專利名稱：用于治療黑素瘤的細胞系、含有它們的組合物、制備所述組合物的方法以及治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療黑素瘤的細胞系、含有它們的組合物、制備所述組合物的方 法以及治療方法。更特別地，本發(fā)明涉及用于治療惡性疾病的多種人黑素瘤細胞系，其中 所述細胞系為(a)Mel-XYl (2007年3月23日以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Inhoffenstra^ e 7 B 38124 Braunschweig, Germany), (b)Mel_XY2(2007 年 3 月 23日以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstra旦 e 7 B38124 Braunschweig, Germany)，(c)Mel_XY3 (2007 年 3 月 23 日以保藏號 DSM ACC2832 保藏 于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstra^ e 7 B 38124 Braunschweig, Germany), (d) Mel-XX4 (2007年3月23日以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物 保藏中心 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Inhoffenstra^ e 7 B 38124 Braunschweig,Germany)，或(e)上述細胞系的亞群?？蓪λ?述細胞系進行照射，從而獲得上述細胞系的凋亡表型群和壞死表型群。所述組合物可以含 有佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑和/或自體樹突細胞。
背景技術(shù)：
目前已進行了許多努力并利用許多資源進行癌癥免疫治療領(lǐng)域的研究。已有重要 證據(jù)指出了 T淋巴細胞在對癌癥有效的免疫應答中的中心作用(Oliver RT, Nouri AM. T ； Cancer Surv 1992 ；13 173-204)。為此，已經(jīng)使用單獨的、帶有佐劑的或與一些細胞因子組 合的同種異體細胞進行治療。另一方面，為人們所知的是，由于其刺激幼稚T淋巴細胞的非凡能力，樹突細胞 (DC)是可起始T細胞應答的抗原呈遞細胞(Schuler G, Steinman RM. J Exp. Med 1997 ； 186 :1183-7，禾口 Banchereau J, Steinman RM. Nature 1998 ；392 :245_52)。已經(jīng)有人在小鼠模型和人體中顯示DC結(jié)合凋亡細胞，從而呈遞產(chǎn)生I類HLA 復合物/肽的抗原，誘導細胞毒T淋巴細胞(Albert ML, Pearce SF，F(xiàn)rancisco LM， Sauter B, Roy P, Silverstein RL, Bhardwaj N.J Exp Med. 1998,188 1359-1368 ；Chen Z, Moyana T, Saxena A, Warrington R, Jia Z, Xiang J. Int J Cancer. 2001,93 :539_548 禾口 Shaif-Muthana M, Mclntyre C, Sisley K, Rennie I, Murray A. CancerRes. 2000,60 6441-6447)。為此，很重要的是凋亡細胞誘導樹突細胞(DC)的成熟，但是許多人報導，人 凋亡細胞不使DC成熟或者誘導這些DC喪失成熟(Pietra G, Mortarini R, Parmiani G， Anichini A. Cancer Res 2001,618218-8226 ；Labarriere N, Bretaudeau L, GervoisN, Bodinier M,Bougras G,Diez E,Lang F,Gregoire M,Jotereau F. IntJ Cancer 2002,101 280—286禾PDemaria S,Santori FR,Ng B,Liebes L,Formenti SC,Vukmanovic S.J Leukoc
7BiOl. 2005,77 :361_368)。Pardoll等的美國專利6，187，306公開了治療和預防黑素瘤的方法，所述方法包 括使用表達黑素瘤免疫顯性抗原的至少一種或多種同種異體細胞系(其中所述細胞系經(jīng) 過改造以使它表達細胞因子)，并對患黑素瘤或有患病風險的患者施用這些轉(zhuǎn)化細胞系。盡 管所用的表達多數(shù)免疫顯性抗原的一種或多種細胞系非常重要，但表達多數(shù)此類抗原的新 細胞系或細胞系組合并未公開。該發(fā)明包含表達細胞因子(如GM-CSF)的經(jīng)實質(zhì)性轉(zhuǎn)化的 細胞系。美國專利5，882，654和美國專利5，840，317公開了用作同種異體疫苗的經(jīng)照射的 黑素瘤細胞系。所公開的療法達到NED患者低于50% (16/37)的水平，并表現(xiàn)出有效的體 液型抗腫瘤活性。Wallack等的美國專利2006/0034811公開了含有抗原呈遞細胞的疫苗，所述抗 原呈遞細胞帶有溶解或破裂的腫瘤細胞(包括胞質(zhì)溶膠和膜)。腫瘤細胞可以是來源于 患者的細胞、細胞系或經(jīng)編碼IL-2的重組痘苗病毒感染的細胞。Palucka等的美國專利 2006/0140983公開了在癌癥患者中誘導免疫的組合物，其包括分離和純化經(jīng)激發(fā)而展示一 種或多種熱休克蛋白和死亡腫瘤細胞的抗原呈遞細胞。抗原呈遞細胞是樹突細胞，腫瘤細 胞可以是自體或同種異體細胞(如細胞系)。該文件公開了需要通過加熱腫瘤細胞使其破 裂而結(jié)合熱休克蛋白。顯示的測定結(jié)果不能必然揭示該組合物在黑素瘤患者中具有免疫誘 導活性。Albert等的美國專利6，602，709公開了使用凋亡細胞來將抗原呈遞至樹突細胞， 以用于T細胞誘導。所述方法可用于誘導抗原特異性的細胞毒T淋巴細胞輔助細胞。樹突 細胞由凋亡細胞或其片段激發(fā)，能夠加工抗原并呈遞加工后的抗原，并誘導可用作治療疫 苗的細胞毒T淋巴細胞的活性。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供幾個用于治療惡性疾病的人黑素瘤細胞系，其中所述細胞系 為(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、 (b)Mel-XY2(以保藏號DSMACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c) Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(d) Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)或(e)上 述細胞系的亞群?？蓪λ黾毎颠M一步進行照射，以獲得具有凋亡表型的類群和具有該 細胞系壞死表型的類群。本發(fā)明另一方面提供用于治療黑素瘤的組合物，其中所述組合物含有至少一種同 種異體黑素瘤細胞系，例如(a)Mel-XYl (以保藏號DSMACC2830保藏于德國微生物和細胞培 養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng) 物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物 保藏中心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏號DSMACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏 中心DSMZ)或其組合，其中這些細胞系不能增殖。所述組合物還可含有賦形劑、佐劑(如 BCG)和免疫調(diào)節(jié)劑(如GM-CSF或IFN-a )。在一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物包含以下 四種同種異體黑素瘤細胞系之間的組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國 微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2 (以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3 (以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物 和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中這些細胞系經(jīng)過照射且不能增殖。在另一優(yōu)選實施方案 中，本發(fā)明的組合物包含以下三種同種異體黑素瘤細胞系之間的組合(a)Mel_XYl(以保 藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel_XY2 (以保藏 號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(c)Mel_XY3 (以保藏號 DSMACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中這些細胞系經(jīng)過照射且 不能增殖。本發(fā)明另一方面提供用于輔助治療黑素瘤的組合物，其中所述組合物包含至少一 種同種異體黑素瘤細胞系，例如(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物 和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細 胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏號DSMACC2829保藏于德國微生物和細胞 培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)及其組合，其中這些細胞系經(jīng)過照射且不能增殖。所述組合物還 可以包含賦形劑、佐劑(如BCG)和免疫調(diào)節(jié)劑(如GM-CSF和/或IFN- a )。在一個優(yōu)選 實施方案中，本發(fā)明組合物包含以下同種異體黑素瘤細胞系之間的組合(a)Mel_XYl(以 保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel_XY2(以保 藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏 號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)或(d)Mel_XX4(以保藏 號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中這些細胞系經(jīng)過照 射且不能增殖。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含以下同種異體黑素瘤細胞系 之間的組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)或(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)，其中這些細胞系經(jīng)過照射且不能增殖。本發(fā)明另一方面提供用于治療人黑素瘤的組合物，所述組合物包含成熟的自體 樹突細胞、載有來自至少一種同種異體人黑素瘤細胞系之細胞的自體樹突細胞、這些至少 一種異源人黑素瘤細胞系的凋亡細胞。所述人黑素瘤細胞系是以下細胞系的一種或多種 (a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，(b) Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，(c) Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，(d) Mel-XX4 (以保藏號DSMACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，或(e)其 亞群。本發(fā)明另一方面提供用于輔助治療人黑素瘤的組合物，所述組合物包含成熟樹 突細胞、載有至少一種同種異體人黑素瘤細胞系之細胞的樹突細胞、一種異源人黑素瘤細 胞系的凋亡細胞和一種異源人黑素瘤細胞系的壞死細胞。所述黑素瘤細胞系是以下細胞 系的一種或多種(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保 藏中心DSMZ)，(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏 中心DSMZ)，(c)Mel-XY3(以保藏號DSMACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中
