專利名稱：卡拉霉素作為拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種候選抗生素卡拉霉素作為拓撲異 構(gòu)酶n抑制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共健康問題。世界癌癥發(fā)病率與死亡率
均呈上升趨勢，尤其是20世紀(jì)70年代以來，癌癥發(fā)病率以年均3%-5%的速 度遞增，癌癥已經(jīng)成為人類最主要的死亡原因。2006年，全球有760萬人 死于腫瘤，占死亡總?cè)藬?shù)的13. 8%。在我國，癌癥死亡率占總死亡率的26%。 因此，抗腫瘤研究是當(dāng)今生命科學(xué)和醫(yī)藥研究中極富挑戰(zhàn)且意義重大的領(lǐng) 域。世界衛(wèi)生組織和包括我國在內(nèi)的各國政府衛(wèi)生機構(gòu)都把攻克惡性腫瘤 作為一項首要的任務(wù)。腫瘤的化學(xué)治療是腫瘤治療的重要組成之一。細胞 毒類藥物依然是臨床應(yīng)用中最重要的一類抗腫瘤藥物，在腫瘤化療中占有 不可替代的地位，加強細胞毒類藥物的研究對于腫瘤的治療具有重要意義。 細胞毒類藥物主要通過干擾細胞代謝或作用于細胞內(nèi)生物大分子發(fā)揮抗腫 瘤作用，包括抗代謝藥、垸化劑、DNA拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase， Topo ) 抑制劑等。臨床上治療腫瘤的藥物多數(shù)屬于這些靶點類藥物，因此，細胞 毒類藥物仍然是目前抗腫瘤藥物的研發(fā)重點領(lǐng)域，目的就是降低毒副作用 以及增加有效性，特別是針對那些尚未有效藥物治療的實體腫瘤和產(chǎn)生耐 藥性的腫瘤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種候選抗生素作為拓撲異構(gòu)酶n抑制劑類抗腫 瘤藥物的新用途。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為
卡拉霉素作為專一性拓撲異構(gòu)酶ii抑制劑的應(yīng)用。所述拓撲異構(gòu)酶n
為真核生物中所必需的酶，在腫瘤細胞DNA復(fù)制和細胞分裂中起著重要作
用，是抗腫瘤藥物的重要作用靶點?？ɡ顾刈鳛閷Ｒ恍酝負洚悩?gòu)酶n抑 制劑類抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點
本發(fā)明候選抗生素化合物卡拉霉素(kalamycin)作為拓撲異構(gòu)酶II抑 制劑類抗腫瘤藥物，其體外作用較目前臨床常用的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑 VP16強十倍左右。同時，卡拉霉素(kalamycin)分子量很小，只有300D,
易于透過細胞膜，易于吸收。


圖1為卡拉霉素對不同腫瘤細胞的I"值示意圖。圖2為kalamycin誘導(dǎo)HCT116阻滯于G2/M期示意圖。為了檢測 kalaraycin對HCT116細胞的周期效應(yīng)，采用流式細胞計數(shù)儀，對kalamycin 處理后的肝癌細胞進行DNA含量分析。選擇l、 2和4pMkalamycin作用于 HCT116細胞24小時觀察量效學(xué)變化。從以上細胞周期時相分布可以看到， kalamycin的周期阻滯效應(yīng)具有濃度依賴性。
圖3為kalamycin誘導(dǎo)S畫C-7721阻滯于G2/M期示意圖。kalamycin 誘導(dǎo)S薩C-7721阻滯于G2/M期。為了檢測kalamycin對SMMC-7721細胞的 周期效應(yīng)，釆用流式細胞計數(shù)儀，對kalamycin處理后的肝癌細胞進行DNA 含量分析。選擇2、 4和8jiMkalamycin作用于S畫C-7721細胞24小時觀察 量效學(xué)變化。從以上細胞周期時相分布可以看到，kalamycin的周期阻滯效 應(yīng)具有濃度依賴性。
圖4為kalamycin不抑制拓撲異構(gòu)酶I介導(dǎo)的pBR322解螺旋示意圖。 (其中，泳道1為不加酶的對照，泳道2為加酶不加藥的對照，泳道7為 10|aM CPT的陽性對照，泳道3-6為反應(yīng)體系中分別加入100、 50、 25、 12.5 jiM kalamycin。電泳結(jié)果表明(圖4 )，在不含酶時，大部分pBR322 以超螺旋狀態(tài)存在；而當(dāng)反應(yīng)體系中有Topo I存在時，在Topo I的作用 下，超螺旋DNA ( Supercoiled DNA )全部轉(zhuǎn)化為解旋的羅(relaxed DMA )。 我們在反應(yīng)體系中加入10 pM Topo I抑制劑CPT后，pBR322的解旋受到 明顯的抑制，與僅有Topo I作用的泳道相比，超螺旋DNA的比例明顯增加， 表明Topo I的活性受到了抑制。然而kalamycin在100、 50、 25、 12.5 |i M劑量處理后，pBR322仍主要以解旋狀態(tài)存在，說明kalamycin對Topo I 沒有抑制作用。)
