專利名稱：日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種日本血吸蟲蛋白，特別是涉及一種日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、 其編碼蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲病由血吸蟲的感染引起，在世界上有76個(gè)國(guó)家，受感染者約1.5億。致病 的血吸蟲有3種，既日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸蟲(S. mansoni)和埃 及血吸蟲(S. haematobium)。在我國(guó)流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健 康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都造成巨大的損失，因此，防治血吸蟲病、開發(fā)研制血吸蟲臨床診斷試劑和抗 血吸蟲的藥物具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。日本血吸蟲作為寄生蟲能在人體和動(dòng)物體內(nèi)存在很多年而不被宿主的免疫機(jī)制 殺死，與它的免疫逃避能力有關(guān)。其免疫逃避機(jī)制有抗原模擬、抗原偽裝和免疫調(diào)節(jié)。其中 免疫調(diào)節(jié)指的是血吸蟲的蛋白能夠調(diào)節(jié)、干擾(主要是抑制)宿主的免疫系統(tǒng)，使其不能發(fā) 揮正常的免疫攻擊效能，從而有利于血吸蟲的生存。血吸蟲的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein, ESP)就是一類可以 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。這些蛋白來自血吸蟲的表皮和腸道上皮，或者是特化的排泄 /分泌器官。血吸蟲各個(gè)蟲期都產(chǎn)生這類蛋白。ESP是潛在藥物靶點(diǎn)和疫苗分子，因?yàn)橐种?這些蛋白可以干擾血吸蟲的免疫逃避機(jī)制從而增強(qiáng)宿主的免疫殺滅功能；ESP是潛在的診 斷分子，因?yàn)檫@些蛋白游離于宿主的血液中，可以很方便地用現(xiàn)有手段檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、其編碼蛋白 及應(yīng)用，該蛋白可成為很好的診斷標(biāo)記分子。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白的基因，包括具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有SEQ ID N0. 2所示序列的蛋白。本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白，包括具有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的 置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQ ID NO. 1序列編碼的蛋白。利用蛋白質(zhì)組學(xué)手段，通過直接分析感染動(dòng)物(兔子)的血液，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲 的14-3-3蛋白(Accession number :EZ000062. 1)在宿主血液中也存在，是其ESP的成分之 一，表明該蛋白可能在血吸蟲的免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避方面發(fā)揮重要作用；這也使它成為很好 的診斷標(biāo)記分子。這是國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白出現(xiàn)在日本血吸蟲的ESP中。本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用；作 為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，在篩選化學(xué)和其他種類藥物方面的應(yīng)用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用；在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用；日本血吸蟲14-3-3蛋白的編 碼基因，在基因治療方面的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式一、方法1、感染動(dòng)物，制備感染血清在血吸蟲流行區(qū)中收集自然感染的陽(yáng)性湖北釘螺(Oncomelania hupensis hupensis)，將釘螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西蘭大白兔剃去腹部的 毛，露出皮膚；取日本血吸蟲1000條尾蚴，經(jīng)裸露的兔子皮膚感染兔子。收集感染后第42 天的動(dòng)物血液，制備血清。2、感染動(dòng)物血清蛋白的提取用6倍體積的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，離心收集蛋白沉淀 (5000rpm, 5 分鐘)，溶解沉淀用 50mM Tris-HCl (pH 8. 3), 5mM EDTA, ImM phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), 0. 5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0. 5mM二硫蘇糖醇(DTT)，
0.5% SDS，利用超聲波促進(jìn)蛋白溶解。3、血清蛋白的酶解過程血清蛋白混合物加入終濃度IOmM DTT,室溫反應(yīng)30分鐘，再加入終濃度55mM的碘 乙酰氨置暗處反應(yīng)15分鐘，用去離子水稀釋5-10倍，按1 50的體積比例加入修飾的測(cè) 序級(jí)牛胰酶，37°C酶解過夜。4、血清蛋白酶解肽段混合物用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(Strong Cation Exchange, SCX) 進(jìn)行分級(jí)SCX柱的平衡和清潔SCX柱在每次使用前，先用高鹽溶液(500mM/25% ACN, pH 3.0)過柱，然后用(H20/25% ACN，pH 3.0)平衡。清洗柱則用高鹽溶液。酶解后的肽段樣品用SCX平衡溶液(水、30%乙腈pH3.0)稀釋，預(yù)先配制好不同 濃度的NH4HCO3鹽溶液(IOmM 500mM)，用注射器將樣品推過SCX色譜柱4. OmmX 150mm P0R0S 50HS column (Sciex-Applied Biosystems)，再依次用配好的鹽溶液，按照濃度從 低到高的順序，洗脫SCX柱上結(jié)合的肽段，分別收集各個(gè)洗脫的組分，用真空濃縮儀將溶液 體積抽減20-30 μ 1左右。5、質(zhì)譜鑒定每個(gè)組分的肽混合物上樣到一個(gè)反相捕獲柱(C18，5 μ m, 300 A，300 μ m
