專利名稱：對(duì)抗水產(chǎn)養(yǎng)殖中無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體感染的合成Replikin肽的制作方法
對(duì)抗水產(chǎn)養(yǎng)殖中無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體感染的合成
Rep I i k i η 肽本申請(qǐng)要求2008年1月18日提交的序列號(hào)為12/010，027的美國(guó)申請(qǐng)、2007年 11月30日提交的序列號(hào)為60/991，676的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2007年10月24日提交的序列號(hào) 為11/923，559的美國(guó)申請(qǐng)、2007年10月24日提交的序列號(hào)為60/982，336的美國(guó)臨時(shí)申 請(qǐng)、2007年10月24日提交的序列號(hào)為60/982，333的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2007年10月24日提 交的序列號(hào)為60/982，338的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2007年8月31日提交的序列號(hào)為60/935，816 的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2007年8月16日提交的序列號(hào)為60/935，499的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2007年 8月8日提交的序列號(hào)為60/954，743的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)和2007年5月30日提交的序列號(hào) 為11/755,597的美國(guó)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其中每一個(gè)申請(qǐng)的整體通過(guò)引用被并入本文。另外， 本申請(qǐng)通過(guò)引用將如下每一個(gè)申請(qǐng)的整體并入本文2007年1月30日提交的序列號(hào)為 60/898, 097的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2007年1月18日提交的序列號(hào)為60/880，966的美國(guó)臨時(shí)申 請(qǐng)、2006年10月24日提交的序列號(hào)為60/853，744的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、2006年2月16日提 交的序列號(hào)為11/355，120的美國(guó)申請(qǐng)、2005年4月28日提交的序列號(hào)為11/116，203的美 國(guó)申請(qǐng)、2004年6月4日提交的序列號(hào)為10/860,050的美國(guó)申請(qǐng)、2002年7月8日提交的 序列號(hào)為10/189，437的美國(guó)申請(qǐng)、2002年3月26日提交的序列號(hào)為10/105，232的美國(guó)申 請(qǐng)、現(xiàn)在的序列號(hào)為7，189，800的美國(guó)專利、2001年10月26日提交的序列號(hào)為09/984，057 的美國(guó)申請(qǐng)和2001年10月26日提交的序列號(hào)為09/984，056的美國(guó)申請(qǐng)、現(xiàn)在的序列號(hào) 為7，176，275的美國(guó)專利。水產(chǎn)養(yǎng)殖一般指對(duì)食用水生動(dòng)物的繁殖和養(yǎng)殖。水產(chǎn)養(yǎng)殖是21世紀(jì)快速發(fā)展 的全球性行業(yè)。造成該行業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最重要原因是疾病。Meyer，F(xiàn). P.，J Anim Sci 1991.69 :4201-4208。水產(chǎn)養(yǎng)殖，特別是無(wú)脊椎動(dòng)物水產(chǎn)養(yǎng)殖，常常包括在銷售或誘發(fā)蛻 皮之前在圍欄或儲(chǔ)罐中短期保存高密度數(shù)量的動(dòng)物。同前。這些濃度對(duì)于無(wú)脊椎動(dòng)物例 如蝦、蛤蛘、牡蠣、龍蝦、扇貝、鮑魚等是有壓力的。有壓力的條件對(duì)于病原體的傳播是理 想的，其中所述病原體包括細(xì)菌例如弧菌(Vibrio)、衣原體(Chlamydia)樣和立克次氏體 (Richettsia)樣的物種，病毒例如桃拉綜合征病毒和白斑綜合征病毒，以及其他微生物病 原體。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中一個(gè)特別嚴(yán)重的病毒性疾病是桃拉綜合征，其顯著地影響全世界的 蝦養(yǎng)殖業(yè)。桃拉綜合征由桃拉綜合征病毒(TSV)所致，桃拉綜合征病毒(TSV)是蟋蟀麻痹 病毒(Cripavirus)屬中二順?lè)醋硬《?Discistroviridae)家族的成員并且具有約10，000 個(gè)核苷酸的單個(gè)正鏈基因組。所述基因組含有兩個(gè)開(kāi)放的讀碼框(ORF)。據(jù)報(bào)道，ORFl含 有解旋酶、蛋白酶和依賴于RNA的RNA聚合酶的編碼。據(jù)報(bào)道，0RF2含有三種衣殼蛋白的 編碼。桃拉綜合征現(xiàn)在被認(rèn)為是美洲地方性的，而且也觀察到在亞洲的爆發(fā)。受感染的 蝦通常具有紅色尾巴，厭食且行為反復(fù)無(wú)常，尾部肌肉可變得不透明，并且角質(zhì)層可變軟。 在該疾病的急性階段觀察到5%和95%之間的死亡率。從TSV爆發(fā)中幸存的蝦看上去在保 持傳染性的同時(shí)對(duì)再感染具有抵抗力。
快速?gòu)?fù)制是某些細(xì)菌、病毒和惡性腫瘤的毒力特征，其中所述細(xì)菌、病毒和惡性 腫瘤包括TSV和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的其他病毒和細(xì)菌疾病，例如衣原體樣疾病和白斑綜合征 (一種病毒性疾病)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一類與快速?gòu)?fù)制有關(guān)的保守肽序列，其被命名為 R印likin。本發(fā)明人已經(jīng)把流感和其它病毒種株中R印Iikin肽的濃度增加同增加的病毒 毒力聯(lián)系起來(lái)。本領(lǐng)域中需要通過(guò)操控R印Iikin序列的復(fù)制功能而預(yù)防和治療病原體感 染的方法，而且需要鑒定與R印Iikin序列的復(fù)制功能相關(guān)的分子靶標(biāo)以治療毒性感染，其 包括疫苗和其他療法。此外，本領(lǐng)域中需要減少針對(duì)新出現(xiàn)的病原體的疫苗和其他療法的 開(kāi)發(fā)所需時(shí)間，其中所述新出現(xiàn)的病原體在種群中快速擴(kuò)張或高度可變或二者。目前用于 疫苗開(kāi)發(fā)的三至十二個(gè)月的時(shí)間范圍常常將疫苗提供在流行病早已經(jīng)結(jié)束之后，或在流行 病依然活躍但病原體變異已經(jīng)使疫苗不太有效或無(wú)效之后。本領(lǐng)域這些問(wèn)題對(duì)于人類和動(dòng) 物健康專業(yè)人員和政府是很大的煩惱。發(fā)明概述本發(fā)明提供合成的肽序列以及分離的、合成的或被合成的R印Iikin肽序列以預(yù) 防和治療病原體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的無(wú)脊椎動(dòng)物中的爆發(fā)，以及向水產(chǎn)養(yǎng)殖中的無(wú)脊椎動(dòng)物施 用一種或多種物質(zhì)以預(yù)防和/或治療病原體在無(wú)脊椎動(dòng)物中的爆發(fā)的方法，其中所述物質(zhì) 包括一個(gè)或多個(gè)所述分離的、合成的或被合成的R印Iikin肽序列或由一個(gè)或多個(gè)所述分 離的、合成的或被合成的R印Iikin肽序列組成。本發(fā)明第一個(gè)非限制性的方面提供一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的物質(zhì)，其包括至少一種含 有約七至約五十個(gè)氨基酸的合成肽，其中所述至少一種合成肽當(dāng)被施用于至少一種能夠在 水中養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物時(shí)增加該無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)至少一種病原體的抵抗力。在一個(gè)非限制性 的實(shí)施方案中，所述至少一種無(wú)脊椎動(dòng)物是甲殼綱動(dòng)物。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施 方案中，所述至少一種甲殼綱動(dòng)物是蝦。本發(fā)明第一個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案提供一種提高水產(chǎn)養(yǎng)殖 的無(wú)脊椎動(dòng)物抵抗力的物質(zhì)，其包括至少一種分離的或合成的肽，所述肽是來(lái)自所述無(wú)脊 椎動(dòng)物的病原體的至少一種肽的至少一種分離的或合成的形式，其中所述至少一種分離的 或合成的肽是至少一種由7至約50個(gè)氨基酸組成的分離的或合成的R印Iikin肽，其包括 R印Iikin模體,所述r印Iikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè) 末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述的至少一種分離的或合成的 R印Iikin肽由R印Iikin模體組成。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述R印Iikin 模體由約7至約10個(gè)、約10至約15個(gè)氨基酸、約15至約20個(gè)氨基酸、約20至約25個(gè)氨 基酸、約25至約30個(gè)氨基酸、約30至約35個(gè)氨基酸、約35至約40個(gè)氨基酸、約40至約 45個(gè)氨基酸或約45至約50個(gè)氨基酸組成。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述的至少一種分離的或合成 的 R印Iikin 肽包括 SEQ ID NO. 1_11、86、87、103-112 和 114-198 中的任一種。在一個(gè)進(jìn)