9心DSMZ)，(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)，或其亞群。本發(fā)明另一方面提供制備前述組合物的方法，其中該方法通過以下步驟進行a)解凍并培養(yǎng)細胞系(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細 胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2 (以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培 養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng) 物保藏中心DSMZ)；b)混合這三種細胞系；c)照射這三種細胞系；d)向細胞系混合物中加入佐劑和賦形劑。所述方法還可以包括在步驟a)中加入 細胞系Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)。本發(fā)明的另一目的提供制備前述組合物的方法，其包括以下步驟a)解凍并培養(yǎng)細胞系(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細 胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2 (以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培 養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3 (以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物 保藏中心DSMZ)和Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏 中心DSMZ)；b)混合上述細胞系；c)照射上述細胞系；d)獲得自體樹突細胞；和e)將所述自體樹突細胞與步驟c)中經(jīng)照射的細胞系共培養(yǎng)一段時間。本發(fā)明另一方面提供在患黑素瘤的患者中誘導抗腫瘤免疫應答的方法，所述方 法包括向有此需要的患者施用有效量的以下細胞系之間的組合(a)Mel_XYl(以保藏號 DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel_XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(c)Mel_XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中這些細胞系不能增殖?？梢?與佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑一起施用。本發(fā)明另一方面提供在患黑素瘤的患者中誘導抗腫瘤免疫應答的方法，所述方 法包括向有此需要的患者施用有效量的以下細胞系之間的組合(a)Mel-XYl (以保藏號 DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel_XY2 (以保藏號 DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel_XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(d)Mel_XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中這些細胞系不能增殖。本發(fā)明另一方面提供在患黑素瘤的患者中誘導抗腫瘤免疫應答的方法，所述方法 包括向有此需要的患者施用有效量的6至72小時之間的共同培養(yǎng)物，所述共同培養(yǎng)物包含 自體樹突細胞和以下細胞系之間的組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微 生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2 (以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物 和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3 (以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細 胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中這些細胞系不能增殖。


圖1顯示以凋亡誘導和壞死為參考進行的本發(fā)明細胞系混合物、照射結(jié)果的代 表性實施例(Apo-Nec細胞)。A圖顯示未經(jīng)照射的細胞，B圖顯示、照射70Gy后的細胞， 用膜聯(lián)蛋白V(Anexin V)-FITC和IP(碘化丙錠)染色。早期凋亡細胞定義為膜聯(lián)蛋白 V-FITC+/IP—，而壞死細胞為雙陽性。圖2顯示用本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物治療的患者的Kaplan-Meier圖。圖3顯示應答于DC所呈遞的自體腫瘤細胞的體外淋巴細胞增殖。結(jié)果顯示為一 式三份實驗的平均值士標準差cpm(每分鐘計數(shù)值)。孵育結(jié)合植物凝集素(PHA)高于 7X104cpm的淋巴細胞作為陽性對照。圖4顯示對抗原Melan A/MART-1和gplOO的四聚體染色。A欄顯示來源于參與檢 測的HLA-A女0201患者的PBMN樣品所獲得的結(jié)果。女ND表示由于施用后樣品中⑶8+T 細胞量不足而導致未測定。B圖顯示⑶8+HLA T淋巴細胞/四聚體肽+在來源于2號患者 的PBMC中提高。數(shù)值代表⑶8+HLA/四聚體肽+的百分比。對來源于健康供體的HLA-A * 0201PBMC進行染色，作為對照。圖5顯示對本發(fā)明Apo-Nec細胞中IL-10和IL-12的胞質(zhì)內(nèi)測量。A圖顯示來自 DCin的FACS結(jié)果，B圖顯示來自DC/Apo-Nec細胞的FACS結(jié)果。圖6顯示抗原HMB45和Mart_l在細胞系Mel_XYl和此細胞系衍生克隆中的表達。 上方三個圖對應于細胞系，下方三個圖對應于克隆。第1列對應于細胞系和對照克??；第2 列分別對應于細胞系HMB45表達和克??；第3列對應于細胞系Mart-1表達和克隆。圖7顯示來自第100號患者的黑素瘤活檢。A圖顯示低放大倍數(shù)圖像(25X)，其 中可看到Ag gplOO陽性和陰性腫瘤細胞；B圖顯示gplOO的異質(zhì)表達，其中可看到高、中和 零表達的細胞(400X) ；C圖顯示AgMART-1的異質(zhì)表達，其中可看到被陰性細胞環(huán)繞的高表 達細胞克隆(400X)。圖8顯示用本發(fā)明Apo-Nec組合物治療的患者的Kaplan-Meier圖。圖9顯示從第200號患者中切除的皮膚轉(zhuǎn)移癌，該患者除GM_CSF、BCG以外還用本 發(fā)明Apo-Nec組合物進行治療。A圖顯示在腫瘤壞死區(qū)域(1)、與腫瘤細胞接觸的淋巴細胞 浸潤區(qū)域⑵和活腫瘤區(qū)域⑶的巨噬細胞。B圖是強腫瘤浸潤區(qū)域的100X細節(jié)圖，C圖 是相同區(qū)域的400X細節(jié)圖(其中觀察到浸潤的淋巴細胞)，D圖顯示相同轉(zhuǎn)移癌的細節(jié)圖 (其大部分是壞死的，具有載有黑色素的巨噬細胞(1)和活區(qū)域(2)，25X)。圖10顯示來自用本發(fā)明Apo-Nec組合物和BCG治療的第300號患者的計算機化軸 向斷層攝影圖。A圖用箭頭顯示肺轉(zhuǎn)移的位置，B圖顯示5個月后拍攝的軸向斷層攝影圖。發(fā)明詳述在本申請中，術(shù)語“組合”和“混合物”可以互換。當在本發(fā)明中提到改變哺乳動物免疫系統(tǒng)的組合物時，應當理解的是，這些組合 物在本領(lǐng)域中也稱為疫苗組合物、基于細胞的疫苗或簡單地稱為疫苗。本發(fā)明的四種細胞系根據(jù)布達佩斯條約于2007年3月23日以以下保藏號保藏 于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ :Mel-XYlDSM ACC2830細胞系、Mel_XY2 DSMACC2831 細胞系、Mel-XY3DSM ACC2832 細胞系和 Mel_XX4 DSM ACC2829 細胞系。細胞系表征測定的結(jié)果示于下表表1 本發(fā)明的人黑素瘤腫瘤細胞標記 從Mel-XYl細胞系的表征中可以看出，細胞在大小和形狀方面作為異質(zhì)的無黑色 素細胞單層而生長(其中大部分形狀為方形或長形)，且沒有延伸。它們在高密度下輕微黑 素化。Mel-XYl細胞在半固體瓊脂中形成大量集落。Mel-XYl細胞在無胸腺鼠(裸鼠)中 是致瘤的，且不發(fā)生轉(zhuǎn)移。從Mel_XY2細胞系的表征中可以看出，細胞在大小上作為異質(zhì)的無黑素細胞單層 生長。該細胞尺寸小，數(shù)量較少，多核且有明顯核仁。還觀察到黑素瘤中特征性樹枝狀延伸 的細胞。在高密度下生長時，它們可以堆積起來并發(fā)育成微腫瘤。Mel-XY2細胞在無胸腺鼠 (裸鼠)中是致瘤的，且不發(fā)生轉(zhuǎn)移。從Mel_XY3細胞系的表征中可以看出，細胞以單層生長。細胞是均勻的、小的且部 分圓形的。在高密度下生長時，它們可以堆積起來并發(fā)育成微腫瘤。Mel-XY3細胞在半固體 瓊脂中形成大量集落。Mel-XY3細胞在無胸腺鼠(裸鼠)中是致瘤的，且不發(fā)生轉(zhuǎn)移。從Mel_XY4細胞系的表征中可以看出，該細胞系在高密度下以紡錘狀單層生長。 在低密度下，它表現(xiàn)出類似于黑素細胞的樹枝狀突出。細胞是黑素化的，且其中一些含有多 個具有明顯核仁的細胞核。群倍增時間為172-173小時，它們在軟瓊脂測定中形成集落。當本發(fā)明Mel_XX4細胞系移植到裸鼠(免疫抑制的)中時，在體內(nèi)產(chǎn)生了腫瘤細 胞系。從原始腫瘤的連續(xù)傳代證明，100%的被移植動物在第一個月中發(fā)生腫瘤。腫瘤生長 緩慢，在第84天達到的平均值為372士63mm3。當以3X 106個細胞的量皮下注射時，本發(fā)明 細胞系Mel-XX4是致瘤的。從對模式染色體數(shù)目的分析中，觀察到下列情況本發(fā)明Mel-XYl細胞系在染色 體計數(shù)中表現(xiàn)為有差異的(在105和110之間)，因而并未得到明確的眾數(shù)(modal number) (男性)。本發(fā)明Mel-XY2細胞系表現(xiàn)出染色體數(shù)目為89和91的雙峰趨勢(男性)。本發(fā) 明Mel-XY3細胞系表現(xiàn)出的眾數(shù)為(男性)。數(shù)目最多的改變是第2對和第6對染色體缺 失和第20對和第22對的額外染色體。本發(fā)明Mel-XY4細胞系表現(xiàn)出眾數(shù)為57-58個(女 性)。對Y照射誘導本發(fā)明細胞系的凋亡進行研究。采用50Gy的射線足以完全抑制本 發(fā)明每種細胞系在軟瓊脂中的克隆發(fā)生能力。當用70或lOOGy照射細胞時，在凋亡/壞死 誘導程度方面未觀測到顯著差異。圖1A顯示，未照射的黑素瘤細胞含有6-9%的早期凋亡 細胞，其特征為為膜聯(lián)蛋白-V+/IP—著色(右下方)。以70Gy照射并培養(yǎng)72小時以后，獲得
