專利名稱：：植物提取物及其治療用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種植物提取物及其治療用途，即一種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的包括春黃菊花的水提取物的組合物，所述組合物在制備治療增殖性和/或炎癥性病癥的藥物中的用途，和一種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的方法，所述方法包括給藥需要其的人類或動物患者有效量的所述組合物。本發(fā)明特別地涉及一種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的、含有春黃菊花的水提取物的組合物，其中所述春黃菊花為Florestubiformis。本發(fā)明進一步涉及所述組合物的用途，特征在于所述病癥為癌癥，優(yōu)選成膠質細胞瘤或肺癌或前列腺癌。本發(fā)明還涉及所述組合物在制備用于治療炎癥性病癥，更優(yōu)選MorbusChron,最優(yōu)選多發(fā)性硬化癥的藥物中的用途。
背景技術：
：已知多種植物的治療性質幾千年。然而，即使在今天，對有效組分的屬性及其性質了解很少，即使對于已經(jīng)研究的那些植物，因為藥物研究通常集中于小分子，認為其具有相對可預測的性質，并且其合成可以控制。Uteshev等人在Eksp.Klin.Fa腿kol.(1999年11月畫12月)62(6):52-5中描述了在大氣和浸泡冷卻期間從德國春黃菊(Matricariachamomilla)獲得的雜多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。Laskova和Uteshev在Antibiot.Khimioter.(1992Jun)37(6):15-8中描述了從春黃菊花分離的雜多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。所述水基提取物是口服或腹膜內(nèi)注射給藥。作者沒有建議任何治療應用，而是報道說刺激作用取決于劑量給藥方案，并且主要取決于試-瞼大鼠的冷卻方式和程度。WO2005/070440涉及一種用于治療變應性(allergic)哞喘或')"曼性支氣管哮喘的草藥處方，其包括特定量的干燥磨碎的春黃菊花、anisfrmts、黑籽等，作為茶水(teainfusion)給藥。WO03/101479描述了包括幾種組分的組合物的有4介值的治療性質，5所述幾種組分典型地通過肌肉注射一起給予。所使用的組合物包括春黃菊提取物，盡管沒有認為它具有治療活性；而是，其被描述為抗刺激劑，其的存在可以減輕注射本身使人不愉快的作用。WO2007/057651公開了一種從春黃菊中除去內(nèi)毒素的方法。發(fā)明概述出人意外地，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)從花頭獲得的，優(yōu)選地通過蒸汽蒸餾獲得的春黃菊提取物具有有價值的治療性質。已知這樣的水提取物由春黃菊花頭的揮發(fā)性組分組成，其描述在歐洲藥典中(MatricariaeaetheroleumPhEur5,corrected.5.1)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述提取物可以減少人類癌細胞中的DNA合成，并且抑制白細胞三烯和IL-6(白細胞介素6)的生成。更出人意外地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在黑枯茗(Nigellasativa)的種子油的存在下，揮發(fā)油的白細胞三烯合成的抑制作用協(xié)同地增強了。發(fā)現(xiàn)已知自身生成作為生長因子的白細胞介素6的癌細胞和已知自身生成白細胞三烯的癌細胞是特別敏感的。最近，可能推斷單獨的春黃菊的揮發(fā)油及其與黑枯茗籽油的組合具有意想不到的抗炎和抗癌性質，例如在治療炎癥、免疫性疾病和癌癥中。'