專(zhuān)利名稱：：一種新型畜用肽苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種獸用口蹄疫化學(xué)合成肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(footandmouthdisease,簡(jiǎn)稱FMD)是偶蹄動(dòng)物的一種高度接觸性、發(fā)熱性、急性傳染病，在世界各國(guó)普遍分布。其傳播迅速，感染馬、牛，豬，羊等牲畜，導(dǎo)致幼畜死亡，成年動(dòng)物生產(chǎn)能力急劇下降，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和肉食及其畜產(chǎn)品的生產(chǎn)和供應(yīng)，給流行國(guó)家和地區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，口蹄疫在許多國(guó)家已經(jīng)被消滅或很好地被控制，然而近幾年，它再度給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1997年我國(guó)臺(tái)灣口蹄疫大爆發(fā)，殃及600多個(gè)豬場(chǎng)，2000年在俄羅斯爆發(fā)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2001年2月在英國(guó)的爆發(fā)和流行，給英國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了繼瘋牛病和豬痘兩大疫情損害后的又一次沉重打擊，其影響甚至擴(kuò)展到整個(gè)歐洲。在我國(guó)，A型FMDV、O型FMDV、Asial型FMDV都有發(fā)生，Asial型FMDV在歷史上僅局限于我國(guó)云南邊境地區(qū)流行，但在2004-2006年先后在我國(guó)新疆、甘肅、江蘇、北京、河南等地爆發(fā)了Asial型口蹄疫，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展?？谔阋卟《?FMDV)屬于細(xì)小核糖核酸病毒，該屬的病毒具有多型性、易變性等特點(diǎn)。全世界有A、O、C、Satl、Sat2、Sat3和Asial7個(gè)血清型，亞型有70多個(gè)，各血清型間不存在交叉免疫，且病毒易發(fā)生變異，這就為FMD的防治造成了很大困難。目前，我國(guó)對(duì)口蹄疫實(shí)行強(qiáng)制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我國(guó)現(xiàn)行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒滅活疫苗，但滅活卻存在許多隱患，如疫苗生產(chǎn)過(guò)程中由于不慎易引起病毒的逃逸以及滅活不完全而導(dǎo)致FMD的再度暴發(fā)，不同型的毒林間不能提供有效保護(hù)等。目前世界上很多國(guó)家已經(jīng)停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗的國(guó)家進(jìn)口畜產(chǎn)品。為了克服滅活疫苗的自身不足，F(xiàn)MD各種新型疫苗如可飼基因工程疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等不斷涌現(xiàn)，但是其在安全性、免疫效果、工藝方面都存在諸多問(wèn)題，影響了這些新型疫苗的使用。研究表明口蹄疫病毒衣殼蛋白由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60個(gè)組成，VP1-VP3位于衣殼蛋白的外側(cè)，組成衣殼蛋白亞單位，而VP4位于病毒顆粒的內(nèi)部。VP1是主要的保護(hù)性抗原，其上含有FMDV主要抗原結(jié)合位點(diǎn)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，研究表明，位于VP1第134-S58氨基酸之間的G-H環(huán)，C端第200-213氨基酸殘基是誘導(dǎo)中和抗體的主要免疫抗原位點(diǎn)。在本發(fā)明中，選擇了O型、A型和Asial型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上第130-168位的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。同時(shí)由于口蹄疫主要以體液免疫為主，有效的疫苗應(yīng)該能i秀導(dǎo)以Th2為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。DiMarchi等曾報(bào)道，將串聯(lián)有FMDVVP1第140-160和第200-213氨基酸殘基的合成肽免疫牛后，動(dòng)物能抵抗病毒的感染。但隨后的研究證實(shí)，當(dāng)將此類(lèi)合成肽疫苗在易感動(dòng)物群內(nèi)大規(guī)模使用時(shí)，卻僅能提供有限的保護(hù)。