1345-53%的早期凋亡細胞(見圖1B，右下方)。膜聯(lián)蛋白-V和IP染色的壞死細胞由未照射 細胞中的7. 5%提高到經(jīng)照射細胞中的約15% (左上方)。因而，在本專利申請中，本發(fā)明 的經(jīng)照射黑素瘤細胞被稱作Apo-Nec細胞，含有一種或多種任意Apo-Nec細胞系(Mel-XYl、 Mel_XY2、Mel_XY3和/或Mel_XX4)的組合物被稱為Apo-Nec組合物。細胞照射使得能夠獲得無增殖能力的細胞，可用于生產(chǎn)組合物，例如本發(fā)明 Apo-Nec組合物。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說很明顯的是，本發(fā)明的Apo-Nec組合物可以包含 本發(fā)明的任一細胞系或它們的不同組合。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明Apo-Nec組合物 包含Mel-XYl、Mel-XY2和Mel_XY3細胞系的混合物或組合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā) 明Apo-Nec組合物包含Mel-XYl、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel_XX4細胞系的混合物或組合。本 發(fā)明優(yōu)選Apo-Nec細胞系的混合物提供了誘導優(yōu)異的抗腫瘤免疫應答的多種抗原的組合。令人驚訝的是，當用本發(fā)明Apo-Nec組合物進行治療時，由本發(fā)明的四種Apo-Nec 細胞系混合物所呈遞的腫瘤抗原組合誘導針對腫瘤的特異性T細胞免疫應答，并使多于 80%的患者免除疾病(見圖8)。本發(fā)明細胞系也用于制備稱作DC/Apo-Nec的本發(fā)明組合物，所述組合物包含至 少一種本發(fā)明細胞系和自體樹突細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞系是細胞系Me 1-XY1、Me 1 _XY2、Me 1 _XY3和 Mel-XX4的不同組合。作為一個非限制性實例，所述組合可包含細胞系Mel-XYl和Mel_XY2 的混合物，或者細胞系Mel-XYl和Mel-XX4的混合物。在一個優(yōu)選實施方案中，細胞系的組 合包含細胞系Mel-XYl、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel_XX4的混合物；因此，存在這四種細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明組合物DC/Apo-Nec包含經(jīng)照射細胞系Mel-XYl、 Mel-XY2、Mel-XY3、Mel-XX4和自體樹突細胞的組合。本發(fā)明四種細胞系的特定組合提供了用于刺激樹突細胞的天然抗原的獨特來源， 還提供了克隆發(fā)生細胞的抗原。必須考慮的是，本發(fā)明四種受照射細胞系的組合不僅提供 天然抗原的特定組合，而且包含細胞群(其中存在約50%的凋亡細胞和約15%的壞死細 胞)的特定組合。這種細胞群組合誘導DC的成熟。本發(fā)明組合物DC/Apo-Nec的I期研究在16名黑素瘤患者(其特征示于表2)中 進行。表2:患者的特征患者性別年齡臨床階段Mts PBMC DC/Apo- 劑量 臨床評價 DTH
(xlO9 Nec (30/3 分值 個細胞) 的劑量 /07)(xlO6 個細胞)1 F 42 IVLN 3.5 54 P(8 8m)2 F 57 IIIND 3.6 54 NED 8(54m+)3 M 32 IIIND 3.3 54 NED 14.25
(35
m+)
4F17II工ND4．454NED9．5
(45
m+)
5M56IVL510 4P(44
m)
6M60II工ND1．534NED4．5
(37
m+)
7M27IVSC4．2lo 2WPND
(1m)
8M26II工ND3．6lo 4P(710．5
m)
9F42II工ND7．515 4NED5．6
(7 lm+]0088])
10M34IVLN6．215 4P5．5
(1l
m)
l lM44工VL4．715 4P(410
m)
12M56工工工ND815 4NED4．5
(25m+
)
13M47IICND9．320 4NED6．5
(26
m+)
14M30II工ND7．520 4NED7．25
(39
m+)
15M52工VLN620 4P3．75
(10
111)
16F57IVSC8．220 4P(65．25
111)
ND不可測；SC皮下；L肺；LN淋巴結(jié)
患者平均年齡為42歲(范圍從17歲到60歲)。接受治療的有5名女性和11名男性。其中一名患者患有IIC期AJCC黑素瘤，八名患有II工期黑素瘤，七名患有IV期黑素瘤。5號和11號患者接受了肺轉(zhuǎn)移手術(shù)；16號患者有皮下轉(zhuǎn)移；1號、10號和15號患者由 于淋巴結(jié)囊破裂而在手術(shù)后在腋窩處接受了放射治療?；颊咚娜艘唤M用5、10、15或20 X 106 個與Apo-Nec細胞共培養(yǎng)的樹突細胞(DC)(本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物)治療和清洗。每 名患者每兩周接受無佐劑的組合物DC/Apo-Nec給藥(0. 3ml)。由于右股的運動損傷后病情 迅速發(fā)展以及不可控的感染，7號患者在第二次給藥后被從實驗方案中排除，該患者未被替 代。未成熟樹突細胞(DCin)表現(xiàn)如下模式95. 1 士3. 6%為CD147CDllc+，70士6%為 CDla+。純度估計約為60%。從接種在無血清培養(yǎng)基中的1父108個？81 獲得約3\106個0(。當從患者中獲得DCin并對包含于本發(fā)明組合物DC/Apo-Nec中的細胞進行表征時 發(fā)現(xiàn)，來源于患者(n= 15)DCin細胞中的42. 3士 13. 7%能吞噬本發(fā)明Apo-Nec細胞。用 電子顯微鏡觀測Apo-Nec細胞的吞噬作用，在DC內(nèi)空泡中觀察到完整Apo-Nec細胞或其部 分。本發(fā)明Apo-Nec細胞影響單核細胞衍生DC細胞的成熟過程的能力通過用流式細 胞術(shù)(FACS) (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA)測量特異性 DC 細胞標記來檢 測。對本發(fā)明Apo-Nec細胞的吞噬作用導致DC細胞成熟表型(相比于與LPS孵育的對照)。 ⑶83、⑶80、⑶86、I類和II類HLA、⑶40的表達量提高證明了 DC細胞成熟。吞噬作用后， 與DCin相比觀察到細胞內(nèi)吞的FITC-Dx下降了 75. 2% 士 16。所有患者中在本發(fā)明Apo-Nec細胞的吞噬作用之后，趨化因子受體(C_C基序)受 體7(CCR7)均提高了其在DC中的表達，這與⑶細胞向MIP-3 0的體外遷移相關(guān)。DCin細 胞(9. 6% CCR7+, MFI 23. 3)向 MIP-1 a 而不向 MIP-3 3 遷移；相反地，DC/Apo-Nec 細胞 (81. 8% CCR7+, MFI 41. 2)明顯地向 MIP-3 3 而不向 MIP-1 a 遷移。除了 6號患者(其表現(xiàn)出低PBMC產(chǎn)率，因而無法獲得10 X106個DC/Apo-Nec細胞 的劑量，只能每次施用3X106個細胞的劑量)以外，剩余所有患者均接受預計劑量的本發(fā) 明DC/Apo-Nec組合物，第1組5 X 106個，第2組10 X 106個，第3組15 X 106個，第4組 20X 106個。本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物的耐受良好，發(fā)現(xiàn)的平均毒性病例均為1級。在給 藥部位發(fā)現(xiàn)弱局部反應和DTH，包擴紅斑和丘疹。無患者顯示自身免疫病的表現(xiàn)(表3)。表3與施用本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物相關(guān)的毒性
癥狀組合物組合物組合物組合物
5xl06lOxlO615xl0620xl06
疲勞1/41/0/40/4
頭痛1/40/0/40/4
寒戰(zhàn)1/40/0/40/4
腹部痛性痙攣0/40/0/41/4
局部反應4/43/4/44/4
虛弱0/41/0/40/4
惡心0/40/0/41/4
腹部疼痛0/40/0/41/4
嘔吐0/40/0/41/4
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厭食0/41/30/40/4腹瀉0/40/30/41/4肌痛1/40/31/40/4在手術(shù)后平均隨訪41. 5月(在25到71個月之間)后，IIC期患者顯示無疾病跡 象(no evidences of disease,NED) ；7/8 (87. 5% )的 III 期患者為 NED, 7/7 的 IV 期患者 顯示疾病的發(fā)展(見圖2)。評估本發(fā)明異質(zhì)細胞Apo-Nec每次給藥的DTH反應，并評估反應強度，DTH分數(shù)如 實施例所述。在施用前，只有6/15的患者表現(xiàn)出針對本發(fā)明Apo-Nec細胞的輕微DTH反應。 DTH測定揭示，Apo-Nec細胞的給藥在所有患者中均誘導特異性反應，因為在施用第二劑 DC/Apo-Nec組合物之后，DTH分數(shù)與第一次施用后觀測到的基礎反應相比顯著提高(Marm Whithney檢驗P = 0. 029, n = 15)。NED患者中的DTH分數(shù)高于疾病正在發(fā)展的患者(P = 0. 28，Mann ffilcoxon 秩和檢驗)。提高每次給藥的DC/Apo-Nec細胞量沒有顯著提高DTH值。通過FACS分析測定，在給藥前和給藥后未觀察到針對包含于本發(fā)明組合物中的 活黑素瘤細胞的體液應答。還利用Western印跡技術(shù)在給藥前和給藥后的血清中鑒定了針 對Apo-Nec細胞的反應性性抗體的存在情況。在四名患者(3號、4號、號和16號)中，在給 藥后血清中只觀察和檢測到黑素瘤蛋白的一條弱條帶(> 200kDa)，所述條帶在作為非特 異性對照的乳腺癌細胞提取物中并未觀察到。為1號患者建立自體黑素瘤細胞系，從而可以測定在該患者中施用DC/Apo-Nec細 胞來誘導針對自身腫瘤的淋巴細胞增殖應答的可能性。在施用Apo-Nec 1號細胞(如實施 例中所述獲得的來自1號患者的經(jīng)照射的腫瘤細胞)之前和之后經(jīng)5天的淋巴細胞孵育 后，測定淋巴細胞增殖。圖3顯示，與給藥前的淋巴細胞相比，作為對DC/Apo-Nec 1號細胞 之應答的給藥后淋巴細胞增殖要更高，提示存在針對Apo-Nec細胞所呈遞腫瘤抗原的特異 性免疫，所述特異性免疫在DC/Apo-Nec細胞給藥后也存在于1號患者的腫瘤中。參與本研究的15名患者中的7名具有單倍型I類HLA-A女0201，這使得可以在他 們自身的PBMC樣品中研究限制性HLA腫瘤特異性應答。