因此，本發(fā)明涉及(1)一種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的組合物，其中含有春黃菊花的水提取物；(2)根據(jù)(l)的組合物，其中所述水提取物為揮發(fā)性油，其是通過包括優(yōu)選地在減壓下水蒸汽蒸餾春黃菊花的提取方法可獲得的；(3)根據(jù)(1)或(2)的組合物，其中所述春黃菊花為Florestubiformis;(4)根據(jù)(2)或(3)的組合物，其中所述蒸汽蒸餾在氮氣氛下進行，并且所述方法進一步包括步驟(i)用交聯(lián)聚維酮接觸所述組合物，與香豆素形成復合物；(ii)除去步驟(i)中形成的交聯(lián)聚維酮和香豆素的復合物；(iii)通過用無水硫酸鈉接觸步驟(ii)得到的組合物以除去水殘留物；和(iv)從步驟(iii)得到的組合物中分離硫酸鈉；(5)根據(jù)(1)至(4)中任一項的組合物，其中所述組合物另外包括黑枯茗油；(6)根據(jù)(5)的組合物，其中所述黑枯茗油為通過純化方法可獲得的純的黑枯茗油，所述純化方法包括步驟(i)用交聯(lián)聚維酮接觸黑枯茗油，與酚類化合物形成復合物；(ii)除去步驟(i)中形成的交聯(lián)聚維酮和酚類化合物的復合物；(iii)通過用無水^L酸鈉接觸步驟(ii)得到的黑枯茗油以除去水殘留物；和(iv)從步驟(iii)得到的黑枯茗油中分離硫酸鈉；(7)根據(jù)(1)至(6)中任一項的組合物，特征在于所述病癥為炎癥性病癥，優(yōu)選地選自MorbusChron和多發(fā)性硬化癥；(8)根據(jù)(1)至(6)中任一項的組合物，其中所述病癥為癌癥，優(yōu)選地選自成力交質細胞瘤、肺癌和前列&i癌；(9)根據(jù)(1)至(7)中任一項的組合物，特征在于所述炎性病癥是由自身免疫性疾病引起，優(yōu)選地由白細胞介素6觸發(fā)，更優(yōu)選地由白細J包三烯觸發(fā)，最優(yōu)選地取決于白細l包介素6和/或白細月包三烯的存在；(10)根據(jù)(1)至(6)和(8)中任一項的組合物，特征在于所述病癥是由增殖性疾病引起，優(yōu)選地由白細胞介素6觸發(fā)，更優(yōu)選地由白細胞三烯觸發(fā)，最優(yōu)選地取決于白細胞介素6和/或白細胞三烯的存在；(11)如(1)至(6)的任一項中定義的組合物的用途，用于制備治療增殖性和/或炎癥性病癥的藥物；(12)根據(jù)(ll)的用途，其中所述病癥如在(7)至(10)的任一項中定義的；(13)—種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的方法，其包括給藥需要其的人類或動物患者有效量的如(1)至(6)中任一項所定義的組合物；和(14)根據(jù)(13)的方法，其中所述病癥如在C7)至(10)的任一項中定義的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是基于使用春黃菊花頭的水提取物獲得的數(shù)據(jù)，所述水提取物優(yōu)選地為通過蒸汽蒸餾獲得的。精確地，所述水提取物由母菊術人員稱為Matricariaeaetheroleum,描述在PhEur5.1中。本發(fā)明進一7步是基于使用黑枯茗籽油和春黃菊花頭的揮發(fā)油的組合獲得的數(shù)據(jù)。所述提取物可以通過任何合適的方法獲得，包括本領域普通技術人員已知的方法。所述提取物可以通過使用水性或有機介質獲得，并且通過過濾、層析、超臨界流體萃取等將其與其它組分分離。例如，在本發(fā)明中可以使用的物質來源于Asteraceae才直物母菊的干花頭或其中的一種或多種物質，包括揮發(fā)油、母菊奧、沒藥醇及其它物質。一種優(yōu)選的方法是通過用交聚維酮(交聯(lián)聚維酮)和硫酸鈉接觸最初得到的揮發(fā)油而將其純化。本領域技術人員已知交聚維酮能夠復合酚類化合物和香豆素。已知硫酸鈉能結合水殘留物。分離純化劑會生成不含或接近不含香豆素、苯酚和水殘留物的提取物。春黃菊提取物的來源很重要。其應當來源于母菊(Florestubiformis)的花頭，優(yōu)選管狀花。所述組合物除了包含春黃菊的揮發(fā)油之外，還可包含作為活性成分的黑枯茗的種子油和乙酰半胱氨酸及抗壞血酸棕櫚酸酯。不需要存在其它試劑。所使用的組合物應當適于注射。為了該目的，期望除去內(nèi)毒素、多如具有分子量超過i:o:或io,ooo的那些。、z可以通過本領域技術人員已知的方法制劑本發(fā)明所使用的組合物。應該使用藥學可接受的組分。術語"藥學可接受的，，指那些從藥理學/毒理學觀點來看患者可接受的，以及從物理學/化學的觀點來看制備藥物的化學家可接受的那些性質和/或物質，這考慮到因素比如制劑、穩(wěn)定性、患者可接受性和生物利用率。