專利名稱：：曲克蘆丁在制備抗病毒性肝炎藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及曲克蘆丁(Troxerutin)在藥物中的用途；尤其涉及曲克蘆丁在制備抗病毒性肝炎藥物中的新用途，特別是在制備抗病毒性乙肝和病毒性丙肝藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
：病毒性乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，它的防治是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題，已引起世界各國(guó)政府的關(guān)注。我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，平均發(fā)病率為120140/10萬(wàn)。其中尤以乙型肝炎為突出。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者超過2.8億，我國(guó)約占9300萬(wàn)。其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)，目前我國(guó)有乙肝患者3000萬(wàn)，每年約有30萬(wàn)人死于與乙肝有關(guān)的肝硬化或肝癌。中國(guó)肝炎防治基金會(huì)于2005年公布的《中國(guó)肝炎的流行現(xiàn)狀及其相關(guān)問題分析報(bào)告》顯示，僅有19%的人目前正在接受抗病毒這一正確的治療方式。我國(guó)肝炎病毒攜帶者的數(shù)量正以每年平均250萬(wàn)人左右的速度迅猛增長(zhǎng)。乙型肝炎不僅嚴(yán)重危害我國(guó)人民的健康，而且還給國(guó)家?guī)韲?yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。乙型肝炎的治療時(shí)間長(zhǎng)，醫(yī)療費(fèi)用較高，再加不恰當(dāng)?shù)臑E用藥物，更加重了額外的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國(guó)每年用于治療乙型肝炎、肝硬化、肝癌的直接醫(yī)療耗費(fèi)約為300億元人民幣。因此，加強(qiáng)病毒性肝炎的預(yù)防，探求乙型肝炎的有效治療方法，是當(dāng)前亟待解決的重大課題。慢性乙型肝炎治療關(guān)鍵是抗病毒治療。病毒性丙型肝炎也是波及全球的傳染病之一，全球有1.7億人感染了丙型肝炎病毒，我國(guó)可能有37004000萬(wàn)丙型肝炎病毒感染者，其發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)。美國(guó)疾病控制中心預(yù)測(cè)，從1990年至2015年，具有慢性肝臟疾病的危險(xiǎn)人群中，丙型肝炎患者將增加4倍。以此推算，如果我國(guó)丙型肝炎病毒的感染和丙型肝炎的流行不能得到很好的控制，至2015年，我們所面臨的丙型肝炎狀況和今天所面臨的慢性乙型肝炎的局面一樣嚴(yán)峻。因此，加強(qiáng)丙型肝炎的研究具有重要性和迫切性。而且，由于缺乏有效的預(yù)防性疫苗，對(duì)丙型肝炎的防治還將是長(zhǎng)期的。丙型肝炎病毒感染是慢性肝病的重要原因，約50%的感染者可轉(zhuǎn)為慢性肝炎，約10%-20%的丙型肝炎20年內(nèi)演變?yōu)楦斡不?，且與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生關(guān)系密切。丙型肝炎的病理機(jī)制及藥物研究是研究熱點(diǎn)之一，但目前還缺乏特異的病理動(dòng)物模型，且臨床上也沒有理想的藥物進(jìn)行治療。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枮?00810038858.1)公開了戸丁在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用，經(jīng)乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)檢測(cè)試劑實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明蘆丁能顯著抑制乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)，具有顯著抑制乙肝病毒作用。曲克蘆丁為維生素P屬的一種，系蘆丁經(jīng)羥乙基化的衍生物，曲克蘆丁已知的藥理作用能抑制血小板的凝集，有防止血栓形成的作用；同時(shí)能對(duì)抗5-羥色胺和緩激肽引起的血管損傷，增加毛細(xì)血管抵抗力，降低毛細(xì)血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水腫；對(duì)急性缺血性腦損傷有顯著的保護(hù)作用。曲克蘆丁的安全性和有效性通過臨床試驗(yàn)，已經(jīng)得到充分肯定；所以，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)曲克蘆丁作為藥物使用，現(xiàn)有曲克蘆丁片劑、膠囊劑、口服液、注射劑等劑型，臨床適用于腦血栓形成和腦栓塞所致的偏癱、失語(yǔ)以及心肌梗塞前綜合征、動(dòng)脈硬化、中心性視網(wǎng)膜炎、血栓性靜脈炎、靜脈曲張、血管通透性升高引起的水腫等。