7一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)包括SEQ ID NO. 1-11、86、87、103-112和114-198 的分離的或合成的R印Iikin肽中的一種或多種的混合物。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí) 施方案中，所述的至少一種分離的或合成的R印Iikin肽包括KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1), HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ ID NO. 6),KIffLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明第一個(gè)方面 的物質(zhì)包括任意兩種或多種合成的R印Iikin肽的混合物。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí) 施方案中，所述物質(zhì)包括合成的R印Iikin肽的等重混合物。本發(fā)明的第二個(gè)非限制性的方面提供一種包括用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的物質(zhì)的疫苗，其中 所述物質(zhì)包括至少一種含有約7至約50個(gè)氨基酸的分離的或合成的肽，其中所述至少一種 分離的或合成的肽當(dāng)被施用于至少一種能夠在水中養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物時(shí)增加該無(wú)脊椎動(dòng) 物對(duì)至少一種病原體的抵抗力。在本發(fā)明的第二個(gè)方面的一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗的物質(zhì)的至少一 種分離的或合成的肽是至少一種R印Iikin肽，其中所述R印Iikin肽由7至約50個(gè)氨基酸 組成并包括R印Iikin模體，所述Mplikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè) 末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述疫苗還包括一種藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明第二個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗提供針對(duì) 無(wú)脊椎動(dòng)物中至少一種病原體的保護(hù)，所述無(wú)脊椎動(dòng)物例如是甲殼綱動(dòng)物或軟體動(dòng)物。在 一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗提供針對(duì)蝦中至少一種病原體的保護(hù)。在 一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，為了施用于蝦，將所述疫苗與蝦飼料混合。在一個(gè)進(jìn) 一步的非限制性的實(shí)施方案中，將所述疫苗與每日定量的蝦飼料混合。在一個(gè)進(jìn)一步的非 限制性的實(shí)施方案中，所述病原體是病毒。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述病 原體是桃拉綜合征病毒。在本發(fā)明第二個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗的至少一 種分離的或合成的肽是SEQ ID NO. 1-11、86、87、103-112和114-198中的任一種。在一個(gè)進(jìn) 一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗包括SEQ ID NO. 1-11、86、87、103-112和114-198 的分離的或合成的R印Iikin肽中一種或多種的混合物。在本發(fā)明第二個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗 的至少一種合成肽是 KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、 KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5)、 KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6), KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、 KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ ID NO. 10)或HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。在 一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗包括任意兩種或多種合成肽的混合物。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗包括每一種合成肽的混合物。在一個(gè)進(jìn)一 步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗包括每一種合成肽的等重混合物。在本發(fā)明第二個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗以每天每 只受治療的蝦的每克體重約0. OOlmg至約IOmg疫苗的量被施用于至少一只蝦。在一個(gè)進(jìn) 一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗以每天每只受治療的蝦的每克體重約0. 005mg至 約5mg疫苗的量被施用于至少一只蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗 以每天每只受治療的蝦的每克體重約0. Olmg至約2mg疫苗的量被施用于至少一只蝦。在一 個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗以每天每只受治療的蝦的每克體重約0. 02mg 至約1.5mg疫苗的量被施用于至少一只蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述 疫苗以每天每只受治療的蝦的每克體重約0. OSmg至約1. Omg疫苗的量被施用于至少一只 蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗以每天每只受治療的蝦的每克體重 約0. Img至約0. 9mg疫苗的量被施用于至少一只蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案 中，所述疫苗以每天每只受治療的蝦的每克體重約0. 2mg至約0. Smg疫苗的量被施用于至 少一只蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗以每天每只受治療的蝦的每 克體重約0. 5mg疫苗的量被施用于至少一只蝦。在本發(fā)明第二個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗的至 少一種分離的、被合成的或合成的R印Iikin肽是存在于桃拉綜合征病毒新出現(xiàn)的種株中 的至少一種R印Iikin肽的至少一種分離的、被合成的或合成的形式。在本發(fā)明第二個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述疫苗作 為預(yù)防性療法在桃拉綜合征病毒的癥狀發(fā)作前被施用于蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí) 施方案中，本發(fā)明疫苗作為預(yù)防性療法在桃拉綜合征病毒的癥狀發(fā)作后被施用于蝦。在一 個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述疫苗以亞治療濃度被施用。在一個(gè)進(jìn)一步的非限 制性的實(shí)施方案中，所述疫苗在至少一只蝦的基本上全部的生命周期中被施用。本發(fā)明第三個(gè)非限制性的方面提供一種為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的無(wú)脊椎動(dòng)物提供抵抗力 的方法，其包括施用一種包括至少一種合成肽的物質(zhì)，其中所述至少一種合成肽當(dāng)被施用 于至少一種能夠在水中養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物時(shí)能夠增加對(duì)至少一種病原體的抵抗力。在一個(gè) 非限制性的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)通過(guò)口服、通過(guò)將無(wú)脊椎動(dòng)物浸沒(méi)在含有此物質(zhì)的水介 質(zhì)中或通過(guò)注射被施用。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)被口服施用。在 一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，所述無(wú)脊椎動(dòng)物是甲殼綱動(dòng)物。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的 實(shí)施方案中，所述甲殼綱動(dòng)物是蝦。本發(fā)明第四個(gè)非限制性的方面提供一種由7至約50個(gè)氨基酸組成的分離的、合成 的或被合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin肽，其中所述R印Iikin肽包括R印Iikin模體，所 述r印Iikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè) 末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。在本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，分離的、合成的或被合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin肽由R印Iikin模體組成。一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案提供編 碼桃拉綜合征病毒R印Iikin肽的核酸序列。本發(fā)明第五個(gè)非限制性的方面提供一種由約16至約34個(gè)氨基酸組成的分離的、 合成的或被合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin支架肽，其中所述R印Iikin支架肽包括(1) 一個(gè)末端賴氨酸和任選地緊鄰所述末端賴氨酸的一個(gè)賴氨酸；(2) 一個(gè)末端組氨酸和任選地緊鄰所述末端組氨酸的一個(gè)組氨酸；(3)距離另一個(gè)賴氨酸約6至約10個(gè)氨基酸以內(nèi)的一個(gè)賴氨酸；和(4)至少6 %的賴氨酸。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，分離的、合成的或被合成的桃拉綜合征 病毒R印Iikin支架肽由約28至約33個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方 案中，所述肽包括 KKVQANKTRVFAASNQGLALALRRYYLSFLDH(SEQ ID NO. 197)或 KKACRNAGYKEA CLHELDCKSFLLAQQGRAGAH(SEQ ID NO. 198)。本發(fā)明第六個(gè)非限制性的方面提供一種增加無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力的方 法，其包括(1)使用所述病原體攻擊與所述無(wú)脊椎動(dòng)物同種的多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物，所述病原體 的水平足以使所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體致?。?2)將患病的或死亡的所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體丟棄；(3)重復(fù)步驟1和2至少一次；并且(4)至少一次地在步驟(1)、(2)和/或(3)中對(duì)所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物施用權(quán)利要 求1的物質(zhì)，其增加所述無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力。在本發(fā)明第六個(gè)方面的一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，所述至少一種分離的或合 成的肽是至少一種R印Iikin肽，其中所述R印Iikin肽由7至約50個(gè)氨基酸組成并包括 Replikin模體,所述r印Iikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè) 末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述無(wú)脊椎動(dòng)物是蝦。在一個(gè)進(jìn)一步的 非限制性的實(shí)施方案中，所述病原體是桃拉綜合征病毒。本發(fā)明第七個(gè)非限制性的方面提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，其包括(1)從一種能 夠在水介質(zhì)中養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體中鑒定至少一種R印Iikin序列，和(2)化學(xué)合 成至少一種被鑒定的R印Iikin序列作為所述疫苗的活性劑。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案 中，所述疫苗從在病原體內(nèi)至少一種R印1 ikin序列被鑒定時(shí)起的七天或更少的時(shí)間內(nèi)被生產(chǎn)。本發(fā)明第八個(gè)非限制性的方面提供一種包括用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的物質(zhì)的動(dòng)物飼料， 其包括至少一種含約七至約五十個(gè)氨基酸的合成肽，其中所述至少一種合成肽當(dāng)被施用 于至少一種能夠在水介質(zhì)中養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物時(shí)增加該無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)至少一種病原體的 抵抗力。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料是甲殼綱動(dòng)物的飼料。在一個(gè)進(jìn)
