專利名稱：用于產(chǎn)生病毒疫苗的源自鴨胚胎的干細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)展和生產(chǎn)病毒疫苗。特別地，本發(fā)明涉及病毒載體和疫苗的工業(yè)生產(chǎn)的領(lǐng)域，更特別地涉及源自不含禽類內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的胚胎干細(xì)胞的鴨細(xì)胞系在生產(chǎn)病毒載體和病毒之中的用途。本發(fā)明特別用于防止人類和動物病毒感染的病毒疫苗的工業(yè)生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
疫苗有效地減少并防止由于很多病毒感染引起的死亡和疾病，例如流感、麻疹、腮腺炎、天花、黃熱病。
現(xiàn)在很多病毒疫苗是從含胚的雞蛋或從雞胚胎中分離的原代雞胚胎成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的。但是，疫苗生產(chǎn)有時無意中被外來的試劑所污染而變得復(fù)雜，所述試劑可源自用于繁殖疫苗株的禽類細(xì)胞底物。確實在雞細(xì)胞來源的活的、減毒的疫苗中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性，這指示逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在，所述疫苗包括歐洲和美國生產(chǎn)者為黃熱病、麻疹和腮腺炎生產(chǎn)的那些疫苗，(Hussain等人，2003, J.Virol 77:1105- 1111 ; Johnson et Heneine， 2001 ， J. Virol., 75:3605-3612)。在那些疫苗中對RT活性來源的研究發(fā)現(xiàn)了含有來自內(nèi)源性禽白血病病毒(ALV-E)和內(nèi)源性禽病毒(EAV)的RNA顆粒的證據(jù)(Johnson et Heneine, 2001 , J. Virol 75:3605-3612;Tsang等人，1999， J. Virol 73:5843-5851 ; Weissmahr等人，1997， J. Virol71 :3005-3012)。
ALV-E和EAV均為存在于雞種系的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的成員。ALV-E是從可遺傳的前病毒元件ev位點表達而來?；谄浒?envelope)序列，ALV-E為從ALV亞組A至D和J (其為外源獲得的感染)分化而來。雖然外源性ALV引起感染的雞中幾種腫瘤性(neoplastic)疾病，例如心肌炎和骨骼石化癥，但是人們并不知道ALV-E對雞是病原性的。ALV-E感染沒有致癌可能，這可能是由于在內(nèi)源性長末端重復(fù)序列(LTR)中缺少病毒癌基因和增強子活性。已經(jīng)在白色來亨雞(White Leghorn Chicken)中鑒定了 20個以上的不同ev位點(ev-1至ev-22)。ev位點根據(jù)發(fā)現(xiàn)的順序命名，并根據(jù)其表達的基因產(chǎn)物和其產(chǎn)生感染性顆粒的能力來進行表型分類。ev位點賦予的ALV-E表型從結(jié)構(gòu)或酶學(xué)上的完全性感染性顆粒到結(jié)構(gòu)或酶學(xué)上(RT-)的缺陷以致無可檢測到的病毒蛋白表達。大多數(shù)ev位點為結(jié)構(gòu)上不完整的，因此不編碼產(chǎn)生感染性病毒顆粒必需的所有序列。已經(jīng)通過育種獲得了對ALV-E呈抗性的雞的品系，命名為ev-0。品系-0的雞缺少ev位點(即ev-0)但是在基因組品系0的雞中存在EAV前病毒序列(Dunwiddie和Faras, 1985,Proc Natl. Acad. Sci USA, 82: 5097-5101 )。
對EAV家族知之甚少，其與ALV家族不同，但是相關(guān)。每個雞基因組中至少存在50個拷貝的EAV元件。但是，已知的EAV序列沒有一個代表全長和完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，目前也沒有鑒定出感染性EAV分離體。但是已經(jīng)表明EAV在源自禽屬，原雞屬(Ga〃w力的胚胎細(xì)胞中高度表達。Weissmahr等人(1997， J. Virol71 :3005- 3012)表明來自EAV內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的顆粒最有可能與培養(yǎng)的雞胚胎成纖維細(xì)胞上清中發(fā)現(xiàn)的大部分顆粒相關(guān)的RT活性有關(guān)。
無意中傳播的風(fēng)險對于活的減毒病毒疫苗來說是特別高的，因為它們不能進行滅活程序，其大部分被注射到人體，因此越過了非特異性免疫保護機制。因此，為了確保用于動物和人類的_班苗的安全，現(xiàn)在已經(jīng)測試用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底物中是否存在可在免疫過程中傳入動物或人類宿主的有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(WHO technical reports Series, 1994)。
另一個方面，含胚的雞蛋和原代雞胚胎成纖維細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)與幾個嚴(yán)重的限
制相關(guān)，包括
-耗時的、繁瑣的、耗費資源的生產(chǎn)過程，對于每個個體生產(chǎn)活動該生產(chǎn)過程需要獲得大量雞蛋或CEF并進行質(zhì)量控制；
-在很多情況下需要昂貴的特異性無病原(SPF)雞胚；-在供體雞群中發(fā)生流行病感染的情況下蛋供應(yīng)不足的風(fēng)險；-與使用源自免除BSE國家的牛血清相關(guān)的通貨膨脹成本；-不能夠使用蛋用于繁殖對雞來說高度劇毒和致命的病毒。
因此迫切需要改善現(xiàn)在的基于蛋或雞胚胎成纖維細(xì)胞的病毒疫苗生產(chǎn)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)平臺的發(fā)展作為蛋和CEF生產(chǎn)系統(tǒng)的替代品來生產(chǎn)病毒疫苗可能是克服
目前疫苗生產(chǎn)瓶頸和時間限制的最迅速和有前景的解決方法。此外，使用細(xì)胞系
用于生產(chǎn)病毒疫苗而不是使用蛋或CEF平臺，將具有以下與疫苗安全相關(guān)的額外的優(yōu)點在疫苗制劑中不存在抗生素添加劑；不需要毒性防腐劑(例如硫柳汞(thiomersal));內(nèi)毒素水平降低，無蛋過敏問題；在無蛋白和血清的培養(yǎng)基中通過細(xì)胞培養(yǎng)無外來試劑/BSE的風(fēng)險；病毒疫苗制備物的較高的純度。
用于制備病毒疫苗的細(xì)胞系的例子為MDCK(源自Madin-Darby狗的腎臟的細(xì)胞),PerC6 (源自人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞，經(jīng)過插入來自人5型腺病毒的El基因的遺傳修飾)由CRUCELL (Netherland)所研發(fā))，VERO (源自非洲綠猴(C^cop/Aecm ae^'o;w)的腎臟上皮細(xì)胞的細(xì)胞，在Chiba University in Chiba, Japan分離)，BHK21 (來自幼倉鼠腎臟細(xì)胞的無限增殖的細(xì)胞)。這些可用的細(xì)胞系中沒有一個滿足所有的醫(yī)學(xué)、規(guī)章制度和工業(yè)要求。例如，這些細(xì)胞系多數(shù)為致瘤性的，關(guān)于使用致瘤性細(xì)胞用于人類疫苗生產(chǎn)有重要的規(guī)章制度考慮；因此，規(guī)章制度部門不愿意允許致瘤性細(xì)胞底物用于生產(chǎn)大量疫苗。另外，這些細(xì)胞系中有一些為錨定依賴性的，這給工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)疫苗帶來了嚴(yán)重障礙。因此需要開發(fā)錨定非依賴性的細(xì)胞系，其無逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制能力，為非致瘤性的且可適用于工業(yè)，易于感染眾多病毒。這就是本發(fā)明的目的。
因此本發(fā)明人利用其在禽類生物學(xué)和禽類胚胎干(ES)細(xì)胞中的專業(yè)知識研發(fā)了新型的穩(wěn)定的鴨細(xì)胞系，其能夠有效地復(fù)制眾多人類和獸類疫苗和疫苗候選者。通過修改私人擁有的方法(參見WO 03/076601和WO 05/007840)，本發(fā)明人能夠產(chǎn)生源自鴨ES細(xì)胞的一系列清楚鑒定和記錄的鴨細(xì)胞系(即犯Bx⑧細(xì)胞)，其中沒有遺傳、化學(xué)或病毒永生化的步驟，其在培養(yǎng)物中不產(chǎn)生有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種獲得源自禽胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系即EBx的方法，其中所述禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
本發(fā)明所述細(xì)胞系為"持續(xù)的"，因為其具有在體外培養(yǎng)一段延長的時間的特性。優(yōu)選地，本發(fā)明所述細(xì)胞能夠增殖至少50代，至少75代，至少100代，至少125代，至少150代，至少175代，至少200代，至少250代。250代不構(gòu)成時間限制因為所獲得的細(xì)胞仍然是活的且仍然能夠進行進一步傳代。不被理論所限制，假定本發(fā)明所述細(xì)胞能夠"持續(xù)地"培養(yǎng)只要細(xì)胞仍然表達端粒酶。確實，假設(shè)本發(fā)明所述禽細(xì)胞中的高水平端粒酶活性對遺傳穩(wěn)定性(即本發(fā)明所述禽細(xì)胞為雙倍體)和持續(xù)性細(xì)胞生長負(fù)責(zé)。
"傳代"意思是細(xì)胞移植從一個培養(yǎng)器皿中轉(zhuǎn)移到另一個，其中有或沒有稀釋。應(yīng)該理解在細(xì)胞從一個培養(yǎng)器皿中轉(zhuǎn)移到另一個的任何時候，可能損失一部分細(xì)胞，因此，無論是否主動進行，可能會發(fā)生細(xì)胞的稀釋。這個術(shù)語與"亞培養(yǎng)"是同義詞。傳代次數(shù)為培養(yǎng)中的細(xì)胞(不論是懸浮生長還是粘附生長)被亞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移至新器皿中的次數(shù)。這個術(shù)語與群體加倍或世代不是同義詞，群體加倍或世代是指細(xì)胞群體復(fù)制一次所需的時間；也就是說，大約為群體中每個細(xì)胞復(fù)制的時間。例如，本發(fā)明步驟a)中的禽類ES細(xì)胞具有約〉40小時的群體加倍時間(PDT)。本發(fā)明所述禽類EBx細(xì)胞具有約〈30小時的PDT;通常對于EBx 細(xì)胞，每三個世代傳代一次。
"雙倍體"是指本發(fā)明所述細(xì)胞每個染色體具有兩個拷貝(2n)，通常一個來自母代一個來自父代。
本發(fā)明所述禽EBx⑧細(xì)胞系為持續(xù)的和雙倍體的(即遺傳穩(wěn)定的)，這個事實構(gòu)成了顯著的和獨特的特征，因為這些術(shù)語經(jīng)常為反面詞語。因此，通過化學(xué)、物理(U.V輻射，X-射線或伽馬輻射等)獲得的或通過遺傳修飾(病毒轉(zhuǎn)化、癌基因過表達)而獲得的癌細(xì)胞和/或永生化細(xì)胞為持續(xù)的細(xì)胞，因為它們可以在培養(yǎng)中無限復(fù)制，但它們不是遺傳穩(wěn)定的，因為它們表現(xiàn)出多倍體染核型。另一個方面，原代細(xì)胞例如雞胚胎成纖維細(xì)胞、MRC5、 WI38，這些為非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，不是持續(xù)的，因為它們在幾代之后具有有限的壽命，但它們是遺傳穩(wěn)定的(即雙倍 體)細(xì)胞。