圖5為kalamycin抑制拓撲異構(gòu)酶II介導(dǎo)的kDNA去連環(huán)示意圖。(其 中，泳道1為不加酶的對照，泳道2為加酶不加藥的對照，泳道3-9為反 應(yīng)體系中分別加入50、 40、 30、 20、 10、 5、 2.5 juM kalamycin,泳道10 為反應(yīng)體系中加入200 juMVP16作陽性對照。kDNA是一個巨大的DNA網(wǎng)狀
結(jié)構(gòu)，不能在1%的瓊脂糖凝膠中遷移，因此電泳后仍滯留在加樣孔中。當(dāng) 有Topo II存在時，在酶的作用下，kDNA的連環(huán)被打開，形成DNA小環(huán) (minicircle)，于是能夠在瓊脂糖凝膠電泳中發(fā)生遷移，如圖5所示。當(dāng) 反應(yīng)體系中加入200 iuMVP16作用后，小環(huán)DNA幾乎全部消失，kDNA連環(huán) 未能被打破，因此仍滯留在上樣孔中(第10泳道)，說明Topo II的活性 受到抑制。同樣，在不同濃度kalamycin作用下，隨著濃度的增高，小環(huán) DNA含量不斷減少，而上樣孔中DNA的量則不斷增加，表明TopoII的活性 受到了不同程度的抑制。10 |iM kalamycin對Topo II的活性已經(jīng)產(chǎn)生顯 著影響；當(dāng)kalamcin濃度增至20 |iM時，泳道中幾乎未見開環(huán)的小環(huán)DNA， 表明Topo II的催化活性大部分被抑制。其活性較VP16強十倍左右。)
具體實施例方式
實施例1: kalamycin細胞毒作用分析。
4接種一定數(shù)量的腫瘤細胞于96孔培養(yǎng)板，保證在整個試驗中細胞處于 對數(shù)生長期，并在藥物作用終止時對照組細胞的光密度(0D)約在1.0左 右。
采用磺酰羅丹明B蛋白染色法(SRB)測定kalamycin對細胞增殖的抑 制作用。根據(jù)細胞生長速率接種一定數(shù)量處于對數(shù)生長期的細胞于96孔培 養(yǎng)板中(見表l)。培養(yǎng)過夜后加入kalamycin,設(shè)置6個作用濃度梯度(10, 5， 2.5， 1.25， 0.6125， 0. 306 m mol/L )，每個濃度3復(fù)孔。作用72小 時后，傾去培養(yǎng)液(對于懸浮細胞，先3000 rpm離心10分鐘，再小心的 吸去培養(yǎng)液)，用預(yù)冷的10%三氯乙酸(TCA)在4 。C固定1小時，蒸餾 水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后每孔加入由1%冰醋酸配制的4 mg/mL 的SRB溶液lOOjal,室溫染色15分鐘，棄去染色液，1%醋酸洗滌5次，空 氣中自然干燥。最后每孔加入150jal Tris溶液U0mMTris水溶液)，酶 標(biāo)儀520 nm波長下測定吸光度OD值，按下列公式計算抑制率抑制率(％) =(OD對照-OD給藥)/ 0D對照x 100%。用軟件Sof tmax 2. 6 (Molecular Device)計算IC5。。實驗重復(fù)三次以上，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)各濃度 的抑制率，采用LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度IC50。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表 示為均值土SD。
選取9株人腫瘤細胞株(結(jié)腸癌細胞HCT-116、 口腔鱗癌細胞KB和乳腺 癌細胞MDA-MB-468來自美國ATCC、乳腺癌細胞MCF-7和卵巢癌細胞SK0V3 來自日本癌癥研究基金會JFCR,肝癌細胞S醒C-7721和肝癌細胞Bel-7402 來自中科院上海生化細胞所、胃癌細胞SGC-7901和黑色素瘤A375來自中 科院上海藥物所)，kalamycin作用72h后，檢測其細胞毒作用。結(jié)果表明 它對不同組織來源的腫瘤細胞生長具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)良好的劑 量依賴性。表明kalamycin抑制這些腫瘤細胞生長的靶點是廣泛存在于細 胞當(dāng)中。kalamycin對9株腫瘤細胞株的I"平均值為2. 5 jiM(圖l)。 _表l.SRB檢測中不同腫瘤細胞的接種數(shù)量