10一步的非限制性的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料是蝦飼料。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 所述動(dòng)物飼料中的物質(zhì)中的合成肽是合成的R印Iikin肽。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，所述動(dòng)物飼料包括蝦生產(chǎn)Rangen 35麥芽漿、1 %的海藻酸鈉、1 %的六偏磷酸鈉和至 少一種合成的R印Iikin肽，其中所述合成的R印Iikin肽是KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、 HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、KAENEFffDGVKQ SH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ ID NO. 6),KIffLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。本發(fā)明第九個(gè)非限制性的方面提供一種蝦，其中所述蝦被包括至少一種Iteplikin 肽的疫苗處理，其中所述至少一種R印Iikin肽由7至約50個(gè)氨基酸組成并包括R印Iikin 模體，所述Mplikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè) 末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述R印Iikin肽是桃拉綜合征病毒R印Iikin肽。在 本發(fā)明第九個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述蝦(1)與多個(gè)其他蝦一起被桃拉綜合 征病毒攻擊，所述桃拉綜合征病毒的水平足以使所述多個(gè)蝦中的至少一個(gè)致??；(2)將所 述多個(gè)蝦中患病的蝦或死亡的蝦或二者丟棄；(3)重復(fù)步驟1和2至少一次；并且(4)至少 一次地在步驟(1)、⑵和/或⑶中對(duì)所述多個(gè)蝦施用一種疫苗，其中所述疫苗包括至少 一種分離的或合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin肽。附圖簡(jiǎn)述

圖1舉例說(shuō)明在用桃拉綜合征病毒攻擊的蝦(南美白對(duì)蝦(Penaeusvarmamei)) 15 天試驗(yàn)期內(nèi)的存活率。圖IA舉例說(shuō)明用Tl疫苗接種的蝦，其中所述Tl疫苗含有來(lái)自桃拉 綜合征病毒(TSV)的R印Iikin序列。圖IB舉例說(shuō)明未被接種的蝦(對(duì)照)。圖1中的數(shù) 據(jù)反映下面實(shí)施例2中闡述的試驗(yàn)。圖IA舉例說(shuō)明5個(gè)試驗(yàn)，其中每個(gè)試驗(yàn)與對(duì)照一起進(jìn) 行了相同的15天時(shí)間。圖IB舉例說(shuō)明在相同的15天期間的三個(gè)對(duì)照試驗(yàn)。在從總共六 個(gè)試驗(yàn)(如下面實(shí)施例2中所述)中去掉一個(gè)異常值后，被接種的蝦具有59%的累計(jì)存活 率(圖1A)。未被接種的蝦具有25%的累計(jì)存活率(圖1B)。被接種的蝦的累計(jì)存活率比 未被接種的蝦的累計(jì)存活率高。這些數(shù)據(jù)表明，使用R印Iikin序列接種提供了免受TSV感 染的保護(hù)。接種后對(duì)抗TSV的相對(duì)存活率是45%。圖2舉例說(shuō)明被桃拉綜合征病毒(TSV)預(yù)先攻擊的(慢性感染的)并且接著在 用Tl疫苗、T2抑制的或“阻斷的”疫苗或不用疫苗(對(duì)照)處理后被TSV再一次攻擊的蝦 (南美白對(duì)蝦)的15天累計(jì)存活率。使用未被TSV預(yù)先攻擊(未慢性感染的)的蝦舉例 說(shuō)明了另一個(gè)對(duì)照研究。這另一個(gè)對(duì)照未被疫苗處理。對(duì)于Tl接種的蝦，一直到第13天 未出現(xiàn)死亡。在暴露于TSV之后第15天，這組具有91%的存活率。對(duì)于喂有抑制的疫苗 T2的蝦，在第2天觀察到第一例死亡。此組具有60%的存活率。對(duì)于經(jīng)受了之前TSV攻擊 的未被接種的對(duì)照組，在第10天發(fā)生第一例死亡，并且該組具有75%的存活率。對(duì)于之前未被桃拉綜合征病毒攻擊的另一個(gè)對(duì)照組(SPF蝦)，累計(jì)存活率是25%。這些結(jié)果顯示， TSV慢性感染的蝦當(dāng)被TSV再次攻擊時(shí)具有更高的存活率(60-91% )。特別地，Tl接種的 南美白對(duì)蝦具有最高的存活率和最低的病毒載量。用TSV攻擊的SPF南美白對(duì)蝦的存活率 是25%。圖2中舉例說(shuō)明的試驗(yàn)被描述在下面的實(shí)施例3中。圖3舉例說(shuō)明分別從伯利茲、泰國(guó)、夏威夷和委內(nèi)瑞拉采集的桃拉綜合征病毒 (TSV)的分離物中的R印Iikin濃度與被相應(yīng)TSV分離物在第1、2和3天攻擊的凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei)達(dá)到50%死亡率所用的平均天數(shù)之間的直接順序相關(guān)性(direct sequentialcorrelation)。每種分離物的R印Iikin濃度之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異是顯著的，在ρ < 0. 001的水平上。圖3中所舉例說(shuō)明的數(shù)據(jù)在下面的實(shí)施例1中被描述。圖4舉例說(shuō)明分別從伯利茲、泰國(guó)、夏威夷和委內(nèi)瑞拉采集的桃拉綜合征病毒 (TSV)的分離物中的R印Iikin濃度與被相應(yīng)的TSV分離物攻擊后15天的凡納濱對(duì)蝦的平 均累計(jì)存活率之間的直接相關(guān)性。每種分離物的R印Iikin濃度之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異是顯著 的，在P < 0. 001的水平上。圖4中所舉例說(shuō)明的數(shù)據(jù)被描述在下面的實(shí)施例1中。圖5舉例說(shuō)明被四種不同的桃拉綜合征病毒分離物攻擊的凡納濱對(duì)蝦的15天累 計(jì)存活率(除非在15天之前發(fā)生100%的死亡)與每種分離物的開(kāi)放讀碼框I(ORFl)的 R印Iikin濃度之間的相關(guān)性。針對(duì)R印Iikin濃度分析了來(lái)自伯利茲、泰國(guó)、夏威夷和委 內(nèi)瑞拉的TSV的個(gè)體分離物的基因組的ORFl的被翻譯的氨基酸序列。對(duì)于伯利茲分離物 R印Iikin濃度被確定為3. 5，對(duì)于泰國(guó)分離物其為3. 4，對(duì)于夏威夷分離物其為3. 3，而對(duì)于 委內(nèi)瑞拉分離物其為3. 0。圖A舉例說(shuō)明用TSV的伯利茲分離物攻擊的蝦在三個(gè)試驗(yàn)中觀 察到的存活率。在一個(gè)試驗(yàn)中，在第6天觀察到全部死亡。在其他試驗(yàn)中，在第11天觀察 到全部死亡。圖B、C和D舉例說(shuō)明用泰國(guó)分離物、夏威夷分離物和委內(nèi)瑞拉分離物分別攻 擊的蝦在為期15天的三個(gè)試驗(yàn)中觀察到的存活率。在泰國(guó)分離物中，在第15天觀察到平 均80%的死亡率。在夏威夷分離物中，在第15天觀察到平均78. 3%的死亡率。在委內(nèi)瑞 拉分離物中，在第15天觀察到平均58. 3%的死亡率。圖5中所舉例說(shuō)明的數(shù)據(jù)在下面的實(shí) 施例1中被描述。圖6舉例說(shuō)明桃拉綜合征病毒基因組中增加的R印Iikin濃度與在2000年和2007 年中此病毒在蝦中的爆發(fā)之間的相關(guān)性。本發(fā)明人分析了可得自www.pubmed.com的桃拉 綜合征病毒肽序列的公開(kāi)可得的序列的平均R印Iikin濃度。圖6是比較2000年和2005年 之間肽序列可公開(kāi)獲得的每年平均R印Iikin濃度(帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差)和桃拉綜合征病毒嚴(yán) 重爆發(fā)日期的圖。此圖中所反映的R印Iikin濃度數(shù)據(jù)可在下面的表13中找到。在2000年 和2007年記錄了此病的嚴(yán)重爆發(fā)?？梢詮拇藞D觀察到的是，此病毒的爆發(fā)發(fā)生在R印Iikin 濃度增加之后。在2000年，TSV具有2. 7的R印Iikin濃度。在2001和2004年之間，TSV 具有低至0. 6的較低平均R印Iikin濃度，而且被鑒定的R印Iikin支架消失了。在2005年 Replikin支架再現(xiàn)，賴氨酸和組氨酸增加，并且R印Iikin濃度相應(yīng)增加到1. 8，接著是在 2006-2007年期間TSV爆發(fā)的增加。參見(jiàn)實(shí)施例5中的2000和2005年TSV的Replikin支
^K O圖7舉例說(shuō)明西尼羅河病毒R印Iikin的周期產(chǎn)生和每年的人類發(fā)病率，通過(guò)證 明每年西尼羅河病毒的包膜蛋白的每100個(gè)氨基酸的R印Iikin濃度Oteplikin計(jì)數(shù)) (Replikin計(jì)數(shù)平均值被帶有所繪標(biāo)準(zhǔn)偏差的黑色柱所舉例說(shuō)明)與疾病控制中心(CDC)報(bào)道的基于全國(guó)范圍的美國(guó)每年的人類病例數(shù)之間的相關(guān)性。瀏覽此數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，包膜蛋白 的R印Iikin計(jì)數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在2000和2001年之間顯著增加(ρ < 0. 001的統(tǒng)計(jì)學(xué) 顯著性)。觀察病毒種群的R印Iikin計(jì)數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的此種變化傳達(dá)了所有常見(jiàn)流 感病毒種株的快速?gòu)?fù)制和R印Iikin計(jì)數(shù)范圍的擴(kuò)大(流感病毒被歸類在顯著不同于西尼 羅河病毒的病毒家族中)的信號(hào)。在流感中，在病毒爆發(fā)前觀察到R印Iikin計(jì)數(shù)上的顯著 統(tǒng)計(jì)變化。從2000至2003年在西尼羅河病毒中觀察到的平均R印Iikin計(jì)數(shù)的增加發(fā)生 在被CDC獨(dú)立記錄并公布的人類西尼羅河病毒(WNV)病例的數(shù)量增加之前。同樣詳細(xì)的 R印Iikin計(jì)數(shù)與發(fā)病率關(guān)系已被顯示在流感種株中，例如H5W與人的死亡率(參見(jiàn)圖8)， 和H3N8馬腦炎與馬的發(fā)病率(參見(jiàn)圖12)，和錐蟲屬惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum) (瘧疾)與人的死亡率(參見(jiàn)圖9)，和桃拉綜合征病毒與蝦的死亡率(參見(jiàn)圖3-5)。