優(yōu)選地通過靜月永內(nèi)，或更優(yōu)選地肌肉注射，仍最優(yōu)選地通過呈氣霧劑或微/納米乳劑經(jīng)由呼吸道的吸入器給藥。包含所述活性成分的藥物組合物可以為適合于口服使用的形式，例如，如片劑、藥片、4t劑、含水或含油懸浮液、可分散的粉劑或顆粒劑、乳劑、硬膠嚢或軟膠嚢、或糖漿劑或酏劑。這些組合物可以包含一種或多種選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以提供藥物上精制且美味的制劑。片劑包含活性成分與無毒的藥學可接受的賦形劑的混合物，其中所述賦形劑為比如，例如惰性稀釋劑，比如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸釣或磷酸鈉；成粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉或褐藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。所述片劑可以是未包衣的，或者它們可以是采用已知的技術包衣，以延遲在胃腸道中崩解和吸收，從而提供4交長時間的持續(xù)作用。例如，可以使用延時的物質比如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們也可以#皮包衣，以形成用于控制釋》文的滲透性治療片。用于口服使用的制劑也可以以明膠硬膠嚢的形式存在，其中將活性成分為與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或者以明膠軟膠嚢的形式存在，其中將活性成分與水或油介質例如花生油、液體石蟲普或橄欖油混合。含水混懸劑可以包含活性物質與合適的賦形劑的混合物。這些賦形劑為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、曱基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或潤濕劑，例如天然存在的磷脂，比如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如十七乙烯氧基鯨蠟醇，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，比如聚氧乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。含水懸浮液也可以包含一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑和一種或多種甜味劑比如蔗糖或糖精。含油混懸劑可通過將活性成分懸浮在植物油或礦物油中來制備，所述植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，所述礦物油比如液體石蠟。所述含油懸浮液可包含增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。可以加入甜味劑(比如上述列出的那些)，并且可以加入調(diào)p木劑以提供可口的口力良制劑。這些組合物可以通過加入抗氧劑比如抗壞血酸來防腐。用于通過加入水來制備含水混懸劑的合適的可分散粉劑和顆粒劑提供了活性成分和分散劑或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合物。合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑為上述示例的。也可以存在甜味劑、調(diào);朱劑和著色劑。本發(fā)明所使用的藥物組合物也可以為水包油型乳劑的形式。油相可以為植物油，例如橄欖油或花生油，或者礦物油，例如液體石蠟或這些物質的混合物。合適的的乳化劑可以是天然存在的樹膠，例如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脫水山梨糖醇單油酸酯，以及所述偏酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。所述乳劑也可以包含甜P木劑和調(diào)P未劑。糖漿或酏劑可以用甜"朱劑來配制，所述鄰"朱劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。