專利名稱：界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物載體及其制備方法，具體涉及交聯(lián)的溫度敏感的聚合 物囊泡的藥物釋放系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
由雙親性聚合物利用分子間的相互作用在水中自組裝形成的聚合物囊泡 (polymersomes),膜的穩(wěn)定性髙、性能(如厚度、彈性、韌性及降解性)可調(diào)、 內(nèi)容量大、能包裹親水和疏水性物質(zhì)，在藥物的控制釋放上具有巨大應(yīng)用潛力。 二嵌段、三嵌段共聚物、接枝共聚物和超枝化共聚物都被發(fā)現(xiàn)能形成囊泡，但 多數(shù)制備用到有機(jī)溶劑。能直接在水中制備得到囊泡將在水溶性藥物的包裹和控制釋放上更具有優(yōu) 勢(shì)。如Discher小組研究了聚乙二醇-聚丁烯(PEO-PEE)及聚乙二醇-聚l, 3-丁二烯(PEO-PBD)襄泡的生物相容性該囊泡在血漿里保持穩(wěn)定，不吸附也 不被巨噬細(xì)胞吞噬，而且其存在不影響細(xì)胞的增殖。這些囊泡在大鼠體內(nèi)的循 環(huán)時(shí)間是隱形脂質(zhì)襄泡的兩倍多(參見JCM Lee， Biotechnol. Bioeng.， 2001, 73(2), 135)。雖然生物相容性良好，伹該體系和現(xiàn)有的大多數(shù)聚合物囊泡體系 都不可生物降解或不易被排出體外。研究者把可生物降解的聚合物混入用以形 成囊泡，包入抗癌藥物阿酵素和紫杉醇后，在異種移植有人類乳腺腫瘤的裸鼠 體內(nèi)第五天時(shí)，囊泡治療組的腫瘤尺寸是只有游離藥物對(duì)照組的腫瘤的一半(參 見FAhmed， Mol. Pharmaceutics, 2006， 3(3), 340)。直接在水中制備得到囊泡將在是蛋白質(zhì)、多肽類和DNA/siRNA等易破壞藥 物的包裹和控制釋放上更具有優(yōu)勢(shì)。研究表明膜蛋白能被插在聚合物囊泡的厚 膜中且保持生物活性(參見P Broz， Nano Le"" 2006， 6， 2349; Meier， Angew. Chem.-Int. Edit.， 2000,39, 4599)。把蛋白質(zhì)藥物包在聚合物囊泡內(nèi)腔也能很好 地保護(hù)其不被降解，保持其生物活性不變(參見S Rameez， Bioconjugate Chem.， 2008， 19, 1025; A Napoli， Nat Mater, 2004， 3， 183)。例如，日本東京大學(xué)的氨基酸聚離子襄泡(PICsome)中的肌紅蛋白能夠保持 其生物活性(參見A Kishimura， Angew. Chem.-Int. Edit., 2007， 46, 6085); Palmer等報(bào)道包裹在PEG-PCL囊泡內(nèi)腔的人和牛的血紅蛋白有和人紅細(xì)胞相 近的氧氣親和性，可作為治療性氧氣載體(參見S Rameez， Bioconjugate Chem.， 2008, 19， 1025)。蔣新國(guó)等報(bào)道表面標(biāo)有老鼠抗小鼠單抗(OX26)、內(nèi)部載有模型 多肽NC-1900的PEG-PCL囊泡能穿過(guò)血腦屏障(BBB)(參見ZQ Pang, J. Control. Release, 2008, 128， 120)。最近，Discher等報(bào)道PEO-PCL/PEOPBD 襄泡包載的胰島素在血漿中能穩(wěn)定存在(參見DA Christian, Eur. J. Pharm. Biopharm.， 2009, 71(3), 463)。這些囊泡普遍存在產(chǎn)率低和對(duì)親水藥物的包裹 效率低，藥物的生物利用度也就低的問(wèn)題；對(duì)靶向襄泡的研究還很少，藥物釋 放到病灶部位如癌細(xì)胞區(qū)的效率低，這些都限制了聚合物囊泡生物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。 設(shè)計(jì)對(duì)信號(hào)(pH、溫度等)響應(yīng)的聚合物囊泡體系(參見JZDu，J. Am. Chem. Soc., 2005， 127， 12800; 127， 17982; SH Qin， Adv. Mater., 2006, 18， 2905)能夠解決上述問(wèn)題，但目前對(duì)這類體系的報(bào)道不多見。同時(shí)，自組裝結(jié) 構(gòu)不穩(wěn)定，注入體內(nèi)大量稀釋后解離，造成藥物過(guò)早釋放，交聯(lián)聚合物囊泡方 面，尤其是用有刺激響應(yīng)性的交聯(lián)劑交聯(lián)的體系的研究還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡及其制備方法， 以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提高囊泡對(duì)小分子藥物、大分子藥物以及探針?lè)肿拥?包載效率，提高囊泡在體內(nèi)血液中循環(huán)的穩(wěn)定性，提高囊泡被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞的 效率，從而提髙藥物的生物利用度，同時(shí)方便囊泡生物降解和排除體外。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 一種制備界面交聯(lián)的溫度敏 感的聚合物襄泡的方法，包括以下步驟(l)取嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含親水段，交聯(lián)鏈段和溫敏段，親水 段和溫敏段位于嵌段共聚物的兩端，交聯(lián)鏈段位于親水段和溫敏段之間；在最 低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature, LCST)以下，將嵌段共 聚物溶于水溶液或緩沖溶液中，升溫至嵌段共聚物的最低臨界溶解溫度以上， 嵌段共聚物中的溫敏段轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷裕蛔越M裝形成聚合物囊泡，親水段構(gòu)5成聚合物囊泡的膜殼，溫敏段構(gòu)成聚合物囊泡的膜核，交聯(lián)鏈段構(gòu)成聚合物囊 泡的界面；所述聚合物囊泡在溫度降到LCST以下時(shí)因?yàn)闇孛舳巫優(yōu)橛H水性，因此聚 合物囊泡溶解；所述緩沖液為本領(lǐng)域常用的緩沖溶液體系。