專利名稱：三七三醇皂苷提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物及其制備，特別涉及中藥三七的提取物三七三醇皂苷 提取物及其制備。
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng,PN)是風(fēng)干后的中國傳統(tǒng)中藥三七(Burk)F. H. Chen的 根。三七皂甙(也稱為三七總皂苷，英文名Panax Notoginsenosides, PNS)是三七的主 要有效成份，由30余種不同的皂甙組成，臨床上廣泛用于治療微循環(huán)障礙相關(guān)性疾病，如 心血管疾病和肝功能障礙。三七皂甙已經(jīng)列入國家藥典，有相應(yīng)制劑產(chǎn)品上市，如注射用血 塞通。三七皂苷 的主要成份為人參皂苷Rbl，人參皂苷Rgl，三七皂苷R1，其制備方法有多篇報道。三七三醇皂苷為三七皂甙的一種，對腦血管疾病有治療作用。三七三醇皂苷也有多篇文獻(xiàn)報道，如中國專利200410073881，公開了一種 三七三醇皂甙的制備方法，包括取三七粉碎，加濃度為60%的乙醇浸泡、滲漉，收集滲漉液， 滲漉液減壓濃縮，濃縮液用蒸餾水稀釋，緩慢加到大孔吸附樹脂分離柱中，用40 %乙醇洗 脫，收集40%乙醇洗脫液，然后再精制得三七三醇皂甙。200510075040公開了一種三七三醇皂苷的生產(chǎn)制備方法及其應(yīng)用，包括取三七粉 碎，加濃度為50-90%的乙醇浸泡、滲漉，收集滲漉液，滲漉液減壓濃縮，濃縮液用蒸餾水稀 釋，緩慢加到大孔吸附樹脂分離柱中，用40%乙醇洗脫，收集40%乙醇洗脫液，然后再精制
得三七三醇皂苷等步驟。以上方法均使用大孔吸附樹脂分離，分離效果不佳，本發(fā)明人在對三七三醇皂苷 進(jìn)行研究過程中，采用C18反相硅膠柱分離，試驗(yàn)出一組新的三七三醇皂甙提取物及其制備 方法，這些三七三醇皂甙提取物具有療效高，純度高，吸收好，質(zhì)量穩(wěn)定，同時制備方法分離 效果佳，含量高，工藝簡單，操作方便，成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種三七三醇皂苷提取物的制備方法，所述制備方法步驟如下a.取三七；b.乙醇滲漉；C.滲漉液濃縮；d.分離出上清液；e.上清液干燥后上硅膠柱，f.用乙酸乙酯和乙醇混合液洗脫；收集洗脫液。g洗脫液濃縮得提取物。優(yōu)選的本發(fā)明的制備方法步驟如下a.取三七，粉碎成粗顆粒；
b. 3 10倍70%乙醇浸泡8小時，滲漉，收集20 40倍量70%乙醇滲漉液，滲漉 流速為lBV/hc.滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1. 5倍，；d.離心，上清液減壓濃縮至干；e.干粉和硅膠比例1 1 3拌樣；上200 300目硅膠柱，樣品與分離硅膠比 例 1 50 150 ；f.用乙酸乙酯和無水乙醇3 5 1(體積比)為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗 脫終點(diǎn)；g.收集洗脫液，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。本發(fā)明更詳細(xì)的制備方法如下 三七，粉碎成顆粒，3 10倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集20 40 倍量70%乙醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1.5倍，離 心，上清液減壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 1 3拌樣；上200 300目硅膠柱，樣品與 分離硅膠比例1 50 150;用乙酸乙酯和無水乙醇3 5 1為洗脫劑洗脫，薄層層析 法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層析條件為氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下 層展開后，用噴10%硫酸乙醇加熱105°C顯色)，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常 規(guī)方法凍干、噴干，即得。本發(fā)明最優(yōu)選的的三七三醇皂苷提取物的制備方法見本發(fā)明實(shí)施例。本發(fā)明還包括用本發(fā)明的制備方法獲得的提取物制備的藥物組合物，所述藥物組 合物是用上述三七三醇皂苷作為藥物活性成分制備成的藥物制劑。本發(fā)明的藥物組合物，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，其中三七三醇皂苷 作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是0. 1-99.9%，其余為藥物可接受的 載體。本發(fā)明的藥物制劑組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單 位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、 薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸 齊 、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴 劑、貼劑。本發(fā)明的藥物組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充 齊U、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進(jìn)行包衣。 適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。 