因?yàn)樗?述關(guān)系已經(jīng)在若干物種即甲殼綱動(dòng)物、馬和人中被證明，而且因?yàn)镽印Iikin序列已經(jīng)與植 物、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、原生動(dòng)物(例如惡性瘧原蟲)、細(xì)菌(例如炭疽)和病毒(參見(jiàn)例 如編號(hào)為7，176，275和7，189，800的美國(guó)專利)的快速?gòu)?fù)制聯(lián)系在一起，所以使R印Iikin 計(jì)數(shù)與發(fā)病率關(guān)聯(lián)看上去是廣泛分布的一般原則。圖7中的數(shù)據(jù)另外舉例說(shuō)明，在2004年和又一次在2005年出現(xiàn)R印Iikin計(jì)數(shù)和 WNV人類病例數(shù)量二者的降低。在2006年，在R印Iikin計(jì)數(shù)增加之后在2007年人類病例 數(shù)量(發(fā)病率)增加。因此，圖7舉例說(shuō)明R印Iikin濃度Oteplikin計(jì)數(shù))的兩個(gè)周期和 變化的WNV人類發(fā)病率的兩個(gè)周期。在圖7中觀察到2000-2003年和2004-2008年之間的 兩個(gè)周期(病毒R印Iikin周期)互相關(guān)聯(lián)。在之前Hmi和H3N2流感病毒數(shù)據(jù)中已經(jīng)觀 察到R印Iikin計(jì)數(shù)的周期(參見(jiàn)例如圖11)。所述關(guān)系在WNV數(shù)據(jù)中比它在流感數(shù)據(jù)中更 清楚地被證明，因?yàn)橛蒆mi或H3N2流感病毒所致的實(shí)際病例數(shù)在歷史上對(duì)特定種株的記 錄不像現(xiàn)在對(duì)西尼羅河病毒所記錄的這樣準(zhǔn)確。相反地，Hmi和H3N2被記作爆發(fā)、流行或 大流行。在重復(fù)的周期中R印Iikin濃度Oteplikin計(jì)數(shù))的逐步增加可用作預(yù)測(cè)病毒擴(kuò) 張的方法。對(duì)R印Iikin計(jì)數(shù)的逐步增加的監(jiān)測(cè)為技術(shù)人員提供了預(yù)測(cè)病毒種群擴(kuò)張和造 成的包括病毒性疾病的爆發(fā)、流行或大流行的發(fā)病率的數(shù)據(jù)。這些事件實(shí)際的發(fā)病率未被 記錄。應(yīng)該注意的是，2007和2008年的R印Iikin計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)被排除在圖7外，因?yàn)榈奖旧?請(qǐng)撰寫時(shí)為止，WNV序列的⑶C報(bào)告被推遲了。圖7中的數(shù)據(jù)也是重要的，因?yàn)閳D7描述了一種在1999年第一次到達(dá)紐約市并在 之后蔓延到全美國(guó)的病毒的進(jìn)展，而不是在許多先前的流行之后重返一個(gè)國(guó)家的病毒，例 如Hmi或H3N2的情況。從所述病毒的新發(fā)現(xiàn)的R印Iikin結(jié)構(gòu)和⑶C提供的很好的流行 病學(xué)數(shù)據(jù)方面來(lái)看，存在著檢查此種蔓延步驟的機(jī)會(huì)。圖8舉例說(shuō)明在人H5m中R印Iikin峰基因pBl基因區(qū)域的R印Iikin計(jì)數(shù)與H5m 感染的人類病例中2003和2007年之間的人類死亡率百分?jǐn)?shù)的關(guān)系。觀察到H5W的pBl 基因區(qū)域中R印Iikin計(jì)數(shù)的增加與宿主的更高死亡率在數(shù)量上是相關(guān)的。在圖中，(1)淺 灰色表示在指定年份全部病毒分離物的平均R印Iikin計(jì)數(shù)，(2)深灰色表示在指定年份人 H5N1分離物的公開(kāi)可得的序列的pBl區(qū)域中的平均R印Iikin計(jì)數(shù)，(3)白色柱表示在指定 年份R印Iikin計(jì)數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以及(4)黑色柱表示在指定年份被鑒定的H5W感 染的人病例的10%的死亡率百分?jǐn)?shù)，其最終達(dá)到86%的死亡率(在圖8中顯示為8. 6)。
圖9舉例說(shuō)明來(lái)自惡性瘧原蟲的每1000個(gè)臨床人類病例的死亡率與惡性瘧原蟲 的ATP酶中的R印Iikin計(jì)數(shù)相關(guān)聯(lián)。瘧疾的高發(fā)病率和死亡率發(fā)生在20世紀(jì)90年代 晚期，而且這些率被認(rèn)為是由于微生物的適應(yīng)和抗瘧疾藥效果的降低所致。ATP酶是青蒿 素(arteminisin)治療瘧疾的首要靶。隨著青蒿素使用的增加和公共健康措施的改善，從 1999年至2006年發(fā)病率和死亡率下降了。從1997年至1998年，惡性瘧原蟲的ATP酶的 Replikin計(jì)數(shù)和每個(gè)瘧疾病例死亡率的增加一起增加了。從1998年至2006年，惡性瘧原 蟲的ATP酶的R印Iikin計(jì)數(shù)和死亡率一起減少了(目前可得的只貫穿于2005年的一致死 亡率)。1997至2005年的每1000個(gè)人類瘧疾病例的死亡率如下1997年的死亡率是17 ； 1998年的死亡率是17 ；1999年的死亡率是19 ；2000年的死亡率是16 ；2001年的死亡率是 13 ；2002年的死亡率是10 ；2003年的死亡率是10 ；2004年的死亡率是9 ；而且2005年的死 亡率是9。死亡率如世界衛(wèi)生組織所宣布的那樣被記錄。Slwww.who.int。圖10舉例說(shuō)明在分離于1995和2007年之間的白斑綜合征病毒(WSSV)的公開(kāi) 可得的氨基酸序列中觀察到的R印Iikin序列的平均R印Iikin計(jì)數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差與WSSV于 2001年在蝦中的嚴(yán)重爆發(fā)之間的相關(guān)性。在2000年的R印Iikin濃度97. 6預(yù)言2001年的 爆發(fā)。此外，在來(lái)自2000年的WSSV分離物的核糖核苷酸還原酶蛋白序列中觀察到R印1 ikin 濃度為103. 8，其中R印Iikin峰基因被鑒定具有甚至更高的R印Iikin濃度110. 7。圖11舉例說(shuō)明在上世紀(jì)三次流感大流行中的總的血凝素R印Iikin計(jì)數(shù)。種株特 異性的高R印Iikin計(jì)數(shù)伴隨著三次大流行中的每一次1918、1957和1968。在所有情況 下，此峰之后是減退(很可能是由于宿主的免疫力所致)，然后是恢復(fù)的以及“反彈的”流 行。這些相關(guān)是由于偶然性的概率非常低所致，因?yàn)樗鼈儗?duì)每個(gè)種株是特定的，對(duì)該世紀(jì)三 個(gè)大流行年份中的每一個(gè)是特定的，對(duì)每次大流行后的減退是特定的，并且對(duì)每次反彈流 行是特定的。圖12顯示1977-2007年間在馬流感的ρΒ1、ρΒ2和pA基因組區(qū)域內(nèi)被鑒定的 Replikin峰基因的R印Iikin計(jì)數(shù)與H3N8馬流感所致的馬腦炎流行病之間的關(guān)系。系列1 反映在所述基因組的PBl區(qū)域的R印Iikin峰基因中被鑒定的平均R印Iikin計(jì)數(shù)。系列2 反映PBl基因區(qū)域中的平均R印Iikin計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。系列3反映在所述基因組的pA基 因區(qū)域的R印Iikin峰基因中被鑒定的R印Iikin計(jì)數(shù)，其中所述pA基因區(qū)域與pBl基因區(qū) 域相鄰。系列4反映在所述基因組的pB2基因區(qū)域的R印Iikin峰基因中被鑒定的R印Iikin 計(jì)數(shù)，其中所述PB2基因區(qū)域也與pBl基因區(qū)域相鄰。據(jù)觀察，pBl基因區(qū)域中的R印Iikin 計(jì)數(shù)的增加在流行病爆發(fā)前一至三年發(fā)生，而沒(méi)有觀察到PB2和pA基因區(qū)域中R印Iikin 計(jì)數(shù)的增加。發(fā)明詳述定義如本文所用，“合成肽”指的是通過(guò)一種過(guò)程產(chǎn)生的肽，其中所述過(guò)程的至少一個(gè) 步驟是在活細(xì)胞外進(jìn)行的，而且此過(guò)程是被人直接地或間接地啟動(dòng)或指揮的。如本文所用，“水產(chǎn)養(yǎng)殖”指的是天然水產(chǎn)物的養(yǎng)殖，例如有殼的水生動(dòng)物的養(yǎng)殖。如本文所用，“施用(administer) ”、“施用(administration) ”或相關(guān)術(shù)語(yǔ)指的是 為了治療目的而將一種化合物引入動(dòng)物或其他受治療者，其中所述引入可以由通過(guò)口的應(yīng) 用、在皮膚上的應(yīng)用、穿過(guò)皮膚的應(yīng)用、穿過(guò)鰓的應(yīng)用、經(jīng)皮注射的應(yīng)用或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在和以后知道的任何其他方法的應(yīng)用而完成，由此所述化合物被直接或間接地引入 動(dòng)物或其他受治療者體內(nèi)。如本文所用，一種肽或其他化合物是“免疫原性的”，如果它能夠獨(dú)立地或與其他 化合物一起刺激活動(dòng)物中的免疫應(yīng)答或抵抗力應(yīng)答。如本文所用，刺激“抵抗力，，或刺激發(fā)展“有抵抗力的，，無(wú)脊椎動(dòng)物或其他動(dòng)物的 化合物、治療或療法是能夠獨(dú)立地或與其他化合物、治療或療法一起刺激活動(dòng)物包括例如 無(wú)脊椎動(dòng)物中的免疫應(yīng)答或抵抗力應(yīng)答的化合物、處理或治療。如本文所用，“治療濃度”指的是病原體疾病在所述疾病至少一個(gè)生命周期中在統(tǒng) 計(jì)學(xué)可測(cè)量的水平上被抑制的治療劑濃度。如本文所用，“亞治療濃度”指的是病原體疾病在所述疾病至少一個(gè)生命周期中在 統(tǒng)計(jì)學(xué)可測(cè)量的水平上沒(méi)有被抑制的治療劑濃度。如本文所用，“疫苗”指的是一種能夠刺激針對(duì)病原體的抵抗力或免疫應(yīng)答的化合 物對(duì)動(dòng)物或人體的施用。施用可以是通過(guò)口、鰓、經(jīng)皮注射、浸沒(méi)在一種濃度的疫苗中或本 領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在和以后知道的任何其他施用方法。無(wú)脊椎動(dòng)物例如蝦、蛤蛘、扇貝等的免 疫系統(tǒng)的詳情未被完全理解。例如，蝦表面上可能不產(chǎn)生抗體。然而，本文的數(shù)據(jù)證實(shí)了對(duì) 于感染的抵抗現(xiàn)象。這種抵抗可以是基于“原始的免疫系統(tǒng)”。雖然不被理論所限制，但是 蝦和一些其他無(wú)脊椎動(dòng)物的“原始的免疫系統(tǒng)”被推理為與其他動(dòng)物中的“Toll受體”和相 關(guān)系統(tǒng)類似。如本文所用，“動(dòng)物”包括蝦和任何其他動(dòng)物。如本文所用，“無(wú)脊椎動(dòng)物”指的是缺少脊柱的任何動(dòng)物。容易水產(chǎn)養(yǎng)殖的無(wú)脊椎 動(dòng)物包括但不限于軟體動(dòng)物、甲殼綱動(dòng)物和棘皮動(dòng)物。軟體動(dòng)物包括但不限于蛤、貽貝、牡 蠣、螺、扇貝和頭足類動(dòng)物如烏賊、章魚、墨魚和陸棲蝸牛。甲殼綱動(dòng)物包括但不限于蝦、蟹、 龍蝦、對(duì)蝦和螯蝦。棘皮動(dòng)物包括但不限于海參和海膽。如本文所用，“甲殼綱動(dòng)物”根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解是一組通常為水生的節(jié)肢 動(dòng)物，并且包括但不限于蝦、蟹、龍蝦、對(duì)蝦和螯蝦。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽”或“蛋白”指的是含有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的化合物，其中一 個(gè)氨基酸的羧基通過(guò)肽鍵被連到另一個(gè)氨基酸的氨基。如本文所用，一種“分離的”或“純 化的”肽或其生物活性部分指的是純化后基本上不含來(lái)自衍生所述肽的細(xì)胞或組織來(lái)源的 細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白或肽的一種肽。一種“合成的”或“被合成的”肽或其生物活性部 分指的是合成后基本時(shí)不含使用任何方法化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品，或基本 不含使用重組基因技術(shù)合成時(shí)的污染肽的一種肽?！氨痪幋a的”蛋白、蛋白序列、蛋白片段序列或肽序列是由編碼所述蛋白或肽序列 的氨基酸的核酸序列所編碼的肽序列，其中所述核酸使用本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在或以后知道 的任何密碼子編碼氨基酸。應(yīng)該注意，本領(lǐng)域眾所周知的是，由于遺傳密碼的冗余性，密碼 子中單個(gè)核苷酸可容易地變換并仍然產(chǎn)生相同的氨基酸序列。將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解 的是，鑒定R印Iikin氨基酸序列的方法還包括鑒定編碼R印Iikin氨基酸序列的核酸序列 的方法，其中所述R印Iikin氨基酸序列由被鑒定的核酸序列所編碼。如本文所用，Replikin序列是含有7至約50個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其包括(1)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)氨基酸殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；
