專利名稱：：一種包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒及制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及殼聚糖納米粒及其制備方法、具體為包封低分子水溶性藥物三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒以及納米粒的制備方法。
背景技術：
：在過去的幾十年里，隨著藥學、生命科學、高分子材料學等學科的飛速發(fā)展，藥劑學的發(fā)展也日新月異，取得了令人矚目的進步，藥物制劑已經(jīng)從普通制劑發(fā)展到靶向制劑階段，并且應用于臨床診斷與治療。近年來磁共振波i普技術(magneticresonancesectroscopy，MRS)已越來越多地用于臨床研究。使用該技術能無創(chuàng)性檢測體內組織器官的生化成分和能量代謝的變化。它是疾病診斷、治療和隨訪的一項新的檢查和監(jiān)測手段。磁共振波譜分析(MRS)是近年磁共振(MR)成像最主要的進展之一。MRS是一種新近發(fā)展起來的功能磁共振成像，是影像學診斷模式一次質的飛躍，具有廣闊的應用前景。該方法利用受檢部位發(fā)生病變前后某一或多種化合物含量的變化，通過其MRS波峰的變化而達到診斷疾病的目的。在臨床研究和診斷中，MRS可以無創(chuàng)地進行在體和離體生物醫(yī)學研究，進行定性或者定量評估組織內的代謝物構成及濃度水平，其測定結果可以反映被研究對象的生化、生理改變。不過，影響MRS結果準確性的因素卻非常復雜，可以歸結在兩個方面一是MRS數(shù)據(jù)的采集；二是MRS采集數(shù)據(jù)的處理。以肝"P-MRS檢査為例，該方法是通過研究肝能量代謝水平(通過磷化物的代謝實現(xiàn))的變化已達到診斷肝臟疾病的目的。但由于正常肝組織與肝病組織之間、不同肝病之間或同一肝病不同時期之間的PME、PDE、Pi、ATP含量差異或變化不大，所以難以應用于臨床。將肝組織靶向方法引入測量磷化物，可放大這一差異，使MRS應用于診斷肝臟疾病及預后判斷。靶向方法作為分子影像研究最重要方法之一，近年來在各個研究領域均取得顯著成果。磁共振成像(MRI)分子影像使分子影像學研究領域重要組成部分，MRI靶向成像是將墨一種帶有順磁性物質如超磁性氧化鐵(SPIO)、軋噴替酸葡甲胺(gadolinium)等，通過某種載體選擇性積聚于特定組織器官或病變組織，改變了MRT1EI、T2WI或P^2WI馳豫時間，是特定組織器官或病變組織的MRI信號發(fā)生明顯改變，從而實現(xiàn)MRI靶向分子成像，并得到更明確的疾病診斷和更可靠的預后評價。MRS成像原理與MRI成像有明顯的相似之處，MRI耙向分子成像研究成功和臨床的廣泛應用，也為MRS的成功靶向成像的實現(xiàn)提供重要理論與經(jīng)驗。MRS成像是通過多種特定化合物的波峰信號強度，反映其含量水平而達到診斷疾病的目的。根據(jù)MRI靶向成像原理推論，改變該組織MRS圖像上某一種或多種化合物的波峰特征，就能實現(xiàn)MRS靶向分子成像的目的。就肝31P-MRS靶向成像而言，要改變波峰特征，只有把向性改變肝組織內PME、PDE、Pi和ATP的其中一種或多種含量水平才能實現(xiàn)。在生物化學中，三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate,ATP)是一種核苷酸，作為細胞內能量傳遞的"分子通貨"，儲存和傳遞化學能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。ATP由腺苷和三個磷酸基所組成，分子式C10H16N5O13P3，分子量507.184。三個磷酸基團從腺苷開始被編為a、(3和Y磷酸基。ATP的化學名稱為5'-三磷酸-9-P-D-呋喃核糖基腺嘌呤，或者5'-三磷酸-9-P-D-呋喃核糖基-6-氨基嘌呤。ATP的立體結構ATP可通過多種細胞途徑產(chǎn)生，最典型的如在線粒體中通過氧化磷酸化由ATP合成酶合成，或者在植物的葉綠體中通過光合作用合成。ATP合成的主要能源為葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在胞液中產(chǎn)生2分子丙酮酸同時產(chǎn)生2分子ATP，最終在線粒體中通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生最多36分子ATP。人體中ATP的總量只有大約0.1摩爾。人體細胞每天的能量需要水解200-300摩爾的ATP，這意味著每個ATP分子每天要被重復利用2000-3000次。ATP不能被儲存，因為ATP的合成后必須在短時間內被消耗，如果將ATP作成某種靶向制劑并提高其穩(wěn)定性，這將是一件很有意義的事情。為了實現(xiàn)肝31P-MRS靶向成像，構建經(jīng)ATP標記的肝細胞靶向納米載體，將ATP釋放入肝細胞內，增加肝細胞內的ATP含量，從而實現(xiàn)改變ATP波峰特征的目標。目前肝靶向給藥系統(tǒng)的研究一般采用微粒被網(wǎng)狀內皮細胞所吞噬的被動靶向法和基于肝細胞表面受體識別的主動靶向法。被動耙向主要依賴于微粒的大小及表面性質等，而主動靶向則是利用藥物或載體分子和受體的特異性配體問的識別。殼聚糖(chitosan，CSO)是一種來自殼多糖脫乙酰作用的天然多糖，是一類由氨基葡萄糖組成的陽離子聚合物，具有低毒性和生物兼容性。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖及其衍生物對生物大分子藥物具有保護作用，以該類聚合物為載體制備的多肽、蛋白質、核酸類藥物的口服制劑已成為該類藥物的研究熱點，近年來已廣泛應用于攜帶質粒DNA的基因治療研究。低分子量殼聚糖不存在難以被消化道吸收而在人體內蓄積的問題，因此，研究低分子量殼聚糖作為藥物載體材料具有非常重要的意義。ATP為水溶性低分子量藥物，要實現(xiàn)ATP的肝靶向分布，必須減少包封ATP的納米粒在體內轉運過程中的藥物泄漏，實現(xiàn)納米粒對ATP的緩釋。然而水溶性低分子量藥物的緩釋是當前藥物制劑研究中的一大難點之一。
