一種制備具有抗凝血活性的海藻寡糖的方法
【專利說明】
[0001] 交叉引用的相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2014年9月23日提交的，申請?zhí)枮?01410489425. 3,發(fā)明名稱為"一 種具有抗凝血活性海藻寡糖的制備方法"的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)，其說明書以全文引用 的方式的并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種制備具有抗凝血活性的海藻寡糖的方法。本發(fā)明也涉及一種由所 述方法所制得的具抗凝血活性的海藻寡糖，以及含有該海藻寡糖的組合物。
【背景技術(shù)】
[0004] 某些海藻多糖及寡糖因其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)組成，以及其生理活性的重要性，多年來 已被研究探討，不少具有硫酸基的多糖及寡糖具有獨特的生理活性，如肝素（heparin) 具抗凝血功效。舉例來說，帶有硫酸基且可作為抗凝血劑的海藻多糖膠有鹿角菜膠 (carrageenan)及巖藻聚糖（fucoidan) 〇
[0005] 巖藻聚糖（fucoidan)是褐藻及某些海洋無脊椎動物（如：海膽、海參）所含的物 質(zhì)，主要結(jié)構(gòu)包含大量的L-巖藻糖（L-fucose)及硫酸酯基團。然而，每種褐藻的巖藻聚糖 的結(jié)構(gòu)組成皆有所差異，除了巖藻糖及硫酸基團以外，還包含了其他單糖，因此在生理活性 上會有不同的變化。已知從裙帶菜（Undaria pinnatifida sporophyll)所產(chǎn)生的巖藻聚 糖經(jīng)由酵素水解處理，獲得較低分子量的巖藻聚糖，于抗凝血實驗結(jié)果呈現(xiàn)具有延遲血液 凝結(jié)的效果。此領(lǐng)域尚有研究顯示，海藻多糖經(jīng)酵素水解處理后，一般尚需經(jīng)化學(xué)方法提高 硫酸基含量，以提高抗凝血活性，然而，以化學(xué)方法（如加入氯磺酸-二甲基甲酰胺試劑） 提高硫酸基含量必須使用化學(xué)試劑，這些試劑多有毒性，需要進一步的移除及純化，制備成 本較高。
[0006] 藻類除了提供海中生物棲息、覓食、繁衍、避難之外，對于人類的健康及醫(yī)療，也有 不可抹殺的貢獻。海藻中的某些特殊成分是人體內(nèi)所需的重要元素、胺基酸、維生素的來 源。在古代中國和日本等國家，都有以海藻作為食物及藥物的證據(jù)，古醫(yī)典包括《本草綱 目》、《本草經(jīng)集注》、《海藥本草》及《本草拾遺》等都有用海藻治療各種疾病的相關(guān)記載。海 藻也是印度尼西亞及其他東南亞國家的傳統(tǒng)藥材，用于退燒、治咳，以及治療氣喘、痔瘡、流 鼻涕、腸胃不適及泌尿疾病等。日本人喜歡食用海藻，以加強身體抗癌、抗腫瘤的能力，且可 有效改善糖尿病癥狀及紓解緊張壓力。
[0007] 因此，需要提供一種制備具有抗凝血活性的海藻寡糖的方法，特別是以天然海藻 為料源，無需以化學(xué)方法提高硫酸基含量，而可產(chǎn)生具有抗凝血活性的海藻寡糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明非可預(yù)期地發(fā)現(xiàn)，以含有來自馬尾藻、石花菜或青海菜的海藻多糖的細(xì)菌 培養(yǎng)液培養(yǎng)海洋菌株，即泡囊假單胞菌（Pseudomonas vesicularis)及/或殺鮭產(chǎn)氣單胞 菌（Aeromonas salmonicida)，可誘導(dǎo)該等海洋菌株產(chǎn)生適合的糖分解酶，而使用含有該等 糖分解酶的酵素液，對于由馬尾藻、石花菜或青海菜所制得的海藻多糖樣本進行水解反應(yīng)， 可達(dá)到提高的水解效率，且所獲得的海藻寡糖具有優(yōu)異的抗凝血活性，無需經(jīng)由額外的化 學(xué)方法添加硫酸基。
[0009] 因此，在一方面，本發(fā)明提供一種制備具抗凝血活性的海藻寡糖的方法，其包括：
[0010] (a)將海洋菌株培養(yǎng)于含有海藻多糖的細(xì)菌培養(yǎng)液，使該海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生 糖分解酶，然后將所獲得的含有該糖分解酶的海洋菌株培養(yǎng)物予以分離，去除菌體，以獲 得含有該糖分解酶的粗酵素液，其中該海藻多糖是由選自馬尾藻、石花菜、青海菜及其任 何組合所組成的群組的海藻所制得，以及該海洋菌株是選自泡囊假單胞菌（Pseudomonas vesicularis)、殺鮭產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas salmonicida)及其組合所組成的群組；
[0011] (b)提供海藻多糖樣本，其是由選自馬尾藻、石花菜、青海菜及其任何組合所組成 的群組的海藻所制得；以及
[0012] (c)于步驟（b)的海藻多糖樣本中，加入步驟（a)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)， 以產(chǎn)生具抗凝血活性的海藻寡糖。
[0013] 在部分具體實施例中，本發(fā)明用以誘導(dǎo)海洋菌株及產(chǎn)制海藻寡糖所使用的海藻多 糖是來自相同海藻。
[0014] 在一特定實施例中，所述步驟（a)的細(xì)菌培養(yǎng)液所含的海藻多糖是由馬尾藻所制 得，以及步驟（b)的海藻多糖樣本是由馬尾藻所制得。