在本發(fā)明中，術(shù)語"細(xì)胞系"和"細(xì)胞"將不加區(qū)分地使用。
術(shù)語"禽類"、"鳥類(bird)"、"鳥類(aves)"或"鳥類(ava)"在本文中具 有相同的意義，將不加區(qū)分地使用。"鳥類"是指分類學(xué)上鳥綱生物的任何種、亞 種或種族。在優(yōu)選的具體實施方式
中，"鳥類"是指分類學(xué)目的任何動物
-"雁形目(Anseriforme)"(即鴨、鵝、天鵝和同類)。雁形目中含有三個家族 的約150種鳥類叫鴨科(Anhimidae (即叫鴨))、鵲雁科(Anseranatidae (鵲鵝)) 和鴨科(Anatidae)，包括超過140種水鳥，其中包括鴨、鵝、天鵝。該目中的所 有物種是非常適合在水面上水棲生存的。所有這些物種都有適合游泳的蹼足(雖 然有些物種后來變得主要在陸地上生存)。
-"雞形目(Galliforme)"(即雞、鵪鶉、火雞、雉和同類)。雞形目是含有 雞、火雞、鵪鵓和雉的鳥類的目。全世界發(fā)現(xiàn)約256個物種。
-"鴿形目(Columbiforme)"(即鴿和同類)。鳥目鴿形目包括非常廣的鴿子和 家鴿。
在本發(fā)明中，術(shù)語"內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的顆粒"或"內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒" 為不加區(qū)分使用的術(shù)語，其意思是由存在于一些禽類細(xì)胞基因組中的ALV-E或 EAV前病毒序列所編碼和/或所表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒。已知在鳥類 中，ALV-E前病毒序列存在于家雞(除了品系-0的雞)、紅色原雞(red jungle fowl) 和環(huán)頸雉(RingneckPheasant)的基因組之中。已知在鳥類中，EAV前病毒序列存 在于所有的原雞屬中，包括家雞、品系-0的雞、紅色原雞、綠色原雞、灰色原雞、 錫蘭原雞(ceylo認(rèn)jungle fowl)和同類)(參見Resnick等人，1990， J. Virol" 64:4640-4653)。
根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，本發(fā)明所述的鳥選自在基因組中不包含ALV-E和 EAV前病毒序列的鳥類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定在鳥類基因組中是否存在 ALV-E和EAV序列(Johnson和Heneine, 2001 ; Weissmahr等人，1996)。優(yōu)選地，鳥 類選自雁形目(即鴨、鵝、天鵝)、火雞、鵪鶇、日本鵪鵓、珍珠雞(GuineaFowl)、 孔雀。因此，源自這些鳥類的細(xì)胞不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E和/或EAV 顆粒。在優(yōu)選的具體實施方式
中，本發(fā)明所述鳥選自鴨、鵝、天鵝、火雞、鵪鶉、 日本鵪鶉、珍珠雞或孔雀。根據(jù)更優(yōu)選的具體實施方式
，鳥是鴨，更優(yōu)選為北京 鴨(Pekinduck)或番鴨(Muscovy duck)。根據(jù)更優(yōu)選的具體實施方式
，鳥是北京 鴨。因此，本發(fā)明提供了一種獲得源自胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)的雙倍體鴨細(xì)胞 系的方法，其中所述鴨細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
根據(jù)第二個優(yōu)選的具體實施方式
，本發(fā)明所述鳥選自在基因組中不包含完整 ALV-E前病毒序列但是最終包含EAV前病毒序列的鳥類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確 定在鳥類基因組中是否存在部分的或完全的ALV-E和EAV序列(Johnson和Heneine, 2001)。己經(jīng)通過育種選擇了幾個不含有完全ALV-E前病毒序列(即ev-0 品系)的雞品系，因此其不產(chǎn)生感染性ALV-E逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，例如
-East Lansing USDA家禽貯存的品系0家雞(ELL-0品系)。East Lansing品系 0雞不含與ALV相關(guān)的任何內(nèi)源性病毒(ev)位點(Dunwiddie和Faras, 1985)。
-來自lnstitut National de la Recherche Agronomique (Domaine de Magneraud， Surgeres, France)的品系DE和PE11 。
因此，源自ev-O鳥類的細(xì)胞不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E顆粒。根據(jù)優(yōu) 選的具體實施方式
，鳥類為ev-0家雞(原雞屬家雞亞種)，優(yōu)選選自ELL-O、 DE 或PEll。
通常，ev-0雞仍然含有EAV前病毒序列但是到目前為止沒有鑒定出感染性 EAV分離體。因此，本發(fā)明提供了一種獲得源自ev-0雞品系的胚胎干(ES)細(xì)胞 的持續(xù)的雙倍體雞細(xì)胞系的方法，其中所述ev-0雞細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi) 源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
根據(jù)第三個具體實施方式
，本發(fā)明所述鳥選自在基因組中包含完整和/或不完 整ALV-E和EAV前病毒序列但是不能產(chǎn)生有復(fù)制能力的ALV-E和EAV逆轉(zhuǎn)錄病 毒顆粒的鳥類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定是否從鳥細(xì)胞中產(chǎn)生了 ALV-E和/或EAV 感染性和/或非感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(Johnson和Heneine, 2001 ; Weissmahr等人， 1996)。優(yōu)選地，鳥類選自特異性無病原(SPF)雞，優(yōu)選為Valo品系(Lohman) 或品系22(SPAFAS)。 '
"有復(fù)制能力的"意思是內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒為感染性的，也就是說這樣 的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒能夠感染本發(fā)明所述禽類細(xì)胞并在其中復(fù)制。
建立本發(fā)明所述的持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系即EBx⑧的方法包括兩個歩驟
a) 在培養(yǎng)基中分離、培養(yǎng)并擴大來自鳥類的胚胎干細(xì)胞，所述鳥類不含有那 些易于產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的完整內(nèi)源性前病毒序列或其片 段，更特異地是不含有EAV和/或ALV-E前病毒序列或其片段，所述培養(yǎng)基為完 全培養(yǎng)基，其包含所有的允許細(xì)胞生長的因子，且存在飼養(yǎng)層，并補充動物血清； 可選地，所述完全培養(yǎng)基可包含添加物例如另外的氨基酸(即谷氨酰胺、非必需 氨基酸等)、丙酮酸鈉、P-巰-基乙醇、維生素、非動物來源的蛋白水解物(即酵母 自溶液、植物水解產(chǎn)物(大豆、小麥等))；
b) 通過改變培養(yǎng)基進行傳代，以完全除去所述因子、所述飼養(yǎng)層和所述血清， 和可選的所述添加物，然后獲得能夠在不含外源性生長因子、飼養(yǎng)層和動物血清 的基本培養(yǎng)基中增殖很長一段時間的粘附或懸浮禽類細(xì)胞系即EBx ，其不產(chǎn)生有 復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
建立EBx⑧細(xì)胞系的過程中步驟b)中為了逐漸或全部除去生長因子、血清和 飼養(yǎng)層而對培養(yǎng)基的修改可同時、相繼或分別進行。去除培養(yǎng)基中的物質(zhì)可通過 下列順序進行--飼養(yǎng)層/血清/生長因子；
-飼養(yǎng)層/生長因子/血清；
-血清/生長因子/飼養(yǎng)層；
-血清/飼養(yǎng)層/生長因子；
-生長因子/血清/飼養(yǎng)層；
-生長因子/飼養(yǎng)層/血清。
在優(yōu)選的具體實施方式
中，去除的順序為生長因子/飼養(yǎng)層/血清。在優(yōu)選的具 體實施方式中，除去添加物例如丙酮酸鈉、非必需氨基酸(NNEA)、維生素、酵 母自溶液是在除去飼養(yǎng)層之后和除去血清之前進行的。優(yōu)選^1.，除去酵母自溶液 是在除去丙酮酸鈉、NNEA、維生素之后進行的。
根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，本發(fā)明步驟a)所述的禽類胚胎干細(xì)胞選自產(chǎn)卵時 的禽類胚胎，也就是說當(dāng)產(chǎn)蛋時。根據(jù)Sellier等人(2006， J. Appl. Poult. Res" 15:219-228)，產(chǎn)卵對應(yīng)于根據(jù)Eyal-Giladi分類(EYAL-G I LAD I 's classification: EYAL-GILADI禾卩KOCHAN, 1976, 尸raw c/eavage ,o pn. mY/w 5freacA:y^wa"'ow .. a comp/ewew/ar_y worwa/ ^r6/e a "ew /ooA Z/ze /ks/ Wages o/cfeve/o; wew/" c/n'cA: . "General Morphology" Dev. Biol. 49:321-337)的下列發(fā)育時期
-番鴨(也稱為巴巴里鴨(Barbariduck): VII期
-珍珠雞VII期-VIII期
-火雞vn-vm期 '-'
-北京鴨VIII期 -雞X期 -曰本鵪鶉XI期 -鵝XI期。
優(yōu)選地，步驟a)的鴨胚胎干(ES)細(xì)胞通過分離處于Eyal-Giladi分類的約 VIII期(產(chǎn)卵期)的北京鴨胚胎獲得。如果在產(chǎn)卵期收集的產(chǎn)下的蛋沒有發(fā)育至 足以收集胚胎干細(xì)胞，可進一步孵育所產(chǎn)的蛋，從幾個小時(過夜)至1至2天 以使胚胎成熟。根據(jù)第二個具體實施方式
，步驟a)的鴨胚胎干(ES)細(xì)胞來自番 鴨。在產(chǎn)卵期，番鴨沒有足夠成熟因為其處于約VII期，因此，將蛋孵育過夜以使 蛋成熟至接近Eyal-Giladi分類的VIII期至X期。
優(yōu)選地，步驟a)的雞胚胎干(ES)細(xì)胞，優(yōu)選為來自ev-0雞品系，是通過 分離處于約Eyal-Giladi分類的X期(產(chǎn)卵期)的胚胎而獲得的。
或者，根據(jù)本發(fā)明步Sla)所述的禽胚胎干細(xì)胞在產(chǎn)卵前的胚胎中收集。在產(chǎn) 卵前遇到的主要問題是蛋需要以手術(shù)方式從母雞中除掉，每個胚胎的ES細(xì)胞數(shù)目 不那么重要。此外，在禽類胚胎發(fā)育的非常早的時期，ES鈾胞沒有完全個體化， 這使得體外培養(yǎng)ES細(xì)胞存在困難。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定產(chǎn)蛋前的時間表以允 許收集禽ES細(xì)胞?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明歩驟a)所述的禽胚胎干細(xì)胞可在產(chǎn)卵后直至孵化時從禽胚 胎中收集。但是，禽胚胎干細(xì)胞將逐步進入分化以產(chǎn)生分化的組織；因此，優(yōu)選 為在產(chǎn)卵后不太長時間內(nèi)收集禽ES。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定產(chǎn)卵后的時間表以 允許收集禽胚胎千細(xì)胞。