發(fā)明內容為了提高三磷酸腺苷在體內的靶向分布，本發(fā)明的目的是提供一種包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒，其重量百分比組成為:86-99.5%殼聚糖，0-10%三磷酸腺苷，0.5-4wt。/。戊二醛；殼聚糖重均分子量為5000-50000Da，殼聚糖納米粒的粒徑為110納米(nm)，電位為20毫伏(mV)。本發(fā)明的另一個目的是提供上述包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)1.分別精密稱取100-200mg殼聚糖、0-20mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s，停3s,600w)，制備得到W/0型亞微乳。2.在制備得到的亞微乳中加入0.005-0.04ml25。/。戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min，制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。本發(fā)明以具有良好水溶性的低分子量殼聚糖為載體材料，通過亞微乳、表面交聯(lián)和離子復合技術的聯(lián)合應用制備包封ATP的殼聚糖納米粒，實現(xiàn)了ATP從殼聚糖納米粒中的緩釋。本發(fā)明通過亞微乳、表面交聯(lián)固化和離子復合技術的聯(lián)合應用，將三磷酸腺苷以細小的納米粒的形式包封于經(jīng)交聯(lián)的殼聚糖納米粒網(wǎng)絡結構中，從而實現(xiàn)殼聚糖納米粒對水溶性低分子量藥物-三磷酸腺苷的緩釋。圖1包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒的藥物體外釋放。圖2三磷酸腺苷釋放前后的殼聚糖納米粒透射電鏡照片，(A)釋放前，(B)釋放后。具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。但本發(fā)明并不局限于這些實施例。一、包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒的制備實施例l精密稱取100mg重均分子量為5000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液卯ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s,600w)，制備得到W/0型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.04ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5),400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4'C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rprn/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。精密稱取100mg重均分子量為50000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1°/。司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s,600w)，制備得到W/0型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.017ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例3精密稱取100mg重均分子量為18000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s，停3s,600w),制備得到W/0型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入O.Olml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例4精密稱取150mg重均分子量為18000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s，600w)，制備得到W/O型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.016ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例5精密稱取200mg重均分子量為18000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s，600w)，制備得到W/0型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.02ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例6精密稱取100mg重均分子量為18000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1°/。司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s，600w)，制備得到W/O型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.005ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10mhi,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C,21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例7精密稱取100mg重均分子量為18000Da的殼聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1°/。司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s,600w)，制備得到W/0型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.016ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4'C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例8精密稱取100mg重均分子量為18000Da的殼聚糖和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s，停3s,600w)，制備得到w/o型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.016ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C，400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。