[0015] 在一特定實施例中，所述步驟（a)的細(xì)菌培養(yǎng)液所含的海藻多糖是由石花菜所制 得，同時步驟（b)的海藻多糖樣本是由石花菜所制得。
[0016] 在一特定實施例中，所述步驟（a)的細(xì)菌培養(yǎng)液所含的海藻多糖是由青海菜所制 得，同時步驟（b)的海藻多糖樣本是由青海菜所制得。
[0017] 在部分具體實施例中，所述步驟（a)的細(xì)菌培養(yǎng)液所含的海藻多糖或所述步驟 (b)的海藻多糖樣本是將所述海藻以熱萃處理所獲得的海藻多糖萃取液。
[0018] 在部分具體實施例中，本發(fā)明的方法可進一步包括步驟（d)，其為將步驟（c)所得 的海藻寡糖依分子量大小予以分離。
[0019] 在一特定實施例中，步驟（c)所得的海藻寡糖可經(jīng)分離成分子量3kDa以下的組分 或分子量介于5kDa與3kDa之間的組分。
[0020] 在部分具體實施例中，步驟（c)或（d)所得的海藻寡糖可經(jīng)干燥處理。
[0021] 在另一方面，本發(fā)明也提供一種具抗凝血活性的海藻寡糖，該海藻寡糖是由此處 所述的方法制得。
[0022] 在又一方面，本發(fā)明提供一種抗凝血活性的組合物，其包括此處所述的海藻寡糖 作為活性成份。
[0023] 在部分具體實施例，本發(fā)明的抗凝血活性的組合物是用于口服投予。
[0024] 本發(fā)明的一個或多個具體實施例的細(xì)節(jié)示于下面的描述。本發(fā)明的其它特征或優(yōu) 點，從以下一些具體實施例的詳細(xì)描述以及后面的申請專利范圍當(dāng)中將更為清楚明確。
【具體實施方式】
[0025] 除非另有指明，所有在此處使用的技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有如同本發(fā)明所屬領(lǐng)域 技術(shù)人員一般所了解的意義。
[0026] 本文所使用的"一"乙詞，如未特別指明，是指至少一個（一個或一個以上）的數(shù) 量。
[0027] 本發(fā)明是關(guān)于一種制備具有抗凝血活性的海藻寡糖的方法。具體而言，本發(fā)明的 方法是將由馬尾藻、石花菜或青海菜制得的海藻多糖樣本經(jīng)酵素水解，而獲得具有抗凝血 活性的海藻寡糖，其中該酵素是泡囊假單胞菌（Pseudomonas vesicularis)及/或殺鮭產(chǎn) 氣單胞菌（Aeromonas salmonicida)的海洋菌株受來自馬尾藻、石花菜或青海菜的海洋多 糖誘導(dǎo)而產(chǎn)生者。
[0028] 具體而言，本發(fā)明的方法包括：
[0029] (a)將海洋菌株培養(yǎng)于含有海藻多糖的細(xì)菌培養(yǎng)液，使該海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生 糖分解酶，然后將所獲得的含有該糖分解酶的海洋菌株培養(yǎng)物予以分離，去除菌體，以獲 得含有該糖分解酶的粗酵素液，其中該海藻多糖是由選自馬尾藻、石花菜、青海菜及其任 何組合所組成的群組的海藻所制得，以及該海洋菌株是選自泡囊假單胞菌（Pseudomonas vesicularis)、殺鮭產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas salmonicida)及其組合所組成的群組；
[0030] (b)提供海藻多糖樣本，其是由選自馬尾藻、石花菜、青海菜及其任何組合所組成 的群組的海藻所制得；以及
[0031] (c)于步驟（b)的海藻多糖樣本中，加入步驟（a)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)， 以產(chǎn)生具抗凝血活性的海藻寡糖。
[0032] 本文所述泡囊假單胞菌及殺鮭產(chǎn)氣單胞菌是常見的水產(chǎn)動物感染性細(xì)菌，可以常 規(guī)方式分離自河口、海水沿岸等環(huán)境，亦可自陸上淡水、廢水、土壤等其他環(huán)境中分離，并可 利用洋菜培養(yǎng)基進一步篩選出具較佳分解洋菜能力的菌株。
[0033] 本文所述"馬尾藻"是指馬尾藻屬（Sargassum)的藻類，屬于褐藻，常見種類包 括：莢托馬尾藻（Sargassum siliquosum)、匍枝馬尾藻（Sargassum polycystum)、半葉 馬尾藻（Sargassum hemiphyllum)等。本文所述"石花菜"是指石花菜屬（Gelidium) 的藻類，屬于紅藻，常見種類包括：安曼司石花菜（Gelidium amansii)、太平洋石花菜 (Gelidium pacificum)、匍·石花菜（Gelidium pusillum)等。本文所述"青海菜"是指礁 膜屬（Monostroma)的藻類，屬于綠藻，常見種類包括：礁膜（Monostroma nitidum)、寬礁膜 (Monostroma oxyspermum)〇
[0034] 本文所述"細(xì)菌培養(yǎng)液"是指一般用于培養(yǎng)海洋細(xì)菌的培養(yǎng)液，例如，海洋液體培 養(yǎng)基（Marine Broth，MB)。
[0035] 依據(jù)本發(fā)明的方法，步驟（a)添加于細(xì)菌培養(yǎng)液的海藻多糖或步驟（b)的海藻多 糖樣本可為將所述海藻以熱萃處理所獲得的海藻多糖萃取液。
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