15
(2)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(3)至少6 %的賴氨酸殘基。R印Iikin序列可包括一個(gè)末端賴氨酸并還可包括一個(gè)末端賴氨酸或末端組氨酸。 R印Iikin肽或R印Iikin蛋白是由R印Iikin序列組成的肽或蛋白。R印Iikin序列還可被 描述為7至約50個(gè)氨基酸的R印Iikin序列，其包括R印Iikin模體或由R印Iikin模體組 成，其中所述replikin模體包括(1)位于所述分離的肽的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘 基和位于所述分離的肽的第二個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2) 位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的第一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘 基；和(4)至少6%的賴氨酸殘基。為了確定R印Iikin濃度，R印Iikin序列必須在一個(gè)末 端處具有賴氨酸殘基和在另一個(gè)末端出具有賴氨酸殘基或組氨酸殘基。術(shù)語(yǔ)“R印Iikin序列”也可以指編碼具有7至約50個(gè)氨基酸的氨基酸序列的核酸 序列，其中所述氨基酸序列包括(1)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)氨基酸殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(2)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(3)至少6%的賴氨酸殘基，其中所述氨基酸序列可包括一個(gè)末端賴氨酸并還可包括一個(gè)末端賴氨酸或末端 組氨酸。如本文所用，R印Iikin峰基因(RPG)或R印Iikin峰基因區(qū)域(RPGA)可互換地 被用來(lái)指基因組區(qū)段、蛋白、蛋白區(qū)段或蛋白片段，其中被表達(dá)的基因或基因區(qū)段當(dāng)與所述 基因組的其他區(qū)段或命名的基因相比時(shí)具有最高濃度的R印Iikin(每100個(gè)氨基酸中的 R印Iikin序列個(gè)數(shù))，所述基因組具有連續(xù)的、不間斷的和重疊的R印Iikin序列。一般地， 與全蛋白相關(guān)的基因或基因區(qū)段或表達(dá)蛋白的基因被稱為R印Iikin峰基因，而與蛋白片 段相關(guān)的基因或基因區(qū)段被稱為R印Iikin峰基因區(qū)域。在基因、基因區(qū)段、蛋白或蛋白片 段中可以鑒定不止一個(gè)RPG或RPGA。RPG或RPGA可具有一個(gè)末端賴氨酸或一個(gè)末端組氨 酸、兩個(gè)末端賴氨酸、或一個(gè)末端賴氨酸和一個(gè)末端組氨酸。RPG或RPGA可同樣地既不具有 末端賴氨酸也不具有末端組氨酸，只要它含有由R印Iikin序列的定義所定義的R印Iikin 序列，即，具有7至約50個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其包括(1)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)氨基酸殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(2)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(3)至少6 %的賴氨酸殘基。如本文所用，“新出現(xiàn)的種株”指的是被鑒定為相對(duì)于這種有機(jī)體的其他種株 中R印Iikin的濃度具有被提高的或正在提高的濃度的它的一個(gè)或多個(gè)蛋白序列中的 Replikin序列的病毒或其他病原體的種株。病毒的新出現(xiàn)的種株指示毒性或復(fù)制的提高。如本文所用，“爆發(fā)”是在與相同病毒性疾病中較早出現(xiàn)的感染的流行病學(xué)模式相 比之下病毒性疾病的毒力、發(fā)病率或死亡率的增加。如本文所用，“R印Iikin計(jì)數(shù)”或“Replikin濃度”指的是在蛋白、蛋白片段、病毒 或生物體中每100個(gè)氨基酸中R印Iikin的數(shù)量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在病毒或生物體的第一個(gè)種株 中的較高R印Iikin濃度與第一種病毒或生物體的更快速的復(fù)制相關(guān)，相比之下所述病毒 或生物體的第二個(gè)較早或較晚出現(xiàn)的種株具有較低的R印Iikin濃度。
如本文所用，“R印Iikin支架”指的是一系列保守的R印Iikin肽，其中每個(gè)所述 Replikin肽序列包括約16至約34個(gè)氨基酸以及優(yōu)選地約28至約33個(gè)氨基酸，并且還包 括(1) 一個(gè)末端賴氨酸和任選地緊鄰所述末端賴氨酸的一個(gè)賴氨酸；(2) —個(gè)末端組氨酸 和任選地緊鄰所述末端組氨酸的一個(gè)組氨酸；(3)距離另一個(gè)賴氨酸6至10個(gè)氨基酸殘基 以內(nèi)的一個(gè)賴氨酸；和(4)約6%的賴氨酸。“R印Iikin支架”還指一系列R印Iikin支架 的單個(gè)成員或多個(gè)成員。在桃拉綜合征病毒中，R印Iikin支架可指包括約16至約34個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選地 約27至約33個(gè)氨基酸殘基和更優(yōu)選地約30至33個(gè)氨基酸殘基的R印Iikin肽序列。在 流感病毒中，R印Iikin支架可指包括約16至約34個(gè)氨基酸殘基和更優(yōu)選地約28至30個(gè) 氨基酸殘基的R印Iikin肽序列。在白斑綜合征病毒中，R印Iikin支架可指包括約16至約 34個(gè)氨基酸殘基和更優(yōu)選地約27至29個(gè)氨基酸殘基的R印Iikin肽序列。如本文所用，蝦的“生命周期”基本上從蝦能用口進(jìn)食之時(shí)延伸直到蝦被收獲。如本文所用，“時(shí)間段”或“時(shí)間點(diǎn)”是可以彼此區(qū)分開(kāi)的任兩個(gè)時(shí)間段或點(diǎn)。例 如，2004年分離的病毒分離物在與2005年分離的相同病毒分離物的不同時(shí)間段被分離。同 樣地，2004年5月分離的病毒分離物在與2004年六月分離的相同病毒分離物的不同時(shí)間段 被分離。作為包括蝦在內(nèi)的無(wú)脊椎動(dòng)物中的治療化合物的R印Iikin序列本發(fā)明人已經(jīng)將水產(chǎn)養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體基因組中的R印Iikin序列(其 包括在桃拉綜合征病毒(TSV)基因組中的R印Iikin序列)鑒定為針對(duì)例如蝦、扇貝、牡蠣、 龍蝦等無(wú)脊椎動(dòng)物中病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物疾病的治療化合物。被鑒定的治療化合物激發(fā) 被病原體攻擊的無(wú)脊椎動(dòng)物的抵抗力，其中所述病原體例如是衣原體樣、立克次氏體樣、弧 菌、桃拉綜合征病毒、白斑綜合征病毒和其他病原體。被鑒定的序列是分離的或被合成的 由7至約50個(gè)氨基酸組成的R印Iikin肽，其包括R印Iikin模體，所述R印Iikin模體包括 (1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè)末端的至 少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基、(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基 處的第一個(gè)賴氨酸殘基、(3)至少一個(gè)組氨酸殘基和(4)至少6%的賴氨酸殘基，其中所述 分離的或被合成的肽是通過(guò)選擇被鑒定的模體以及分離或合成包括所述模體的所述肽而 被分離或合成的。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，R印Iikin肽由所述R印Iikin模體組成。技 術(shù)人員將理解如何使用上述方法分離和合成R印Iikin肽。可以使用生產(chǎn)已知結(jié)構(gòu)的肽的 任何方法。R印Iikin肽已經(jīng)與植物、動(dòng)物、細(xì)菌、病毒、惡性瘧原蟲和其他生物中的快速?gòu)?fù)制 相關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)序列號(hào)為7, 176，275和7，189，800的美國(guó)專利。R印Iikin還已經(jīng)與例如流 感、西尼羅河病毒、瘧疾、白斑綜合征病毒和桃拉綜合征病毒的病原體的毒力、發(fā)病率和死 亡率相關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)圖6-12。此外，迄今進(jìn)行的包括雞、兔、蝦和人的所有測(cè)試或研究都顯 示，R印Iikin序列是免疫原性的和/或激發(fā)抵抗力的，或二者。參見(jiàn)2006年2月16日提 交的序列號(hào)為11/355，120的美國(guó)申請(qǐng)(實(shí)施例6和7)、序列號(hào)為6，638，505的美國(guó)專利。 此外，病原體基因組中R印Iikin序列(或病原體基因組中特別感興趣的區(qū)域，其被稱為 R印Iikin峰基因)的濃度已經(jīng)與病原性爆發(fā)、發(fā)病率和死亡率相關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)圖3-12。特 別地，Replikin濃度已經(jīng)與桃拉綜合征病毒中無(wú)脊椎動(dòng)物(蝦)的死亡率以及桃拉綜合征 病毒和白斑綜合征病毒二者中無(wú)脊椎動(dòng)物(蝦)的病原性爆發(fā)相關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)圖3-6和10。R印Iikin序列已經(jīng)廣泛地與毒力、發(fā)病率和死亡率相關(guān)，并且一致地與馬、兔、雞、人和蝦的 免疫原性和抵抗力相關(guān)。這些大范圍的數(shù)據(jù)為含有R印Iikin序列的疫苗提供支持，其包括 對(duì)含有來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原體的Replikin序列的疫苗的支持。在水產(chǎn)養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體中鑒定的分離的或被合成的R印Iikin肽然后 被喂、被注射或以其他方式被施用于例如蝦、扇貝、牡蠣、龍蝦等無(wú)脊椎動(dòng)物，作為在病原體 疾病包括TSV或其他病原體疾病的預(yù)測(cè)爆發(fā)之前或在所述疾病的爆發(fā)之中對(duì)抗所述疾病 可能的爆發(fā)的預(yù)防藥。