實施例9精密稱取100mg重均分子量為18000Da的殼聚糖、20mg三磷酸腺苷(ATP)和吐溫80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS緩沖液中(pH7.4)，磁力高速(400rpm)攪拌10min作為水相。配置1%司盤80(span80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作為油相。在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10min后，采用探頭超聲20次(工作2s,停3s,600w)，制備得到W/0型亞微乳。在制備得到的亞微乳中加入0.016ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6h(恒溫攪拌(60°C,400rpm))后，加入鹽酸調pH至弱酸性(pH為5)，400rpm磁力攪拌10min,制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。將制得包封ATP的殼聚糖納米粒分散液低溫離心(4°C，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低溫離心(4'C，21000rpm/，25min)，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封ATP的殼聚糖納米粒。二、包封ATP的殼聚糖納米粒的特性分別稱取上述實施例1-9得到的包封ATP的殼聚糖納米粒10mg,加100mL雙蒸水分散，得到相應的包封ATP的殼聚糖納米粒分散液。使用Zetasizer3000HS分析儀，測定包封ATP的殼聚糖納米粒的平均粒徑(D)和點位。通過公知的紫外分光光度法測定藥物含量，實施例1-9的上述特性均列于下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3、6和7所得包封ATP的殼聚糖納米粒在pH7.4的磷酸緩沖液中的體外釋放結果參見圖l。圖1顯示，以亞微乳、表面交聯(lián)固化和離子復合技術的聯(lián)合應用制備得到的包封ATP的殼聚糖納米粒，ATP從納米粒中的釋放具有緩釋作用，均可持續(xù)釋放24小時以上，而ATP為低分子水溶性藥物，相同量的藥物粉末在pH7.4的磷酸緩沖液中的可在瞬間溶解。更進一步，隨著納米粒制備過程中戊二醛加入量的增加(實施例6-實施例3-實施例7)，ATP從殼聚糖納米粒中的緩釋效果越明顯。圖2為實施例3的包封ATP的殼聚糖納米粒的ATP釋放前后的透射電鏡照片，從圖2A中可以清楚的看到ATP以細小的復合納米粒(ATP與殼聚糖的復合物)的形式被包裹于以交聯(lián)殼聚糖作為載體的球狀結構中，而圖2B則為ATP釋放后的殼聚糖納米粒，納米粒表面與納米粒中可明顯看到ATP釋放后所殘留的空洞。納米粒粒子形狀規(guī)則，呈類球形，大小較為均勻。權利要求1.一種包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒，其組成的重量百分比為86-99.5％殼聚糖，0-10％三磷酸腺苷，0.5-4％戊二醛；殼聚糖重均分子量為5000-50000Da，殼聚糖納米粒的粒徑為110納米，電位為20毫伏。2.權利要求1所述的一種包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒的制備方法，其特作在于，通過以下步驟實現(xiàn)(1)分別稱取100-200mg殼聚糖、0-20mg三磷酸腺苷和吐溫80100mg溶于pH7.4的PBS緩沖液中，400rpm磁力攪拌后作為水相，配置重量體積比為1%司盤80正己烷溶液90ml作為油相，在400rpm磁力攪拌條件下將水相緩慢滴加到油相后，在400rpm條件下繼續(xù)攪拌10分鐘后，采用探頭超聲20次，制備得到W/0型亞微乳；(2)在上述得到的亞微乳中加入0.005-0.04ml25%戊二醛溶液，于電熱恒溫水槽中固化反應6小時后，加入鹽酸調至pH5，400rpm磁力攪拌10分鐘,得到包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒分散液，將分散液低溫離心，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，再低溫離心，重復3次，洗去表面活性劑后，分散于去離子水中，冷凍干燥制備得到包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒。3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特作在于，步驟(2)所述固化反應是60°C恒溫400rpm攪拌。4.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特作在于，步驟(2)所述低溫離心條件為4。C，21000rpm/，25分鐘。全文摘要本發(fā)明提供一種包封三磷酸腺苷的殼聚糖納米粒，其組成為86-99.5wt％殼聚糖，0-10wt％三磷酸腺苷，0.5-4wt％戊二醛；殼聚糖重均分子量為5000-50000Da，殼聚糖納米粒的粒徑為110nm左右，電位為20mV左右。本發(fā)明以具有良好水溶性的低分子量殼聚糖為載體材料，通過亞微乳、表面交聯(lián)和離子復合技術的聯(lián)合應用制備包封ATP的殼聚糖納米粒，實現(xiàn)了ATP從殼聚糖納米粒中的緩釋。本發(fā)明通過亞微乳、表面交聯(lián)固化和離子復合技術的聯(lián)合應用，將三磷酸腺苷以細小的納米粒的形式包封于經(jīng)交聯(lián)的殼聚糖納米粒網(wǎng)絡結構中，從而實現(xiàn)殼聚糖納米粒對水溶性低分子量藥物-三磷酸腺苷的緩釋。文檔編號A61K47/36GK101596169SQ200910100449公開日2009年12月9日申請日期2009年7月6日優(yōu)先權日2009年7月6日發(fā)明者應曉英,杜永忠,胡富強,弘袁申請人:浙江大學