通過HLA四聚體/肽和IFN- y分 泌(用ELISpot測量)之間的特異性關(guān)聯(lián)，直接在外周血樣品中測定由⑶/Apo-Nec組合物 誘導的抗gplOO應答和特異性Melan A/MART-1 CD8+T細胞。在5/7的患者中，在之前(第一次給藥前7天)和之后(第四次給藥后15天)獲 得了足夠的PBMC，用以通過四聚體染色分析對gplOO和Melan A/MART-1具有反應性的特異 性⑶8+T淋巴細胞的存在。結(jié)果顯示于圖4A。2號和6號患者在給藥后的gplOO和Melan A/MART-1特異性⑶8+T細胞的比例顯著提高至高于1 %，而且他們?nèi)詾镹ED (分別在手術(shù)后 的53個月和36個月)；而5號、8號和16號患者的給藥前四聚體染色降低，而且它們均在給 藥后處于疾病發(fā)展狀態(tài)(圖3A)。以2號患者的結(jié)果為例顯示于圖4B。識別gplOO或Melan A/MART-1肽的CD8+T細胞的百分比在給藥后分別從0. 17和0. 26提高到1. 15和1. 16。用 健康陽性HLA-A * 0201供體在相同條件下進行的實驗中未觀察到反應性。與用gplOO或Melan A/MART-1脈沖刺激的自體DC細胞孵育24小時后，在給藥 前和給藥后總PBMC的ELISpot中分析IFN-y的釋放，用流感肽作為對照(flu58_66)。在 5/7的HLA-A女0201患者中進行這一分析。觀察到兩名患者(5號和16號)在施用本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物后誘導了 IFN- y，所述IFN- y由gplOO和Melan A/MART-1特異性 ⑶8+T細胞所分泌。在5號和16號患者中，所誘導的分泌IFN- y的⑶8+T細胞發(fā)生率為 7-3. 5X10—4。在2號患者中，在給藥前和給藥后發(fā)現(xiàn)大量的gplOO和Melan A/MART-1特異 性⑶8+T細胞。這名患者在手術(shù)后54個月仍未患病。8號和15號患者在基點(給藥前) 顯示少量⑶8+T細胞，在本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物四次給藥后未觀察到變化。在吞噬作用后的不同時間點通過FACS來定量本發(fā)明DC/Apo-Nec細胞中IL-12和 IL-10之間的平衡，之后用Brefeldin A處理8小時以在胞質(zhì)內(nèi)積聚細胞因子。如圖5所 示，只有6. 1 %的DCin產(chǎn)生IL-12，但是在32小時之后，通過共培養(yǎng)，30. 8%的DC/Apo-Nec 細胞被誘導產(chǎn)生IL-12。另一方面，81. 6%的DCin在胞質(zhì)中含有細胞因子，且它們在吞噬作 用后不會被修飾。產(chǎn)生IL-10和IL-12的雙陽性細胞在24小時時為27. 8% (見圖5)。本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物是安全的，患者對其耐受良好。本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物誘導患者中的細胞應答，因為與基準值相比，用 Apo-Nec細胞作為免疫原的DTH反應第二次給藥后在所有患者中均提高。在手術(shù)后進行治療時，本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物所治療患者(lie和III期)中 的85%在平均41. 5個月的隨訪后無疾病(見圖2)。本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物本身可用 于治療患黑素瘤的患者，也可用作根治后的輔助治療，因為它能刺激患者中的免疫應答，其 中免疫系統(tǒng)清除了所有殘留的腫瘤細胞，保護患者免于復發(fā)的可能。更特別地，本發(fā)明DC/ Apo-Nec組合物可用于治療處于IIB、IIC和III期的具有較少腫瘤塊的患者，也可用作IV 期患者在根治之后的輔助治療。對本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是，本發(fā)明DC/Apo-Nec組合物可用于治療人黑素瘤； 它也可作為與其他療法一起使用的佐劑以及免疫系統(tǒng)刺激劑，例如，這取決于患者的階段 和治療階段。重要地，必須指出的是本發(fā)明Apo-Nec細胞的組合物誘導自體DC細胞成熟。本發(fā) 明Apo-Nec細胞的混合物或組合物是用于裝載樹突細胞的黑素瘤抗原的很好來源。注意， 樹突細胞只通過接觸、吞噬本發(fā)明Apo-Nec細胞的組合而成熟，無需加入額外的刺激(例如 常用做成熟混合物的白細胞介素1、腫瘤壞死因子a、CD40配體或前列腺素E)。吞噬本發(fā) 明Apo-Nec細胞的DC提高了應答于趨化因子MIP-3 0的體外遷移和IL-12的胞內(nèi)產(chǎn)生。本 發(fā)明DC/Apo-Nec細胞能向特異性CTL抗原呈遞交叉的天然腫瘤抗原。如前所述，每名患者的DCin對Apo-Nec細胞的吞噬均誘導這些DC的成熟。另一方面，對本發(fā)明細胞系的克隆發(fā)生能力進行分析。軟瓊脂中的本發(fā)明MEL-XY3 細胞系集落表現(xiàn)出不均勻的形態(tài)，細胞間具有低粘附。觀察到低比例的黑素化集落。軟瓊 脂中的本發(fā)明MEL-XY1細胞系集落表現(xiàn)為緊密的形態(tài)，在所含細胞間具有高粘附。很少觀 察到黑素化的集落。作為表征集落的方法，比較了本發(fā)明細胞系和軟瓊脂中所述細胞系集落的黑素瘤 抗原表達水平，以肌動蛋白的表達進行歸一化。克隆表征的結(jié)果示于表4和圖6。表4本發(fā)明細胞系和本發(fā)明克隆發(fā)生系之間抗原表達的比較研究
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黑 ND:未測定*未歸一化的數(shù)據(jù)可以觀察到，在本發(fā)明的細胞群和每種細胞系都存在克隆發(fā)生細胞的亞群，這些 克隆發(fā)生細胞也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？寺“l(fā)生細胞的存在可以為患者提供未分化細胞 (也叫做干細胞)的典型抗原。黑素瘤腫瘤的異質(zhì)性高，因此對免疫療法而言，很重要的是使用由細胞系及其亞 群的混合物或組合所提供的復合抗原混合物。作為一個實例，圖7顯示了原發(fā)黑素瘤活檢， 其顯示了該腫瘤的異質(zhì)性與黑素細胞分化抗原表達的比較。當根據(jù)下述實施例中公開的方案，用本發(fā)明Apo-Nec組合物和作為佐劑的BCG、作 為免疫調(diào)節(jié)劑的GM-CSF —起治療患者時，觀察到75%的患者(IIC期和III期)在最長51 個月的隨訪中無疾病(見圖8)，且毒性低，僅為1級。顯示了來自一個選定方案患者的示例性結(jié)果。200號患者為女性，白種人，67歲， 2003年11月加入實驗。2002年6月，她接受了對生長的脊背痣的手術(shù)。組織學顯示為皮 膚黑素瘤，Clark分級為IV，Bresl0W分級為5. 7mm。2002年8月，檢測到一些衛(wèi)星瘤，并將 它們切除。向該患者施用Apo-Nec+BCG+GM-CSF，接受600 u g GM-CSF(/組合物)，結(jié)束治療 時幾乎無毒性。在最后一次臨床檢查時，在其背部檢測到一個可疑結(jié)節(jié)，將其切除，顯微鏡 圖像顯示于圖9。觀察到強烈的淋巴浸潤和殘余的存活腫瘤區(qū)域，但也有強烈的腫瘤組織壞 死，而且存在載有黑色素的巨噬細胞。作為一個實例，還顯示了用本發(fā)明Apo-Nec組合物+BCG+IFN-a治療的患者中的 結(jié)果。300號患者是男性，17歲，他加入實驗時患有左腹股溝腺病。兩個月后，實施了另一 左腹股溝切除手術(shù)，其中得到4/11的有黑素瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)。他接受了低劑量白細胞介素_2 的治療。第二次切除的14個月后，在腹股溝弓檢測到復發(fā)，再次實施手術(shù)，其中分離了 5/7 有黑素瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)?；颊弑憩F(xiàn)出背部疼痛。計算機化軸向斷層攝影術(shù)揭示了腹膜后的腺 病，實施采用Dartmouth方案的化學療法。結(jié)束化學療法后，他開始用本發(fā)明Apo-Nec組合 物+BCG治療。開始用本發(fā)明組合物治療14個月后，在左腹股溝區(qū)域檢測了一個結(jié)節(jié)。對 其進行手術(shù)，檢測到黑素瘤轉(zhuǎn)移，以及大量淋巴漿細胞浸潤。該患者繼續(xù)用Apo-Nec組合物
19+IFN-Q治療。圖10顯示了左肺結(jié)節(jié)的消退?，F(xiàn)在，該患者已經(jīng)無疾病。本發(fā)明公開了組合表達大多數(shù)黑素瘤相關(guān)抗原的黑素瘤細胞系、包含這些經(jīng)照射 細胞系的組合物以及包含離體產(chǎn)生的自體DC(已吞噬了黑素瘤細胞系的凋亡/壞死細胞混 合物)的組合物。根據(jù)下面的實施例可更好地闡明本發(fā)明，所述實施例不應理解為對其范圍加以限 制。相反地，應當清楚理解的是，在閱讀本說明后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可提出其他實施方案、 修改和等同方案，而不偏離本發(fā)明精神和/或所附權(quán)利要求書的范圍。實施例1 本發(fā)明細胞系的獲得、建立和維持Mel-XYl 細胞系Mel-XYl得自一名男性白種人患者，從背部原發(fā)性黑素瘤后繼發(fā) 的肺轉(zhuǎn)移中獲得。該患者兩年后死于腦轉(zhuǎn)移。Mel-XY2 該細胞系來源的患者是44歲的男性白種人，其表現(xiàn)出背部糜爛性黑色 素瘤(Clark’ s分級為III)。兩年后，該患者同時發(fā)生腋窩腺病和肺轉(zhuǎn)移。腋窩腺病被切 除、分離，由這些細胞產(chǎn)生了本細胞系。Mel-XY3 患者為43歲的白種男性，他發(fā)生原發(fā)性臂部黑素瘤。兩年后，腋下淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)。該患者接受了 DTIC的化療，無明顯的臨床反應。腋窩轉(zhuǎn)移被切除，這些細胞 產(chǎn)生了細胞系Mel-XY3。Mel_XX4:該細胞系從一名33歲白種女性的腹股溝腺病手術(shù)中獲得，其中上述腺 病被診斷為黑素瘤轉(zhuǎn)移。原發(fā)性腫瘤不明。十五個月后，該患者在腹股溝淋巴結(jié)處復發(fā)。切 除全部黑素化淋巴結(jié)，并切成小塊，去除脂肪和結(jié)締組織，懸于Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng) 基(DMEM)中，通過以尼龍篩擠壓進行機械分離，將細胞聚集體在37°C用酶處理過夜。將細胞重懸于在補充有10%胎牛血清(FBS) (Natocor, Cordoba,Argentina)的黑 素瘤培養(yǎng)基中，接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，在具有濕度和5% C02-95%空氣的氣氛中以37°C孵 育。24小時后，除去培養(yǎng)基以除去未貼壁的細胞。使細胞懸液四次通過抗成纖維細胞微球柱(Miltenyi Biotec，Germany)。獲得的 細胞被命名為Mel-XX4。^ Centro de Investigaciones Oncologicas-FUCA W GMP $ ^ c^ it il ^ 黑素瘤培養(yǎng)基DMEM :F12的營養(yǎng)混合物(1 1)中進行培養(yǎng)來維持本發(fā)明的四種細胞 系(Mel-XYl、Mel-XY2、Mel_XY3和Mel_XX4)，所述營養(yǎng)混合物除了 10%胎牛血清(FBS) (Natocor, Cordoba, Argentina)之外，還補充有2mM谷氨酰胺、20nM亞硒酸鈉、100 ii M抗 壞血酸、0. 