(2)對(duì)步驟(1)形成的聚合物囊泡的界面進(jìn)行交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定囊泡結(jié)構(gòu)，得到界面交 聯(lián)的溫度敏感的聚合物嚢泡。上述技術(shù)方案中，所述嵌段共聚物至少包含親水段，交聯(lián)鏈段和溫敏段三 個(gè)功能嵌段，其中，親水段和溫敏段位于嵌段共聚物的兩端，交聯(lián)鏈段位于親 水段和溫敏段之間，在親水段和溫敏段之間還可以加入其他功能嵌段。所述嵌段共聚物中的親水段的分子量為1000 8000Da,制備親水段可選用 的原料和方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，例如可以選自但不局限于聚乙 二醇(PEG)、葡聚糖、聚羥乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸e羥丙酯 (PHPMA)或聚乙烯醇(PVA)中的一種嵌段聚合物的交聯(lián)鏈段的側(cè)鏈含有羧基，因此，當(dāng)嵌段聚合物形成聚合物 囊泡之后，交聯(lián)鏈段構(gòu)成聚合物囊泡的界面，從而可以用二氨基化合物對(duì)其進(jìn) 行界面交聯(lián)；交聯(lián)鏈段的重復(fù)單元數(shù)為5 40個(gè)，交聯(lián)鏈段為側(cè)鏈含有羧基的 聚合物，可以選自但不局限于聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚丁烯酸、 聚戊烯酸、聚己烯酸或聚庚烯酸中的一種；通式為<formula>formula see original document page 6</formula> ;其中，Ri選自氫或甲基，R3選自氫或甲基，R2選自一COOH、H2 H2 H2 — H2 H2 H2 山^ " 一—C—COOH、 一C一C—COOH或一C—C-C-COOH中的一種,n=5~40;嵌段聚合物的溫敏段的分子量為5000 35000Da，為溫度敏感聚合物，可 選自但不周限于聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(N，N-二乙基丙烯酰 胺)(PDEA)或聚(甲基乙烯醚)(PMVE)中的一種；嵌段聚合物的溫敏段的分子量 占嵌段聚合物總分子量的60 90%;上述技術(shù)方案中，反應(yīng)溫度需要髙于具體反應(yīng)嵌段聚合物的低臨界溶液溫 度(LCST)，反應(yīng)溫度的上限本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)囊泡所需包封的藥物的種類來(lái)確定合適的溫度，而且因?yàn)榉磻?yīng)體系是水溶液，所以常壓下，最髙不超過(guò)1001C 。
所述嵌段聚合物在其低臨界溶液溫度(LCST)以下時(shí)，溫敏段表現(xiàn)為親水性，因此嵌段聚合物分子在水溶液中單分子溶解，當(dāng)溫度上升到嵌段聚合物的低臨界溶液溫度(LCST)以上時(shí)，溫敏段轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，于是嵌段聚合物分子間發(fā)生原位自組裝；所述嵌段共聚物的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，在此，以PEG-PAA-PNIPAM共聚物的制備作為例來(lái)說(shuō)明三嵌段共聚物的制備方法，PEG-PAA-PN1PAM共聚物可通過(guò)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(ReversibleAddition-Fragmentation Chain Transfer, RAFT)聚合方法方便合得到首先通過(guò)DCC/NHS法制備大分子RAFT試劑PEG-DMP，然后以PEG-DMP為鏈轉(zhuǎn)移劑通過(guò)一鍋兩步順序加料分別聚合AA和NIPAM單體，PEG-DMP先后引發(fā)AA和NIPAM的RAFT聚合，制備一系列分子量可控的PEG-PAA-PNIPAM嵌段共聚物，其合成路線如下圖所示
HO
S\ /S、
NH,
PEG
、C"H 5J5/!E」
o
DCC, NHS
DCM, 20 hr
、0
O
NH
PEG-DMP
S\ /S、
、C12H25
O
o
〉=0 gHO —
〖'、C12H25
AA, A舊N
dioxane, 70 0C, 24 hr
NIPAM, A舊Ndioxgne70 °C, 24 hr
PEG-PAA-PNIPAM
/
上述技術(shù)方案中，所述嵌段聚合物的LCST受中間段的比例、鹽濃度、溶液pH的影響，可在28^至50X:之間調(diào)節(jié)。例如PEG-PAA-PNIPAM嵌段共聚物的LCST在pH7.4,150 mM NaCl時(shí)，中間段PAA的重復(fù)單元數(shù)和溫敏PNIPAM段的重復(fù)單元數(shù)的比值為(10~ 12):100時(shí)，LCST為38 40 C ，該P(yáng)EG-PAA-PNIPAM嵌段共聚物構(gòu)成的共聚物囊泡解交聯(lián)后在體溫371C時(shí)溶解，將包裹物釋放出來(lái)。
上述技術(shù)方案中，步驟(2)所述的交聯(lián)可采用但不局限于下列方法