適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活 性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑， 或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含 有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基 纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性 酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需 要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體 和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載 體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉 齊U、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這 種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的藥物組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載 體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽 酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA 二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋 酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、 麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及 其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性 齊IJ、聚乙二 醇、環(huán)糊精、環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每 次1-20劑，如1-20袋或粒或片，每劑lmg-1000mg。以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果。本發(fā)明的三七三醇皂苷提取物在LPS誘導(dǎo)的微循環(huán)障礙形成之后的作用對粘附于小靜脈壁白細(xì)胞的數(shù)目的影響在LPS組，注射LPS20分鐘(E)和LPS60分鐘(F)導(dǎo)致了大量白細(xì)胞對血管壁的 粘附。在LPS+三七三醇皂苷提取物組，注射LPS之后20分鐘導(dǎo)致了粘附于小靜脈壁的白
細(xì)胞數(shù)目顯著增加(H)，然后開始三七三醇皂苷后處理，導(dǎo)致了粘附白細(xì)胞數(shù)目的明顯降低 ⑴。對照組60分鐘的觀察期只發(fā)現(xiàn)了少量粘附的白細(xì)胞。相反，LPS組粘附于 小靜脈壁的白細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行性增加并和時間呈現(xiàn)線性關(guān)系，LPS注射后20分鐘為 5. 6士0. 3cells/200ym，而在60分鐘時高達(dá)13. 1 士 1. lcells/200 μ m。三七皂甙提取物后 處理30分鐘顯著改善了 LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞對血管壁的粘附。對肥大細(xì)胞脫顆粒作用的影響注射LPS60分鐘之后脫顆粒的肥大細(xì)胞增加到52. 3士5. 21%。三七三醇皂苷提取 物后處理顯著地抑制了 LPS誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒，其值達(dá)到了 22. 56 士 5. 62 %。對中性粒細(xì)胞粘附分子⑶lib和⑶18的表達(dá)的影響LPS刺激之后⑶1 Ib和⑶18的熒光強(qiáng)度被明顯提高，其值分別達(dá)到和 56. 33士4. 00和66. 85士3. 18。三七三醇皂苷提取物后處理抑制了⑶lib的熒光強(qiáng)度。對血漿細(xì)胞因子濃度的影響LPS刺激之后所有測定的細(xì)胞因子都迅速升高了，分別達(dá)到了 261. 52士64. 41， 652. 83士 156. 32和2. 53士0. 21ng/L。三七三醇皂苷提取物后處理顯著的抑制IL-6和 INF-Y的產(chǎn)生，在一定程度上改善了 TNF-α的釋放。試驗(yàn)的結(jié)果顯示在LPS注射之后20分鐘運(yùn)用三七三醇皂苷提取物后處理對于以上提到的每一個LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生改變的效果是，能夠顯著的減少粘附于小靜脈壁白細(xì)胞的 數(shù)目、脫顆粒的肥大細(xì)胞的數(shù)目以及中性粒細(xì)胞⑶lib的表達(dá)以及LPS誘導(dǎo)的血漿IL-6， INF- γ濃度，這些結(jié)果顯示運(yùn)用三七三醇皂苷提取物后處理能夠改善三七三醇皂苷提取物 誘導(dǎo)的白細(xì)胞的粘附，能夠改善在本試驗(yàn)條件之下LPS誘導(dǎo)的微循環(huán)障礙。這些結(jié)果表明 三七三醇皂苷提取物對LPS誘導(dǎo)的敗血癥具有治療作用。另一項(xiàng)研究表明，用本發(fā)明的三七三醇皂苷提取物處理可以很好地降低腸系膜上 動脈缺血-再灌注誘導(dǎo)的肝臟微循環(huán)障礙，包括降低微靜脈直徑，紅細(xì)胞流速和灌注的竇 狀隙數(shù)量，以及增加白細(xì)胞滾動和粘附。本發(fā)明的三七三醇皂苷提取物對微循環(huán)障礙的改 善作用是基于對缺血_再灌注誘導(dǎo)的肝臟損傷的保護(hù)作用。有關(guān)試驗(yàn)表明，本發(fā)明的三七三醇皂甙提取物比現(xiàn)有技術(shù)療效高，副作用少，純度 高，吸收好，質(zhì)量穩(wěn)定，用途新穎，同時制備方法工藝簡單，操作方便，成本低廉，適合工業(yè)化 生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面以具體來說明本發(fā)明，實(shí)施例是為了便于理解本發(fā)明，而不以任何方式限制 本發(fā)明的權(quán)利要求和核心內(nèi)容。