3mg/ml半乳糖、0. 15mg/ml的丙酮酸鈉和5 y g/ml的胰島素、100IU/ml青霉素、 10iig/ml鏈霉素。將對Melan A/MART-1 (M27 :AAGIGILTV)和 gpl00(G154 :KTWGQYWQV)抗原具有特 異性的克隆CTL(限制的HLA A女0201)在含有10%滅活AB人血清和抗生素的RPMI培養(yǎng) 基中以14天的周期使用30ng/ml抗CD3抗體(0KT-3，BD Biosciences)進行擴增，并且每 3 天使用一組 300UI/ml IL-2 (Chiron BV, Amsterdam, Netherlands)。實施例2 細胞系的表征體外生長動力學將104個細胞在24孔板(Corning)的孔中培養(yǎng)。每2-3天，用EDTA(0. 02% )處 理細胞，收集并計數(shù)。從指數(shù)生長期的生長曲線斜率來計算細胞群倍增時間。15/21頁克隆發(fā)生錨著非依賴性細胞的生長通過軟瓊脂方法來測定(Hamburger和Slamon，Science 197:461,1977)。將3_10 X 103個細胞在上層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將平板孵育21天，然后每天 加入50 u 1的培養(yǎng)基。將超過36個細胞的集落在顯微鏡下計數(shù)。利用免疫細胞化學(ICC)和FACS來表征黑素瘤抗原為進行ICC測定，用EDTA處理指數(shù)生長的細胞，離心，甲醛固定，石蠟包埋，然后切 成薄片。用患者的正常組織樣品作為對照。用針對角蛋白、波形蛋白、gplOO/HMB45(Biogenex)、MARTl/Melan_A(Dako)的單 克隆抗體(Mab)和抗S100的多克隆抗體對組織和細胞進行測定。利用抗生物素蛋白-生物素復合物(Vectastain ABC)使反應顯影。利用0. 6%的 H202封閉內(nèi)源過氧化物。通過重懸經(jīng)EDTA處理的細胞來進行間接免疫熒光反應。在使用10%稀釋的正常 山羊血清封閉后，將細胞與一抗孵育，沖洗，與二抗(FITC山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako)) 孵育，洗滌，在 多聚甲醛中固定，并用 FACS (FACS Vantage SE，Becton-Dickinson，USA) 進行分析。一抗是小鼠抗p53Mab (D0-7，BD Pharmingen)、3F8抗⑶2、R24抗⑶3。對于p53 的情況，將細胞進行透化處理。通過PCR-SSP對I類和II類人類白細胞抗原(HLA)進行分 型。利用RT-PCR測定黑素瘤相關(guān)抗原用Trizol(Invitrogen)提取總 RNA。為 了起始 cDNA 合成，向 1-3 ii gRNA 中加 入適當?shù)囊?，與 200U MMLV-RT 酶(Promega)、25_40URNAsin (Promega)和 250-500 u M dNTP(Invitrogen)在70°C孵育5分鐘，然后42°C孵育60分鐘。選用特異性引物對，用Taq DNA 聚合酶(Invitrogen)擴增 cDNA 等分試樣(2-10 u 1)。特異性引物顯示如下GplOO5' -GCTTGGTGTCTCAAGGCAACT-3‘ (SEQ ID No 1)5' -CTCCAGGTAAGTATGAGTGAC-3‘ (SEQ ID No 2)MART-15' -CAAGATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3' (SEQ ID No 3)5' -GCTTGCATTTTTCCTACACCATTCCA-3' (SEQ ID No 4)酪氨酸酶5' -TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3'5' -AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3'5' -GTCTTTATGCAATGGAACGC-3'5' -GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3'TRP-25' -GAGTGGTCCCTACATCCTACG-35' -GCGTCCTGGTCCTAATAATGT-3MAGE-15' -GAGTCCTCAGGGAGCCTCC-3' (SEQ ID No 11)
(SEQ ID No5)
(SEQ ID No6)
(SEQ ID No7)
(SEQ ID No8)
(SEQ ID No 9) (SEQ ID No 10)
21
5' -TTGCCGAAGATCTCAGGAAA-3‘ (SEQ ID No 12)NY-ES0-15' -AGCCGCCTGCTTGAGTTCTACCTC-3〃 (SEQ ID No 13)5' -AGGGAAAGCTGCTGGAGACAG-3' (SEQ ID No 14)MDR-15' -TCCAAGAAGCCCTGGACAAAG-3' (SEQ ID No 15)5' -TTGATGATGTCTCTCACTCTGTTCC-3' (SEQ ID No 16)MIA5' -CATGCATGCGGTCCTATGCCCAAGCTG-3' (SEQ ID No 17)5' -GATAAGCTTTCACTGGCAGTAGAAATC-3' (SEQ ID No 18)肌動蛋白5-' ATGTTTGAGACCTTCAACACCCC-3' (SEQ ID No 19)5' -GCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3' (SEQ ID No 20)反義鏈引物顯示于下面一行中。為進行酪氨酸檢測，還擴增了使用內(nèi)部引物進行的第一步PCR反應的1/100等分 試樣(巢式PCR)。在瓊脂糖凝膠中分析PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠進行染色；通過與100bp DNA PM標記 (Promega)的條帶進行比較來計算片段的大小。細胞遺傳學和細胞分子學分析將對應于本發(fā)明四種細胞系的相應細胞與秋水仙素(0. lyg/ml)在37°C孵育 8-16小時，用來進行指數(shù)生長期的細胞遺傳學分析，使用胰蛋白酶-EDTA溶液收集，并按照 標準方案進行處理。使用G-帶技術(shù)。根據(jù)人類細胞遺傳學命名國際體制(Mitelman，1995 ISCN. :AnInternational System for Human Cytogenetic Nomenclature， (S Karger， Basel編輯)進行染色體的鑒定。實施例3 從單核細胞產(chǎn)生樹突細胞(DC)，對其進行表征，并裝載Apo-Nec細胞。從健康供體的血沉棕黃層或者白細胞清除產(chǎn)物中獲得樹突細胞。將外周血單個核 細胞(PBMC)用Fycoll-Hypaque密度梯度進行純化。將PBMC懸于新鮮的AIM-V 無血清培 養(yǎng)基(Invitrogen)中，并使其在培養(yǎng)瓶(TPP，Germany)中貼壁。37°C培養(yǎng)2小時后，去除未 貼壁細胞，并將貼壁的單核細胞在補充有800U/ml rhuGM-CSF和50ng/ml IL-4 (Peprotech, Mexico)的AIM-V中培養(yǎng)5天，從而獲得⑶in。通過光學顯微鏡和FACS來分析表型變化。 為誘導DCin的可控成熟，加入2 u g/ml的LPS (大腸桿菌J5脂多糖，Sigma, St. Louis, CA)， 最后培養(yǎng)細胞48小時。在細胞處于未成熟狀態(tài)(DCin)時，并且在用針對⑶14、⑶11c、⑶la、II類HLA、 CD80、CD86、CD83、CD40、I 類 HLA 和 CCR7 抗原的熒光染料標記抗體(BD Biosciences, San Jose, CA)對5X 105個細胞染色而進行凋亡/壞死細胞(Apo-Nec細胞)吞噬測定后，通過 FACS分析(Becton Dickinson, San Jose, CA)進行DC細胞表型表征。合適的同種型對照 為大鼠 IgG2a PE、小鼠 IgGl 和 IgG2a(BD Biosciences, San Jose，CA)。還采用未標記的單 克隆抗體抗⑶83 (IgGl)和合適的同種型作為對照，分析了⑶83在吞噬Apo/Nec細胞的DC 中的表達情況；為進行顯色，使用抗小鼠IgGl_PerCP(BD Biosciences, San Jose, CA)。
通過將IX 106 個 DC 與 lmg/ml 綴合 FITC 的葡聚糖(Dx-FITC) (Sigma, St Louis, CA)在37°C孵育30分鐘，來評估DC的內(nèi)吞能力。孵育后，用PBS洗滌細胞，并用FACS進行 分析。對照包括與Dx-FITC在4°C下孵育30分鐘(以抑制內(nèi)吞過程)的DC;另一方面，在 測定中時間點為0時被認為是基準摻入。用FACS定量DX-FITC的摻入(內(nèi)吞)。DC細胞吞噬作用的評估將DCin細胞在新鮮的AIM-V培養(yǎng)基中與Apo-Nec細胞(如前所述制備)進行不 同時間的共培養(yǎng)。在一些測定中，DC被PKH26染成紅色，Apo-Nec細胞被PKH67 (Sigma， St. Louis, CA)染成綠色。在共培養(yǎng)后進行FACS分析，將吞噬了 Apo-Nec細胞的DC的百分 比定義為雙陽性細胞的百分比。針對每種顏色進行合適的對照。通過在4°C下將細胞孵育 相同時長來作為Apo-Nec細胞與DC非特異性結(jié)合的對照。DC在體外的遷移在與Apo-Nec細胞共培養(yǎng)之前和之后，用48孔趨化小室(AP 48Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD)分析DC細胞的體外遷移。將10ng/ml用RPMI稀釋的MIP-1 a或 MIP-30 (Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)置于底部隔室中。通過將RPMI置于下部小室中 來測定基礎遷移。將DC接種在上部小室(3X104個⑶/孔)的RPMI中。在上部和下部小 室之間放置5 u m孔徑的聚碳酸酯膜(Neuroprobe，Inc. ,Bethesda,MD)。37°C放置90分鐘 后，去除膜上側(cè)的細胞，將粘附在膜下側(cè)的遷移細胞用中性水稀釋的10%GiemSa染色。將 膜晾干，用加拿大樹膠包埋在載玻片上，用顯微鏡計算遷移數(shù)目。用40X放大倍率對每個 孔分析5個視野，每種條件分析3個孔。用Student檢驗進行統(tǒng)計學分析。電子顯微術(shù)吞噬過程也用電子顯微術(shù)進行了研究。用0. 1M磷酸緩沖液中2. 5%的多聚甲醛固 定共培養(yǎng)的樣品，用的四氧化鋨進行固定后染色，將樣品用蒸餾水洗滌兩遍，并用5% 的乙酸雙氧鈾復染兩小時。洗滌和脫水后，將樣品包埋于樹脂(Durkupan)中。獲得超薄切 片(70-90nm)，置于銅網(wǎng)上，并用Reynold's檸檬酸鉛進行復染。在Zeiss 109透射電子顯 微鏡下對篩網(wǎng)進行分析。或者，為了獲得完整細胞的圖像，由超薄切片機(Reichert-Jimg) 得到薄切片(0. 5um),用溶于0. 1M的碳酸鹽緩沖液的0. 4%甲苯胺藍染色，用Durkupan包 埋，用光學顯微鏡(1000X)分析。由Sony Cybershot Digital數(shù)碼相機(500萬像素)獲 得圖像，并用Adobe photoshop 6. 0程序處理。體外交叉呈遞測定、IFN- Y分泌用抗CD14 微球(Miltenyi Biotec, Germany)從 HLA A * 0201 供體中純化 98% 的⑶14+單核細胞，并通過如前所述的5天培養(yǎng)分化成DCin細胞。將DCin細胞與Apo-Nec 細胞孵育6、12、24和48小時，并在1ml的AIMV培養(yǎng)基中過夜暴露于特異性CTL MelanA/ MART-1 或 gplOO 的克隆。根據(jù)廠商建議，通過 ELISA 技術(shù)(OptEIA IFN- y ,Pharmingen BD Biosciences, San Diego, CA) 一式三份測定分泌到上清液中的IFN-Y。每個實驗都繪制標 準曲線，并用log-log回歸分析和Cembal 2. 2軟件計算樣品濃度。對照包括DC加20 y g/ ml的MART-1或gplOO肽、表達MART-1和gplOO抗原的HLAA * 0201+活黑素瘤細胞系(陽 性對照)，或者與非特異性肽和不表達合適抗原的HLA A女0201+活黑素瘤細胞系一起培養(yǎng) 的DC (陰性對照)。測量胞質(zhì)內(nèi)的細胞因子IL-10和IL-12
