 483 GGTMTACGGAGGGTGCMGOGTTMTOGGMTTACTGGGCGTMAGOGCAOGCAGGOGG 542 Query 541 TTTGTTMGTCAGATGTGMATCCCOGGGCTCMCCTGGGMCTGCATTTGMACTGGCA 600
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 543 TTTGTTMGTCAGATGTGMATCCCOGGGCTCMCCTGGGMCTGCATTTGMACTGGCA 602 Query 601 AGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGMTTCCAGGTGTAGCGGTGMATGCGTAGAGATC 660
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 603 AGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGMTTCCAGGTGTAGCGGTGMATGCGTAGAGATC 662 Query 661 TGGAGGMTACCGGTGGCGMGGCGGCCCCCTGGAOGMGACTGAOGCTCAGGTGOGMA 720
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 663 TGGAGGMTACCGGTGGCGMGGCGGCCCCCTGGAOGMGACTGAOGCTCAGGTGOGMA 722
Query 721 GCGTGGGGAGCMACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAOGCTGTMACGATGTCGATTT780
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
Sbjct 723 GCGTGGGGAGCMACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAOGCTGTMACGATGTCGATTT782 Query 781 GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTMOGOGTTMATOGACOGCCTGGGG 840
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 783 GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTMOGOGTTMATOGACOGCCTGGGG 842 Query 841 AGTAOGGCOGCMGGTTAMACTCMATGMTTGAOGGGGGCCOGCACMGOGGTGGAGC 900
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct 843 AGTAOGGCOGCMGGTTAMACTCMATGMTTGAOGGGGGCCOGCACMGOGGTGGAGC 902
Query 901 ATGTGGTTTMTTCGATGCMCGCGMGMCCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGMCTT960
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
Sbjct 903 ATGTGGTTTMTTCGATGCMCGCGMGMCCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGMCTT962
Query 961 TCCAGAGATGGCATTGGTGCCTTOGGGMCTCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTOGTC1020
lllllllll llllllllllllllllllll lllllllllllllllllllllll
Sbjct 963 TCCAGAGATGG-ATTGGTGCCTTOGGGMCTCTG-AGACAGGTGCTGCATGGCTGTOGTC1020
Query 1021 AGCTOGTGTTGTGMATGTTGGGTGTMGTYCOGCMOGAGCGCMOCCTTATYCTTTGK1080
Sbjct 1021 AGCTOGTGTTGTGMATGTTGGGT-TMGTOCOGCMOGAGCGCMOCCTTATCCTTTGT 1079 Query 1081 TGCCAGCGRTTOGGCOGGGMOCTCAMGGAGACTGCMAGTGATMMCTGRAGGMGGTG 1140
Sbjct1080TGCCAGCGGTTOGGCOGGGMC-TCAMGGAGACTGCCAGTGATMACTGGAGGMGGTG1138Query1141GGGATGAOGTCMGTCATCATGGCOCTTAOGAGATAGGGCTACACAOGTGCTACMTGCG1200| | | | | | | | | ||||||||||||||| | | | | | | | | | |||||||| | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct1139GGGATGAOGTCMGTCATCATGGCOCTTAOGAG-TAGGGCTACACAOGTGCTACMTG"G1196Query1201OGTATACAWAGAKMGCGACYTOGCKAGAGCMGCGGGACCTCATAMGTAOGTOGTAGT1260| || || || | IN || || || | || II II II II II I II II II II II II II II II II ISbjct1197OGTATACMAGAGMGCGAOCTOGCGAGAGCMGCGG-ACCTCATAMGTAOGTOGTAGT 1255Query1261COGGATTGGAGTCTGCMCTOGACTCCATGMGTOGGMTOGCTAGTMTOGTAGATCAG 1320| | | | | | | |||||||||| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |||||||||| | | | | | | | | |Sbjct1256COGGATTGGAGTCTGCMCTOGACTCCATGMGTOGGMTOGCTAGTMTOGTAGATCAG 1315Query1321MTGCTAOGGTGMTAOGTTCOOGGGCCTTGTACACACOGCCOGTCACACCATGGGAGTG 1380I II II II II IIIIIIIIIIIIII I II II II II II II II II II II II II II II II II II ISbjct 1316 MTGCTAOGGTGMTAOGTTCOOGGGCCTTGTACACACOGCCOGTCACACCATGGGAGTG 1375Query 1381 GGTTGCAMAGMGTAGGTAGCTTMOCTTOGGGAGGGCGCTTAOCACTTTGTGATTCAT 1440||||||||||| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 1376 GGTTGCAMAGMGTAGGTAGCTTMOCTTOGGGAGGGCGCTTAOCACTTTGTGATTCAT 1435Query 1441 GACTGGGGTGAAG 1453| | | | | | | | | | | |根據(jù)S rRNA基因測序BLAST結(jié)果，此菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌種Serratia marcesc一ns0其次，對上述菌株的紅色代謝物進行鑒定1、購買靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品，將靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于酸性甲醇，此溶液做全波長掃 描，由掃描結(jié)果可知在該條件下靈菌紅素的最大吸收波長為540nm。