實(shí)施例1三七三醇組皂苷的制備三七，粉碎成顆粒，過20目篩，8倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集30 倍量70%乙醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1. 5倍，離 心，上清液減壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 2拌樣；上250目硅膠柱，樣品與分離硅膠比 例1 100;用乙酸乙酯和無水乙醇4 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層 析條件為氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展開后，用噴10%硫酸 乙醇加熱105°C顯色，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。實(shí)施例2實(shí)施例1所述的三七三醇組皂苷的檢測性狀淡黃色或棕褐色粉末，味苦。照高效液相色譜法測定提取物含量色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0. 05%磷 酸溶液(99 400)為流動相；檢測波長為203nm。理論板數(shù)按人參皂苷Re峰計(jì)算應(yīng)不低 于2500。對照品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷Rgl，人參皂苷Re和三七皂苷Rl適量。 加甲醇分別制成每Iml含人參皂苷Rgl 1.3mg、人參皂苷Re 0. 2mg的溶液、三七皂苷Rl 0. 6mg,即得。供試品溶液的制備取提取物粉末0.05g至25ml容量瓶中，精密稱定，加20ml甲 醇溶解，超聲處理，放冷后加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。測定法分別精密吸取上述對照品溶液各10μ 1與供試品溶液10μ 1，注入液相 色譜儀，測定，即得。Rgl含量占總提取物70%三七皂苷Rl含量占總提取物20%人參皂苷Re含量范圍占總提取物9%，提取物中水分不超過10. 0% ；水分照水分測定法(《中國藥典》2005版附錄IX H第一法)測定，不得過10.0%。三七總皂苷含量在85%以上；三七總皂苷中Rbl不多于8%。實(shí)施例3三七，粉碎成顆粒，3倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集20倍量70%乙 醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1. 5倍，離心，上清液減 壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 1拌樣；上200目硅膠柱，樣品與分離硅膠比例1 50; 用乙酸乙酯和無水乙醇3 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層析條件為 氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展開后，用噴10%硫酸乙醇加熱 105°C顯色)，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。 實(shí)施例4三七，粉碎成顆粒，10倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集40倍量70% 乙醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1. 5倍，離心，上清液 減壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 3拌樣；上200 300目硅膠柱，樣品與分離硅膠比例 1 150;用乙酸乙酯和無水乙醇5 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層析 條件為氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展開后，用噴10%硫酸乙 醇加熱105°C顯色)，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。實(shí)施例5三七，粉碎成顆粒，5倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集25倍量70%乙 醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1. 5倍，離心，上清液減 壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 1.5拌樣；上250目硅膠柱，樣品與分離硅膠比例1 80; 用乙酸乙酯和無水乙醇4 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層析條件為 氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展開后，用噴10%硫酸乙醇加熱 105°C顯色)，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。實(shí)施例6實(shí)施例3的提取物，經(jīng)過檢測，Rgl含量占總提取物40%，三七皂苷Rl含量占總提 取物10%，人參皂苷Re含量占總提取物5%。提取物中水分不超過10.0%;三七總皂苷含 量在80%以上；三七總皂苷中Rbl不多于10%。實(shí)施例7實(shí)施例4的提取物，經(jīng)過檢測，Rgl含量占總提取物70%，三七皂苷Rl含量占總提 取物20%，人參皂苷Re含量占總提取物5%。提取物中水分不超過10. 0% ；三七總皂苷含 量在85%以上；三七總皂苷中Rbl不多于8%。實(shí)施例8實(shí)施例5的提取物，經(jīng)過檢測，Rgl含量占總提取物50%，三七皂苷Rl含量占總提 取物15%，人參皂苷Re含量占總提取物10%。