將PKH26標記的DC (紅色)與PKH67標記的Apo_Nec細胞共培養(yǎng)不同的時間(6、 12、24 禾口 48 小時)。在培養(yǎng)后(Golgi Plug, BDBiosciences, San Jose CA)用 Brefeldin A(8小時)封閉其產(chǎn)物后，通過細胞內(nèi)免疫熒光技術(shù)進行積累的細胞因子的測量。用0. 05% 皂苷對細胞進行透化，并用抗IL10 (大鼠同種型IgG2a) -APC和抗IL12亞單位p40_p70 (小 鼠同種型 IgGl)-PerCp(BD Biosciences, San Jose,CA)進行染色。選擇 PKH26/PKH67 雙染 色的細胞群來進行FACS研究，對上述細胞群在四色實驗中評估細胞因子。以4°C共培養(yǎng)物 作為對照。實施例4 本發(fā)明組合物的制備以及給藥方案Apo-Nec 組合物對細胞系進行照射用70Gy的γ射線(Siemens, Instituto Alexander Fleming, BuenosAires, Argentina)照射本發(fā)明的四個細胞系(Mel-XYl、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4)，隨后將細 胞(50% DMEM、40%人白蛋白和10% DMS0)凍于液氮中待用。施用細胞的當天，將細胞解凍、洗滌，然后制備成包含本發(fā)明每種分離細胞系或其 組合的5-10 X 106個細胞的組合物劑量，將其重懸于DMEM培養(yǎng)基中。皮內(nèi)注射300ul。DC/Apo-Nec 組合物制備凋亡/壞死腫瘤細胞在含10%胎牛血清的黑素瘤培養(yǎng)基中，解凍并接種如前所述經(jīng)照射和冷凍的細胞 (Mel-XYl、Mel-XY2、Mel_XY3和Mel_XX4)，直到發(fā)生完整的凋亡過程。培養(yǎng)72小時后，將 細胞從培養(yǎng)瓶的底部分離，洗滌、計數(shù)，并重懸于新鮮的無血清AIMV 培養(yǎng)基中(治療級， GIBC0, Invitrogen Corporation, Grand Island, N. Y) 凋亡和壞死通過膜聯(lián)蛋白-V FITC 連接技術(shù)和碘化丙錠(IP)摻入(膜聯(lián)蛋白-V凋亡檢測試劑盒，BD Biosciences, San Jose, CA)來檢測，用FACS進行分析。軟瓊脂上的克隆生成檢測以一式六份進行(1.5X104個細 胞/孔)，以分析經(jīng)照射細胞的增殖能力(與未照射的對照細胞相比)。根據(jù)每個患者的劑量，將5、10、15或20X 106個DC與Apo_Nec細胞在AIMV培養(yǎng) 基中于37°C共培養(yǎng)48小時。在給藥當天，將共培養(yǎng)的細胞用1200rpm離心5分鐘，重懸于 DMEM培養(yǎng)基(300 yl)，并向具有淋巴結(jié)完整通路的四肢之一進行皮內(nèi)注射。對所有組合物的制備進行質(zhì)量控制和無菌測定。
實施例5 患者研究設計及選擇標準 進行患者研究以評估毒性、生存力及對治療的免疫應答。所述研究經(jīng) Institutional Revision Council of Instituto Alexander Fleming及倫理委員會批準。 生存力標準為(a)經(jīng)組織學證實為IIB、IIC、III或IV期(AJCC)的皮膚黑素瘤；(b)手術(shù) 后具有最小程度或者不可檢測疾病(ND)的患者，評估了計算機化軸向斷層攝影術(shù)和乳酸 脫氫酶(LDH)水平。本研究中可包括具有未知原發(fā)性黑素瘤的患者；(c)年齡在15到60歲 之間；(d)預期壽命大于6個月；(e)結(jié)果(EC0G)0，ol ;(f)先前用IFN-a治療過的III期 患者(該患者已完成治療或由于疾病發(fā)展、毒性或其他臨床原因而中斷治療)，或者手術(shù)前 6個月未開始用IFN-a治療的患者；(g)足以用于白細胞清除方法的靜脈入口，(h)實驗室 選取標準為血紅素> 10gr%;白細胞計數(shù)> 4800/mm3，血小板> 150，000/mm3 ；總直接膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶< 1. 5倍正常最高值；LDH彡450mU/ml ；i)非孕婦，對未到更年 期的婦女，每次給藥前一周測定血清3 "HCG ；⑴肌酸酐< 1. 4mg%;(k)前幾個月無化學治 療、放射治療或者生物治療；(k)無皮質(zhì)激素或者非固醇類抗炎藥物(AINE)治療；(1)無活 躍的腦轉(zhuǎn)移；(m)正常的ECG ； (n)所有患者必須簽署知情同意書?；颊咴u估和治療方案在第一次給藥前35天內(nèi)完成患者基本評估。臨床評價包括完整的臨床病史、身 體檢查、心電圖(ECG)、計算機化軸向斷層攝影術(shù)(胸腔、腹腔、骨盆和腦)，測定腫瘤階段、 腫瘤大小并記錄患病部位、血液化學檢測和血液學。對所選的患者進行白細胞清除以獲得 PBMC，進而產(chǎn)生DC。患者以兩周的間隔接受4次DC/Apo-Nec給藥。皮內(nèi)進行接種(300 yl)，并對每劑 量進行DTH檢測，該檢測包括在前臂接種無佐劑的5-20 X 106個DC/Apo-Nec細胞。給藥后 2、24和48小時分析生命體征和DTH皮膚反應。第70天通過腹部超聲波檢查和胸腔X射線 來檢查患者的狀況，該方案結(jié)束于第75天(進行臨床檢查)。為施用本發(fā)明的Apo/Nec細胞，在有完整淋巴結(jié)的一肢對患者進行皮內(nèi)(id)注 射。二十名(20)患者接受400 iig rhGM-CSF劑量(每天lOOiig，共4天)。在給藥當天， 將 0. lml hGM-CSF 與 0. 05ml 的 Apo-Nec (0. 3ml 中 16X106 個未照射細胞)和 BCG(1 X 106 個集落形成單位)混合。在其后3天中，在給藥位點處皮內(nèi)注射0.1ml rhGM-CSF。每個患 者接受間隔為3周的4次給藥，然后一年中每兩個月接受1次組合物，次年每3個月接受1 次組合物，其后繼續(xù)每6個月接受1次組合物。統(tǒng)計學分析根據(jù)國立癌癥研究所(NCI)的通用毒性標準對所有不良結(jié)果進行分類。可評估群體定義為接受4次給藥的所有患者。由于多數(shù)患者數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布 的，因此對全部數(shù)據(jù)使用Wilcoxon’ s秩和檢驗進行分析。在每組之間使用單變量AN0VA和 Dunnett多重比較檢驗比較接受不同劑量DC/Apo-Nec的不同群體的DTH值。？值< 0.05 被認為是顯著的。評估受治患者免疫應答的方法為評估患者的免疫應答，分別在給藥前7天(前血清)和治療完成后15天(后血 清)獲取血清，所得樣品保存于-80°C。PBMC細胞通過Ficoll-Hypaque梯度及后續(xù)離心而 從白細胞清除術(shù)(給藥前)中純化，或從最后一次給藥后15天獲得的100ml血液(給藥后) 中純化，將PBMC凍存于50% DMEM、40%人白蛋白和10% DMS0中直到用于免疫分析。將患 者樣品與綴合有FITC的小鼠抗HLA * A0201單克隆抗體(BD-Pharmingen，San Jose, CA) 孵育后，測定HLA-A * 0201HLA分型。DTH 反應在給藥的每天，在前臂上用2 X 106個Apo-Nec細胞進行DTH測試，在給藥后第2、24 和48小時后評估反應。DTH強度值確定如下0 紅斑<0. 5cm ；1 具斑點的紅斑0. 5-1. 0cm ； 2 具斑點的紅斑1. 0-2. 0cm ；3 具斑點的紅斑> 2. 0cm或丘疹狀紅斑< 1. 5cm ；4 丘疹狀紅 斑> 1. 5cm。儲藏DTH對應所有個體DTH強度之和的四分之一。增殖測定通過Ficoll-Hypaque密度梯度獲得施用組合物前和施用組合物后的PBMC，凍存
25于液氮中待用。將細胞解凍用于測定，在AIM-V培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island, NY)中以 37°C孵育1小時。將5X 105個細胞接種到含有或不含植物凝集素(PHA) (5 u g/ml) (Gibco, Grand Island, NY)的96孔板中，并在37°C孵育72小時。在最后16小時中，對細胞進行(3H) dThd(Amersham, 1 u Ci/well)脈沖刺激，在細胞裂解后用液閃計數(shù)器測量(Ceu Harvester, Nunc, Rochester, NY)DNA 中摻入的放射性。細胞因子的測定在給藥前(給藥前血清)和第四次給藥后兩周(給藥后血清)測定患者的血 清IL-10和IL-12濃度。將血清凍于_80°C直至ELISA測定(OptEIA IL-10和IL-12，BD Biosciences, San Diego, CA) 0每次實驗都繪制標準曲線，樣品的濃度使用Cembal 2. 2軟 件通過log-log線性回歸分析進行計算。用ELISpot 技術(shù)測量 IFN-Y 使用包被有抗CD14(Miltenyi Biotec, Paris, France)的微球，從來自 HLA-A2 陽 性患者的PBMC中純化CD14+細胞作為刺激劑，在含有100ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4的 合成SYN-H培養(yǎng)基(AbCys, Paris, France)中培養(yǎng)5天，并用10 u g/ml的LPS再處理48小 時使其成熟。在37°C下用稀釋在SYH-H培養(yǎng)基中的10 u g/ml合適多肽對成熟的DC脈沖刺 激1小時，洗滌，并與PBMC混合直至達到10 1的E/T患者比例，每孔使用總計105個⑶8+ 淋巴細胞。用硝酸纖維素膜(MAIPS450 ；Millipore, Bedford, MA)蓋上 96 孔板，與 10 ii g/ ml人抗IFN- y mAb (Mabtech，Nacka, Sweden)在pH 9. 6的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中4°C 過夜，洗滌，用IMDM培養(yǎng)基+10% AB人血清(Biowest, Nuaille, France)在37°C封閉1小 時。將效應細胞接種到100 y L培養(yǎng)基中，加入靶細胞直至達到10 1的E/T比例，每孔總 計200 ii L。孵育24小時后，將孔用含0. 1 %吐溫-20的PBS洗滌5次。將平板與1 y g/ml 人生物素標記的抗IFN- y小鼠mAb (Mabtech)在PBS/HSA(0. 4g/L)中室溫孵育2小時。用 含0. 1 %吐溫-20的PBS洗滌數(shù)次后，加入溶于PBS/HSA中的1 1000堿性磷酸酶-鏈霉 抗生物素蛋白(Mabtech)，室溫孵育1小時。然后洗滌平板，加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸 /硝基-四氮唑藍底物，室溫放置30分鐘(Mabtech)。用水洗滌平板來終止顯色。干燥后， 使用ELISpot自動圖像讀取系統(tǒng)(AID，Strassberg, Germany)通過硝酸纖維素膜上的彩色 點來計數(shù)和顯現(xiàn)分泌IFN- y的⑶8+T細胞。用HLA四聚體/肽染色用HLA-A0201四聚體來分別鑒定對MART-1 (AAGIGILTV)或綴合PE (藻紅蛋白)的 gp-100 (KTWGQYWQV)或APC(別藻藍蛋白)具有特異性的⑶8+T淋巴細胞的克隆。在37°C 進行染色方法15分鐘，并立即置于冰上。然后，將樣品與抗⑶8 FITC(BD Biosciences, Sanjose CA)在4°C再孵育40分鐘，并用FACS進行分析。使用MART-1 (M27 AAGIGILTV)和 gpl00(G154 :KTWGQYWQV)抗原的特異性CTL克隆(受限的HLA A * 0201)作為陽性對照， 所述克隆在RPMI培養(yǎng)基中以14天的周期進行增殖，上述培養(yǎng)基中含有30ng/ml抗CD3抗 體(0KT-3，BD Biosciences)和每 3 天 300UI/ml IL-2 (Chiron BV)，以及 10%滅活的人 AB 血清和抗生素。用來自健康HLA-A0201供體的PBMC樣品作為陰性對照。體液應答的測定將含有Apo-Nec細胞的活細胞按照相同比例混合，用10%兔血清封閉30分鐘，并