2、將所得到的菌體應(yīng)用基本培養(yǎng)基(SM培養(yǎng)基)搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液離心得到上清 液和菌體，上清液經(jīng)過乙酸乙酯萃取，菌體經(jīng)過酸性甲醇萃取，兩者萃取液經(jīng)過濃縮去溶 劑，用乙酸乙酯溶解，低溫靜置，沉淀后得到了大量紅色素及其它雜質(zhì)，此混合物經(jīng)過高效 液相色譜和紅外色譜作全波段掃描，得到在波長540nm處波峰面積很大，而其它物質(zhì)的吸 收波長的波峰面積都比這小很多，全波段波長與靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)樣品所測的波長范圍一致， 證明了混合物中有靈菌紅素的存在，同時也證明靈菌紅素在混合物中的含量比其它物質(zhì)要
^^ o沉淀后得到的混合物用硅膠柱層析，層析柱里采用氯仿和乙酸乙酯洗脫，最后去 溶劑得到了靈菌紅素粗產(chǎn)品。再利用薄層色譜和柱色譜法對其進行再分，得到靈菌紅素純
P
m o選540nm作為檢測波長，由自制的靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品作濃度0D540的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可 由吸收值0D540，計算出靈菌紅素的含量。此含量比在菌體沒有做任何變異誘導(dǎo)和培養(yǎng)基的 選擇的情況下都要高。通過賴氨酸脫羧酶普適測定方法，對發(fā)酵液中賴氨酸脫羧酶測定分析得到，此酶 在發(fā)酵液中存在，而已有的報道中該菌屬不產(chǎn)賴氨酸脫羧酶，由此可推測此菌株是一株沙 雷氏菌新菌株。
本發(fā)明的菌株與以往的同屬菌株相比在酸性環(huán)境中也能產(chǎn)具有抗腫瘤作用的靈 菌紅素，菌株穩(wěn)定。因此，本菌株為在醫(yī)藥方面尤其是制備抗腫瘤藥物方面提供了廣闊前 景。為相關(guān)疾病的治療開拓了新的途徑。
具體實施例方式實施例11、菌株的篩選分離與純化實施例①初篩制備初篩菌懸液稱取湖北省黃石市興華生化有限公司糖化車間土壤 樣品lg。接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基(蛋白胨10g;牛肉膏5g;蒸餾水1000ml ；瓊脂 20g (固)；CaCl2 15.68/1，調(diào)？11至5.0-6.5)中，30_37°C連續(xù)培養(yǎng)30天進行富集，得初篩 菌懸液；取初篩菌懸液20 u 1涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落 在液體SM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進一步進行涂布分離，經(jīng)多次純化、分離，最后得到不同菌 落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；②二次篩選制備復(fù)篩菌懸液，備一定濃度氯化銨SM培養(yǎng)基內(nèi)，加入初篩分離菌 的分離菌懸液50ia，30°C恒溫振搖5-7天，得復(fù)篩菌懸液；取復(fù)篩菌懸液20 iil涂于固體 SM培養(yǎng)基，30°C恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細(xì)菌生長情況以及菌落形態(tài)；然后挑取單菌落 在SM培養(yǎng)基中逐級加入一定梯次濃度的檸檬酸三鈉，分離得到純的此菌株。③觀察菌落的形態(tài)為菌落呈紅色、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，紅色菌 落周圍是乳白色的菌株。實施例2靈菌紅素的制備與純化實施例取實施例1中培養(yǎng)篩選分離的菌體應(yīng)用基本培養(yǎng)基(SM培養(yǎng)基)搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵 液離心得到上清液和菌體，上清液經(jīng)過乙酸乙酯萃取，菌體經(jīng)過酸性甲醇萃取，兩者萃取液 經(jīng)過濃縮去溶劑，用乙酸乙酯溶解，低溫靜置，沉淀后得到了大量紅色素及其它雜質(zhì)的混合 物，將此混合物用硅膠柱層析，層析柱里采用氯仿和乙酸乙酯洗脫，最后去溶劑得到了靈菌 紅素粗產(chǎn)品。再利用薄層色譜和柱色譜法對其進行再分，即得到靈菌紅素純品。實施例3將靈菌紅素純品與藥劑學(xué)上可接受的賦形劑、輔料一起制備成各種劑型的抗腫瘤 藥物。
權(quán)利要求
一種產(chǎn)靈菌紅素的微生物菌株，為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serra tiamarcescensZSG)，CCTCC NOM 209195。
2.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)靈菌紅素的微生物菌株在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)靈菌紅素的微生物菌株及其應(yīng)用，該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescensZSG)。該菌株與以往的同屬菌株相比在酸性環(huán)境中也能產(chǎn)具有抗腫瘤作用的靈菌紅素，菌株穩(wěn)定，因此，該菌株為在醫(yī)藥方面尤其是制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用方面提供了廣闊前景；為相關(guān)疾病的治療開拓了新的途徑。
文檔編號A61P35/00GK101864373SQ200910266649
公開日2010年10月20日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者馮家駿, 危威, 張佑紅, 朱雄偉, 蔡再華 申請人:武漢工程大學(xué);黃石興華生化有限公司