7利用碳二亞胺縮合法(CARBODIIMIDE Chemistry),用二胺基化合物對(duì)步驟(l)所得聚合物囊泡進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)；
所述二胺基化合物可選自但不局限于含pH敏感鍵的二胺基化合物或還原
敏感的二胺基化合物，所述含pH敏感鍵的二胺基化合物選自但不局限于
H2 H2 H h2 H2H2N—C_C—0—g-0—C—C-NH2
H2 I 3 H2
H2N—C—C—O—C一O—C一C—NH2
Chk 吣
H2 H2 H H2 H2H2N_C—C_0—C—0—C—C—NH2
OH
H2 H2 H H2 H2H2N—C—C—O—C—0_C—C—NH2
OCH3
H2N_C—C—O-C—O—C—C—NH2
或
H3CO
OCH3
中的一種；所述還原敏感的二胺基化合物選自但不
局限于胱胺(H2N—C^"C^"S—S—C^"C^"NH2〉；
經(jīng)化學(xué)交聯(lián)后的聚合物囊泡對(duì)溫度穩(wěn)定，即使降溫至低臨界溶液溫度(LCST)以下也不發(fā)生解離；對(duì)大量稀釋穩(wěn)定，即使稀釋1000倍也不發(fā)生解離；對(duì)2 M的氯化鈉鹽的水溶液穩(wěn)定，粒徑不變；用上述含pH敏感鍵的二胺界面交聯(lián)的聚合物囊泡在酸性環(huán)境下(pH5 6.5)解交聯(lián)；用上述還原敏感的二胺界面交聯(lián)的聚合物襄泡在還原環(huán)境下(如DTT 10 mM)解交聯(lián)。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為利用上述技術(shù)方案得到的界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡，所述界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的尺寸為50 350納米，優(yōu)選的界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的尺寸為50 200納米，粒徑分布小于等于0.1。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為應(yīng)用上述界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡包封藥物，在室溫下，藥物先溶在嵌段共聚物水溶液或緩沖溶液中，然后再升溫到嵌段共聚物的LCST以上，將藥物包封在聚合物囊泡內(nèi)；對(duì)形成的聚合物囊泡的界面進(jìn)行交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定囊泡結(jié)構(gòu)，即得包裹藥物的界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡。
上述技術(shù)方案中，所述藥物選自但不局限于小分子親水性藥物或大分子親水性藥物中的一種，所述小分子親水性藥物，可以選自但不局限于鹽酸阿霉素，所述大分子親水性藥物，可以選自但不周限于蛋白質(zhì)、DNA或SIRNA中的一種，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇所需包封的藥物分子。
進(jìn)一步的技術(shù)方案中，在室溫下單分子溶解的三嵌段聚合物的水溶液中加入水溶性分子探針就可以把水溶性分子探針包裹在囊泡中，所述水溶性分子探針可以選自但不局限于磁性納米粒、軋劑、量子點(diǎn)或近紅外染料中的一種。
進(jìn)一步技術(shù)方案中，為了解決蛋白質(zhì)釋放中細(xì)胞穿透/滲透性差的問(wèn)題，通?？梢酝ㄟ^(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞(receptor mediated endocytosis)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞攝取，或通過(guò)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)(cell penetrating protein mediated transduction)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)治療性蛋白質(zhì)藥物的高效細(xì)胞內(nèi)釋放。受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞一般通過(guò)生物靶向分子如單抗、多肽(RGD)、激素、糖或凝集素(lectin)、葉酸和一些維生素的主動(dòng)耙向來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吞，從而增加藥物的生物利用度。由穿透細(xì)胞蛋白質(zhì)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)在瘤內(nèi)注射后能夠直接穿透細(xì)胞膜把藥物快速、有效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)揮療效。