究其原因，強(qiáng)效T細(xì)胞表位的缺乏可能是影響該疫苗效果的一個(gè)因素。同時(shí)攜帶B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位的串聯(lián)肽已經(jīng)被證明對(duì)牛表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性。研究證實(shí)，在FMDV衣殼蛋白上有多個(gè)能被牛和豬淋巴細(xì)胞識(shí)別的T細(xì)胞表位，但對(duì)這些T細(xì)胞表位的識(shí)別明顯地受到了宿主MHC多態(tài)性的限制，進(jìn)而也限制了它們?cè)谝呙缰械膽?yīng)用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的T細(xì)胞表位不足以刺激易感動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)口蹄疫病毒產(chǎn)生有效的保護(hù)。所以，提供強(qiáng)效的外源T細(xì)胞表位以輔助增強(qiáng)易感動(dòng)物的免疫應(yīng)答是研究高效肽苗的關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種能抵抗口蹄疫病毒感染的肽疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)上述肽疫苗的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明提供一種抗口蹄疫病毒的肽疫苗，其特征在于肽抗原具有如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在對(duì)口蹄疫病毒抗原表位充分了解的基礎(chǔ)上，通過(guò)試驗(yàn)動(dòng)物篩選得到口蹄疫病毒的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位及其最佳組合方式，進(jìn)而通過(guò)大量試驗(yàn)室試驗(yàn)在小反芻獸疫病毒上找到了一段能增強(qiáng)口蹄疫VP1上優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位的強(qiáng)效外源T細(xì)胞表位，然后通過(guò)一定的接頭氨基酸將強(qiáng)效外源T細(xì)胞表位和優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位連接，構(gòu)建了含輔助性強(qiáng)效外源T細(xì)胞表位和FMDV主要抗原表位基因的多肽疫苗，并通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬完全符合設(shè)計(jì)要求。上述的肽苗，其可以采用化學(xué)合成的方法制備合成肽抗原。本發(fā)明還提供了該肽疫苗的制備方法，主要包括以下步驟(1)抗原肽的化學(xué)合成；(2)抗原肽的裂解、沉淀；(4)高壓液相色譜分離純化多肽抗原；(5)多肽疫苗的配置。上述制備方法中抗原肽的化學(xué)合成是以氨基樹(shù)脂和FMOC氨基酸為原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的活性氨基端，主要包括如下步驟(a)FMOC基團(tuán)脫除用含15%-35%六氫吡啶的DMF溶液在2S-26。C條件反應(yīng)20-40分鐘脫除氨基上保護(hù)的FMOC基團(tuán)，氮?dú)獯蹈?，?huà)F洗滌樹(shù)脂；(b)接肽反應(yīng)加入HOBT、HBTU、DIEA與FMOC保護(hù)的氨基酸在20-28。C條件反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌樹(shù)脂；(c)封閉反應(yīng)使用1.5%-3.5%的乙酰咪唑在20-26。C條件反應(yīng)15-30分鐘。上述制備方法中抗原肽裂解沉淀操作中所使用的裂解試劑為三氟乙酸(TFA)、苯酚(Phenol)和水(H20),它們的比例是90/8/2，裂解反應(yīng)的時(shí)間為1-3小時(shí)。上述制備方法中肽抗原的分離純化主要使用高壓液相色譜，色譜條件如下(a)ds反相色譜柱,規(guī)格19mmx250mmx5um，孔徑300埃；(b)流動(dòng)相A相為含0.5。/。TFA的水，B相含0.5%TFA的乙腈。上述制備方法中疫苗配制的方法包括如下(a)用注射用水將肽抗原稀釋到3(K200ug/ml;6(b)將油佐劑高壓滅菌后備用。(c)在20-28。C條件下將抗原水相與油佐劑按照5:5的比例進(jìn)行乳化，分裝后即得到多肽疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上迷肽及其混合物在制備預(yù)防和/或治療口蹄疫的藥物中的用途。