26與1/10稀釋的給藥前和給藥后的血清于4°C孵育1小時。然后進行洗滌，將上述細胞與從 兔(DakoCytomation，Glostrup，DK)中得到的人抗免疫球蛋白抗體(IgG+A+M)在4°C孵育 1小時。洗滌細胞，并以的多聚甲醛固定，通過FACS進行分析?；蛘?，在封閉階段先用 含0.05%皂苷(Sigma-Aldrich，Saint Louis, M0)的PBS對細胞進行透化，并在反應階段 之后向每個反應中加入0. 05%皂苷/PBS。用正常血清作為一抗對照。從本發(fā)明Apo-Nec細胞系中制備蛋白提取物。將細胞沉淀凍于_80 °C，解凍，并用 裂解緩沖液(50mM Tris-CIH, pH 7. 5,1% NP40,150mMNaCl, 5mM EDTA, ImM PMSF)在 4°C處 理 20 分鐘。將懸液用 Polytron(Brinkmann Instruments, USA)勻菜，并于 10，OOOg 離心 40 分鐘。將上清液以等分試樣凍存于-20°C。根據(jù)Lowry法測量蛋白濃度。用類似方法制備 IIB-BR-G人乳腺癌細胞系蛋白提取物。將蛋白提取物(50ii g)在3% -12%梯度的SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 膜(0.45iim 孔徑，Sigma-Aldrich, Saint Louis, M0, USA)。用 3% 的脫脂牛奶(Moliko， Argentina)封閉后，將膜與1/10稀釋的患者血清孵育4°C過夜。數(shù)次洗滌后，將膜與從山 羊中獲得的綴合辣根過氧化物酶(HRP) (Zymed, San Francisco, CA)的人抗IgG+A+M—起抗 體孵育，用4-氯-萘酚和H202顯色。黑素瘤轉(zhuǎn)移瘤的組織病理學分析用石蠟包埋的活檢來分析淋巴樣細胞和DC細胞的浸潤。將三到五個切片用蘇 木精 / 曙紅染色，或者用抗 CD4(1F6 clon)、抗 CD8(C8E-144b clon)、抗 CD20 (L26 clon)、 抗 CDla(010 clon) (DakoCytomation, Glostrup, DK)禾口 抗 CD57(NK1 clon, Zymed, San Francisco, CA)抗體進行免疫染色，用ABC試劑和對二氨基聯(lián)苯(DAB)或以Novared作為 底物(Vectastain，Vector, Burlingame, CA)顯色。將不含一抗的反應作為對照。切片用 Olympus BX40顯微鏡進行分析。
權(quán)利要求
用于治療惡性疾病的人黑素瘤細胞系，其特征在于所述細胞系選自(a)Mel-XY1(以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(e)上述細胞系的亞群。
2.權(quán)利要求1的細胞系，其特征在于它是以保藏號DSMACC2830保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ的細胞系Mel-XYl。
3.權(quán)利要求1的細胞系，其特征在于它是以保藏號DSMACC2831保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ的細胞系Mel-XY2。
4.權(quán)利要求1的細胞系，其特征在于它是以保藏號DSMACC2832保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ的細胞系Mel-XY3。
5.權(quán)利要求1的細胞系，其特征在于它是以保藏號DSMACC2829保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ的細胞系Mel-XX4。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的細胞，其特征在于所述細胞系是經(jīng)過照射的，且不能增殖。
7.權(quán)利要求6中任一項的細胞，其特征在于所述細胞系中包含凋亡表型細胞群。
8.權(quán)利要求7的細胞系，其特征在于凋亡細胞群構(gòu)成所述細胞中35%到60%的量。
9.權(quán)利要求6中任一項的細胞，其特征在于所述細胞系中包含壞死表型細胞群。
10.權(quán)利要求9的細胞系，其特征在于壞死細胞群構(gòu)成所述細胞中10%到25%的量。
11.權(quán)利要求1的細胞系，其特征在于所述亞群包含能夠在軟瓊脂中形成集落的人黑 素瘤細胞。
12.用于治療黑素瘤的組合物，其特征在于含有選自以下的至少一種同種異體黑素 瘤細胞系(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)及其組合，其中所述細胞系不能增殖。
13.權(quán)利要求12的組合物，其特征在于還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
14.權(quán)利要求13的組合物，其特征在于所述佐劑為BCG。
15.權(quán)利要求13的組合物，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑選自GM-CSF、G-CSF、IFN-a、環(huán) 磷酰胺及其混合物。
16.權(quán)利要求12的組合物，其特征在于所述細胞系是經(jīng)過照射的。
17.權(quán)利要求12的組合物，其特征在于所述細胞系中包含凋亡表型細胞群。
18.權(quán)利要求17的組合物，其特征在于所述凋亡細胞群構(gòu)成所述細胞中35%到60%的量。
19.權(quán)利要求12的組合物，其特征在于所述細胞系中包含壞死表型細胞群。
20.權(quán)利要求19的組合物，其特征在于所述壞死細胞群構(gòu)成所述細胞中10%到25%的量。
21.權(quán)利要求12的組合物，其特征在于它包含以下同種異體黑素瘤細胞系的至少 一種組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)，其中所述細胞系是經(jīng)過照射的，且不能增殖。
22.權(quán)利要求21的組合物，其特征在于它還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
23.權(quán)利要求12的組合物，其特征在于它包含以下同種異體黑素瘤細胞系的至少 一種組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)，其中所述細胞系是經(jīng)過照射的，且不能增殖。
24.權(quán)利要求23的組合物，其特征在于它還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
25.用于輔助治療黑素瘤的組合物，其特征在于至少含有選自以下的同種異體黑素 瘤細胞系(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)及其組合。
26.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于所述細胞系是經(jīng)過照射的，且不能增殖。
27.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于所述細胞系中包含凋亡表型細胞群。
28.權(quán)利要求27的組合物，其特征在于凋亡細胞群構(gòu)成所述細胞中35%到60%的量。
29.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于所述細胞系中包含壞死表型細胞群。
30.權(quán)利要求29的組合物，其特征在于壞死細胞群構(gòu)成所述細胞中10%到25%的量。
31.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
32.權(quán)利要求31的組合物，其特征在于所述佐劑為BCG。
33.權(quán)利要求31的組合物，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑選自GM-CSF、G-CSF、IFN-a、環(huán) 磷酰胺及其混合物。
34.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于包含以下同種異體黑素瘤細胞系的至少一 種混合物(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)，其中所述細胞系是經(jīng)過照射的，且不能增殖。
35.權(quán)利要求34的組合物，其特征在于還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
36.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于包含以下同種異體黑素瘤細胞系的至少一 種混合物(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中 心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心 DSMZ)，其中所述細胞系是經(jīng)過照射的，且不能增殖。
37.權(quán)利要求36的組合物，其特征在于還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
38.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于所述組合物作為輔助治療與選自手術(shù)、放射療 法、化學療法、生物化療和免疫療法的療法組合使用。
39.用于治療人黑素瘤的組合物，其特征在于包含成熟的自體樹突細胞、載有來自至少 一種異源人黑素瘤細胞系之細胞的自體樹突細胞、來自所述至少一種異源人黑素瘤細胞系 的凋亡細胞和來自所述至少一種異源人黑素瘤細胞系的壞死細胞。
40.權(quán)利要求39的組合物，其特征在于所述人黑素瘤細胞系選自(a)Mel-XYl(以保 藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel_XY2 (以保藏 號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel_XY3 (以保藏號 DSMACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(d)Mel_XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(e)上述細胞系的亞群以及(a) 至(d)的組合。