以PEG-PAA-PNIPAM三嵌段共聚物為例，在共聚物囊泡表面引入靶向分子anti-HER2和TAT:首先通過(guò)DCC/NHS法活化RAFT試劑CPDP上的羧基，然后與NH2-PEG-COOH反應(yīng)，得到大分子RAFT試劑HOOC-PEG-CPDP;用該大分子RAFT試劑進(jìn)行AA和NIPAM的序貫RAFT聚合即得到HOOC扁PEG-PAA隱PNIPAM;其羧基通過(guò)EDC/NHS與anti-HER2或TAT上的氨基反應(yīng)即得到靶向載體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)，引入所需靶向分子，所述靶向分子可選自但不局限于葉酸、抗體、RGD、糖或TAT中的一種。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述嵌段共聚物選自聚乙二醇-聚丙烯酸-聚異丙基丙烯酰胺(PEG-PAA-PNIPAM),其中，PEG具有優(yōu)異的水溶性和生物相容性，能有效屏蔽電荷和包裹物，可長(zhǎng)時(shí)間在體內(nèi)循環(huán)，通過(guò)PEG鏈端引入生物靶向分子可實(shí)現(xiàn)髙效腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞；PNIPAM具有溫敏性中間PAA段側(cè)鏈帶有羧基官能團(tuán)，可用于調(diào)節(jié)PNTPAM的最低臨界溶解溫度(LCST)到38~43'C，且可與二胺分子反應(yīng)交聯(lián)，得到穩(wěn)定的聚合物囊泡。PEG和PAA為FDA批準(zhǔn)的生物材料，PNIPAM也因其獨(dú)特的溫敏性而在生物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛。研究表明水溶性聚合物的分子量小于4萬(wàn)時(shí)，可以通過(guò)泌尿系統(tǒng)排出體外。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
(1) 聚合物囊泡在水溶液中自組裝形成，不涉及有機(jī)溶劑，可方便且髙效包載小分子藥物、大分子藥物(如蛋白質(zhì))、探針?lè)肿拥龋朔怂幬锇d效率低、易變性失活等缺陷；而且可調(diào)節(jié)其LCST使聚合物囊泡在體溫37度下解交聯(lián)后，聚合物單分子溶解，最終可排出體外。
(2) 通過(guò)還原敏感分子或pH敏感分子對(duì)囊泡進(jìn)行交聯(lián)，得到穩(wěn)定的界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物襄泡，使得襄泡在細(xì)胞外和血液中不被降解，從而保證囊泡包封的蛋藥物穩(wěn)定； 一旦進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，襄泡則開始解交聯(lián)、聚合物溶解，蛋白質(zhì)藥物則快速釋放，產(chǎn)生高效治療作用；克服了蛋白質(zhì)在體內(nèi)易被降解、要求大量藥物等不足。
(3) 在襄泡表面引入腫瘤靶向基團(tuán)(如葉酸、抗體)或細(xì)胞膜穿透的蛋白質(zhì)(如TAT多肽)，實(shí)現(xiàn)高效腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，從而實(shí)現(xiàn)高效細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放，有效克服了蛋白質(zhì)藥物進(jìn)入細(xì)胞量少、療效差的缺點(diǎn)。


附圖l,基于實(shí)施例一所得三嵌段共聚物PEG113-PAA24-PNIPAM211的交聯(lián)、溫度敏感的納米聚合物襄泡的工作原理示意圖
其中，(a)實(shí)施例五、六和七中簡(jiǎn)單升溫形成聚合物囊泡；(b)實(shí)施例八和九中通過(guò)對(duì)聚合物囊泡的界面進(jìn)行交聯(lián)來(lái)得到穩(wěn)定的聚合物囊泡；(c)降溫到LCST以下，囊泡溶脹；(d)實(shí)施例十、十一和十二中，在10 mM DTT存在下、降溫到LCST以下，囊泡解體。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖1及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一，RAFT聚合得到三嵌段共聚物PEG-PAA-PNIPAM 氬氣保護(hù)下，將引發(fā)劑AIBN (0.62mg， 3.77nmo1),大分子RAFT試劑 PEG-DMP (0.10g， 19nmol)，丙烯酸單體AA C0.0328g， 0.456 mmol)和5.0mL 的二氧六環(huán)加入到lOmL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣30分鐘后把瓶子放 在70"C的油浴中，攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，取樣測(cè)定AA單體的轉(zhuǎn)化率，并向其余 部分加入第二單體NIPAAM C0.4260g， 3.8mmol)和一些AIBN (0.2mg溶在 0.2mL 二氧六環(huán)中)使其在70'C下再反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后在冷乙醚中沉淀， 后真空干燥48小時(shí)，得到三嵌段共聚物，產(chǎn)率為70 86%。核磁結(jié)果表明其結(jié) 構(gòu)為PEGll3-PAA24-PNIPAM2n，其中PNIPAM所占的整個(gè)分子的分子量的比 例約78%,在PBS中其LCST為38.5'C 。
實(shí)施例二， RAFT聚合得到嵌段共聚物DEX-PMA-NIPAM 氬氣保護(hù)下，將引發(fā)劑AIBN C0.62mg， 3.77pmol)，大分子RAFT試劑 DEX-CPDPA (0.127g, 20nmol),甲基丙烯酸單體MA (9.46mg， 110|imol) 和5.0mL的二氣六環(huán)加入到lOmL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣30分鐘后 把瓶子放在751C的油浴中，攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，取樣測(cè)定MA單體的轉(zhuǎn)化率， 并向其余部分加入第二單體NIPAAM (0.7230g, 6.4mmol)和一些AIBN (0.2mg 溶在0.2mL 二氧六環(huán)中)使其在75'C下再反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后在冷乙醚中 沉淀，后真空干燥48小時(shí)，得到三嵌段共聚物，產(chǎn)率為70 75%。核磁結(jié)果表 明其結(jié)構(gòu)為DEX37-PMAS-PNIPAM356，其中PNIPAM所占的整個(gè)分子的分子量 的比例約86%，在PBS中其LCST為33'C 。