這些制劑也可以包含緩和劑、防腐劑和調(diào)味劑及著色劑。該藥物組合物可以為無菌可注射的含水或含油混懸液的形式。該懸浮液可以使用合適的分散劑或潤濕劑和混懸劑來制備，所述分散劑或潤濕劑和混懸劑的實例為上述提及的。無菌可注射的制劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射的溶液劑或混懸劑，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的賦形劑和溶劑中有水、林才各溶液和等滲氯化鈉溶液。而且，通常使用無菌、不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質。為了該目的，可以使用任意溫和的非揮發(fā)油，包括合成性單或甘油二酯。而且，脂肪酸比如油酸可用于可注射性制劑中。所述組合物也可以以用于直腸給藥所述藥物的栓劑形式給藥。這才羊的組合物可以通過混合藥物與合適的無刺激性賦形劑來制備，所述賦形劑在常溫為固體，但是在直腸溫度為液體，因此，將在直腸中溶化以釋放所述藥物。這樣的物質為可可脂和聚乙二醇。對于局部應用，合適的組合物為例如乳膏劑、軟膏劑、膠狀物、溶液劑或混懸劑的形式。如上所述，本發(fā)明的組合物可以通過注射給予。盡管任何非腸道纟會藥都是合適的，但是肌肉注射是優(yōu)選的。還可以優(yōu)選的是口力良給予所述組合物。在這種情況下，并且如果佳_用促滲劑，不應當將胰島素包括在口服制劑中。對于獸醫(yī)學，口服給藥可以是特別優(yōu)選的。也可以給予受試者其它的活性物質。盡管不相信其它物質為必需的，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些類固醇和維生素，典型地口服給予時，可以支持或增加所述藥物的效果。合適的甾體激素可增加特定蛋白質的合成，其通過在主要代謝產(chǎn)物比如維生素和氨基酸的幫助下暴露某些順反子來達到。合適的類固醇的實例為雌二醇、諾龍和雌三醇。也可以給予維生素比如A、D和/或E。維生素A的作用可能是保存上皮組織的完整性、在蛋白質合成中起作用以及穩(wěn)定細胞膜和亞細胞膜。的精^劑量和頻率取決于一些因素。'這些因素包括使用的特定組分、要治療的特定病癥、病癥的嚴重性、特定患者的年齡、體重和一般身體狀況、以及個體可能服用的其它藥物，這是本領域技術人員熟知的。圖1A顯示了實施例1中母菊屬(Matricaria)精油對IL-6抑制復制1(inhibitionreplication1)的結果VIP—Matr'07—78IC50=5pg/ml(圖解確定)PRISMIC50=7.782|ng/ml(用GraphPadPrism計算)95%區(qū)間3.169至19.11圖IB顯示了實施例1中母菊屬精油對IL-6抑制復制2的結果VIPMatr'0778IC50=8fig/ml(圖解測定)PRISMIC50-8.78pg/ml(用GraphPadPrism計算)95%區(qū)間6.248至12.35pg/ml圖1C顯示了實施例1中Nigella精油對IL-6抑制復制1的結果VIP—Nig，07_8IC5(H不適用PRISMIC50-沒有會聚點(GraphPadPrism)95%區(qū)間圖1D顯示了實施例1中Nigella精油對IL-6抑制復制2的結果VIP—Nig'07—8IC50:不適用PRISMIC50-沒有會聚點(GraphPadPrism)95%區(qū)間圖2顯示了從實施例2的5-LOX抑制測定得到的結果，實施例2試驗了NICHA對5-LOX活性的抑制(平均2至4個獨立的測定(結果來自3個獨立的對ViP—E—Nig，07—8的5-lox測定、4個獨立的對VIP—Matr07—78的5-lox測定和2個獨立的對混合物1:1的5-lox測定)。圖2A:ViP_Matr，07—78(春黃菊油)，復制1圖2B:ViP—Nig，07—8(Nigellasativa油)，復制1圖2C:ViP—Matr'07—78(春黃菊油)，復制2圖2D:ViP—Nig,07—8(Nigellasativa油)，復制2ii圖2E:混合物1:1(VIP—Matr，07一78:ViP—E—Nig，07—8)圖3顯示了在實施例2中，在NICHA作用下，WST-l對HL-60細胞的生存力測定得到的結果。圖3A:ViP一Matr，07—78(春黃菊油)圖3B:ViP一Nig，07一8(Nigellasativa油)圖4顯示了在實施例3中，NICHA對前列腺癌細胞DU145中的DNA合成的作用得到的結果。