所述肽可被單獨(dú)地或與普通飼料或?yàn)榱藬y帶所述肽而配制的補(bǔ)充飼 料一起被施用于無(wú)脊椎動(dòng)物。技術(shù)人員將理解，可以使用配制飼料的任何方法，其中所述方 法經(jīng)口服為無(wú)脊椎動(dòng)物提供R印Iikin序列?？梢詫⒎€(wěn)定劑或防腐劑或兩者加入R印Iikin 序列的混合物或R印Iikin序列和無(wú)脊椎動(dòng)物飼料的混合物中以在一段時(shí)間內(nèi)維持治療有 效的定量喂食和治療所養(yǎng)殖的包括蝦、扇貝、牡蠣、蛤、蟹、鮑魚、龍蝦等的無(wú)脊椎動(dòng)物。技術(shù) 人員將理解對(duì)于使飼料和治療混合物中短肽穩(wěn)定的方法的廣泛選擇?？梢栽诟腥景l(fā)生之前或之后施用治療或亞治療水平的肽。還可對(duì)慢性感染的群體 進(jìn)行施用。在病原體基因組中被鑒定的或被鑒定為由病原體所表達(dá)的任何R印Iikin可作為 治療化合物被施用以激發(fā)蝦的抵抗力應(yīng)答。下面的示范性序列可作為對(duì)抗桃拉綜合征病 毒的疫苗單獨(dú)地或以任何組合被喂給蝦KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK(SEQ ID NO. 2)、KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5), KVPCEQKIffLH (SEQ IDNO. 6)、KIWLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQID NO. 8)、KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ IDNO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。與所有桃拉綜合征病毒Iteplikin序列一樣，包括如下所討論的R印Iikin序列和 R印Iikin支架序列的示范性序列可以被喂，或以浸入施用方法被使用，或被注射。所述序列 可被單獨(dú)地或以任何組合被施用，其中所述組合包括肽的等重組合。含有約7至約50個(gè)氨 基酸的任何R印Iikin序列或免疫原性序列可被用作施用于無(wú)脊椎動(dòng)物的化合物，包括用 作疫苗。例如，SEQ ID N0. 1-11、86、87、103-112和114-198中的每一個(gè)可被單獨(dú)地或以組 合被用作施用于無(wú)脊椎動(dòng)物以對(duì)抗TSV感染的化合物。病毒載量的減少和劑量響應(yīng)曲線免疫原性的或激發(fā)抵抗力的合成肽可以以每天每只受治療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克 體重約0. OOlmg至約IOmg合成肽的量、以每天每只受治療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克體重約 0. 005mg至約5mg合成肽的量、以每天每只受治療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克體重約0. Olmg至約 2mg合成肽的量、以每天每只受治療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克體重約0. 02mg至約1. 5mg合成肽 的量、以每天每只受治療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克體重約0. OSmg至約1. Omg合成肽的量、以每 天每只受治療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克體重約0. Img至約0. 9mg合成肽的量、以每天每只受治 療的無(wú)脊椎動(dòng)物的每克體重約0. 2mg至約0. Smg合成肽的量、以每天每只受治療的無(wú)脊椎 動(dòng)物的每克體重約0. 5mg合成肽的量施用于無(wú)脊椎動(dòng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如何確定 適合于治療或亞治療施用的合成肽劑量?，F(xiàn)在已經(jīng)在蝦中測(cè)試了含有等重肽的混合物的TSV疫苗劑量并顯示其提供保護(hù) 作用。已經(jīng)測(cè)試了下面的肽KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、 KAENEFffDGVKQSH(SEQID NO. 3)、KGHRKVPCEQK(SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ IDNO. 5)、KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6), KIffLHQNPGK (SEQ IDNO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8), KGNTRVHVK (SEQ IDNO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)和 HVEKIVDKAK (SEQ IDNO. 11)。在不 同實(shí)驗(yàn)中，所述疫苗以每天被測(cè)試蝦的每克體重大約0. 02,0. 08和0. 50mg Replikin疫苗 的量被施用。所述劑量是近似的，由于個(gè)體蝦消耗的個(gè)體差異。被重Ig至4g的蝦口服攝 取后，所有三種劑量水平都被很好地耐受，而且與未被接種的對(duì)照相比，所有都在蝦中產(chǎn)生 統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的較低的病毒載量。0. OSmg和0. 5mg劑量提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的保護(hù)。最低 的劑量0. 02mg在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之一中提供了未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的保護(hù)，然而如上面所證明， 觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的較低的病毒載量。每“克蝦”0. 50mg的劑量(迄今被測(cè)的最高劑量) 提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)上最顯著的保護(hù)91%。因此，從迄今的結(jié)果來(lái)看，每“克蝦”0. 50mg的劑量和 可能地更高一些，是本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選的實(shí)施方案。在約七天或更少時(shí)間以內(nèi)的疫苗生產(chǎn)本發(fā)明另一個(gè)非限制性的方面提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，其中至少一種R印Iikin 序列在病原體內(nèi)被鑒定而且所述至少一種R印Iikin序列作為疫苗的活性劑被化學(xué)合成。 本發(fā)明人已經(jīng)在從病原體被鑒定之時(shí)開(kāi)始七天或更少的時(shí)間內(nèi)成功地生產(chǎn)了這樣一種有 效的疫苗。一旦病原體被鑒定，其基因組就被確定。技術(shù)人員然后使用例如 ReplikinsForecast (Replikins LLC，波士頓，馬薩諸塞州)來(lái)調(diào)查基因組的R印Iikin序 列。一旦R印Iikin序列被鑒定，任何一個(gè)或多個(gè)R印Iikin序列被選作化學(xué)合成。優(yōu)選 的R印Iikin序列可以是在R印Iikin峰基因中鑒定的R印Iikin序列。被鑒定的至少一種 R印Iikin序列的化學(xué)合成是按本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣而進(jìn)行。所述合成肽然后被施用于病原體的宿主。疫苗的施用可以是口服，與食物源混合 用于口服食用，通過(guò)鰓，在濃縮的浸液中使疫苗通過(guò)鰓、皮膚、口等被吸收入體內(nèi)，通過(guò)注射 或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在和以后知道的任何其他方法。所述疫苗可與藥學(xué)上可接受的載 體、賦形劑、結(jié)合劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他有幫助的化合物、輔助劑、溶液或混合物 組合。所述方法可在七天或更少的時(shí)間內(nèi)完成，這是基于在病原體基因組中鑒定 R印Iikin序列的容易性和化學(xué)合成大量肽的容易性。在七天或更少的時(shí)間內(nèi)為疫苗提供有 效的活性成分的這個(gè)新方法解決了本領(lǐng)域一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，因?yàn)槟壳暗囊呙缟a(chǎn)方法通常需 要三至十二個(gè)月。疫苗生產(chǎn)的這種耽擱可能在流行病早已經(jīng)結(jié)束之后，或在流行病仍活躍 但病原體的變異已經(jīng)使疫苗不太有效或無(wú)效之后，才能供應(yīng)疫苗。疫苗開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)過(guò)程對(duì)于 衛(wèi)生專業(yè)人員和政府是很大的煩惱。本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)提供一種方法以大大地減少疫苗開(kāi) 發(fā)的耽擱。養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物的抵抗系的開(kāi)發(fā)本發(fā)明另一個(gè)非限制性的方面提供一種增加無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力的方 法，其包括(1)使用所述病原體攻擊與所述無(wú)脊椎動(dòng)物同種的多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物，所述病原體 的水平足以使所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體致?。?2)將患病的或死亡的所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體丟棄；(3)重復(fù)步驟(1)和⑵至少一次；并且
19
