專利名稱：一種乳酸菌細(xì)胞壁裂解物的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
微生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)是人和動(dòng)物體內(nèi)最復(fù)雜和最大的微生態(tài)系統(tǒng)，胃腸菌群自身以及與機(jī)體之間始終處于一種動(dòng)態(tài)的平衡中，腸道菌群的平衡和穩(wěn)定對(duì)機(jī)體的生理功能 具有重要的作用，對(duì)其宿主的健康具有深遠(yuǎn)的影響。腸道內(nèi)益生菌主要包括雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳桿菌(Lactobacillus)、 腸球菌(Enterococcus)、芽孢桿菌(Bacillus)以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum) [2]。腸道益生菌可以通過(guò)非免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)穩(wěn)定微生態(tài)環(huán)境，即通過(guò)體內(nèi)定植、黏附、競(jìng)爭(zhēng) 占位提高內(nèi)源宿主的防御機(jī)制；除了這一方面外，益生菌可以通過(guò)提高機(jī)體的體液免疫水 平和細(xì)胞免疫水平來(lái)增進(jìn)機(jī)體的免疫防御機(jī)能。目前，乳酸菌活菌制劑已在腸道疾病的防治、泌尿系統(tǒng)炎癥防治等方面得到一定 的臨床應(yīng)用(見(jiàn)《乳酸細(xì)菌——基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用》P332-335、P343-343，張剛主編，化學(xué)工 業(yè)出版社，2007年)。但尚未見(jiàn)到將糞腸球菌細(xì)胞壁分離并臨床用于免疫調(diào)節(jié)方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
1.菌種篩選糞腸球菌為人體腸道的正常菌群。新加坡國(guó)立大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌是人體腸 道乳酸菌中免疫調(diào)節(jié)性能最強(qiáng)的一類，而且其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制與細(xì)胞壁組分有關(guān)。本發(fā)明從健康嬰兒腸道中分離出27種乳酸菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有4種糞腸球菌具 有免疫調(diào)節(jié)的功能，表明了乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)功能是依賴菌種的。從4種糞腸球菌中，又優(yōu) 選出高免疫活性的MB508菌。2.糞腸球菌細(xì)胞壁裂解物制備方法將糞腸球菌培養(yǎng)液離心并洗滌菌體，再高溫高壓(121 ，0. IMPa, 20min)滅活使 菌體裂解，最后干燥，獲得細(xì)胞壁裂解物質(zhì)。
具體實(shí)施例方式1.糞腸球菌分離取健康兒童新鮮糞便25g，放入裝有95mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角燒瓶中，充分振 搖IOmin (250次/rain)，制成10-1的稀釋液·再稀釋得到10_2，10_3，10_4，10_5的稀釋液·將各糞便稀釋液分別取0. ImL涂布在腸球菌選擇性培養(yǎng)基(Ec)平板上，37°C培養(yǎng) 48h后，選取紫紅色、表面光滑凸起、周邊整齊、直徑1. 0 1. 5mm的菌落，分別傳于Ec基礎(chǔ) 斜面上.將各斜面菌種涂片、革蘭染色、鏡檢，選取革蘭染色陽(yáng)性、圓形或卵圓形、單個(gè)、成 對(duì)或短鏈狀排列的菌株，定名為MB508菌。2. MB508菌細(xì)胞壁裂解物制備將MB508菌培養(yǎng)液3000rpm離心5分鐘，無(wú)菌水洗滌2 3次，高溫高壓(121 °C，0. lMPa,20min)裂解滅活，最后噴霧干燥，得到糞腸球菌細(xì)胞壁裂解3.用于改善接觸性皮炎 用四周齡BALB/c小鼠做試驗(yàn)，分成二組，一組喂以通常飼料為對(duì)照組。另一組為 試驗(yàn)組，飼料中加MB508細(xì)胞壁物質(zhì)(10mg/kg/天)，就誘導(dǎo)發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)的情況進(jìn)行比較。 在16周齡時(shí)二組都用50 μ L0. 5%二硝基氟苯(DNFB)液處理以刺激誘導(dǎo)發(fā)生接觸性皮炎， 處理后5天用0. 2% DNFB 20 μ L涂于耳殼使引起接觸性過(guò)敏反應(yīng)，在誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的24及 48小時(shí)后用千分厚度計(jì)(Dial thickness gauge，卡尺)測(cè)量耳殼腫脹厚度。喂給MB508的小鼠與對(duì)照組小鼠相比，耳殼腫脹可抑制一半，對(duì)耳殼組織做染色 觀察，表明喂食MB508的小鼠炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯可受到抑制。4.免疫調(diào)節(jié)18只小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只，分別為MB508組和生理鹽水對(duì)照組，MB508組 小鼠腹腔注射用無(wú)菌生理鹽水配制的lmg/mL MB508細(xì)胞壁物質(zhì)，生理鹽水對(duì)照組注射生理 鹽水，2組每次均注射0. 5ml每只，連續(xù)2d，注射后第4d進(jìn)行小鼠巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)測(cè)定和 血清溶菌酶活力的測(cè)定(按試劑盒說(shuō)明測(cè)定)。結(jié)果吞噬功能影響
Hl吞噬率吞噬指數(shù)~
對(duì)照組 29. 50 + 2. 17b~~0. 97 士 0. 17B MB508 組 58. 60 士 4. 891 ~~2. 55 士 0. 48A對(duì)小鼠血清溶菌酶的影響
~m\血清溶菌酶活力 對(duì)照組 10. 15 士 2. 67^ MB508 組 ~18. 21 士 3. 49以上結(jié)果表明，MB508細(xì)胞壁物質(zhì)能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)其分泌血清溶 菌酶功能，提高巨噬細(xì)胞殺傷能力。
權(quán)利要求
乳酸菌細(xì)胞壁裂解物主要為肽聚糖和脂磷壁酸的混合制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸菌細(xì)胞壁裂解物，來(lái)自乳酸菌腸球菌屬的糞腸球菌 (E. Faecalis).
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述糞腸球菌，是從健康兒童腸道篩選而得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸菌細(xì)胞壁裂解物的制備方法為將乳酸菌接種于培養(yǎng)基， 37°C，培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液離心，洗滌，得到濕菌體。高溫高壓破壁，最后濃縮干燥得到乳 酸菌細(xì)胞壁裂解物。
5.乳酸菌細(xì)胞壁裂解物在免疫調(diào)節(jié)方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及以人體腸道中篩選而得的糞腸球菌為菌種，經(jīng)高密度發(fā)酵，高溫高壓破壁而得的一種乳酸菌細(xì)胞壁裂解物質(zhì)，以及在免疫調(diào)節(jié)方面的用途。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101953855SQ20091005762
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者馬明 申請(qǐng)人:明博醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)(上海)有限公司