曲克戸丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)曲克蘆丁對(duì)抗乙肝病毒和丙肝病毒作用的相關(guān)研究報(bào)道，而本發(fā)明能使曲克蘆丁的應(yīng)用拓展到一個(gè)新的領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供曲克蘆丁在制備抗病毒性肝炎藥物中的新用途，特別是在制備抗病毒性乙肝和病毒性丙肝藥物中的新用途。本發(fā)明對(duì)曲克蘆丁進(jìn)行了新的藥理實(shí)驗(yàn)本發(fā)明對(duì)曲克蘆丁進(jìn)行了體外抗乙肝表面抗原(HBeAg)和乙肝核心抗原(HBsAg)實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例l)，體內(nèi)鴨感染乙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例2)，結(jié)果(參見表1，2和3)證明曲克蘆丁具有顯著的乙肝病毒抑制作用，而且其最大優(yōu)點(diǎn)是在停藥后未見明顯的乙肝病毒重新復(fù)制的"反跳"現(xiàn)象；因此可將曲克蘆丁用于制備抗病毒性乙肝的藥物。本發(fā)明對(duì)曲克蘆丁又進(jìn)行了體內(nèi)對(duì)卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝損傷模型的肝保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例3)，結(jié)果(參見表4)顯示曲克蘆丁可不同程度地抑制BCG和LPS誘導(dǎo)的小鼠血清ALT、AST水平的升高，對(duì)小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用；因此可將曲克蘆丁用于制備抗病毒性丙肝的藥物。根據(jù)上述藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，曲克蘆丁在抗乙肝、丙肝病毒活性試驗(yàn)中顯示出優(yōu)良的效果。因此可將曲克蘆丁用來制備抗病毒性乙肝或丙肝藥物用于動(dòng)物，優(yōu)選用于哺乳動(dòng)物，特別是人。曲克蘆丁制備的抗病毒性肝炎藥物，藥物中含有有效量的曲克蘆丁及常規(guī)的可藥用載體。該藥物可用常規(guī)的藥物制備方法，將曲克蘆丁與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和(或)輔劑結(jié)合，制成可作為藥物使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃?，如片劑、丸劑、膠囊劑、口服液、注射劑等劑型的制劑，也可以制成緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑以及各種微粒給藥制劑。制劑中含有O.1_90重量％的曲克蘆丁。本發(fā)明曲克蘆丁的給藥劑量取決于諸多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑及給藥次數(shù)等。通常體重約75公斤患者，所給曲克蘆丁的日劑量為0.001mg/kg體重-70mg/kg體重，優(yōu)選0.Olmg/kg體重-10mg/kg體重。給藥劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。具體病例可由醫(yī)師根據(jù)病情調(diào)整。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于1.本發(fā)明提供了曲克蘆丁在制備抗病毒性乙肝藥物方面的新用途。2.本發(fā)明提供了曲克蘆丁在制備抗病毒性丙肝藥物方面的新用途。3.本發(fā)明曲克蘆丁制備的抗病毒性乙肝、丙肝藥物，可以制成不同劑型，可以不同方式給藥，增加臨床應(yīng)用的選擇性。4.本發(fā)明所需的原料價(jià)格低，原料易得，便于大范圍內(nèi)使用。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例僅用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1曲克蘆丁體外抗乙肝病毒試驗(yàn)1.材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物以H印G22.2.15細(xì)胞為模型，將H印G22.2.15細(xì)胞接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入DMEM培養(yǎng)基混合培養(yǎng)液(含10%FBS及380yg/mlG418)5ml，置37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱中，34天傳代。用5%NaHC03調(diào)pH值至7.2。(DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；G418為Sigma公司產(chǎn)品)。阿德福韋酯(蘇州葛蘭素史克制藥有限公司產(chǎn)品)，以二甲基亞砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培養(yǎng)液稀釋成5iig/ml。