實(shí)施例三，RAFT聚合得到嵌段共聚物PEG113-PHAlfl-NIPAM90 氬氣保護(hù)下，將引發(fā)劑AIBN (0.62mg， 3.77nmol),大分子RAFT試劑 PEG-CPDPA(0.10g， 19,ol) , 5-己烯酸單體HA(22.8 mg, 200nmol)和4.0mL 的二氧六環(huán)加入到lOmL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣30分鐘后把瓶子放 在75'C的油浴中，攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，取樣測(cè)定HA單體的轉(zhuǎn)化率，并向其余部分加入第二單體NIPAM(0.1930g,1.70mmol)和一些AIBN(0.2mg溶在0.2mL 二氧六環(huán)中)使其在70C下再反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后在冷乙醚中沉淀，后真 空干燥48小時(shí)，得到三嵌段共聚物，產(chǎn)率為70~75%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為 PEGn3-PHAw-NIPAM9。，其中PNIPAM所占的整個(gè)分子的分子量的比例約61%, 在PBS中其LCST為38'C 。
實(shí)施例四，RAFT聚合得到嵌段共聚物PEG-PAA-PNIPAM 氬氣保護(hù)下，將引發(fā)劑AIBN (0.62mg， 3.77nmo1)，大分子RAFT試劑 PEG-CPDPA(MW 2200， O.lg， 45.5拜o1)，丙烯酸單體AA(115mg， 1.60mmo1) 和5.0mL的二氧六環(huán)加入到10mL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣30分鐘后 把瓶子放在75'C的油浴中，攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，取樣測(cè)定MA單體的轉(zhuǎn)化率， 并向其余部分加入第二單體NIPAM(0.0520g， 0.460mmol)和一些AIBN(0.2mg 溶在0.2mL 二氧六環(huán)中)使其在70C下再反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后在冷乙醚中 沉淀，后真空干燥48小時(shí)，得到三嵌段共聚物，產(chǎn)率為70%。核磁結(jié)果表明其 結(jié)構(gòu)為PEG43-PAA3S-PNIPAM1QD,其中PNIPAM所占的整個(gè)分子的分子量的比 例約72%,在PBS中其LCST為45T 。
實(shí)施例一至四制備不同的三嵌段共聚物，并測(cè)試所得三嵌段共聚物在PBS 緩沖溶液(pH7.4， 0.02 M， [NaCl=150 mM〉中的LCST,結(jié)果如下所示
嵌段聚合物溫敏段分子量占整個(gè)嵌段共聚 物分子量的比例溶液體系溶液pH1XST
PEG113-PAA24-NIPAM21178%PBS7.438.5。C
PEG113-PHA10-NIPAM9061%PBS7.438°C
DEX37-PMA5-NIPAM35686%PBS7.433 °C
PEG43-PAA35-NIPAMi0072%PBS7.445 °C
實(shí)施例五，聚合物囊泡的形成
嵌段聚合物PEG113-PAA1G-PNIPAM18o (5.0mg)在4'C下溶解于5mL純水 中，通過(guò)0.22nm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾后，將溶液置于40'C的恒溫?fù)u床中200 RPM 搖60分鐘，以得到尺寸為253.1±1.3納米、分布均勻(PDI為0.08±0.003)的 聚合物囊泡；
實(shí)施例六，聚合物囊泡的形成
12嵌段聚合物PEGm-PAA24-PNIPAM211 (5.0mg)在4"下溶解于5mLPBS (生理鹽水，pH7.4， 0.02 M， [NaCl] = 150 mM)中，通過(guò)0.22nm的針頭過(guò)濾器 過(guò)濾后，將溶液置于40'C的恒溫?fù)u床中200 RPM搖60分鐘，以得到尺寸為 51.1±1.3納米、分布均勻(PDI為0.18±0.003)的聚合物囊泡
實(shí)施例七，聚合物囊泡的形成
嵌段聚合物PEG113-PAA24-NIPAM215 (5.0mg)在4匸下溶解于0.5mL的 MES緩沖溶液中(0.5ml, pH5.5， 0.02M)，通過(guò)0.22nm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾后， 將溶液置于40X:的恒溫?fù)u床中200 RPM搖60分鐘，得到尺寸為148.1±0.3納米、 分布均勻(PDI為0.058±0.003)的聚合物襄泡；
實(shí)施例八，胱胺交聯(lián)聚合物囊泡
為了得到交聯(lián)的聚合物襄泡，向?qū)嵤├咧行纬傻木酆衔锬遗萑芤褐?，?40r下，加入預(yù)熱好的0.2mL胱胺二鹽酸鹽(0.375mg, 1.67fimo1)水溶液，1 小時(shí)后加入預(yù)熱的O.lmL NHS (0.575mg， 5.0pmo1)水溶液和0.2mL的EDC (3.84mg, 20jano1)水溶液，共聚物的最終濃度是5g/L,胱胺/羧基的摩爾比保 持在1:2,反應(yīng)混合物在40X:的恒溫?fù)u床中200 RPM搖 一 夜即得到交聯(lián)的聚合 物囊泡。