(4)至少一次地在步驟(1)、(2)和/或(3)中對(duì)所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物施用權(quán)利要 求1的物質(zhì)，其增加所述無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力。所述過(guò)程可被重復(fù)若干次，直至在養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物中觀察到期望水平的存活 率，包括100%存活率。養(yǎng)殖的有抵抗力的無(wú)脊椎動(dòng)物然后可被用作繁殖種以生產(chǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖 的無(wú)脊椎動(dòng)物的抵抗系。包括免疫原性肽的化合物可在每次重復(fù)步驟1和2時(shí)被施用，可 在第二次重復(fù)步驟1和2時(shí)被施用，或可在之后某次重復(fù)步驟1和2時(shí)被施用。如下面的 實(shí)施例3和圖2所證明，在對(duì)每克蝦體重施用約0. 5mg的包括i^一種等重的桃拉綜合征病 毒免疫原性肽的化合物之前被桃拉綜合征病毒慢性感染的蝦提供了 91 %的被TSV攻擊的 蝦的存活率。相比之下，只有25%的之前未被TSV攻擊且未被施用疫苗的蝦在攻擊中存活 了下來(lái)。進(jìn)一步地，75%的被TSV慢性感染且未被施用疫苗的蝦另外在攻擊中存活了下來(lái)。實(shí)施例3和圖2中報(bào)告的試驗(yàn)證明，與疫苗處理結(jié)合的耐受抵抗力迄今已經(jīng)提供 了所觀察到的針對(duì)TSV攻擊的最高度保護(hù)。像這樣，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種提高抵 抗力的方法，其使用所選病原體對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的周期攻擊并與疫苗的施用相結(jié)合。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗的至少一種分離的或合成的肽是R印Iikin肽。R印Iikin肽已 被證明激發(fā)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中的免疫原性和/或抵抗力應(yīng)答。例如，針對(duì)SARS的 Replikin序列和H5W流感病毒R印Iikin支架的疫苗產(chǎn)品已經(jīng)被證明，參見(jiàn)例如2006年2 月16日提交的序列號(hào)為11/355，120的美國(guó)申請(qǐng)(實(shí)施例6和7)，所有在兔或雞上測(cè)試的 Replikin序列誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，而且神經(jīng)膠質(zhì)瘤R印Iikin序列已經(jīng)在癌細(xì)胞中被鑒定且 被分離或合成為肽，其中所述肽在兔中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并與人的天然抗體應(yīng)答發(fā)生反應(yīng)。參 見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，638，505。Replikin結(jié)構(gòu)的保守性與毒力和致死性相關(guān)任何結(jié)構(gòu)的保守性對(duì)于此結(jié)構(gòu)是否提供用來(lái)攻擊和破壞或刺激的穩(wěn)定不變的靶 來(lái)說(shuō)是重要的。已經(jīng)顯示，R印Iikin序列通常是保守的。當(dāng)一個(gè)結(jié)構(gòu)被以某種方式與該生 物體的基本生存機(jī)制相關(guān)聯(lián)時(shí)，所述結(jié)構(gòu)往往是保守的。變化的結(jié)構(gòu)提供不恒定的靶，這是 避免襲擊者的好策略，其中所述襲擊者例如針對(duì)先前結(jié)構(gòu)專門生成的并因此對(duì)修改形式無(wú) 效的抗體。此策略被流感病毒所用，例如，以致先前疫苗在應(yīng)對(duì)當(dāng)前有毒性的病毒時(shí)可能是 非常無(wú)效的。然而，與存活功能太緊密聯(lián)系的特定結(jié)構(gòu)顯然不能經(jīng)常改變。R印Iikin結(jié)構(gòu)的一 個(gè)必需成分是組氨酸(h)，已知其經(jīng)常與氧化還原酶中的金屬基團(tuán)結(jié)合并且是復(fù)制所需的 能量的可能來(lái)源。因?yàn)榻M氨酸結(jié)構(gòu)保持不變，Replikin序列結(jié)構(gòu)更保持為用于破壞或刺激 的靶具有吸引力。此外，如下面表1和2中所證明，R印Iikin結(jié)構(gòu)在有毒性的病原體中通 常是保守的，其中所述病原體包括無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體。鑒于R印Iikin結(jié)構(gòu)在無(wú)脊椎動(dòng)物病原體中的保守性，本發(fā)明的一個(gè)方面提供針 對(duì)至少一種分離的或被合成的R印Iikin序列的抗體或抗體片段或抗R印Iikin的小分子， 其中所述分離的或被合成的R印Iikin序列是在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的蛋白或蛋白片段中或 在R印Iikin峰基因中或在包括水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的R印Iikin峰基因的蛋白或基因區(qū)域中。 Replikin的抗體和抗R印Iikin的小分子作為針對(duì)病原體爆發(fā)的療法是有用的。在鑒定病 原體中的R印Iikin序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道很多為了治療和診斷的目的而開(kāi)發(fā)抗體 或抗體片段的途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣知道如何生產(chǎn)用來(lái)結(jié)合被鑒定的R印Iikin序列的小分子。作為治療靶和預(yù)示器的R印Iikin支架本發(fā)明人已經(jīng)在流感、白斑綜合征病毒和桃拉綜合征病毒的種株中證實(shí)， Replikin支架的存在預(yù)示了流行病。像這樣，除了病毒中R印Iikin的總數(shù)外，跨越時(shí)間 的每個(gè)R印Iikin的結(jié)構(gòu)是富含信息的，而且R印Iikin支架提供用來(lái)鑒定和控制快速?gòu)?fù)制 的特別有用的靶，其中所述快速?gòu)?fù)制包括病原體疾病在水產(chǎn)養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物包括蝦中的 爆發(fā)。下面的表1顯示1917年在被流感感染的鵝中第一次觀察到的R印Iikin支架(鵝 Replikin)。幾十年來(lái)，恒定的長(zhǎng)度、恒定的氨基末端的賴氨酸和羧基末端的組氨酸殘基在 不同種株中在固定的支架中是保守的。鵝R印Iikin的同系物從1917年直至2006年在包 括對(duì)1918年、1957年和1968年三次大流行負(fù)責(zé)的每個(gè)種株HlNl、H2N2和H3N2的種株中 出現(xiàn)。含有其他取代的同系物也在H1N2、H7N7、H5N2和H5m中被觀察到。ΜΛ 在與快速?gòu)?fù)制相關(guān)的流感病毒R印Iikin肽的89年的保守性中顯示有序取 代的R印Iikin支架，從1917年鵝流感的R印Iikin和1918年人類大流行的R印Iikin到 2006年H5N1 “禽流感”的同系物。(SEQ ID NO. 12-74，分別地，按出現(xiàn)順序)
年份
2 9個(gè)氨基酸
kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkg圓sypklsksyjnnkgkevlvlwgvhh
kk^sypklsk、sy^nnkgkevlvlwgvhh kkg^sypkl^s y^nnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkg_sypklsksytnnkgkevlv||wgvhh kkg^sypklsksytnnkgkevlvilwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kk^sypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkg^sypklsksytnnkgkevlv_wgvhh
1917
1918
1930 1933
1976
1977
1979
1980
1980
1981 1981 1985 1991
種林
H1N_ 流感鵝 Replikin HlNl人流感大流行
HlNl HONl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl
2權(quán)利要求
一種用于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中提高無(wú)脊椎動(dòng)物的抵抗力的物質(zhì)，其包括至少一種分離的或合成的肽，所述至少一種分離的或合成的肽是來(lái)自所述無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體的至少一種肽的至少一種分離的或合成的形式，其中所述至少一種分離的或合成的肽是由7至約50個(gè)氨基酸組成的至少一種分離的或合成的Replikin肽，其包括一個(gè)Replikin模體，其中所述Replikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物是甲殼綱動(dòng)物。
3.如權(quán)利要求2所述的物質(zhì)，其中所述甲殼綱動(dòng)物是蝦。
4.如權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其中所述至少一種分離的或合成的肽是合成的。
5.如權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其中所述至少一種分離的或合成的R印Iikin肽由所述 R印Iikin模體組成。
6.如權(quán)利要求5所述的物質(zhì)，其中所述R印Iikin模體由7至約10個(gè)、約10至約15個(gè) 氨基酸、約15至約20個(gè)氨基酸、約20至約25個(gè)氨基酸、約25至約30個(gè)氨基酸、約30至 約35個(gè)氨基酸、約35至約40個(gè)氨基酸、約40至約45個(gè)氨基酸或約45至約50個(gè)氨基酸 組成。
7.如權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其中所述至少一種分離的或合成的R印Iikin肽 包括下述中的至少一種:KVGSRRYKSH (SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、 KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5)、 KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6), KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、 KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ ID NO. 10)和 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。
8.如權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)包括分離的或合成的R印likir^t KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK(SEQID NO. 2),KAENEFffDGVKQSH(SEQ ID NO. 3)、 KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5), KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6)、 KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、 KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)和 HVEKIVDKAK (SEQ ID NO. 11)中兩種或多種的混合物。
9.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的物質(zhì)。
10.一種疫苗，其包括權(quán)利要求6所述的物質(zhì)。
11.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其還包括藥學(xué)上可接受的載體。
12.如權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗提供針對(duì)甲殼綱動(dòng)物中至少一種病原體 的保護(hù)。
13.如權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗提供針對(duì)蝦中至少一種病原體的保護(hù)。
14.如權(quán)利要求13所述的疫苗，其中所述病原體是病毒。
15.如權(quán)利要求14所述的疫苗，其中所述病原體是桃拉綜合征病毒。
16.如權(quán)利要求13所述的疫苗，其中所述疫苗與蝦飼料混合。
17.如權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗與每日定量的蝦飼料混合。
18.如權(quán)利要求15所述的疫苗，其中所述至少一種分離的或合成的肽是 KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ IDNO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK(SEQID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ IDNO. 6)、 KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、 KEHVEKIVDK(SEQ IDNO. 10)和 / 或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。