曲克蘆丁(陜西森弗生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，以二甲基亞砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培養(yǎng)液分別稀釋成1yg/ml，2.5iig/ml，5yg/ml的溶液。培養(yǎng)細(xì)胞消化液用0.25%胰蛋白酶(Costar公司產(chǎn)品)消化成單個(gè)細(xì)胞，吹打混勻后，分別接種于96孔培養(yǎng)板(每孔細(xì)胞數(shù)為1X104)及24孔培養(yǎng)板(每孔細(xì)胞數(shù)為1X105)上。分別加入培養(yǎng)液200ul及l(fā)ml，37°C5%C02孵箱培養(yǎng)48h。待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)上清液，換用含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，每3天換用含同等藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行9天，第9天末收集培養(yǎng)上清液，-2(TC保存；同批試劑盒檢測(cè)上清液中HBsAg、HBeAg1.2實(shí)驗(yàn)分組聯(lián)合用藥采用棋盤法設(shè)計(jì)。分為單用曲克蘆丁、陽(yáng)性對(duì)照藥物為阿德福韋酯和不加藥物的陰性對(duì)照組。曲克蘆丁濃度取1、2.5和5iig/ml，陽(yáng)性對(duì)照藥物阿德福韋酯濃度取5iig/ml。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。1.2.1每孔加入待測(cè)標(biāo)本50ul，設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，每孔加入陰性對(duì)照(或陽(yáng)性對(duì)照)各一滴，并設(shè)空白對(duì)照一孔。1.2.2每孔加入酶結(jié)合物1滴(空白對(duì)照孔除外)，充分混勻，封板，置37t:孵育30分鐘;1.2.3棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)五次后拍干；1.2.4每孔加顯色劑A液、B液各1滴，充分混勻，封板，置37°C孵育15分鐘；1.2.5每孔加入終止液1滴，混勻；1.2.6用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm，讀取各孔讀數(shù)。1.3上清液HBsAg和HBeAg的檢測(cè)采用放射免疫法，結(jié)果以復(fù)孔平均值表示。立可讀乙肝HBsAg、HBeAg診斷試劑盒(上?？迫A生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。計(jì)算方法抑制率(％)=(陰性對(duì)照組cpm-實(shí)驗(yàn)組cpm)/陰性對(duì)照組2.結(jié)果組間比較用方差分析，采用SPSS11.0完成(見表1)表1曲克蘆丁對(duì)HBsAg和HBeAg抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，曲克蘆丁具有乙肝病毒抑制作用；因此，可將曲克蘆丁用于制備抗病毒性乙肝的藥物。實(shí)施例2曲克戸丁體內(nèi)抗乙肝病毒試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料1.1病毒鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強(qiáng)陽(yáng)性血清，采自上海麻鴨，_70°C保存。1.2動(dòng)物1日齡北京鴨(北京醫(yī)科院藥植所動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)產(chǎn)品)。1.3藥物阿德福韋酯(中國(guó)蘇州葛蘭素史克制藥有限公司產(chǎn)品)；曲克蘆丁(陜西森弗生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。以上藥物分別制成lmg/ml的脂質(zhì)體，以注射用水稀釋后給藥。1.4試劑a-32P_dCTP(北京福瑞公司產(chǎn)品)；缺口翻譯藥盒(普洛麥格公司產(chǎn)品)；S印hadexG-50，F(xiàn)ico11PVP(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)；SDS(德國(guó)Merck公司產(chǎn)品)；魚精DNA、牛血清白蛋白(中國(guó)科學(xué)院生物物理所產(chǎn)品)；硝酸纖維素膜0.45um(安普公司產(chǎn)品)。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1復(fù)制鴨乙型肝炎病毒感染模型取1日齡北京鴨30只，隨機(jī)分成5組模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，曲克戸丁低、中、高劑量組。每組6只。每只經(jīng)腿脛靜脈注射0.2ml上海麻鴨DHBV-DNA強(qiáng)陽(yáng)性鴨血清。2.2藥物治療在感染后7天自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，為治療前樣本(TO)，-7(TC保存待檢。