根據(jù)另一具體實施方式
，步驟a)的細(xì)胞是富含原生殖細(xì)胞(PGC)的胚胎干 細(xì)胞群。更優(yōu)選地，步驟a)的禽類ES細(xì)胞是純化的PGC細(xì)胞。在禽類物種中， 原生殖細(xì)胞起源于胚層的中心區(qū)(Ginsburg和Eyal-Giladi, 1987 Development 101 (2) :209-19; Karagenc等人，1996 Dev Genetl9 (4) :290-301 ; Petitte等人，1997 Poultry Sci. 76 (8) : 1084-92)。然后它們移至前端的胚外位點，生發(fā)新月(germinal crescent)直到被處于胚胎發(fā)育的2.5至5天之間的脈管系統(tǒng)收集到達生殖脊。這 些細(xì)胞定居于生殖嵴并最終分化成為卵母細(xì)胞或精母細(xì)胞(Nieuwkoop和Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press pll3-127)。從供體禽類胚胎分離PGC的方法己 見于文獻并能被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地進行(見如公布日為1993年9月7日，公 布號為05-227947的JP924997; Chang等人，1992. Cell Biol. Int. 19 (2): 143-149 ; Naito等人，1994 Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161 ; Yasuda等人，1992. J. Reprod. Fert. 96: 521-528 ; Chang等人，1992 Cell Biol. Int. Reporter 16 (9) : 853-857)。根據(jù)具 體實施方式，PGC細(xì)胞是從處于Hamburger禾Q Hamilton分類(Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88:49-92)的12-14期的雞胚背側(cè)主動脈收集的胚胎血液中收集的。在另 一優(yōu)選具體實施方式
中，PGC是從生發(fā)新月通過機械解剖雞胚而收集的或從生殖 腺收集的。然而，正如上文討論，其他分離PGC的方法是己知的并可以選擇性使 用。
這些禽類胚胎干細(xì)胞是通過在39'C培養(yǎng)物中介于48至72小時的緩慢雙倍時 間鑒定的。
不被理論所限，逐步除去生長因子、詞養(yǎng)層、添加物和血清后確定的禽類ES 細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件允許適應(yīng)并選擇那些保持了 ES細(xì)胞大多數(shù)需要的特性(核型 穩(wěn)定性、無限增殖、ES記號的表達)的細(xì)胞，但是還表現(xiàn)出工業(yè)上受歡迎的特性， 例如在無血清培養(yǎng)基中以高細(xì)胞密度懸浮生長。端粒酶構(gòu)成的最重要的ES記號之 一。由于在細(xì)胞傳代中持續(xù)并保持端粒酶表達，EBx⑧細(xì)胞為持續(xù)的(即永生的) 但另外是遺傳穩(wěn)定的(即雙倍體的)。
更特別地，本發(fā)明提供了一種獲得源自ES細(xì)胞的持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系的方 法，其中所述禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包 括以下步驟
a)在對應(yīng)于Eyal-Giladi分類(EYAL曙G I LAD I's classification: EYAL-GILADI 和KOCHAN， 1976, Fraw c/eavage to / n>mY/ve Wreac&ybr附a,/owa"General Morphology" Dev. giol. 49:321-337)的約VI期和至孵化前，優(yōu)選在約產(chǎn)卵 期，分離鳥胚胎，優(yōu)選從鴨或ev-O雞中分離鳥類胚胎，其中所述鳥類的基因組中 不含有易于產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的內(nèi)源性前病毒序列；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎而獲得的禽胚胎干(ES) 細(xì)胞，所述培養(yǎng)基添加以下物質(zhì)
-胰島素生長因子(IGF-1)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF); -動物血清；和
-可選地，選自下列的生長因子白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素6受體 (IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF);
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于一層飼養(yǎng)細(xì)胞上并繼續(xù)培養(yǎng)ES細(xì) 胞持續(xù)至少一次傳代；
d) 可選地，在1至約15優(yōu)選為3至約15次傳代的幾個傳代范圍內(nèi)，從培養(yǎng) 基中除去選自IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所有的生長因子，并繼續(xù)培養(yǎng)禽類ES 細(xì)胞至少一個傳代。優(yōu)選地，從培養(yǎng)基中除去選自IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所 有的生長因子是在一個傳代時同時進行的。通常，除去IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF 在約10至15個傳代內(nèi)進行； 1 ,
e) 從培養(yǎng)基中除去IGF-1和CNTF，并繼續(xù)培養(yǎng)禽類ES細(xì)胞至少一個傳代。 優(yōu)選地，從培養(yǎng)基中除去選自IGF-1和CNTF的生長因子是在一個傳代時同時進 行的。通常，除去IGF-1和CNTF在約15至25個傳代內(nèi)進行?；蛘撸GF-1 和CNTF是逐步在幾個傳代內(nèi)減少進行的(至少2個傳代且約接近15個傳代)；
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層， 并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中添加物的濃度，以在至少一個傳代之后完全除 去添加物；和
h) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去 動物血清；和 —
i) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層，可選不含動物血清和添加物的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性禽類細(xì)胞系即EBx⑧，其中所述持續(xù)的雙倍體
禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
j)可選地，進一步使所述粘附性禽EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。使細(xì)胞 培養(yǎng)物適應(yīng)為懸浮可都在建立EBx⑧細(xì)胞的過程中進行。例如，使用源自番鴨胚胎 干細(xì)胞的鴨EBx⑧細(xì)胞，細(xì)胞在除去飼養(yǎng)層之前被適應(yīng)于懸浮生長。對于源自北京 鴨的鴨EB⑧細(xì)胞(EB24、 EB26、 EB66)，細(xì)胞在除去血清之前被適應(yīng)于懸浮生長。 k)可選地，進一步亞克隆所述禽EBx⑧細(xì)胞，例如通過限制性稀釋。 在優(yōu)選的具體實施方式
中，本發(fā)明涉及一種獲得源自禽胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系即EBx⑧的方法，其中所述禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi) 源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包括以下步驟
a) 在約產(chǎn)卵期發(fā)育期分離鳥胚胎，其中所述鳥類的基因組中不含有易于產(chǎn)生 有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的內(nèi)源性前病毒序列；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的禽胚胎干(ES)細(xì)
胞，所述培養(yǎng)基至少添加以下物質(zhì) ，
-胰島素生長因子(IGF-1)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTf); -哺乳動物血清例如胎牛血清；
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于一層飼養(yǎng)細(xì)胞上并繼續(xù)培養(yǎng)ES細(xì) 胞持續(xù)至少一個傳代；
e) 從培養(yǎng)基中除去IGF-1和CNTF，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至少一個傳代；
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層， 并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 逐步降低培養(yǎng)基中所述哺乳動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去 哺乳動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和哺乳動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖的 源自ES細(xì)胞的粘附性禽類EBx⑧細(xì)胞系，其中所述持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系不產(chǎn)生 有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i) 可選地，進一步使粘附性禽EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件，優(yōu)選為通過 促進作為懸浮物的生長，更優(yōu)選為將通過步驟h)中獲得的粘附性禽EBx⑧細(xì)胞系 轉(zhuǎn)移至比最初的支持物具有較小粘附特性的另一個支持物(即例如超低粘附性支 持物)。
當(dāng)進行使粘附性禽EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件的步驟j)時，該步驟可在 另一個優(yōu)選的具體實施方式
中在步驟g)的逐步降低培養(yǎng)基中哺乳動物血清的濃度 之前進行。
在另一個優(yōu)選的具體實施方式
中，用于獲得本發(fā)明所述持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞
系的方法的步驟b)中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進一步補充選自以下的生長因子白細(xì)胞介素
6 (IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)和成纖維細(xì)胞生長因 子(FGF)，且所述的方法進一步包括步驟d):