本發(fā)明在詳盡了解口蹄疫病毒分子結(jié)構(gòu)及其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫應(yīng)答的分子成分，及激活宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的分子基礎(chǔ)上，針對(duì)我國(guó)口蹄疫流行現(xiàn)狀，以O(shè)型、A型和Asial型FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1上優(yōu)勢(shì)抗原表位基因?yàn)榛A(chǔ)，結(jié)合強(qiáng)效的外源Th細(xì)胞表位設(shè)計(jì)了新型高效的肽苗。本發(fā)明的抗FMDV肽疫苗可以有效應(yīng)對(duì)口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例L肽抗原固相化學(xué)合成合成法，采用的是FMOC保護(hù)氨基酸，固相載體采用的是氨基樹(shù)脂。生產(chǎn)過(guò)程通常分為肽抗原的固相合成、肽的裂解、抗原純化與除菌保存。具體步驟如下1.1肽抗原的固相合成l丄l合成原料的準(zhǔn)備合成肽抗原的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示。依據(jù)上述抗原的序列以及合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的保護(hù)氨基酸，加入到相應(yīng)的氨基酸瓶中。同樣按要求稱量氨基樹(shù)脂，放入反應(yīng)腔，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成肽的名稱，反應(yīng)腔的皮重及所稱樹(shù)脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑包括DMF、AIM(已酰咪唑)、PIP(哌咬)、甲醇等》史置到相對(duì)應(yīng)的試劑瓶中。1.1.2合成儀狀態(tài)的檢測(cè)檢查合成儀器是否正常運(yùn)行，開(kāi)機(jī)后，運(yùn)行自檢程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查氮?dú)馐欠癯渥?，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對(duì)儀器的性能有所了解，所以要對(duì)每種合成試劑的流速進(jìn)行測(cè)定。發(fā)送測(cè)試程序到合成儀，進(jìn)行測(cè)量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)上下閥門(mén)壓力，直至達(dá)到要求。試劑瓶號(hào)測(cè)試程序測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)范圍Piperidine1I1.0-1.2mlA匿5E1.0-1.2mlMeOH9D3.5-4.0mlDIC8S0.45-0.55g匪F10A2.6-2.8ml1丄3肽抗原的合成開(kāi)始在合成儀的程序中將要合成的氨基酸序列與合成方法發(fā)送到合成儀上。編輯合成肽的序列，保存。檢查合成方法是否正確，序列是否為所存名字，設(shè)定合成循環(huán)；確定后保存，然后運(yùn)行程序。!.1.4肽抗原的合成如上述的多肽序列，合成的時(shí)候是從C端開(kāi)始至N端，依照設(shè)定的程序，依次不斷地重復(fù)如下合成步驟(1)脫除FMOC保護(hù)基團(tuán)使用含25%六氬吡梵的DMF溶液在25°C條件反應(yīng)30分鐘脫除氨基上保護(hù)的FMOC基團(tuán)；(2)洗滌樹(shù)脂氮?dú)獯蹈蓸?shù)脂，用DMF洗滌樹(shù)脂5次；(3)接肽反應(yīng)力口入HOBT、HBTU、DIEA與FMOC保護(hù)的氨基酸在25。C條件反應(yīng)1.5小時(shí)，氮?dú)獯登?shù)脂，然后DMF洗滌樹(shù)脂；(4)洗滌樹(shù)脂氮?dú)獯蹈蓸?shù)脂，使用DMF洗滌樹(shù)脂5次；(5)封閉反應(yīng)使用2.5。/。的乙酰咪唑在25。C條件反應(yīng)30分鐘，將未反應(yīng)活性氨基封閉；8(6)多肽抗原合成后處理合成結(jié)束后從多肽合成儀上取下反應(yīng)器，再用甲醇洗滌肽樹(shù)脂5次，后在通風(fēng)廚內(nèi)吹干，然后將多肽樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至棕色瓶?jī)?nèi)，放入-2〖rc冰箱內(nèi)，封口膜密封備用。1.2、肽抗原的裂解及鑒定1.2.1、肽抗原的裂解按照比例(TFA/Phenol/H2O=90/8/2)配制裂解液，然后從冰箱內(nèi)取出合成好多肽樹(shù)脂，放入圓底燒瓶?jī)?nèi)，在通風(fēng)廚內(nèi)向燒瓶?jī)?nèi)加入配制好的裂解液和磁攪拌子，然后穩(wěn)定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續(xù)攪拌2小時(shí)到反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)80分鐘除去粗產(chǎn)品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹(shù)脂用砂心漏斗過(guò)濾出來(lái)，既得到多肽抗原。