提取物中水分不超過10.0% ；三七總皂苷 含量在85%以上；三七總皂苷中Rbl不多于8%。實(shí)施例9三七，粉碎成顆粒，6倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集35倍量70% 乙醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1.5倍，離心，上清液減壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 2. 5拌樣；上270目硅膠柱，樣品與分離硅膠比例 1 120;用乙酸乙酯和無水乙醇4. 5 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層 析條件為氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展開后，用噴10%硫酸 乙醇加熱105°C顯色)，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。實(shí)施例10取實(shí)施例1的三七三醇組皂苷，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，根據(jù)制劑 學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成片劑.實(shí)施例11取實(shí)施例1的三七三醇組皂苷，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，根據(jù)制劑 學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成膠囊劑.實(shí)施例12
取實(shí)施例1的三七三醇組皂苷，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，根據(jù)制劑 學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成注射劑.實(shí)施例13兩組病人，各50人，服用現(xiàn)有技術(shù)的三七三醇組皂苷片和本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施例 1的三七三醇組皂苷片，有效率相同，后者頭暈，惡心等副作用減少50%以上。
權(quán)利要求
一種三七三醇組皂苷提取物的制備方法，其特征在于，提取步驟如下a.取三七；b.乙醇滲漉；c.滲漉液濃縮；d.分離出上清液；e.上清液干燥后上硅膠柱；f.用乙酸乙酯和乙醇混合液洗脫；收集洗脫液；g洗脫液濃縮得提取物。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，提取步驟如下a.取三七，粉碎成粗顆粒；b.3 10倍70%乙醇浸泡8小時，滲漉，收集20 40倍量70%乙醇滲漉液，滲漉流速 為 lBV/h ；c.滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1.5倍；d.離心，上清液減壓濃縮至干；e.干粉和硅膠比例1 1 3拌樣；上200 300目硅膠柱，樣品與分離硅膠比例 1 50 150 ；f.用乙酸乙酯和無水乙醇3 5 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)；g.收集洗脫液，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。
3.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，提取步驟如下三七，粉碎成顆粒，3 10倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集20 40倍量 70%乙醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1. 5倍，離心，上 清液減壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 1 3拌樣；上200 300目硅膠柱，樣品與分離 硅膠比例1 50 150;用乙酸乙酯和無水乙醇3 5 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判 斷洗脫終點(diǎn)，薄層層析條件為氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展 開后，用噴10%硫酸乙醇加熱105°C顯色，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方 法凍干、噴干，即得。
4.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，提取步驟如下三七，粉碎成顆粒，過20目篩，8倍70%乙醇浸泡8小時，裝滲漉桶滲漉，收集30倍量 70%乙醇滲漉液，滲漉流速為lBV/h，滲漉液于70°C以下減壓濃縮至藥材的1.5倍，離心， 上清液減壓濃縮至干，干粉和硅膠比例1 2拌樣；上250目硅膠柱，樣品與分離硅膠比例 1 100;用乙酸乙酯和無水乙醇4 1為洗脫劑洗脫，薄層層析法判斷洗脫終點(diǎn)，薄層層析 條件為氯仿乙酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，下層展開后，用噴10%硫酸乙 醇加熱105°C顯色，洗脫液70°C以下真空減壓濃縮至干或以常規(guī)方法凍干、噴干，即得。
5.用權(quán)利要求1的三七三醇皂苷提取物的制備方法獲得的提取物。
6.含有權(quán)利要求5的提取物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥提取物及其制備，特別涉及中藥三七的提取物三七三醇皂苷提取物及其制備，制備過程包括提取，分離，濃縮等步驟。
文檔編號A61P1/16GK101966214SQ20091006989
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者張?zhí)m蘭, 李瑞明, 王玉 申請人:天津天士力制藥股份有限公司