d) 可選地，從培養(yǎng)基中除去選自IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所有生長因子， 并繼續(xù)培養(yǎng)ES細(xì)胞至少一個傳代。 '
在更加優(yōu)選的具體實施方式
中，當(dāng)進行步驟d)時，步驟e)的從培養(yǎng)基中除 去IGF-1和CNTF的步驟e)是在步驟d)的從培養(yǎng)基中除去選自IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所有生長因子之后進行。
根據(jù)本發(fā)明，"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"是指含有經(jīng)典培養(yǎng)基配方的培養(yǎng)基，其本身至少 使細(xì)胞存活和(甚至更好)使細(xì)胞生長。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子有BME (基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基)、MEM (最簡Eagle培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基199、 DMEM (Dulbecco改良Eagle 培養(yǎng)基)、GMEM (Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基)、DMEM-HamF12、 Ham-F12和 Ham-FlO、 Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基、MacCoy 5A培養(yǎng)基、RPMI 1640、 GTM3。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含無機鹽(例如CaCl2、 KC1、 NaCl、 NaHC03、 NaH2P04、 MgS04 等)、氨基酸、維生素(硫胺素、核黃素、葉酸、D-泛酸鈣等)和其他成分如葡萄 糖、P-巰基-乙醇、丙酮,。優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基。表1給出了 DMEM/HAMF12的成分
表l: DMEM-HAM F12配方(mg/1)
無機鹽
無水氯化鈣116.60
硝酸鐵(三價)*9H200.05
硫酸鐵(二價)*7H200.417
氯化鉀311.80
硫酸銅(二價)*5H200.0013
氯化鎂* 6H2061.20
無水硫酸鎂48.84
氯化鈉6996.00
磷酸二氫鈉，H2062.50
無水磷酸二氫二鈉71.02
硫酸鋅，7H200.432
碳酸氫鈉1200.00
氨基酸
L-丙氨酸4.45
L-精氨酸* HC1147.50
L-天冬酰胺*H207.50
L-天冬氨酸6.65
L-胱氨酸'HC1.H2031.29
L-半胱氨酸 2HC117.56
L-谷氨酸7.35
E15-813中的L-谷氨酰胺365.00甘氨酸18.75
L-組氨酸*HC1，H2031.48
L-異亮氨酸54.47
L-亮氨酸59.05
L-賴氨酸*HC191.25L-蛋氨酸 17.24
L-苯丙氨酸 35.48
L-脯氨酸 17.25
L-絲氨酸 26.25
L-蘇氨酸 53.45
L-色氨酸 9.02
L-酪氨酸 38.70
L-纈氨酸 52.85
維生素
D(+)-生物素 0.0035
D-泛酸鈣 2.24
氯化膽堿 8.98
葉酸 2.65
肌醇 12.60
煙堿 2.02
吡哆醛'HC1 2.00
吡眵醇.HC1 0.031
核黃素 0.219
硫胺，HC1 2.17
胸腺瞎啶脫氧核苷 0.365
維生素B12 0.68
其它成分
無水D-葡萄糖 3151.00
次黃嘌呤 2.10
DL-68-硫辛酸 0.105
亞油酸 0.042
苯酚紅 8.10
腐胺'2HC1 0.081
丙酮酸鈉 55.00
另外，本發(fā)明所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基可補充以下添加物
-0.1至5 mM L-谷氨酰胺，優(yōu)選為2至3 mM L-谷氨酰胺；
-0.05至2 mM丙酮酸鈉，優(yōu)選為0.1至1 mM丙酮酸鈉；
-0.1至2.5%非必需氨基酸，優(yōu)選為約1%非必需氨基酸；
-0.1至2.5%維生素，優(yōu)選為約1%維生素；
-0.05至5 mM p-巰基-乙醇，優(yōu)選為約0.16 mM (3-巰基-乙醇;-非動物來源的蛋白水解產(chǎn)物。
為了建立本發(fā)明所述鴨EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)選在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充非動物來源的蛋
白水解產(chǎn)物。非動物來源的蛋白水解產(chǎn)物選自細(xì)菌胰化蛋白胨、酵母胰化蛋白胨、 植物水解產(chǎn)物例如大豆水解產(chǎn)物，或其混合物。在優(yōu)選的具體實施方式
中，非動 物來源的蛋白水解產(chǎn)物為酵母水解產(chǎn)物。術(shù)語"水解產(chǎn)物"包括大豆蛋白胨或酵 母提取物的酶消化產(chǎn)物。水解產(chǎn)物可分別從眾多大豆蛋白胨或酵母提取物制備物 中獲得，其可被進一步用酶消化(例如，使用番木瓜蛋白酶)，和/或通過自我分解、 熱分解和/或胞漿溶解而形成。水解產(chǎn)物還可從商售渠道獲得，例如酵母自溶液
(Yeastolate)、Hy-Soy、Hy-Yeast 412和Hi-Yeast 444，來源為例如SAFC Biosciences (舊稱JRH) (Lenaxa, KA), Quest International (Norwich, N. Y.), OrganoTechnie S.A. (法國)或Deutsche Hefewerke GmbH (德國)。酵母提取物的來源也在WO 98/15614 中公開。酵母提取物和大豆水解產(chǎn)物的來源也在WO00/03000中公開。本發(fā)明的 培養(yǎng)基中所用的水解產(chǎn)物優(yōu)選為從粗制組分中純化而來，因為在這個純化過程中 優(yōu)選除去了干擾有效培養(yǎng)的雜質(zhì)，從而改善了水解產(chǎn)物的一致性?？赏ㄟ^超離心 或Sephadex色譜(例如，使用Sephadex G25或Sephadex G10或同等材料)、離子 交換色譜、親和色譜、尺寸排阻色譜或"反相"色譜進行純化。優(yōu)選地，使用lOkDa 闕值的濾器通過超濾進行純化。這些方法在本領(lǐng)域是已知的。使用這些方法，可 收集含有確定分子量的大豆或酵母水解產(chǎn)物的組分。優(yōu)選地，大豆和酵母水解產(chǎn) 物的平均分子量優(yōu)選為大約220至375道爾頓。優(yōu)選地，酵母水解產(chǎn)物存在于細(xì) 胞培養(yǎng)基中。從例如SAFC-BIOSCIENCES (Ref58902C)中獲得的酵母水解產(chǎn)物 50X (約200g/1)存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中，其在培養(yǎng)基中的終濃度為約0.1X至2X， 優(yōu)選為約0.5X至約IX。也可向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入大豆水解產(chǎn)物。從例如 SAFC-BIOSCIENCES (Ref58903C)中獲得的大豆水解產(chǎn)物50X被加入到培養(yǎng)基 中，其終濃度為約0.1X至2X，優(yōu)選為約1X?；蛘?，可向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入大豆 水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的混合物，如US2004/0077086中所描述。
本發(fā)明一個優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM-HamF12，其補充了 2 mM L-谷氨酰 胺、lmM丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、1%維生素、0.16mMp-巰基-乙醇和可選 的1X酵母水解產(chǎn)物。
"完全培養(yǎng)基"是指補充或未補充的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)選是基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基， 其補充至少一種生長因子和動物血清。WO 03/076601、 WO 05/007840、 EP 787180、 US 6,114，168、 US 5,340,740、 US 6,656,479、 US 5,830,510和Pain等人的文章(1996， Development 122:2339-2348)中描述了完全培養(yǎng)基的例子?；蛘?，完全培養(yǎng)基可以 是條件培養(yǎng)基，優(yōu)選BRL條件培養(yǎng)基。說到例子，BRL條件培養(yǎng)基根據(jù)本領(lǐng)域公 認(rèn)技術(shù)制備，如Smith和Hooper的文章中所描述的技術(shù)(1987, Dev. Biol. 121 : 1-9)。 BRL細(xì)胞可從ATCC保藏號CRL-1442的細(xì)胞得到。條件培養(yǎng)基可補充下述 外源性生長因子和動物血清。本文所用的術(shù)語"生長因子"是指在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對于培養(yǎng)的未分化禽類ES 細(xì)胞的存活和生長必要的生長因子?？梢愿爬ǖ貐^(qū)分兩個生長因子家族細(xì)胞因 子和營養(yǎng)因子。細(xì)胞因子主要是那些通過與gpl30蛋白結(jié)合的受體發(fā)揮其功能的 細(xì)胞因子。因此，白血病抑制因子(LIF)、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素6、白細(xì) 胞介素6受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、制瘤素(oncostatin)和心營養(yǎng)素 (cardiotrophin)具有相似的作用模式，該作用模式為在受體水平上募集特異性鏈， 并且將特異性鏈以單體形式或有時是異源二聚體的形式與gpl30蛋白結(jié)合。營養(yǎng) 性因子主要是干細(xì)胞因子(SCF)、胰島素生長因子l (IGF-1)和成纖維細(xì)胞生長 因子(FGF)，優(yōu)選堿性FGF (bFGF)或人FGF (hFGF)。
本發(fā)明所述完全培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基，以及至少一種 細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子通過與gpl30蛋白和/或至少一種營養(yǎng)因子結(jié)合的受體而 發(fā)揮作用。優(yōu)選地，本發(fā)明所述完全培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和至少一種生長因子， 選自白血病抑制因子(LIF)、制瘤素、心營養(yǎng)素、胰島素生長因子l (IGF-1)、睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、 干細(xì)胞因子(SCF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、白細(xì)胞介素ll (IL-ll)。根據(jù) 第一個優(yōu)選具體實施方式
，完全培養(yǎng)基為補充了動物血清和至少IGF-1和CNTF 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)第二個優(yōu)選具體實施方式