1.dX5mm, LC Packings)，在20 μ 1/min的流速下脫鹽。然后這個(gè)捕獲柱和一個(gè)分析用的 75 μ mX 150mm C18柱(LC Packings)相連接，肽混合物就在200nl/min的流速下，從這個(gè) 柱子上洗脫進(jìn)入裝有Protana NanoES的電噴霧離子源的QSTAR pulser i中。Agilent 1100毛細(xì)液相系統(tǒng)(Agilent Technologies)用來提供流動(dòng)相A(0. 5%乙酸/水)和流動(dòng) 相B(0. 5%乙酸/乙腈)，線性梯度是60分鐘內(nèi)5% B到50% B, 30分鐘內(nèi)50% B到90% B，然后是在90% B停留15分鐘。在分析柱后通過一個(gè)不銹鋼的兩通(Valco Instrument) 連接一個(gè)10 μ m直徑的PicoTip納噴霧頭(New Objective)，加上2500-3000伏的噴霧電 壓，以獲得穩(wěn)定的噴霧。MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜譜圖通過信息依賴的采集(IDA)和任務(wù)-循環(huán)增強(qiáng)來記錄。在每
4個(gè)測(cè)定掃描中，選取3-6個(gè)信號(hào)最強(qiáng)、帶2到3個(gè)電荷的離子，用滾動(dòng)碰撞能量打碎，以獲 得串聯(lián)質(zhì)譜的信息。噴霧電壓=3000, DP = 50，F(xiàn)P = 220，MS掃描范圍為m/z 450-1400， MSMS掃描范圍為m/z 50-1800，GSl = 20，簾氣為10，所用離子源為Protana NanoES電噴 霧離子源。6、質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)處理及日本血吸蟲排泌蛋白的鑒定質(zhì)譜搜索用的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括從11717個(gè)從公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI下載的日本血吸蟲蛋白 質(zhì)序列(時(shí)間是 2008 年 10 月 16 日)。搜索軟件是 MASCOT (http://www. matrixscience. com/, Matrix Science)。搜索參數(shù)為最大漏切點(diǎn)，3個(gè)；monoisotopic ；肽電荷數(shù)， +1/+2/+3 ；修飾，半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索結(jié)果合并后， 用下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾篩選1)對(duì)每一個(gè)串聯(lián)質(zhì)譜譜圖的搜索結(jié)果列表，只提取排位在第一個(gè)的結(jié)果，其他的 則丟棄；2)搜索得到的肽段中如果有KR，KK, RK, RR等序列，則這個(gè)肽段丟棄；3)搜索得到的肽段，長(zhǎng)度在8個(gè)氨基酸以上的保留，小于8個(gè)氨基酸的丟棄；4)重復(fù)打到的肽段，只計(jì)算其中分值最高的，把這些肽段分值加起來，做為蛋白的 得分；5)蛋白的得分超過60，就認(rèn)為是可信的結(jié)果。低分的蛋白，手工檢查后保留或者 丟棄。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，則丟棄。同時(shí)進(jìn)行反向蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索。反向蛋白庫(kù)是將日本血吸蟲蛋白質(zhì)序列 反轉(zhuǎn)，保持長(zhǎng)度、組成不變。根據(jù)正向庫(kù)和反向庫(kù)搜索得到的結(jié)果，確定假陽(yáng)性率。計(jì)算方 法假陽(yáng)性=2*(反向庫(kù)肽段數(shù))/(正向庫(kù)肽段數(shù)+反向庫(kù)肽段數(shù))。假陽(yáng)性控制在0%。二、結(jié)果1)從被感染的動(dòng)物血清中直接鑒定日本血吸蟲的排泌蛋白在國(guó)際上首次從被感染的動(dòng)物血清中直接鑒定日本血吸蟲的排泌蛋白。鑒定到日 本血吸蟲14-3-3蛋白的3個(gè)肽段(表1)，證明了日本血吸蟲14-3-3蛋白的確存在于宿主 動(dòng)物的血清中，可以被檢測(cè)到，因而可以成為血吸蟲臨床診斷的靶標(biāo)分子。表1日本血吸蟲14-3-3在被感染的動(dòng)物血清中被發(fā)現(xiàn)和鑒定 2)日本血吸蟲14-3-3蛋白的序列保守性
鑒定到的日本血吸蟲14-3-3蛋白的肽段，都經(jīng)過與宿主動(dòng)物即兔子的序列的比 較，發(fā)現(xiàn)這些肽段都是血吸蟲特異的、不同于宿主。3)日本血吸蟲14-3-3蛋白的功能日本血吸蟲14-3-3蛋白發(fā)揮多種重要的生物學(xué)功能。本實(shí)施例中的結(jié)果表明日 本血吸蟲14-3-3蛋白可以分泌到宿主的血液中，和宿主的免疫系統(tǒng)直接接觸，推測(cè)可能發(fā) 揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，可以通過在感染動(dòng)物或人體血液中檢測(cè)血吸蟲14-3-3蛋白 的存在，從而判斷是否感染血吸蟲，或者判斷藥物治療后的驅(qū)蟲效果。
權(quán)利要求
一種日本血吸蟲14 3 3蛋白的基因，其特征在于包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲14-3-3蛋白的基因，其特征在于所述的SEQID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO. 2所示序列的蛋白。
3.一種日本血吸蟲14-3-3蛋白，其特征在于包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序 列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能 的蛋白。
4. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用。
5. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在篩選藥物方面的應(yīng)用。
6. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用。
7. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用。
8. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白的編碼基因在基因治療方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、其編碼蛋白及應(yīng)用，該基因包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；日本血吸蟲14-3-3蛋白，包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQ ID NO.1序列編碼的蛋白。本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用；作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，在篩選藥物方面的應(yīng)用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用；在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用；日本血吸蟲14-3-3蛋白的編碼基因，在基因治療方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P33/12GK101921768SQ200910057438
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者馮正, 劉鋒, 胡薇, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心