細胞株 組織類型 接種個數(shù)(個/孔)
實施例2:流式細胞術(shù)檢測周期分布。
將處于對數(shù)生長期的HCT116和S醒C-7721細胞接種于6孔板中(5 x
SGC-7901 MDA-MB-468 MCF-7 SK0V3 KB
HCT-116 A375
SMMC-7721 Bel—7402
7000 8000 8000 8000 8000 5000 5000 綱O 綱O
癌 瘤
癌癌癌 癌t
癌^,l腔^色癌癌
胃乳乳卵口結(jié)黑肝肝105細胞/孔)，貼壁過夜，加入不同濃度的kalamycin處理(HCT116用1、 2、 4jumol/L，用下，SMC-7721用2、 4、 8|amol/L),對照孔中加入相應(yīng)濃度的 DMS0。處理結(jié)東后，胰酶消化并收集細胞，4 。C 3000 rpm離心5 min。棄 上清，用冰冷的PBS重懸細胞，4 。C 3000 rpm離心5min,洗滌一次。加 入300 ju 1的PBS，將細胞混懸；然后緩慢加入預(yù)冷的無水乙醇700 ju 1 (邊 加邊渦旋)，-2(TC固定2 h; 1800 rpra離心3 min,棄上清；在沉淀中加 入500 nl含RNase(10 Mg/ml)的PBS,混勾，37。C水浴15 min。 然后， 加入IO jul PI終濃度為20 |ag/ml, 25。C避光染色30 min。用流式細胞 儀(FACSCalibur(TM), Becton Dickinson, USA)檢測細胞中DNA含量,每 組樣品至少分析lxl()3個細胞。實驗結(jié)果用軟件CELLQUEST (Becton Dickinson, USA)和ModFIT LT處理(參見圖2和3)。 實施例3: kalamycin不抑制拓撲異構(gòu)酶I 。
拓撲異構(gòu)酶I介導(dǎo)的負超螺旋pBR322解旋反應(yīng)基本步驟如下反應(yīng)緩 沖體系包括10 mM Tris-Cl pH 7. 9， 50mMKCl， 50mMNaCl， 5mMMgC12, 0, lmMEDTA, 15 mg/ml牛血清白蛋白(BSA ), 0.25 ju g負超螺旋pBR322, lunitTopo I和相應(yīng)濃度的待測化合物，37 。C水洛15分鐘進行解旋反應(yīng)。 反應(yīng)混合物中加入2 Ml 10% SDS終止反應(yīng)，1 %瓊脂糖凝膠電泳1 h,電 泳緩沖液為1 xTAE(40mMTris堿，40 mM醋酸，lmMEDTA),電壓4 V/cm。 0. 5 mg/ml溴化乙嚏染色15 min，凝膠成像分析儀300 nM透射紫外光觀察 并拍照。
拓撲異構(gòu)酶I介導(dǎo)的pBR322解旋反應(yīng)(參見圖4)。電泳結(jié)果表明在 不含酶時，大部分pBR322 (華美生物工程公司產(chǎn)品)以超螺旋狀態(tài)存在； 而當(dāng)反應(yīng)體系中有拓撲異構(gòu)酶I (廣州中山大學(xué)提供)存在時，在拓撲異 構(gòu)酶I的作用下，超螺旋DNA全部轉(zhuǎn)化為解旋的DNA。當(dāng)在反應(yīng)體系中加 入10 iaM拓撲異構(gòu)酶I抑制劑CPT后，pBR322的解旋受到明顯的抑制， 與僅有Topo I作用的泳道相比，超螺旋DNA的比例明顯增加，表明拓撲異 構(gòu)酶I的活性受到了抑制。然而kalamycin用12.5、 25、 50、 100juM劑 量處理后，pBR322仍主要以解旋狀態(tài)存在。提示kalamycin不是拓撲異構(gòu)
酶I抑制劑。
實施例4: kalamycin強烈抑制拓撲異構(gòu)酶n。
拓撲異構(gòu)酶II活性可以通過ATP依賴的kDNA去連環(huán)實驗檢測。反應(yīng)總 體積15 jul,含50 mMTris.HCl (pH 7.7), 50 mM KC1, 5 mM MgC12， 1 mM ATP， 0.5 mM DTT， 0.5 mM EDTA， 50 mg/ml BSA， 20 ng kDNA， 2 units拓 撲異構(gòu)酶II和相應(yīng)濃度的待測化合物。37 'C水浴lSmin后，加入l n 1 10% SDS終止反應(yīng)。ly。瓊脂糖凝膠電泳lh，電泳緩沖液為1 xTAE (40mMTris 堿，40 mM醋酸，lmMEDTA),電壓4 V/cm。 0. 5 mg/ml溴化乙啶染色15 min, 凝膠成像分析儀300 nM透射紫外光觀察并拍照。