，完全培養(yǎng)基為補充了動物血清和 至少IGF-1、 CNTF、 IL-6和IL-6R的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)第三個優(yōu)選具體實施方式
， 完全培養(yǎng)基為補充了動物血清和至少IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)另一個具體實施方式
，完全培養(yǎng)基為包含生長因子(即例如由 BRL或STO細(xì)胞表達的)和可選補充了至少一種選自LIF、 IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF、 IL-ll的外源性生長因子的條件培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基或條件培 養(yǎng)基中生長因子IGF-1、 CNTF、 IL曙6、 IL-6R、 SCF、 FGF、 IL-ll的濃度為約0.01 至10 ng/ml，優(yōu)選為0.1至5 ng/ml，更優(yōu)選為約1 ng/ml。
本發(fā)明的培養(yǎng)基可另外包含抗生素，例如慶大霉素、青霉素和鏈霉素以預(yù)防 細(xì)菌污染?？稍贓S細(xì)胞培養(yǎng)早期傳代向培養(yǎng)基中加入抗生素。例如，可向培養(yǎng)基 中加入終濃度為10 ng/ml的慶大霉素、終濃度為100 U/ml的青霉素和終濃度為100 pg/ml的鏈霉素。在優(yōu)選的具體實施方式
中，在本發(fā)明的持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞系建立 過程的晚期步驟中不向培養(yǎng)基中加入抗生素。
在本發(fā)明的禽胚胎干細(xì)胞建立過程中，在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)細(xì)胞。更優(yōu)選地， 飼養(yǎng)細(xì)胞是為了培養(yǎng)禽ES細(xì)胞而培養(yǎng)的動物細(xì)胞或細(xì)胞系。或者，飼養(yǎng)細(xì)胞可被 細(xì)胞外基質(zhì)加結(jié)合的生長面子所替代。下述飼養(yǎng)基質(zhì)是指飼養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)。 本文所用的飼養(yǎng)基質(zhì)根據(jù)本領(lǐng)域已知過程構(gòu)建。如上所述，優(yōu)選飼養(yǎng)基質(zhì)是預(yù)先 準(zhǔn)備好的。術(shù)語"預(yù)先準(zhǔn)備好的"是指在起源于胚層盤(blastoderm disk)受精禽 卵的細(xì)胞沉積下來與詞養(yǎng)基質(zhì)接觸之前將飼養(yǎng)基質(zhì)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，如 足以啟動和建立通過詞養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生例如生長因子或其他因子的一段時間；通常，在起源于胚層盤受精禽卵的細(xì)胞沉積下來與飼養(yǎng)基質(zhì)接觸之前一至兩天通過培養(yǎng) 飼養(yǎng)基質(zhì)本身而預(yù)先準(zhǔn)備好飼養(yǎng)基質(zhì)。飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選包含小鼠成纖維細(xì)胞。優(yōu)選 STO成纖維細(xì)胞，但原代成纖維原細(xì)胞也是適合的。而且本發(fā)明就小鼠細(xì)胞飼養(yǎng) 基質(zhì)的使用已作過描述，應(yīng)考慮包含來自其他鼠科物種(如大鼠)；其他哺乳動物 物種(如有蹄動物、牛、豬類)；或禽類物種(如雞形目、雞、火雞、鴨、鵝、鵪 鶉、雉)的細(xì)胞的飼養(yǎng)基質(zhì)也可使用。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的飼養(yǎng)細(xì) 胞可以用表達載體轉(zhuǎn)染使得例如生長因子如禽類SCF在STO細(xì)胞中呈組成型表 達。因此，"飼養(yǎng)層"產(chǎn)生可溶形式的細(xì)胞因子和/或附在細(xì)胞膜上形式的細(xì)胞因子。 因此，本發(fā)明的培養(yǎng)過程可選地包含建立單層飼養(yǎng)細(xì)胞層。用標(biāo)準(zhǔn)方法使詞養(yǎng)細(xì) 胞不能進行有絲分裂。例如，使飼養(yǎng)細(xì)胞暴露于X或伽馬射線中(如4000 Rads 的伽馬射線)或可以用絲裂霉素C處理(如用10 pg/ml處理2至3小時)。使細(xì) 胞不能進行有絲分裂的操作還詳細(xì)見于美國典型微生輛保藏中'心(ATCC， 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)通常附送細(xì)胞的信息中(如STO 飼養(yǎng)細(xì)胞可從ATCC保藏號1503獲得)。單細(xì)胞層可選地培養(yǎng)至約80%融合度， 優(yōu)選達到約90%融合度，更優(yōu)選達到約100%融合度。雖然單層飼養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)是 培養(yǎng)物的優(yōu)選形態(tài)，任何合適的形態(tài)應(yīng)視為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，例 如，多層、單層、簇生、聚集或其他聯(lián)結(jié)或成簇的飼養(yǎng)細(xì)胞均應(yīng)視為包含在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)并尤其視為包含在術(shù)語"基質(zhì)"的含義之內(nèi)。
本發(fā)明的培養(yǎng)基添加動物血清。使用的動物血清優(yōu)選是胎兒動物血清。優(yōu)選 胎牛血清。而且雖然本發(fā)明就胎牛血清的使用己作過描述，應(yīng)考慮也能使用包含 來自其他動物物種(如雞、.馬、豬、有蹄動物等)血清的動物血清。動物血清在 培養(yǎng)基中的終濃度是約1至25%、優(yōu)選5%至20%，更優(yōu)選8%至12%。在優(yōu)選具 體實施方式中，培養(yǎng)基中動物血清的終濃度是約10%。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
， 培養(yǎng)基包含約10%胎牛血清。
在第一個優(yōu)選具體實施方式
中，本發(fā)明的鳥類選自雁形目，優(yōu)選為鴨，更優(yōu) 選為北京鴨，再更優(yōu)選為北京鴨品系M14或GL30。根據(jù)第二個優(yōu)選具體實施方 式，本發(fā)明的鳥類為番鴨。因此，本發(fā)明提供了一種獲得源自胚胎干(ES)細(xì)胞 的持續(xù)雙倍體鴨細(xì)胞系的方法，其中所述鴨細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆 轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包括以下步驟
a) 在產(chǎn)卵期(即產(chǎn)卵)，或稍早或稍遲于產(chǎn)卵期，分離鴨胚胎?？蛇x地，將 卵孵育至成熟，通常為孵育過夜(即番鴨)；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的鴨胚胎干(ES)細(xì) 胞，所述培養(yǎng)基補充以下物質(zhì)胰島素生長因子(IGF-1)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子
(CNTF)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF) 和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和動物血清；
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于飼養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì)胞至少一個傳代；
d)在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去選自'IGF-1、 CNTF、 IL-6、
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鴨ES細(xì)胞至少一個傳代；
f) 在一個傳代至另一個傳代的過程中，逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，
以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層，優(yōu)選為在約5至約25個傳代后完全除去，并 繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 可選地；逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去
動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 增殖的源自ES細(xì)胞的粘附^fe鴨細(xì)胞系即鴨EBx⑧，其中所述持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞 系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i) 可選地，進一步使粘附性鴨細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。 在過程中除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物，優(yōu)選在步驟f)和g)之間或在步驟g)
和h)之間除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物。
步驟b)中的動物血清濃度優(yōu)選為5%至10%。胰島素生長因子(IGF-1)、睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、 干細(xì)胞因子(SCF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的濃度優(yōu)選為約1 ng/ml。
本發(fā)明還提供了第二個獲得源自胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)雙倍體鴨細(xì)胞系的 方法，其中所述鴨細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法 包括以下步驟
a) 在產(chǎn)卵期(即產(chǎn)卵)，或稍早或稍遲于產(chǎn)卵期，分離鴨胚胎?？蛇x地，將 卵孵育至成熟，通常為孵育過夜(即番鴨)；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的鴨胚胎干(ES)細(xì) 胞，所述培養(yǎng)基補充以下物質(zhì)IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF和FGF和動物 血清；
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于飼養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì) 胞至少一個傳代；
d) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去選自IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所有生長因子，優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì)胞至少 一個傳代；
e) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去生長因子IGF-1和CNTF， 優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì)胞至少一個傳代；
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去詞養(yǎng)層， 優(yōu)選為在約5至約25個傳忭后完全除去，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性鴨細(xì)胞系即鴨EBx⑧，其中所述持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞 系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i) 可選地，進一步使粘附性鴨細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。 在過程中除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物，優(yōu)選在步驟f)和g)之間或在步驟g)
和h)之間除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物。
步驟b)中的動物血清濃度優(yōu)選為5%至10%。 IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的濃度優(yōu)選為約1 ng/ml。
本發(fā)明提供了第三種獲得源自胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)雙倍體鴨細(xì)胞系的方 法，其中所述鴨細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包 括以下步驟
a) 在產(chǎn)卵期(即產(chǎn)卵)，或稍早或稍遲于產(chǎn)卵期，分離鴨胚胎?？蛇x地，將 卵孵育至成熟，通常為孵育過夜(即番鴨)；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的鴨胚胎干(ES)細(xì) 胞，所述培養(yǎng)基補充以下物質(zhì)胰島素生長因子(IGF-1)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子
(CNTF)和動物血清；
c) 將歩驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于飼養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì) 胞至少一個傳代；
d) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去生長因子IGF-1和CNTF， 優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì)胞至少一個傳代；
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層， 優(yōu)選為在約5至約25個傳代后完全除去，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；除去添加物？
g) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去 動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性鴨細(xì)胞系即鴨EBx⑧，其中所述持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞 系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i) 可選地，進一步使粘附性鴨EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。 在過程中除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物，優(yōu)選在步驟f)和g)之間或在步驟g)
和h)之間除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物。
步驟b)中的動物血清濃度優(yōu)選為5%至10%。 IGF-1和CNTF的濃度優(yōu)選為 約1 ng/ml。
一旦獲得了粘附性或懸浮鴨細(xì)胞系，本發(fā)明方法還包括另外的步驟，使鴨 EBx⑧細(xì)胞適應(yīng)于在不含非動物來源的蛋白水解產(chǎn)物例如酵母水解產(chǎn)物的細(xì)胞培 養(yǎng)基中生長。優(yōu)選地，本發(fā)明所述鴨EBx⑧細(xì)胞系通過Q-PERT分析不顯示逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 此外，通過將本發(fā)明所述鴨EBx⑧細(xì)胞與有ALV復(fù)制能力的細(xì)胞例如鵪鶉QT6細(xì) 胞或雞DF1細(xì)胞進行共同培養(yǎng)的實驗證明鴨EBx⑧細(xì)胞不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi) 源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。另外，透射電子顯微鏡(TEM)分析也證明在鴨EBx⑧細(xì)胞 中不存在有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。優(yōu)選地，本發(fā)明所述鴨EBx⑧細(xì)胞 系選自如下所述的鴨EB24、鴨EB26和鴨EB66。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，本發(fā)明的鳥類選自雞形目，更優(yōu)選為雞，優(yōu) 選為ev-0家雞(原雞屬家雞亞種)。因此，本發(fā)明提供了一種獲得源自胚胎干(ES) 細(xì)胞的持續(xù)雙倍體ev-0家雞細(xì)胞系的方法，其中所述ev-0家雞細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù) 制能力的內(nèi)源性ALV-E逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包括以下步'驟
a) 在產(chǎn)卵期(即產(chǎn)卵)，或稍早或稍遲于產(chǎn)卵期，分離ev-0家雞胚胎；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的ev-O家雞胚胎干(ES) 細(xì)胞，所述培養(yǎng)基補充以下物質(zhì)IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF和FGF和動 物血清；
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于飼養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)ev-0家 雞ES細(xì)胞至少一個傳代；
d) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去選自IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所有生長因子，優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng) 雞ES細(xì)胞至少一個傳代；—
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層， 優(yōu)選為在約5至約25個傳代后完全除去，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去 動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性ev-0家雞細(xì)胞系即EBx ev-0，其中所述持續(xù)的雙倍 體禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i) 可選地，進一步使粘附性禽細(xì)胞系EBxev-O適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。 在過程中除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物，優(yōu)選在步驟f)和g)之間或在步驟g)
和h)之間除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物。
步驟b)中的動物血清濃度優(yōu)選為5%至10%。 IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF和FGF的濃度優(yōu)選為約1 ng/ml。
本發(fā)明還提供了第二種獲得源自胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)雙倍體ev-O家雞細(xì) 胞系的方法，其中所述ev-0家雞細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E逆轉(zhuǎn)錄 病毒顆粒，所述方法包括以下步驟 ，
a) 在產(chǎn)卵期(即產(chǎn)卵)，或稍早或稍遲于產(chǎn)卵期，分離ev-0家雞胚胎；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的ev-O家雞胚胎千(ES)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基補充以下物質(zhì)IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF和FGF和動
物血清；
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于飼養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)ev-0家 雞ES細(xì)胞至少一個傳代；
d) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去選自IL-6、 IL-6R、 SCF、 FGF的所有生長因子，優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng)雞ES細(xì)胞至少 一個傳代；
e) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去生長因子IGF-1和CNTF， 優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng)ev-0家雞ES細(xì)胞至少一個傳代；
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層， 優(yōu)選為在約5至約45個傳代后完全除去，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去 動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性ev-0家雞細(xì)胞系，其中所述持續(xù)的雙倍體ev-0家雞 細(xì)胞系即雞EBx⑧不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i) 可選地，進一步使粘附性ev-O家雞細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。 在過程中除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物，優(yōu)選在步驟f)和g)之間或在步驟g)