圖4A:24小時培養(yǎng)，ViP—Matr，07_78(春黃菊油)圖4B:24小時培養(yǎng)，ViP一Nig，07—8(Nigellasativa油)圖4C:48小時培養(yǎng)，ViP一Matr，07—78(春黃菊油)圖4D:48小時培養(yǎng)，ViP一Nig，07一8(Nigellasativa油)圖5顯示了在實施例3中，在48小時培養(yǎng)期間，NICHA對U-87MG細胞中的DNA合成的作用得到的結果。圖5A:ViP—Matr，07一78(春黃菊油)圖5B:ViP一Nig，07一8(Nigellasativa油)圖5C:混合物1:1(VIP一Matr，07—78:ViP—E一Nig，07一8)實施例下述實施例進一步闡述本發(fā)明。實施例1-在THP1(巨嗟細胞)中，對白細胞介素6釋放的抑制活性樣品和參考物質試驗樣品種屬供應商Art.No批號ViP編號Nigella油NigellaeoleumH紐selerAG26-4150-12006.08.0537ViP—Nig'07—8母菊屬精油M3tric虹i3eAetheroleumPhEurH紐selerAG卜4925-22006.09.0181ViP—Matr'07—78參考物質順序編號批號供應商測定NDGA74540422780/15400Fluka對不同的HL-60細胞的5-LOX抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*該測定是以兩個獨立的復制進4亍的。對THP-1細l包的IL-6抑制測定在37°C,用細胞(人類THP-1)預培養(yǎng)樣品30分鐘，所述細胞此前用PMA分化(0,125x106細胞/孔)。用LPS(lug/ml)開始該反應，并且在37。C進行所述培養(yǎng)超過24小時。在沒有LPS-刺激下，用測定混合物進行陰性對照t(O)[參考l]。用購自CaymanNo:583361的酶免疫測定(EIA)試劑盒進行IL-6的定量。在波長=415nm測定光密度。使用至少5種不同濃度的標準曲線計算數(shù)量。每個樣本點測定雙份。將劑量相關抑制值表示為陽性對照值的百分凄丈。用牙呈序GraphPad陽Prism(Version4,GraphPadSoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)測定IC50值(相當于抑制水平為50%時的樣品濃度)。結果實施例1的結果顯示在圖1中。實施例2-在人類癌細胞系中，NICHA001對白細胞三烯釋放的抑制活性研究了在不同濃度的NICHA時，兩個人類細胞系(粒細胞)對白細胞三烯釋放的反應。用Nigella油、春黃菊油和兩種油的組合進行各個試驗。樣品試驗樣品描述供應商Art.No批號ViP編號Nigella油NigellaeoleumH紐selerAG26-4150-12006.08.0537ViP—Nig'07一8MatricariaMatricariasH紐selerAG1-4925-22006.09.0181ViP—Matr'07—78精油AetheroleumPhEur測定測定細胞系樣品試驗濃度5-L0X抑制粒細胞ViP—Nig'07—80,3/3/30ng/ml分化的HL60ViP—Matr'07—780.1/0.3/1/3/10/30ng/ml混合物0，3/3/30ng/mlWST-1測定HL-60細胞ViP—Nig'07—80,3/3/30ng/mlViPMatr'07785-LOX抑制測定將人類HL-60細胞(髓細胞性白血病，DSMZNoACC3)保存在37。C下的濕潤大氣中，所述濕潤大氣中含有5%的C02,并將其培養(yǎng)在完全RPMI1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補充有10%的胎牛血清和1。/。(v/v)青霉素/鏈霉素溶液。用DMSO(1.2。/。的v/v)分化細胞6至8天。如Bennet等人描述的[參考2]進行5-LOX活性測定。簡言之，收集分化的細胞，懸浮在包含Ca"(lmM)和葡萄糖(lmM)的PBS中，并將其分布在96-孔微量滴定板(lx106細胞/孔)中。在室溫下，用樣品或賦形劑預培養(yǎng)15分鐘后，加入鈣離子載體A23187(5uM)和花生四烯酸(10uM)開始反應。所有的值都是最終濃度。在沒有鈣離子載體刺激下進行陰性對照。