1.2.2、合成抗原的鑒定肽抗原合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛試時(shí)間質(zhì)譜法(MALDL-TOF)和反相高壓液相色i普法(RP-HPLC)進(jìn)行定性定量分析。L3、肽抗原的分離純化肽抗原的分離純化采用高壓液相色譜法，色譜條件是色譜柱ODS€18(柱規(guī)格19mmx250mmx5n，300A,Hypersil);流動(dòng)相A(0.5o/。TFA/H2O),流動(dòng)相B(0.5。/。TFA/乙腈)；梯度洗脫條件為30min內(nèi)從10%B變化到50%B;檢測(cè)波長(zhǎng)216nm;流速為1.0mL/min;進(jìn)樣量:20ul。L4、肽疫苗的配制1.4.1、肽抗原水相配制將合成好的肽抗原冷凍干燥，配制多價(jià)肽疫苗時(shí)各型抗原按照1:1:1的質(zhì)量比稱取抗原混合在一起，用滅菌注射用水將合成肽抗原稀釋至i80^g/ml;配制單價(jià)肽疫苗時(shí)將該型肽抗原用滅菌注射用水稀釋至6(Hig/ml。然后將肽抗原溶液經(jīng)孔徑為0.2nm的過(guò)濾器過(guò)濾，除菌。1.4.2、疫苗油相的準(zhǔn)備將油佐劑經(jīng)121。C，30分鐘滅菌，備用。1.4.3、肽疫苗的乳化按油相和抗原水相為5:5的比例，先將油相加入乳化罐內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)以200r/m慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌5分鐘后，同時(shí)緩'f曼加入水相抗原，加完后攪拌15分鐘，再以5000r/m高速攪拌10分鐘，靜置10分鐘，使疫苗乳化成油包水的單相疫苗。實(shí)施例II肽疫苗的安全性試驗(yàn)按照上述實(shí)施例合成如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽抗原，然后按照上述實(shí)施例配制抗口蹄疫病毒的多肽疫苗，每批疫苗抗原含量為60ug/ml。每批疫苗用體重350450g的豚鼠10只，每只皮下注射2ml;用體重18~22g的小鼠10只，每只皮下注射0.5ml。連續(xù)觀察7日，判定是否出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。觀察結(jié)杲見(jiàn)表2。表2:肽疫苗對(duì)豚鼠與小鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>安全從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的肽疫苗免疫豚鼠和小鼠后連續(xù)觀察7日，均沒(méi)有出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，豚鼠和小鼠均沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。這說(shuō)明本發(fā)明的肽疫苗對(duì)于豚鼠和小鼠是安全的。實(shí)施例ni肽疫苗的免疫效果研究將體重450克左右的健康豚鼠隨機(jī)分為五組，每組六只豚鼠，在后腿進(jìn)行多點(diǎn)肌肉注射試驗(yàn)疫苗，各組注射抗原種類(lèi)及劑量見(jiàn)表1。第一次免疫后28天進(jìn)4于第二次免疫，然后釆血測(cè)定抗口蹄疫特異性抗體和中和抗體產(chǎn)生的情況。表l:各組豚鼠免疫抗原類(lèi)型和劑量分組注射試劑首免劑量二免劑量第一組滅活疫苗0.2ml0.2ml第二組SEQIDNO:l多肽疫苗0.2ml0.2ml第三組SEQIDNO:2多肽疫苗0.2ml0.2ml第四組佐劑0.2ml0.2ml1、間接ELISA法檢測(cè)口蹄疫病毒特異性抗體在96孔酶標(biāo)板上以O(shè)型口蹄疫病毒為包^皮抗原(1:IO稀釋)，被才全豚鼠血清為一抗，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG為二抗，在波長(zhǎng)492nm處測(cè)定每個(gè)學(xué)清樣品的OD值，同時(shí)以空白孔調(diào)零。每組隨機(jī)采血3只，以1:32稀釋豚鼠血清，取每組間接ELISA方法測(cè)定結(jié)果的平均值(見(jiàn)表2)。表2顯示，除第四組外，各免疫組豚鼠的特異性抗體水平在第一次免疫后的第二周明顯提高，即抗O型口蹄疫病毒合成肽疫苗組的特異性抗體水平在第一次免疫豚鼠后的第二周明顯提高。同時(shí)，其特異性抗體水平高于滅活苗組。