和h)之間除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物。
步驟b)中的動物血清濃度優(yōu)選為5%至10%。 IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF和FGF的濃度優(yōu)選為約1 ng/ml。
本發(fā)明提供了第三種獲得源自胚胎干(ES)細(xì)胞的持續(xù)雙倍體ev-O家雞細(xì)胞 系的方法，其中所述ev-0家雞細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E逆轉(zhuǎn)錄病 毒顆粒，所述方法包括以下步驟
a) 在產(chǎn)卵期(即產(chǎn)卵)，或稍早或稍遲于產(chǎn)卵期，分離ev-0家雞胚胎；
b) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的ev-O家雞胚胎干(ES) 細(xì)胞，所述培養(yǎng)基補充以下物質(zhì)IGF-1和CNTF和動物血清；
c) 將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于詞養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)ev-O家 雞ES細(xì)胞持續(xù)至少一個傳代；
d) 在1至約15個傳代的范圍內(nèi)，從培養(yǎng)基中除去生長因子IGF-1和CNTF， 優(yōu)選為同時在一個傳代中除去，并繼續(xù)培養(yǎng)ev-0家雞ES細(xì)胞至少一個傳代；
f) 逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層， 優(yōu)選為在約5至約45個傳代后完全除去，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；
g) 可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去 動物血清；和
h) 獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層和可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性ev-0家雞細(xì)胞系即雞EBx ev-O，其中所述持續(xù)的雙
倍體雞細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；
i)可選地，進一步使粘附性ev-O家雞細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。 在過程除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物，優(yōu)選在步驟f)和g)之間或在步驟g)和h)
之間除去基礎(chǔ)培養(yǎng)基的添加物。
步驟b)中的動物血清濃度優(yōu)選為5%至10%。 IGF-1和CNTF的濃度優(yōu)選為
約1 ng/ml。
在另一個優(yōu)選的具體實施方式
中，本發(fā)明所述鳥是由特異性無病原(SPF)禽 群中獲得的家雞(原雞屬家雞亞種)。更優(yōu)選地，雞品系為白色來亨雞。已經(jīng)篩選 了 SPF雞蛋確認(rèn)其不存在已知的雞細(xì)菌病原體和病毒，包括網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病 毒(REV)和禽外源性白血病病毒(ALV-A、 ALV-B、 ALV-C、 ALV-D、 ALV-J)。本 發(fā)明所述SPF蛋可以是來自LOHMANN (Cuxhaven, Germany)的VALO蛋或來自 CHARLES RIVER(Spafas)的L22蛋。因此，本發(fā)明還提供了獲得源自胚胎干(ES) 細(xì)胞的持續(xù)雙倍體雞細(xì)胞系的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞從SPF雞蛋獲得，如用 ev-0雞蛋所描述。優(yōu)選地，從SPF蛋獲得的雞EBx⑧細(xì)胞系為EBv13。
本發(fā)明所述雞EBx⑧細(xì)胞系通過Q-PERT分析可能顯示出逆轉(zhuǎn)錄酶活性，但是 不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒?？赏ㄟ^將本發(fā)明所述雞EBx ev-O 細(xì)胞與有ALV復(fù)制能力的細(xì)胞例如鵪鶇QT6細(xì)胞或雞DF1細(xì)胞進行共同培養(yǎng)的 實驗而證明不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。另外，還可通過TEM證 明在雞EBx ev-O細(xì)胞中不存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
鳥的體溫通常為約39°C。因此，本發(fā)明的方法還可以包括將培養(yǎng)溫度降低至 37"的另外步驟以使本發(fā)明所述禽細(xì)胞系適應(yīng)于在37"C生長。優(yōu)選地，溫度調(diào)整 在除去飼養(yǎng)層之后和除去血清之前進行?；蛘?，溫度調(diào)整在除去血清的歩驟之后 或使細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的步驟之后進行。
本發(fā)明建立的EBx⑧細(xì)胞系具有以下特性在不含外源性生長因子和動物血清 且不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中作為粘附細(xì)胞或懸浮細(xì)胞生長?？蓡为毷褂没蚵?lián)合使 用不同的技術(shù)使細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，其中
-將粘附性細(xì)胞以高細(xì)胞密度植入，稍高于細(xì)胞融合度以迫使細(xì)胞進入懸浮 狀；
-將粘附性細(xì)胞植入含低濃度動物血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中；
-將粘附性細(xì)胞植入塑料制成的不允許細(xì)胞粘附或只允許微弱細(xì)胞粘附的 細(xì)胞培養(yǎng)器皿，例如細(xì)菌培養(yǎng)碟或培養(yǎng)板，以及由公司像Coming (組織培 養(yǎng)碟和培養(yǎng)板，Ref. 3262、3473、3471、3474;培養(yǎng)瓶Ref. 3814等)或Sarstedt (培養(yǎng)瓶ref 831810502等)所研發(fā)的超低粘附培養(yǎng)板；
-將粘附性細(xì)胞植入器皿中并搖晃培養(yǎng)(約50rpm)。
EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)選鴨EBx⑧和雞EBx ev-0可在體外培養(yǎng)一段相當(dāng)長的時間。有利地，由本發(fā)明的方法所獲得的粘附性或錨定非依賴性(即懸浮)EBx⑧細(xì)胞能 夠增殖至少50代、至少75代、至少100代、至少125代、至少150代、至少175 代、至少200代、至少250代。術(shù)語"品系"應(yīng)理解為能夠在體外培養(yǎng)中無限增 殖同時在或多或少的程度上保持相同的形態(tài)學(xué)和表型特征的任何細(xì)胞群體?？赏?過例如限制性稀釋從本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞中獲得克隆。這些克隆是與通過分裂產(chǎn) 生這些克隆的細(xì)胞在遺傳上相同的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法所獲得的持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系即EBx ，所述 EBx⑧為小的、圓的(即直徑為約10 ^M)個體化細(xì)胞，其在37'C或39'C時的加 倍時間為約30小時或30小時以下。禽EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)選鴨EBx⑧或雞EBx ev-O， 表達具有以下特性的胚胎干細(xì)胞表型
-高細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)比；
-內(nèi)源性端粒酶活性；
- 可選地，它們表達二種或多種另外的ES標(biāo)記例如堿性磷酸酶、SSEA-1、
EMA-1、 ENS1標(biāo)記； -加倍時間小于本發(fā)明方法的步驟a)中的禽ES細(xì)胞的加倍時間(在39°C
時為48小時至72小時)，其加倍時間在37'C時為約30小時或30小時以
下(優(yōu)選24小時)。 所述細(xì)胞不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
本發(fā)明所述禽EBx⑧細(xì)胞系能夠在不含外源性生長因子、血清和/或滅活的飼 養(yǎng)層，可選地補充了本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的各種添加物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基特別是 例如SAFC Excell培養(yǎng)基、DMEM、 GMEM、 DMEM-HamF12或McCoy中無限增 殖。添加物的例子為非必需氨基酸、維生素、丙酮酸鈉和抗生素。本發(fā)明所述鴨 EBx⑧細(xì)胞具有在不補充谷氨酰胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長的顯著特點。
本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其保持多能或多能(phiri-ormultipotent)禽胚 胎干細(xì)胞，優(yōu)選多能或多能鴨胚胎干(ES)細(xì)胞，在培養(yǎng)中的未分化狀態(tài)。根據(jù) 優(yōu)選的具體實施方式
，本發(fā)明涉及用于鴨胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含補充 了動物血清和補充了至少IGF-1和CNTF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)第二個優(yōu)選的具體 實施方式，本發(fā)明涉及用于鴨胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含補充了動物血清 和補充了至少IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)第三個優(yōu)選的具體 實施方式，本發(fā)明涉及用于鴨胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含補充了動物血清 和補充了至少IGF-1、 CNTF、 IL-6、 IL-6R、 SCF和FGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述培養(yǎng) 基足夠保持所述鴨ES細(xì)胞在培養(yǎng)中的未分化狀態(tài)至少7天，優(yōu)選至少20天，優(yōu) 選至少100天。所述的本發(fā)明的培養(yǎng)基還可以包括可選的至少一種選自白細(xì)胞介 素-11、心營養(yǎng)素、制瘤素和白血病抑制因子(LIF)的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng) 基還包括如前所述的非動物來源的蛋白水解產(chǎn)物；更優(yōu)選地，其為1X濃度的酵母 水解產(chǎn)物。本發(fā)明所述禽(優(yōu)選為鴨)ES細(xì)胞的培養(yǎng)基還可包括飼養(yǎng)細(xì)胞層。本發(fā)明還提供了持續(xù)的鴨ES細(xì)胞培養(yǎng)物，其實質(zhì)上由表達具有以下特性的干 細(xì)胞表型的未分化的鴨ES細(xì)胞組成 -高細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)比； -內(nèi)源性端粒酶活性；