在37°C,培養(yǎng)所述測定混合物15分鐘，通過加入lOOjil的包含HC1(1M,3%v/v)的甲醇和將孩吏量滴定板放置在水上終止反應。在用50nl的PBS中和和離心(340xg)10分鐘后，測定上清液中的LTB4濃度。通過測定在測定條件下生成的白細月包三烯B4的量來測量樣品和參考化合物[參考3]對5-LOX活性的作用。用購自CaymanNo520111(LTB4)的酶免疫測定(EIA)試劑盒進行白細胞三烯B4的定量。在波長14二415nm測定光密度。使用至少5種不同濃度的標準曲線計算數(shù)量。每個樣本點測定雙份。將劑量相關抑制值表示為陽性對照值的百分數(shù)。如果可適用的，用程序GraphPad-Prism(第4版，GraphPadSoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)測定IC50值(相當于抑制水平為50%時的樣品濃度)。WST-1對HL60的生存力測定細i包功能/線粒體用TetrazoliumsaltWST-1試劑盒(Biovision,K301-500,CAUSA)試驗對人類肝細胞(HepG2)、人類粒細胞(分化的HL60)、人類單核細胞(THP-1)和人類巨噬細胞(分化的THP-l)的代謝活動的減少[參考4]。用提取物預培養(yǎng)所述細胞24小時。通過活細;9包將四唑鹽WST-1還原為甲臘(formazan)的能力測量細胞的代謝活性。通過用板讀數(shù)器(BioRad，USA)測定波長入=450nm的光密度(OD)來直接測量曱鵬的量。進行該光學測量三次，計算標準偏差。對于每個試驗濃度，從含有細胞的OD測量結果的平均值減去空白(樣品的測定混合物，但不含細胞)的OD值。將OD450-值轉化成具有100%的生存力讀數(shù)(相當于不含樣品的對照測量結果)的百分數(shù)值。結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例3-NICHA001對人類癌細胞系增殖的影響研究不同濃度的NICHA下，成月交質細胞瘤細胞和前列腺癌細胞的增殖反應。用Nigella油、春黃菊油和兩種油的組合進行各個試驗。樣'試驗樣品描述_供應商Art.No批號_ViP編號NigellaoilNigellaeoieumH紐selerAG26-4150-12006.08.0537ViP—Nig，07一8母菊屬精油MatricariaeH紐selerAG1-4925-22006.09.0181ViP—Matr'07—78AetheroleumPhEur測定測定_細胞系_^_試驗濃度DNA合成前列腺癌細胞ViP—Nig，07—80,3/3/30嗎/mlDU145ViP—Matr'07—780,3/3/30/60ng/ml成膠質細胞瘤細胞ViP—Nig'07_80,3/3/30ng/mlU-87MGViP一Matr'07—78混合物DNA合成3H-胸苷結合通過胰蛋白酶消化收集DU145和U-87MG細胞，并且以IO，OOO細胞/孔接種在96孔板中。在37。C和5%的C02下，用所需濃度的樣品培養(yǎng)所述細胞24小時和/或48小時。將細胞用3H-胸苷(ljuci/ml)(PerkmElmer)脈沖24小時。之后，用PBS洗滌它們，并用甲醇固定兩次，每次5分鐘。用0.3NTCA沉淀蛋白質。在洗滌步驟之后，加入150jul的0,3NNaOH,用15分鐘，以溶解細胞。用不含有細月包的樣品測量背景對照。為了檢測用于DNA合成的加入的311-胸苷，將樣品轉移到含有閃爍混合物的閃爍管中。在Tn-Carb1900TR液體閃爍計數(shù)器(Packard,USA)中進行定量。在測定條件下，通過測定放射性標i己(dpm)的量來測量幾種濃度樣16品的作用。將劑量相關值表示為陽性對照值的百分數(shù)。樣本點測量四卞分，將i吳差表示為標準偏差。前列腺癌細胞DU145得到的結果NICHA對前列腺癌細胞(DU145)中的DNA合成作用的結果顯示在圖4A-4D中。參考化合物對DNA合成的IC5o值如下24h培養(yǎng)48h培養(yǎng)參照ic5095%置信水平ic5095%置信水平(nM)(nM)(nM)(nM)喜樹堿152115.9至199.47，55.1至11,0成膠質細胞瘤細胞U87MG得到的結果NICHA對U-87MG纟田胞(48小時培養(yǎng))中的DNA合成的影響的結果顯示在圖5A-5C中。