實(shí)施例九，用酸敏感的含縮酮的二胺交聯(lián)聚合物囊泡
三嵌段聚合物PEG113-PAA24-NIPAM211 (5.0mg)在4t:下溶解于0.5mL的 PB緩沖溶液中(0.5ml, pH7.0, 0.02M)，通過(guò)0.22pm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾后， 將溶液置于43'C的恒溫?fù)u床中200 RPM搖60分鐘，得到尺寸為78.5±0.3納米、 分布均勻(PDI為0.07±0.003)的聚合物囊泡
為了得到酸敏感交聯(lián)的聚合物囊泡，加入431C下預(yù)熱好的0.2mL含縮酮的 二胺(0.271mg, 1.67nmol)PB水溶液(PH 7.0), 1小時(shí)后加入預(yù)熱的O.lmL NHS (0.575mg, 5.0nmo1)水溶液和0.2mL的EDC (3.84mg, 20nmo1)水溶液，共 聚物的最終濃度是5g/L, 二胺/羧基的摩爾比保持在1:2，反應(yīng)混合物在43'C的 恒溫?fù)u床中200 RPM搖24小時(shí)即得到交聯(lián)的聚合物囊泡。
實(shí)施例十DTT還原胱胺交聯(lián)的聚合物囊泡解交聯(lián)
氬氣保護(hù)下，將稱好的DTT加到內(nèi)有不同pH值的1.5ml交聯(lián)了的 DEX37-PMAs-NIPAM3S6聚合物囊泡CLP (0.1毫克/毫升)的玻璃樣品池中，使最終DTT的濃度是O， 10或100 mM，然后玻璃樣品池用橡膠塞封住，交聯(lián)的 聚合物囊泡CLP溶液搖晃均勻后，置于25C空氣恒溫箱中，在選定時(shí)間、25 'C下，通過(guò)動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)來(lái)跟蹤測(cè)定顆粒的粒徑變化。結(jié)果表明， pH越大，粒徑變化越快，DTT的還原解交聯(lián)的速度越快；DTT的濃度越大， 粒徑變化越快，DTT的還原解交聯(lián)的速度越快；如pH7.4時(shí)，加10 mM DTT 需要30-40分鐘就使粒徑從原來(lái)的210納米降到15納米，加100 mM DTT只需 要l-3分鐘，粒徑就會(huì)降到15納米左右。
實(shí)施例十一DTT還原胱胺交聯(lián)的聚合物襄泡后，在生理?xiàng)l件溶解 氬氣保護(hù)下，將稱好的DTT加到1.5 ml交聯(lián)了的PEG113-PAA24-NIPAM211 聚合物襄泡CLP (0.1毫克/毫升，生理鹽水(PBS, pH7.4, 0.02 M, [NaCl=150 mM))的玻璃樣品池中，使最終DTT的濃度是0或lOmM,然后玻璃樣品池 用橡膠塞封住，交聯(lián)的聚合物囊泡CLP溶液搖晃均勻后，置于25^C和37X:空 氣恒溫箱中，分別在25C和37'C下，通過(guò)動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)來(lái)跟蹤測(cè)定 顆粒的粒徑變化。結(jié)果表明，在25'C和37X:下、10mMDTT存在時(shí)，30分鐘 都使粒徑從原來(lái)的210納米降到15納米以下，而37C下未加DTT時(shí)，10小時(shí) 內(nèi)囊泡的粒徑保持不變；說(shuō)明在生理?xiàng)l件下解交聯(lián)的囊泡能夠溶解在水溶液中。 實(shí)施例十二酸剌激的聚合物囊泡解交聯(lián)
室溫下，將有不同pH值(4， 5， 6和7.4)的1.5ml如實(shí)施例九得到的交 聯(lián)聚合物囊泡CLP (0.1毫克/毫升)分別加到不同DLS的玻璃樣品池，然后玻 璃樣品池用橡膠塞封住，交聯(lián)的聚合物囊泡溶液搖晃均勻后，置于25C空氣恒 溫箱中，通過(guò)動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)來(lái)跟蹤測(cè)定顆粒的粒徑變化。結(jié)果表明， pH越小，粒徑變化越快，說(shuō)明酸敏感解交聯(lián)的速度越快；如使粒徑從原來(lái)的210 納米降到15納米，pH4時(shí)只需約10分鐘，pH5時(shí)需要約20分鐘，pH6時(shí)需要 約40分鐘，而pH7.4時(shí)，24小時(shí)內(nèi)粒徑基本不變。
實(shí)施例十三靶向聚合物襄泡的制備
以PEG-PAA-PNIPAM三嵌段共聚物為例，在共聚物囊泡表面引入靶向分子 anti-HER2:首先通過(guò)DCC/NHS法活化RAFT試劑CPDP上的羧基，然后與 NH2-PEG-COOH反應(yīng)，得到大分子RAFT試劑HOOC-PEG-CPDP:用該大分 子RAFT試劑進(jìn)行AA和NIPAM的序貫RAFT聚合即得到HOOC-PEG-PAA-PN1PAM;其羧基通過(guò)EDC/NHS與anti-HER2上的氨基反應(yīng)即得到耙向載體。 實(shí)施例十四包裹蛋白質(zhì)模型FITC-葡聚糖(MW4000)及DTT觸發(fā)釋放 聚合物PEGU3-PAA24-NIPAM2U (1.25 mg)和FITC-葡聚糖(1.25 mg， 0.0125 mol/mol glucose)在4 C下被溶解在0.125 mL的MES緩沖溶液(pH 5.5， 0.02 M),聚合物囊泡如前面實(shí)施例八描述的一樣進(jìn)行交聯(lián)后，40'C下對(duì)PB (pH 7.4， 0.02 M)透析(MWCO100kDa) 48小時(shí)，除去未被包裹的FlTC-葡聚糖， 透析液至少要更換5次。