19.如權(quán)利要求18所述的疫苗，其包括分離的或合成的肽KVGSRRYKSH(SEQID NO. 1)、 HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ ID NO. 6),KIffLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)禾口 HVEKIVDKAK (SEQ ID NO. 11)中兩種或多種的混合物。
20.如權(quán)利要求19所述的疫苗，其包括分離的或合成的肽KVGSRRYKSH(SEQID NO. 1)、 HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5)、KVPCEQKIWIH(SEQ ID NO. 6) ,KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)禾口 HVEKIVDKAK (SEQ ID NO. 11)的混合物。
21.如權(quán)利要求20所述的疫苗，其包括所述分離的或合成的肽中每種的等重混合物。
22.如權(quán)利要求20所述的疫苗，其中將所述物質(zhì)以每天每只蝦的每克體重約0.Olmg至 約2mg疫苗的劑量施用于蝦。
23.如權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述劑量是每天每只蝦的每克體重約0.2mg至 1. Omg疫苗。
24.如權(quán)利要求23所述的疫苗，其中所述劑量是每天每只蝦的每克體重約0.5mg疫苗。
25.如權(quán)利要求15所述的疫苗，其中所述至少一種分離的或合成的R印Iikin肽是存在 于新出現(xiàn)的桃拉綜合征病毒種株中的至少一種R印Iikin肽的至少一種分離的或合成的形式。
26.如權(quán)利要求15所述的疫苗，其中將所述疫苗作為預(yù)防性療法在桃拉綜合征病毒的 癥狀發(fā)作前施用于蝦。
27.如權(quán)利要求15所述的疫苗，其中將所述疫苗作為療法在桃拉綜合征病毒的癥狀發(fā) 作后施用于蝦。
28.如權(quán)利要求15所述的疫苗，其中將所述疫苗作為預(yù)防性療法以亞治療濃度施用于蝦。
29.如權(quán)利要求28所述的疫苗，其中在至少一只蝦的基本上全部的生命周期中施用所 述疫苗。
30.一種在無(wú)脊椎動(dòng)物中提供對(duì)病原體的抵抗力的方法，其包括對(duì)所述無(wú)脊椎動(dòng)物施 用權(quán)利要求1的物質(zhì)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述物質(zhì)被通過(guò)口服、通過(guò)將所述無(wú)脊椎動(dòng)物浸 沒(méi)在含有所述物質(zhì)的水介質(zhì)中或通過(guò)注射施用。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述物質(zhì)被口服施用。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物是甲殼綱動(dòng)物。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述甲殼綱動(dòng)物是蝦。
35.一種由7至約50個(gè)氨基酸組成的分離的或合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin肽，其 中所述R印Iikin肽包括R印Iikin模體，所述Mplikin模體包括(1)位于所述模體的第一個(gè)末端的至少一個(gè)賴氨酸殘基和位于所述模體的第二個(gè)末端 的至少一個(gè)賴氨酸殘基或至少一個(gè)組氨酸殘基；(2)位于距離第二個(gè)賴氨酸殘基六至十個(gè)殘基處的至少一個(gè)賴氨酸殘基；(3)至少一個(gè)組氨酸殘基；和(4)至少百分之六的賴氨酸殘基。
36.如權(quán)利要求35所述的分離的或合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin肽，其中所述 Replikin肽由所述R印Iikin模體組成。
37.一種分離的或合成的核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求35的桃拉綜合征病毒R印Iikin肽。
38.一種由約16至約34個(gè)氨基酸組成的分離的或合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin支 架肽，其包括(1) 一個(gè)末端賴氨酸和任選地緊鄰所述末端賴氨酸的一個(gè)賴氨酸；(2) —個(gè) 末端組氨酸和任選地緊鄰所述末端組氨酸的一個(gè)組氨酸；(3)距離另一個(gè)賴氨酸約6至約 10個(gè)氨基酸以內(nèi)的一個(gè)賴氨酸；和(4)至少6%的賴氨酸。
39.如權(quán)利要求38所述的分離的或合成的桃拉綜合征病毒R印Iikin支架肽，其中所述 肽由28至33個(gè)氨基酸組成。
40.如權(quán)利要求39所述的肽，其包括KKVQANKTRVFAASNQGLALALRRYYLSFLDH(SEQ ID NO. 197)或KKACRNAGYKEACLHELDCKSFLL AQQGRAGAH(SEQ ID NO. 198)。
41.一種增加無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力的方法，其包括(1)使用所述病原體攻擊與所述無(wú)脊椎動(dòng)物同種的多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物，所述病原體的水 平足以使所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體致??；(2)將患病的或死亡的所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體丟棄；(3)重復(fù)步驟1和2至少一次；并且(4)至少一次地在步驟⑴、(2)和/或(3)中對(duì)所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物施用權(quán)利要求1 的物質(zhì)，其增加所述無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)所述病原體的抵抗力。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中步驟(4)通過(guò)至少一次地在步驟(1)、(2)和/或 (3)中對(duì)所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物施用權(quán)利要求7的物質(zhì)而進(jìn)行。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物是蝦。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病原體是桃拉綜合征病毒。
45.一種生產(chǎn)疫苗的方法，其包括(1)從能夠在水介質(zhì)中養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體 中鑒定至少一種R印Iikin序列，和(2)化學(xué)合成至少一種被鑒定的R印Iikin序列作為所 述疫苗的活性劑。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中從在所述病原體內(nèi)所述至少一種R印Iikin序列被 鑒定時(shí)起的七天或更少的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)所述疫苗。
47.動(dòng)物飼料，其包括權(quán)利要求1的物質(zhì)。
48.動(dòng)物飼料，其包括蝦生產(chǎn)Rangen35麥芽漿、1 %的海藻酸鈉、1 %的六偏磷酸鈉 和至少一種合成的R印Iikin肽，所述合成的R印Iikin肽是KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ IDNO. 6)、KIWLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK(SEQID NO. 8)、KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ IDNO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。
49.用權(quán)利要求13的疫苗處理的蝦。
50.如權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物是蛤、貽貝、扇貝、牡蠣、其他軟體 動(dòng)物、螯蝦或龍蝦。
51.如權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗提供針對(duì)于蛤、貽貝、扇貝、牡蠣、其他軟 體動(dòng)物、螯蝦或龍蝦的至少一種病原體的保護(hù)。
52.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物是蛤、貽貝、扇貝、牡蠣、其他軟體 動(dòng)物、螯蝦或龍蝦。
53.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物是蛤、貽貝、扇貝、牡蠣、其他軟體 動(dòng)物、螯蝦或龍蝦。
54.一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的物質(zhì)，其包括含有約7至約50個(gè)氨基酸的至少一種合成肽，其 中當(dāng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中所述至少一種合成肽被施用于至少一種無(wú)脊椎動(dòng)物時(shí)增加所述至少一 種無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)至少一種病原體的抵抗力。
55.一種疫苗，其包括權(quán)利要求54所述的物質(zhì)。
56.一種增加無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力的方法，其包括(1)使用所述病原體攻擊與所述無(wú)脊椎動(dòng)物同種的多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物，所述病原體的水 平足以使所述無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體致?。?2)將患病的或死亡的所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物的至少一個(gè)個(gè)體丟棄；(3)重復(fù)步驟(1)和(2)至少一次；并且(4)至少一次地在步驟(1)、(2)和/或(3)中對(duì)所述多個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物施用權(quán)利要求54 的物質(zhì)，其增加所述無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力。
全文摘要
本發(fā)明提供在水產(chǎn)養(yǎng)殖的無(wú)脊椎動(dòng)物的病原體基因組中鑒定的含有約7至約50個(gè)氨基酸的分離的或被合成的肽，其用來(lái)預(yù)防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖中這些病原體的爆發(fā)，以及使用被鑒定的肽預(yù)防和治療病原體爆發(fā)的方法。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101969993SQ200880018241
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者埃倫諾爾·S·博戈奇, 塞繆爾·博戈奇, 塞繆爾·溫斯頓·博戈奇, 安妮·埃倫諾爾·博桑伊 申請(qǐng)人:塞繆爾·博戈奇;埃倫諾爾·S·博戈奇;塞繆爾·溫斯頓·博戈奇;安妮·埃倫諾爾·博桑伊