參考化合物對U-87MG細胞的DNA合成的IC50值如下48h培養(yǎng)參照ic5095%置信水平(nM)(nM)喜樹堿3,322.5至4.4根據(jù)實施例結果的結論研究了春黃菊(Matricariarecutita:VIP—Matr07—78)的精油和黑枯茗(Nigellasativa:VIP一Nig07—8)的種子油抑制分化的人類粒細胞細胞系HL60(人類急性髓細胞樣白血病)中白細胞三烯合成的可能性。Nigellasativa種子油顯示了對5-Lox活性給人深刻印象的抑制，IC50值為3.02ug/ml(實施例2,圖2d)。令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)所述兩種化合物的混合物抑制HL60粒細胞細胞系中白細胞三烯的合成強于添加劑。與預期的IC50值為0.76ug/ml不同，得到的IC50為0.53ug/ml(實施例2,圖2e)。因此，我們得到結論所述兩種化合物的組合增強了單組分的活性。VIP—Matr07_78顯示出對于白細月包三烯合成的抑制甚至更加高得多的抑制活性，顯示出的IC50值為0.38ug/ml(實施例2,圖2c)。因此，母菊屬精油看來是一種非常有效的5-LOX抑制劑。為了評價觀察的抑制活性是否僅僅是細胞毒素作用的結果，我們用選擇的濃度培養(yǎng)細胞，用于5-LOX試驗，并測定線粒體活性(WST)。如在圖3a和3b中所示，用選擇濃度的VIP—Nig07—8或VIP_Matr07—78沒有出現(xiàn)任何細胞毒性(實施例2,圖3a和3b)。因此，我們得到結論觀察到的抑制白細胞三烯合成的活性是與5-脂氧合酶特異性相互作用的結果。也獲得了關于人類巨噬細胞細胞系THP1釋放白細胞介素6的進一步的結果。雖然Nigellasativa沒有顯示出任何活性(實施例1,圖lc和ld),但是母菊以劑量依賴性方式抑制THP1細胞釋放白細胞介素6,并且IC50值為5ug/ml(實施例1,圖la和lb)。重復試'驗(復制2)顯示出復制1的結果(實施例l)有可重現(xiàn)性。我們的結果表明母菊屬的精油顯示出對人類急,性髓細胞樣白血病細胞HL60中白細胞三烯合成的強的抑制活性(實施例2,圖2c)。進一步地，該結果還顯示出在人類巨噬細胞細胞系THP1中白細胞介素6的釋放可能受到抑制(實施例，圖la和lb)。由于獲得抑制作用所需的濃度相當?shù)氐停覀兺茰y治療有效量在人類終將容易地達到，特別地由于精油是高親脂性的和應當容易被吸收。結合精油能夠以納摩爾范圍的濃度有效地抑制人類粒細胞細胞系HL60中類花生酸類物質(白細胞三烯)形成的特征，該母菊的精油似乎是用于研究治療炎癥/自身免疫性疾病和某些類型癌癥的藥物的很有價值的候選物。在第三類試-驗(實施例4)中，我們研究了Nigellasativa的種子油或母菊屬的揮發(fā)油是否在體外抑制前列腺癌細胞系DU145和成膠質細胞瘤細胞系U87MG中DNA的合成。在48小時后，母菊(VIP—Matr07—78)以劑量依賴性方式同時抑制這兩種細胞系的DNA合成(實施例4,圖4c)，然而，Nigellasativa(VIP—Nig07—8)沒有顯示出對這兩種癌細胞系的抑制作用(實施例4，圖4d)。由于已知DU145生成作為生長因子的白細I包介素6，那么似乎DNA合成的抑制是(至少部分是)由于母菊的揮發(fā)油對白細胞介素6釋》文的抑制活性引起的。明顯地，成月交質細胞瘤細胞系U87MG的DNA合成的抑制是母菊的揮發(fā)油對白細胞三烯合成的強抑制的作用。權利要求1.一種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的組合物，包括春黃菊花的水提取物。2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述春黃菊花為Florestubiformis。3.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述該水提取物是通過包括水蒸汽蒸餾春黃菊花的提取方法可獲得的揮發(fā)油，優(yōu)選在減壓下進行。4.根據(jù)權利要求3的組合物，其中所述蒸汽蒸餾在氮氣氛下進行，并且所述方法進一步包括下述步驟(i)用交聯(lián)聚維酮接觸所述組合物，交聯(lián)聚維酮與香豆素形成復合物，(ii)除去步驟(i)中得到的復合物；和(iii)通過用無水硫酸鈉接觸步驟(ii)得到的組合物以除去水；和(iv)從步驟(iii)得到的組合物中分離硫酸鈉。