載有FlTC-葡聚糖的CLPs被分成幾份 一個(gè)是加入10mM DTT，溫度為 20T， 一個(gè)是加入lOmM DTT,溫度為37'C,另一個(gè)是只加入PB,溫度為20 'C (control),這些溶液被馬上轉(zhuǎn)移到透析袋中，后者被浸入30 mL相同DTT 濃度，相同溫度的PB中，到一定時(shí)間取5mL的透析袋外的透析液用來(lái)測(cè)定其 熒光強(qiáng)度，并把5mL的新鮮液體加入透析袋外，F(xiàn)ITC-葡聚糖在聚合物囊泡中 的包封率和釋放后仍在囊泡中包著的FITC-葡聚糖可以通過(guò)室溫下用100 mM 的DTT還原囊泡1小時(shí)后溶解，并稀釋2000倍后測(cè)量熒光強(qiáng)度，基于已知濃 度的FITC-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線而得到。
結(jié)果表明模型蛋白質(zhì)FITC-葡聚糖(MW 4000和40000)不影響囊泡的 形成(尺寸基本不變)，并能高效地包裹在囊泡中(負(fù)載率>85%)。載有FITC-葡聚的交聯(lián)襄泡在10 mM DTT下、201C時(shí)很快解交聯(lián)，觸發(fā)釋放FITC-葡聚糖 2小時(shí)釋放近50%: 37'C時(shí)FITC-葡聚糖的釋放也較快2小時(shí)釋放38%;形成 對(duì)比的是，無(wú)DTT條件下，20t:時(shí)FITC-葡聚糖的釋放在6小時(shí)僅釋放18%。 實(shí)施例十五包裹模型蛋白質(zhì)FITC-BSA (牛血清白蛋白)及其酸觸發(fā)釋放 聚合物PEG113-PAA24-NIPAM2n(1.25 mg)和FITC-BSA (0.625 mg， 4 FITC/BSA)在4 t:下被溶解在0.125 mL的PB緩沖溶液(pH 7.0， 0.02 M)，聚合 物囊泡如前面實(shí)施例九描述的一樣進(jìn)行交聯(lián)后，40'C下對(duì)PB (pH 7.4， 0.02 M) 透析(MWCO 500 kDa) 48小時(shí)，除去未被包裹的FITC-BSA，透析液至少要 更換5次。
提純后的載有FITC-BSA的CLPs被分成三份分別MES緩沖溶液(pH 6, 0.5 M)和醋酸鹽緩沖溶液(pH 5, 0.5 M)把原來(lái)的CLP溶液的PH調(diào)節(jié)到6 和5，和在PB (pH 7.4)的原樣。這些溶液被馬上轉(zhuǎn)移到透析袋中，后者被浸
15入30 mL相同濃度和pH值得緩沖溶液中，置于20^C的恒溫?fù)u床中以200RPM 速度搖晃。到一定時(shí)間取5mL的透析袋外的透析液用來(lái)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并把 5mL的新鮮液體加入透析袋外，F(xiàn)ITC-BSA在聚合物囊泡中的包封率和釋放后 仍在囊泡中包著的FITC-BSA可以通過(guò)室溫下用100 mM的DTT還原囊泡1 小時(shí)后溶解，并稀釋后測(cè)量熒光強(qiáng)度，基于已知濃度的FITC-BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線而 得到。
結(jié)果表明模型蛋白質(zhì)FITC-BSA對(duì)囊泡的形成影響不大，尺寸基本不變， 并能高效地包裹在囊泡中(負(fù)載率30-90%)。載有FITC-BSA的交聯(lián)襄泡在酸 性條件下，很快解交聯(lián)并把蛋白質(zhì)釋放出來(lái)FITC-BSA在pH 6下5-6小時(shí)內(nèi) 釋放出約50%;在pH5下，5小時(shí)內(nèi)釋放出約70-80%;而在pH7.4下，12小 時(shí)內(nèi)僅釋放出約10%。
實(shí)施例十六包裹模型小分子抗癌藥物阿霉素及其DTT觸發(fā)釋放
聚合物PEG113-PAA24-NIPAM211 (1.25 mg)和阿霉素(0.25 mg)在4 "C下被 溶解在0.125 mL的MES緩沖溶液(pH 5.5， 0.02 M)， 40'C下聚合物囊泡如前面 實(shí)施例八描述的一樣進(jìn)行交聯(lián)8小時(shí)后，用濃磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.4， 0.05 M，氯化鈉150 mM)把原來(lái)的CLP溶液的PH調(diào)節(jié)到7.4，繼續(xù)40C下?lián)u4小 時(shí)。40'C下對(duì)相同PBS透析(MWCO 12 kDa) 48小時(shí)，除去未被包裹的阿霉 素，透析液至少要更換6次。
把載有DOX的CLPs被分成幾份 一個(gè)是加入10mM DTT，溫度為20", 一個(gè)是加入10mM DTT，溫度為37'C ，另一個(gè)是只加入PBS (pH 7.4， 0.05 M), 溫度為20'C (control),這些溶液被馬上轉(zhuǎn)移到透析袋中，后者被浸入30 mL相 同DTT濃度，相同溫度的PBS中，到一定時(shí)間取5mL的透析袋外的透析液用 來(lái)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并把5mL的新鮮液體加入透析袋外，DOX在聚合物襄泡中 的包封率和釋放后仍在襄泡中包著的DOX可以通過(guò)室溫下用100 mM的DTT 還原襄泡l小時(shí)后溶解，并稀釋后測(cè)量熒光強(qiáng)度得到。
結(jié)果表明DOX不影響囊泡的形成且尺寸基本不變，包封率為10-20%。 載有DOX的交聯(lián)囊泡在10 mM DTT、 20"和37'C下、PBS中，很快解交聯(lián)， DOX在5小時(shí)內(nèi)釋放出約60-70%。
實(shí)施例十七聚合物囊泡對(duì)疏水藥物紫杉醇的包裹和酸剌激藥物釋放聚合物PEGn3-PAA36-NIPAM32。 (5 mg)在4 r下被溶解在0. 5 mL的MES 緩沖溶液(pH 5.5， 0.02 M),加入溶在O.lmL的THF中的紫杉醇(l mg)，升溫至 40",如實(shí)施例七形成囊泡；然后，開蓋半小時(shí)使THF揮發(fā)；而后聚合物囊泡 如實(shí)施例八描述的一樣進(jìn)行交聯(lián)8小時(shí)后，40'C下對(duì)PB (pH 7.4， 0.02 M)透析 (MWC0 12kDa) 48小時(shí)，除去未被包裹的紫杉醇，透析液至少要更換6次。