DHBV感染雛鴨7天后進(jìn)行藥物治療試驗(yàn)，曲克蘆丁低、中、高劑量組分別給予曲克蘆丁10、25、50iig/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿德福韋酯50iig/kg，模型對(duì)照組給予生理鹽水。灌胃給藥，每日2次，連續(xù)10天，在用藥第5天(T5)，第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，_701:保存待檢。2.3DHBV-DNA的測(cè)定鴨血清樣品用32P_DHBVDNA探針作斑點(diǎn)雜交，X射線底片上得到放射自顯影像，以酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)定其OD值，半定量計(jì)算DNA水平。3.結(jié)果雛鴨感染乙肝病毒后DHBV-DNA全部陽(yáng)性，曲克蘆丁25yg/kg、50yg/kg對(duì)DHBV-DNA有明顯抑制作用(P<0.05)，且曲克蘆丁在停藥后未見明顯的乙肝病毒重新復(fù)制的"反跳"現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照藥阿德福韋酯在用藥期間可顯著抑制鴨DHBV-DNA(P<0.05)，但停藥后出現(xiàn)乙肝病毒重新復(fù)制的"反跳"現(xiàn)象(P<0.05)(見表2、表3)。表2曲克戸丁對(duì)鴨血清DHBV-DNA水平的影響(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05。表3曲克戸丁對(duì)鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的影響(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，曲克蘆丁具有顯著的乙肝病毒抑制作用；因此，可將曲克蘆丁用于制備抗病毒性乙肝的藥物。實(shí)施例3曲克蘆丁體內(nèi)對(duì)卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝損傷模型的肝保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，i，1822g(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心產(chǎn)品)。1.2藥品與試劑曲克戸丁(陜西森弗生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)制成lmg/ml的脂質(zhì)體，用水稀釋后以注射給藥。利巴韋林注射液(上海信誼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)。卡介苗(BCG)(上海生物制品公司產(chǎn)品)。脂多糖(LPS)(Sigma公司產(chǎn)品)。ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果動(dòng)物隨機(jī)分組，尾ivBCG2Sit/只，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，治療組給予不同劑量的藥物，每日l(shuí)次，陽(yáng)性對(duì)照組給予利巴韋林，50ug/kg，每日l(shuí)次。正常飼養(yǎng)10天，末次給藥后再次尾ivLPS10ug/只，進(jìn)行攻擊，16h后眼眶靜脈取血，進(jìn)行肝功能檢測(cè)(血清ALT、AST測(cè)定)(見表4)。表4曲克盧丁對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(n二6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，曲克戸丁可不同程度地抑制BCG和LPS誘導(dǎo)的小鼠血清ALT、AST水平的升高，對(duì)小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用；因此，可將曲克蘆丁用于制備抗病毒性丙肝的藥物。權(quán)利要求曲克蘆丁在制備抗病毒性肝炎藥物中的用途。2.權(quán)利要求1所述曲克蘆丁在制備抗病毒性肝炎藥物中的用途，其特征在于所述曲克蘆丁在制備抗病毒性乙肝藥物中的用途。3.權(quán)利要求1所述曲克蘆丁在制備抗病毒性肝炎藥物中的用途，其特征在于所述曲克蘆丁在制備抗病毒性丙肝藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及曲克蘆丁在藥物中的新用途。通過對(duì)曲克蘆丁進(jìn)行體外和體內(nèi)抗乙肝病毒、丙肝病毒的藥理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明，曲克蘆丁具有顯著的抑制乙肝病毒、丙肝病毒作用。因此，可將曲克蘆丁用于制備抗病毒性肝炎藥物，特別是用于制備抗病毒性乙肝和病毒性丙肝的藥物。而且所需的原料價(jià)格低，原料易得，便于大范圍內(nèi)使用。文檔編號(hào)A61K31/7048GK101708182SQ20091019842公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月6日優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日發(fā)明者徐從立,黃山申請(qǐng)人:上海雙科醫(yī)藥科技有限公司