5.根據(jù)權利要求4的組合物，其基本上不含水，優(yōu)選地包含少于0.1%w/w的水，最優(yōu)選地包含少于0.01。/。w/w的水。6.根據(jù)權利要求5的組合物，其基本上不含香豆素，以7-羥基香豆素來計算，優(yōu)選地包含少于0.1%w/w,最優(yōu)選i也包含少于0.005%w/w的香豆素。7.根據(jù)權利要求5或權利要求6的組合物，其包含含量為5-15%w/w,更優(yōu)選15-25%w/w,最優(yōu)選20-30%w/w的母菊萸。8.根據(jù)權利要求1-7任一項的組合物，其中還包含黑枯茗油。9.根據(jù)權利要求8的組合物，其中所述黑枯茗油為通過純化方法可獲得的純的黑枯玄油，所述純化方法包括下述步驟(i)用交聯(lián)聚維酮接觸黑枯茗油，交聯(lián)聚維酮與酚類化合物形成復合物；(ii)除去步驟(i)中得到的復合物；和(iii)通過用無水硫酸鈉接觸步驟(ii)得到的黑枯茗油以除去水；和(iv)從步驟(iii)得到的黑枯茗油中分離硫酸鈉。10.根據(jù)權利要求1至9中任一項的組合物，其中所述組合物是可通過超濾獲得的，優(yōu)選地4吏用具有孔徑為0.001至0.02pm,更優(yōu)選地0.001至O.Olpm的過濾器。11.根據(jù)權利要求1至10中任一項的組合物，其不含或基本上不含內(nèi)毒素，優(yōu)選地包含含量為100EU/ml(按照Ph.Eur的內(nèi)毒素單位/ml)或更少，更優(yōu)選50EU/ml或更少，仍更優(yōu)選10EU/ml或更少的內(nèi)毒素。12.根據(jù)權利要求1至11中任一項的組合物，其不包含具有分子量超過IO，OOO的物質，更優(yōu)選地不包含具有分子量超過1,000的物質。13.根據(jù)權利要求1至12中任一項的組合物，其不含或基本上不含選自下述的化合物香豆素、類黃酮、春黃菊和/或黑枯茗的典型雜質的其它酚類化合物和殘留水。14.根據(jù)權利要求1至13中任一項的組合物，其另外包括抗壞血酸椋櫚酸酯和/或乙酰半胱氨酸。15.根據(jù)權利要求1至14中任一項的組合物，其另外包括至少一種藥物助劑，優(yōu)選地選自藥用試劑和藥用賦形劑。16.根據(jù)權利要求1至15中任一項的組合物，其中通過注射或吸入所述組合物進4亍治療。17.根據(jù)權利要求1至16中任一項的組合物，其中所述病癥為炎癥性病癥，優(yōu)選地選自MorbusChron和多發(fā)性硬化癥。18.4艮據(jù)4又利要求1至16的組合物，其中所述病癥為癌癥，優(yōu)選地選自成膠質細胞瘤、肺癌和前列腺癌。19.根據(jù)權利要求1至17中任一項的組合物，其中炎癥性病癥是由自身免疫性疾病引起，優(yōu)選地由白細胞介素6觸發(fā)，更優(yōu)選地由白細胞三烯觸發(fā)，最優(yōu)選地取決于白細月包介素6和/或白細月包三烯的存在。20.^f艮據(jù)權利要求1至16和18中任一項的組合物，其中所述病癥是由增殖性疾病引起，優(yōu)選地由白細胞介素6觸發(fā)，更優(yōu)選地由白細胞三烯觸發(fā)，最優(yōu)選地取決于白細胞介素6和/或白細胞三烯的存在。21.如權利要求1至15中任一項定義的組合物的用途，用于制備治療增殖性和/或炎癥性病癥的藥物。22.根據(jù)權利要求21的用途，其中所述治療為如權利要求16所定義的。23.根據(jù)權利要求21或22的用途，其中所述病癥為如權利要求17至20中任一項所定義的。24.—種用于治療增殖性和/或炎癥性病癥的方法，其包括給藥需要其的人類或動物患者有效量的如權利要求1至15中任一項所定義的組合物。25.根據(jù)權利要求24的方法，其中通過注射和/或吸入所述組合物進行給藥。26.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述組合物為可注射的組合物。27.根據(jù)權利要求24至26中任一項的方法，其中所述病癥為如外又利要求17至20中4壬一項所定義的。全文摘要一種包括春黃菊花的水提取物的組合物，用于治療增殖性和/或炎癥性病癥。文檔編號A61K36/185GK101687001SQ200880018227公開日2010年3月31日申請日期2008年6月2日優(yōu)先權日2007年6月1日發(fā)明者M·H·克魯特申請人:因塞尼昂控股有限公司