41.權(quán)利要求39的組合物，其特征在于所述成熟的樹突細胞具有⑶14_、⑶llc+、⑶la+ 和⑶83+的表型。
42.權(quán)利要求39的組合物，其特征在于還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
43.用于輔助治療人黑素瘤的組合物，其特征在于包含成熟的樹突細胞、載有來自至少 一種異源人黑素瘤細胞系之細胞的樹突細胞、來自一種異源人黑素瘤細胞系的凋亡細胞和 來自一種異源人黑素瘤細胞系的壞死細胞。
44.權(quán)利要求43的組合物，其特征在于所述細胞系選自(a)Mel-XYl(以保藏號 DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel_XY2 (以保藏號 DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel_XY3 (以保藏號 DSMACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(d)Mel_XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(e)上述細胞系的亞群以及(a) 至(d)的組合。
45.權(quán)利要求43的組合物，其特征在于所述成熟的樹突細胞具有⑶14_、⑶llc+、⑶la+ 和⑶83+的表型。
46.權(quán)利要求43的組合物，其特征在于還含有賦形劑、佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
47.權(quán)利要求43的組合物，其特征在于所述組合物作為輔助治療與選自手術(shù)、放射療 法、化學療法、生物化療和免疫療法的療法組合使用。
48.制備根據(jù)權(quán)利要求12、21、23、25、34或36中任一項的組合物的方法，其特征在于以 下步驟a)解凍并培養(yǎng)以下細胞系(a)Mel-XYl(以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞 培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培 養(yǎng)物保藏中心DSMZ)；b)混合這三種細胞系；c)照射這三種細胞系；d)向細胞系混合物中加入佐劑和賦形劑。
49.權(quán)利要求48的方法，其特征在于以50到lOOGy的值照射所述細胞。
50.權(quán)利要求48的方法，其特征在于所述佐劑為BCG。
51.權(quán)利要求48的方法，其特征在于在步驟d)中還加入免疫調(diào)節(jié)劑。
52.權(quán)利要求51的方法，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑選自GM-CSF、G-CSF、IFN-a、環(huán)磷 酰胺及其混合物。
53.權(quán)利要求48的方法，其特征在于步驟a)中還含有細胞系Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心)。
54.制備根據(jù)權(quán)利要求39或43中任一項的組合物的方法，其特征在于包括以下步驟a)解凍并培養(yǎng)以下細胞系(a)Mel-XYl(以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞 培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3 (以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng) 物保藏中心DSMZ)和Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保 藏中心)；b)混合這些細胞系；c)照射這些細胞系；d)獲得自體樹突細胞；和，e)將自體樹突細胞與步驟c)的經(jīng)照射細胞共培養(yǎng)一定時間。
55.權(quán)利要求54的方法，其特征在于以50到lOOGy的值照射所述細胞。
56.權(quán)利要求54的方法，其特征在于共培養(yǎng)在35到39°C的溫度下進行6到72小時的 時間。
57.權(quán)利要求54的方法，其特征在于步驟e)中自體樹突細胞與細胞系之間的比例為 1 1 至 IJ 3 1。
58.權(quán)利要求54的方法，其特征在于步驟e)的樹突細胞中包含未成熟的樹突細胞。
59.在患黑素瘤的患者中誘導抗腫瘤免疫應答的方法，其特征在于包括對有此需要的 患者施用有效量的以下細胞系之間的組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德 國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2 (以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微 生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏號DSMACC2832保藏于德國微生 物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中所述細胞系不能增殖。
60.權(quán)利要求59的治療方法，其特征在于它經(jīng)皮內(nèi)施用。
61.權(quán)利要求59的治療方法，其特征在于它與佐劑一起施用。
62.權(quán)利要求61的治療方法，其特征在于所述佐劑為BCG，其量為每個給藥劑量中 0. 1-2X106集落形成單位。
63.權(quán)利要求59的治療方法，其特征在于它與免疫調(diào)節(jié)劑一起施用。
64.權(quán)利要求63的治療方法，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑為GM-CSF，其量為每次給藥 劑量中100到600 ii g。
65.權(quán)利要求59的治療方法，其特征在于所述細胞有效量包含5-50X 106個細胞的組口 O
66.在患黑素瘤的患者中誘導抗腫瘤免疫應答的方法，其特征在于包括向有此需要的 患者施用有效量的以下細胞系之間的組合(a)Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德 國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2 (以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微 生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3 (以保藏號DSMACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和 細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中所述細胞系不能增殖。
67.權(quán)利要求66的治療方法，其特征在于它經(jīng)皮內(nèi)施用。
68.權(quán)利要求66的治療方法，其特征在于它與佐劑一起施用。
69.權(quán)利要求66的治療方法，其特征在于所述佐劑為BCG，其量為每個給藥劑量中 0. 1-2X106集落形成單位。
70.權(quán)利要求66的治療方法，其特征在于它與免疫調(diào)節(jié)劑一起施用。
71.權(quán)利要求66的治療方法，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑為GM-CSF，其量為每個給藥 劑量中100到600 ii g。
72.權(quán)利要求66的治療方法，其特征在于所述細胞有效量包含5到50X 106個細胞的 組合。
73.在患黑素瘤的患者中誘導抗腫瘤免疫應答的方法，其特征在于包括向有此需要的 患者施用有效量的自體樹突細胞與以下細胞系之間的組合的6到72小時共培養(yǎng)物(a) Mel-XYl (以保藏號DSM ACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(b) Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c) Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(d) Mel-XX4(以保藏號DSM ACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，其中所 述細胞系不能增殖。
74.權(quán)利要求73的方法，其特征在于所述自體樹突細胞在共培養(yǎng)開始時是未成熟樹 突細胞，在共培養(yǎng)結(jié)束時是成熟自體樹突細胞和載有以下細胞系的自體樹突細胞的混合 物(a)Mel-XYl (以保藏號DSMACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、 (b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)、(c) Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)和(d) Mel-XX4(以保藏號DSMACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)。
75.權(quán)利要求73的方法，其特征在于在共培養(yǎng)結(jié)束時每個細胞系的細胞中包含凋亡細 胞群和壞死細胞群的混合物。
76.權(quán)利要求73的方法，其特征在于它經(jīng)皮內(nèi)施用。
77.權(quán)利要求73的方法，其特征在于來自共培養(yǎng)物的細胞有效量共包含5-50X106個 細胞。
全文摘要
用于治療黑素瘤的細胞系、含有它們的組合物、制備所述組合物的方法以及治療方法。更特別地，本發(fā)明涉及用于治療惡性疾病的多種人黑素瘤細胞系，其中所述細胞系為(a)Mel-XY1(以保藏號DSMACC2830保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，(b)Mel-XY2(以保藏號DSM ACC2831保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，(c)Mel-XY3(以保藏號DSM ACC2832保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，(d)Mel-XX4(以保藏號DSMACC2829保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心DSMZ)，或(e)它們的亞群。所述細胞系可以是經(jīng)過照射的，從而獲得上述細胞系的凋亡表型群和壞死表型群。所述組合物可以含有佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑和/或自體樹突細胞。
文檔編號A61K39/00GK101861163SQ200880018249
公開日2010年10月13日 申請日期2008年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月11日
發(fā)明者喬斯·莫多, 埃里卡·馬里亞·萬厄弗烏, 馬里亞·馬塞拉·巴里奧 申請人:國家科學和技術(shù)研究委員會(Conicet);銷售基金會;Inis生物技術(shù)有限責任公司