表2:間接ELISA檢測(cè)豚鼠血清FMDV特異性抗體結(jié)果C^土SE)分組第一組第二組第三組第四組免疫前0.18650.17560.18790.2012第--周0.35230.35340.35120.2256首第二周0.52240.64730.64850.3579免第三周0.56320.68590.70640.2912第四周0.98711.03011.12310.2865笫一周1.51311.60231.62720.3946免第二周第三周1.83390.94621.83661.19671.96821.22010.38410.26352、豚鼠血清中和抗體的檢測(cè)分別選用免疫前(0天)，第一次免疫后第28天，第二次免疫后第三周(第49天)的豚鼠血清用于微量中和試驗(yàn)，每組各測(cè)2只豚鼠。將生理鹽水稀釋的豚鼠血清滅活后，在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用稀釋液作一系列倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度作4孔，每孔加入50^1病毒液(100TCIDso)，37。C溫箱中和lh后每孔加入lOOpl細(xì)胞懸液，置于5。/。C02培養(yǎng)箱中37。C培養(yǎng)，自48h開(kāi)始觀察，至144h終判。設(shè)置陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照、病毒回歸試驗(yàn)、血清毒性試驗(yàn)、正常細(xì)胞對(duì)照。按照Spearman-Karber方法，計(jì)算出能保護(hù)50%孔中的細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價(jià)。結(jié)果如表3所示，除第四組外，在第一次免疫后各試驗(yàn)組均出現(xiàn)中和抗體，且笫二組、第三組的中和抗體滴度高于第一組，即抗O型口歸，疫病毒的合成肽疫苗免疫后產(chǎn)生的中和抗體滴度高于滅活苗產(chǎn)生的中和抗體滴度。表3:豚鼠的中和抗體水平豚鼠編號(hào)第一組第二組第三組第四組免疫前1<0.6<0.6<0.6<0.6(第o天)2<0.6<0.6<0.6<0.6首免11.31.91.5<0,6(第28天)21.51.72.0<0.6-免12,12.32.4<0.6(第49天)21.82.01.9<0.6由上述結(jié)果可以看出，肽疫苗在豚鼠上免疫后，產(chǎn)生的特異性抗體水平和中和抗體水平均高于口蹄疫滅活疫苗，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于佐劑組產(chǎn)生的抗體水平。這體現(xiàn)了肽疫苗潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。3、肽疫苗淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)試驗(yàn)準(zhǔn)備96孔板、培養(yǎng)箱、Bio-Rad酶標(biāo)儀、生物安全才巨3-(4，5-二曱基噢哇-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的配制MTT50mg溶解在iOmlRPMI1640和0.1ml的胎牛血清(FCS)的混合溶液，即得到5mg/ml的MTT.試驗(yàn)抗原依據(jù)下表4中所示抗原序列按照上述實(shí)施例合成肽抗原。試驗(yàn)方法與結(jié)果無(wú)菌分離豚鼠脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液0.1ml加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再分別加入30ug肽抗原，每個(gè)抗原設(shè)置3個(gè)重復(fù)。37。C刺激培養(yǎng)48h后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入預(yù)熱到37。C的二甲基亞砜(DMSO)，持續(xù)振蕩5min,用Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)OD570/()D630光吸收值，按下列公式計(jì)算刺激指數(shù)(StimulationIndex,SI):SI-待測(cè)孔OD值/空白對(duì)照孔OD值，計(jì)算結(jié)杲如下表l。表4:淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果刺激指數(shù)SI分組抗原種類(lèi)SI值第一組(免疫組)滅活疫苗o.楊第二組(免疫組)SEQIDNO:l多肽抗原0.524第三組(免疫組)SEQIDNO:2多肽抗原0.562第四組(CK組)免疫佐劑0.150上表說(shuō)明免疫組(第--組到第三組)與對(duì)照組(第四組)都存在顯著性差異(PO.S5)。各免疫組相比，第二組、第三組的刺激指數(shù)要高于第一組，說(shuō)明該合成肽疫苗相對(duì)滅活疫苗而言對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞有更強(qiáng)的刺激作用。序列表〈110〉陶鈺，邵國(guó)虎〈120〉一種新型畜用肽苗及其制備方法〈130〉一種新型畜用肽苗及其制備方法〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211〉61〈212〉PRT〈213〉人工序列<■〉1GlyLeuSerlieLeuPhe!