釆用 一個拓撲異構(gòu)酶II特異的催化反應(yīng)-拓撲異構(gòu)酶II介導(dǎo)的kDNA去連環(huán)作用，驗證kal呵cin能夠抑制拓撲異構(gòu)酶II的催化活性。kDNA (美 國T叩oGEN〈Port Orange, FL， USA〉公司產(chǎn)品)是一個巨大的DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 不能在1%的瓊脂糖凝膠中遷移，因此電泳后仍滯留在加樣孔中。當(dāng)有拓撲 異構(gòu)酶II (美國TopoGEN〈Port Orange, FL, USA〉公司產(chǎn)品)存在時，在酶 的作用下，kDNA的連環(huán)被打開，形成DNA小環(huán)(minicircle),于是能夠在 瓊脂糖凝膠電泳中發(fā)生遷移，如圖5所示。當(dāng)反應(yīng)體系中加入IOO yMVP16 作用后，小環(huán)DNA幾乎全部消失，kDNA連環(huán)未能被打破，因此仍滯留在上 樣孔中，說明Topo II的活性受到抑制。同樣，在不同濃度kalamycin作 用下(50、 40、 30、 20、 10、 5、 2. 5juM)，隨著濃度的增高，小環(huán)DNA含 量不斷減少，而上樣孔中DNA的量則不斷增加，表明拓撲異構(gòu)酶II的活性 受到了不同程度的抑制。10 pM kalamycin對拓撲異構(gòu)酶II的活性已經(jīng)產(chǎn) 生顯著影響；當(dāng)kalamycin濃度增至20 jaM時，泳道中幾乎未見開環(huán)的小 環(huán)DNA，表明拓撲異構(gòu)酶II的催化活性大部分被抑制，這個效果強于VP16 在200 juM時的作用效果?？梢妅alamycin是一個很強的拓撲異構(gòu)酶II。
從以上結(jié)果可以看出，kalamycin有較強的細胞毒作用，它可以把腫瘤 細胞抑制在G2/M期，從而使腫瘤生長抑制和凋亡。通過靶點分析，證明它 是一個很強的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，比臨床上常用的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑 VP16強十倍左右，可以作為一個拓撲異構(gòu)酶II抑制劑類抗腫瘤藥物應(yīng)用。 可將kalamycin溶于橄欖油、茶油、芝麻油、大豆油等脂溶性溶劑，制成 注射劑，或把kalamycin混入淀粉等填料，制成口服劑型抗腫瘤藥物。
權(quán)利要求
1. 一種卡拉霉素作為專一性拓撲異構(gòu)酶II抑制劑的應(yīng)用。
2. 按權(quán)利要求i所述的卡拉霉素作為專一性拓撲異構(gòu)酶n抑制劑的應(yīng) 用，其特征在于所述拓撲異構(gòu)酶n為真核生物中所必需的酶，在腫瘤細胞DNA復(fù)制和細胞分裂中起著重要作用，是抗腫瘤藥物的重要作用靶點。
3. 按權(quán)利要求i所述的卡拉霉素作為專一性拓撲異構(gòu)酶n抑制劑的應(yīng)用，其特征在于卡拉霉素作為專一性拓撲異構(gòu)酶II抑制劑類抗腫瘤藥物 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種候選抗生素卡拉霉素作為拓撲異構(gòu)酶II抑制劑的應(yīng)用。卡拉霉素作為專一性拓撲異構(gòu)酶II抑制劑的應(yīng)用?？ɡ顾厥亲鳛橐环N抗生素進行開發(fā)利用，其可以作為一種拓撲異構(gòu)酶II抑制劑類抗腫瘤藥物，它不抑制拓撲異構(gòu)酶I，是一種專一性的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，其體外抑制拓撲異構(gòu)酶II抑制劑的效果較VP16強十倍左右。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種化合物作為新的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑類抗腫瘤藥物的應(yīng)用，藥效較目前常用的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑強，可應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。
文檔編號A61K31/365GK101480388SQ200910013989
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者健 丁, 玲 丁, 張偉杰, 李富超, 林麗萍, 松 秦 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所