提純后的載有紫杉醇的CLPs被分成三份分別MES緩沖溶液(pH 6， 0.5 M)和醋酸鹽緩沖溶液(pH 5， 0.5 M)把原來(lái)的CLP溶液的PH調(diào)節(jié)到6和5, 和在PB (pH7.4)中的原樣。這些溶液被馬上轉(zhuǎn)移到透析袋中，后者分別被浸 入30 mL相同濃度和pH值的緩沖溶液中，置于2t)1C的恒溫?fù)u床中以200 RPM 速度搖晃。到一定時(shí)間取出5mL的透析袋外的透析液，并把5mL的新鮮液體加 入透析袋外。用HPLC測(cè)定不同時(shí)間釋放出來(lái)的紫杉醇的量和紫杉醇在聚合物 囊泡中的包封率。
結(jié)果表明紫杉醇對(duì)囊泡的形成影響不大，尺寸基本不變紫杉醇能包裹 在囊泡中，包封率為50-70%。載有紫杉醇的交聯(lián)襄泡在酸性條件下會(huì)很快解交 聯(lián)并把紫杉醇釋放出來(lái)紫杉醇在pH 6下5-6小時(shí)內(nèi)釋放出約50%;在pH 5 下，5小時(shí)內(nèi)釋放出約70-80%;而在pH7.4下，24小時(shí)內(nèi)僅釋放出約15% 。
權(quán)利要求
1. 一種制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含親水段，交聯(lián)鏈段和溫敏段，親水段和溫敏段位于嵌段共聚物的兩端，交聯(lián)鏈段位于親水段和溫敏段之間；在最低臨界溶解溫度以下，將嵌段共聚物溶于水溶液或緩沖溶液中，升溫至嵌段共聚物的最低臨界溶解溫度以上，嵌段共聚物中的溫敏段轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，原位自組裝形成聚合物囊泡，親水段構(gòu)成聚合物囊泡的膜殼，溫敏段構(gòu)成聚合物囊泡的膜核，交聯(lián)鏈段構(gòu)成聚合物囊泡的界面；(2)對(duì)步驟(1)形成的聚合物囊泡的界面進(jìn)行交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定囊泡結(jié)構(gòu)，得到界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法， 其特征在于所述溫敏段選自聚(N-異丙基丙烯酰胺)、聚(N，N-二乙基丙烯酰 胺)或聚(甲基乙烯醚)中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法， 其特征在于所述溫敏段的分子量為5000 35000Da。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法， 其特征在于所述溫敏段的分子量占整個(gè)嵌段共聚物的分子量的60% 90%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法， 其特征在于所述嵌段共聚物中的親水段的分子量為1000 8000Da。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法， 其特征在于嵌段聚合物的交聯(lián)鏈段的重復(fù)單元數(shù)為5 40個(gè)，所述交聯(lián)鏈段 為側(cè)鏈含有羧基的聚合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法， 其特征在于步驟(2)為利用碳二亞胺化學(xué)法，用二胺基化合物對(duì)步驟(l)所得 聚合物囊泡進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物襄泡的方法， 其特征在于所述二胺基化合物可選自含pH敏感鍵的二胺基化合物或還原敏 感的二胺基化合物中的一種。
9. 權(quán)利要求1 8所述的制備界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡的方法制 得的界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡。
10.權(quán)利要求9所述的界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡在作為藥物載體 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡及其制備方法，所述界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡由嵌段共聚物構(gòu)成，所述嵌段共聚物至少包括親水段、交聯(lián)鏈段和溫敏段，親水段構(gòu)成聚合物囊泡的膜殼，溫敏段構(gòu)成聚合物囊泡的膜核，交聯(lián)鏈段構(gòu)成聚合物囊泡的界面，對(duì)聚合物囊泡的界面進(jìn)行交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定囊泡結(jié)構(gòu)，從而形成界面交聯(lián)的溫度敏感的聚合物囊泡；由于該囊泡在水溶液體系中形成，并且對(duì)其界面進(jìn)行了交聯(lián)，因此提高了聚合物囊泡對(duì)小分子藥物、大分子藥物以及探針?lè)肿拥陌d效率，在體內(nèi)血液中循環(huán)的穩(wěn)定性，被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞的效率，從而提高藥物的生物利用度，同時(shí)方便聚合物囊泡排除體外。
文檔編號(hào)A61K47/32GK101519495SQ20091003011
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日
發(fā)明者孟鳳華, 徐海飛, 鐘志遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)