>euSerGlulieLysGlyValLeuValHis151015LyslieGluLysLysValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrGlyGluSer202530ProValAlaAsnValArgGlyAspLeuGinValLeuThrProLysAla354045Al.aArgThrLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalie505560〈210〉2〈211〉61〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2GlyLeuSerlieLeuPheLeuSerGlulieLysGlyValLeuValHis151015!LyslieGluLysLysValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrGlyGluSer202530ProValThrAsnValArgGlyAspLeuGinValLeuAlaGinLysAla354045AlaArgThrLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalie505560權(quán)利要求1、一種抗口蹄疫病毒的肽疫苗，其特征在于肽抗原具有如SEQIDNO1、SEQIDNO2所示的氨基酸序列。2、權(quán)利要求1中所述疫苗，其特征在于，所述疫苗還包含相應(yīng)的佐劑。3、權(quán)利要求1所述的多肽及其混合物在制備預(yù)防和/或治療口蹄疫的藥物中的用途。4、一種根據(jù)權(quán)利要求1中所述的肽抗原制備疫苗的方法，主要包括以下步驟(1)抗原肽的化學(xué)合成；(2)抗原肽的裂解、沉淀；(3)高壓液相色譜分離純化多肽抗原；(4)疫苗配置。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗制備方法，抗原肽的化學(xué)合成其特征在于，是以氨基樹(shù)脂和9芴曱氧羰基(Fmoc)氨基酸為原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的活性氨基端，主要包括如下步驟(a)FMOC基團(tuán)脫除用含15%-35%六氫吡咬的二甲基甲酖氨(DMF)溶液在20-26。C條件反應(yīng)20-40分鐘脫除氨基上保護(hù)的FMOC基團(tuán)，氮?dú)獯蹈?，二甲基甲酰?DMF)洗滌樹(shù)脂；(b)接肽反應(yīng)加入1-羥基苯丙三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N，N，N'，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、二異丙基乙胺(DIEA)與FMOC保護(hù)的氨基酸在20-28。C條件反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，二甲基甲酰?DMF)洗滌樹(shù)脂；(c)封閉反應(yīng)使用1.5%-3.5%的乙酰咪唑在20-26。C條件反應(yīng)15-30分鐘。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述疫苗的制備方法，其中所述多肽抗原裂解所用試劑為三氟乙酸(TFA)/苯酚(Phenol)/H2O=90/8/2,裂解時(shí)間為1-3小時(shí)。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述疫苗的制備方法，特征在于，疫苗配制的方法包括如下(a)用注射用水將肽抗原稀釋到30-200ug/ml;(b)將油佐劑高壓滅菌后備用。(c)在20-28°C條件下將抗原水相與油佐劑按照5:5的比例進(jìn)行乳化，分裝后即得到肽疫苗。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種新型抗口蹄疫病毒感染的肽苗及其制備方法，免疫該肽疫苗后可使易感動(dòng)物抵抗口蹄疫病毒的感染。該疫苗結(jié)合了口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位和強(qiáng)效外源T細(xì)胞表位，具有如SEQIDNO1、SEQIDNO2所示的氨基酸序列，可以通過(guò)化學(xué)合成和基因工程的方法制備，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、免疫效果好、安全性好，可用于保護(hù)易感動(dòng)物牛、豬等免受口蹄疫病毒的感染。文檔編號(hào)A61P31/14GK101579522SQ20091013665公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2009年5月12日優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日發(fā)明者邵國(guó)虎,鈺陶申請(qǐng)人:陶鈺;邵國(guó)虎