- 可選地，鴨ES細(xì)胞可表達一種或多種另外的ES標(biāo)記例如堿性磷酸酶、 SSEA-1、 EMA-1、 ENS1標(biāo)記；
- 加倍時間在37E或39'C時為約40小時。
所述的本發(fā)明的未分化鴨細(xì)胞當(dāng)生長于如前所述的鴨胚胎干細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基 中的飼養(yǎng)細(xì)胞上時能夠保持所述的干細(xì)胞表型。所述的未分化鴨細(xì)胞可用于產(chǎn)生 嵌合或轉(zhuǎn)基因鴨。
因此，本發(fā)明還涉及一種獲得嵌合鴨的方法，所述方法包括以下步驟
a) 向受體鴨胚胎的胚下腔中引入如上所述的持續(xù)的鴨ES細(xì)胞培養(yǎng)物；和
b) 孵育步驟a)中獲得的胚胎直至孵化成小鴨子；
c) 選擇所述嵌合小鴨子，其包含己經(jīng)在所述小鴨子中定居的異源細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種獲得遺傳修飾的嵌合鴨的方法，所述方法包括以下步驟
a) 向受體鴨胚胎的胚下腔中引入如上所述的遺傳修飾的鴨ES細(xì)胞；和
b) 孵育步驟a)中獲得的胚胎直至孵化成小鴨子；
c) 選擇所述嵌合小鴨子，其包含己經(jīng)在所述小鴨子中定居的經(jīng)遺傳修飾的異 源細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及獲得所述嵌合小鴨子的子代的方法，其中所述方法包括以下步
驟
a) 使所選的步驟c)中獲得的嵌合小鴨子成熟為成年鳥；
b) 飼養(yǎng)所述的其中具有異源細(xì)胞的成年鳥，從而產(chǎn)生鳥子代；
c) 在子代中選擇目的鳥。
本發(fā)明還包括另外的步驟即表達在所述遺傳修飾的鴨ES細(xì)胞中包含的表達載
體所編碼的異源多肽。優(yōu)選地，異源多肽被運送進入鴨的體液，例如血液、精液、 尿液或由經(jīng)遺傳修飾的雌鴨所產(chǎn)生的發(fā)育中的禽卵的蛋白中。
本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞具有以上所述所有的特性，且可用于產(chǎn)生生物制品例如
病毒疫苗和重組肽和蛋白。
本發(fā)明還提供了一種在本發(fā)明所述持續(xù)的雙倍體禽EBx⑧細(xì)胞系中復(fù)制病毒 的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明運提供了一種在本發(fā)明所述持續(xù)的雙倍體禽EBx⑧細(xì)胞 系，優(yōu)選為鴨或雞EBx⑧細(xì)胞系中復(fù)制病毒的方法，其包括以下步驟
-以目的病毒感染禽EBx⑧細(xì)胞培養(yǎng)物；所述禽EBx⑧細(xì)胞優(yōu)選為在不含動
物血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
- 培養(yǎng)經(jīng)感染的禽EBx⑧細(xì)胞以復(fù)制所述病毒；
-收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和/或所述細(xì)胞中的病毒。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式
，所述方法包括以下步驟
a) 在培養(yǎng)器皿中在無血清的1號培養(yǎng)基中以懸浮方式增殖所述禽EBx⑧細(xì)胞;
b) 當(dāng)細(xì)胞密度為至少1.5xl(^個細(xì)胞/ml時以所選病毒感染所述細(xì)胞；
c) 可選地，在感染之前不久，感染同時或感染之后不久，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加 入無血清的2號培養(yǎng)基；和
d) 進一步培養(yǎng)所述感染的細(xì)胞以使病毒復(fù)制；和
e) 可選地，收獲所述病毒。
本發(fā)明所述方法包含另外的步驟即在允許病毒繁殖的條件下在培養(yǎng)基中加入
蛋白水解酶。蛋白水解酶選自胰蛋白酶、糜蛋白酶(chymotrypsine)、嗜熱菌蛋白 酶(thermolysine)、胃液素(pepsine)、月夷酶(pancreatine)、木瓜蛋白酶(papain)、 鏈霉蛋白酶(pronase)、祜草桿菌蛋白酶A (subtiiisine A)、彈性蛋白酶(elastase)、 furine和羧肽酶(carboxypeptidase)。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式
，酶是胰蛋白酶。優(yōu) 選地，蛋白水解酶是由原核宿主或植物產(chǎn)生的重組蛋白(即trypzean)?？稍诓《?感染之前、感染時和/或感染后加入蛋白水解酶。優(yōu)選地，加入蛋白水解酶是在病 毒感染之后。向培養(yǎng)基中加入蛋白水解酶可每天進行一次、'每天進行多次或每天 不足一次，直至收獲病毒。
本文中所用術(shù)語"病毒"不僅包括天然發(fā)生的病毒還包括減毒的病毒、重排 病毒(reassortantviruse)、疫苗株以及重組病毒及其衍生的病毒載體。本發(fā)明所述 病毒優(yōu)選選自痘病毒(poxviruse )、正粘病毒(orthomyxoviruse )、副粘病毒
(paramyxoviruse)、皰疹病毒(herpes viruse)、嗜肝病毒(hepadnaviruse)、腺病 毒(adenoviruse)、細(xì)d、病毒(parvoviruse) 、 U乎腸f瓜病毒(reoviruse)、環(huán)狀病毒
(circoviruse )、 冠狀病毒(coronavimse )、 黃病毒(flavivirase )、 披膜病毒
(togaviruse)、雙RNA病毒(birnavriruse)禾口逆轉(zhuǎn)錄病毒。
在優(yōu)選的具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗屬于 痘病毒科(poxviridae)家族，更優(yōu)選為屬于脊椎動物痘病毒亞科(chordopoxviridae)。 在一個具體實施方式
中，病毒或相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗為痘病毒， 優(yōu)選為禽痘病毒(avipoxvirus)，選自雞痘病毒(fowlpox vims)(即TROVAC)、 金絲雀痘病毒(即ALVAC)、雪雞痘病毒(juncopox virus)、八哥痘病毒(mynahpox virus)、鴿痘病毒、鸚鵡痘病毒、鵪鶉痘病毒、麻雀痘病毒、椋鳥痘病毒(starling poxvirus)或火雞痘病毒。根據(jù)另一個優(yōu)選具體實施方式
，病毒為牛痘病毒，其選 自Lister-Elstree牛痘病毒株、修飾的牛痘病毒例如修飾的牛痘病毒Ankara(MVA)， 其可由ATCC (ATCC號VR-1508), NYVAC (Tartaglia等人，1992, Virology, 188:217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi, 1994, Vaccine, 12:675-681), CVI78 (Kempe等人1968, Pediatrics 42:980-985)獲得，以及其它重組的或非重組牛痘病 毒。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于正粘病毒家族，特別是流感病毒。流感病毒選自人類流感病毒、禽流感病毒、馬 流感病毒、豬流感病毒、貓流感病毒。流感病毒優(yōu)選選自株A、 B和C。在株A 中，根據(jù)血凝素和神經(jīng)氨糖酸苷酶(neuraminidase)而列出不同的亞型，例如而不 限于H1N1、 H2N2、 H3N2、 H4N2、 H4N6、 H5N1、 H5N2、. H7N7 et H9N2。在 H1N1株中，可列出A/PortoRico/8/34、 A/New Caledonia/20/99、 A/Beijing/262/95、 A/Johannesburg/282/96、 A/Texas/36/91 、 A/Singapore、 A/Solomon Islands/03/2006 。 在H3N2株中，可列出A/Panama/2007/99、 A/Moscow/10/99、 A/Joh證esburg/33/94、 A/Wisconsin/10/04 。在株B中，可列出而不限于B/Porto Rico/8/34 、 B/Johannesburg/5/99 、 B/Vienna/1/99 、 B/Ann Arbor/1/86 、 B/Memphis/1/93 、 B/Harbin/7/94 、 N/Shandong/7/97 、 B/Hong Kong/3 3 0/01 、 B/Yamanashi/166/98 、 B/Jiangsu/10/03、 R/Ma1aysia。本發(fā)明所述流感病毒選自野生型病毒、從感染個體 中獲得的原代病毒分離體、重組病毒、減毒病毒、溫度敏感性病毒、適應(yīng)低溫的 病毒、重排病毒、反向遺傳—工程化病毒。當(dāng)本發(fā)明所述病毒為流感病毒時，本發(fā) 明所述方法包含另外的步驟—即在允許病毒繁殖的條件下向培養(yǎng)基中加入蛋白水解 酶。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式
，酶為胰蛋白酶。細(xì)胞培養(yǎng)基中胰蛋白酶的終濃度為 0.01 pg/nil直至10 pg/ml。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基中胰蛋白酶的終濃度為0.01至 10usp/ml (usp:美國藥典單位)，優(yōu)選為約0.05至2usp/ml，更優(yōu)選為約0.3至1 usp/ml，更優(yōu)選為約0.75 usp/ml。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 副粘病毒家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的副粘病毒或重組副粘病毒，其選自麻 疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、Sendai病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副 流感病毒I和III型、牛瘟(Rinderpest)病毒、犬瘟熱病毒、新城疫(Newcastle) 病毒、鴨副流感病毒。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，病毒為麻疹病毒或重組麻疹病 毒。根據(jù)另一個優(yōu)選的具體實施方式
，病毒為新城疫病毒(NDV)或重組NDV。 NDV株的例子為LaSota株。當(dāng)本發(fā)明所述病毒為NDV時，本發(fā)明所述方法優(yōu)選 包括另外的歩驟即在允許病毒繁殖的條件下向培養(yǎng)基中加入蛋白水解酶。根據(jù)優(yōu) 選的具體實施方式
，酶為胰蛋白酶。細(xì)胞培養(yǎng)基中胰蛋白酶的終濃度為0.01嗎/ml 直至10嗎/ml。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基中胰蛋白酶的終濃度為0.01至10 usp/ml(usp: 美國藥典單位)，優(yōu)選為約0.3至1 usp/ml，更優(yōu)選為約0.4至0.75 usp/ml。有趣的 是，本發(fā)明所述可粘附生長的EBx⑧細(xì)胞系可用于在斑檢驗中進行病毒滴定，優(yōu)選 為NDV滴定。確實，不像CEF和雞DF1成纖維細(xì)胞一樣(其中不可能觀測到任 何引起細(xì)胞病變的效應(yīng))，在EBx⑧細(xì)胞中生長的病毒引起特征性的巨大細(xì)胞的形 成。另外，NDV病毒顆?？赏ㄟ^血凝素檢驗來確定。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明 所述EBx⑧細(xì)胞用于病毒滴定例如NDV病毒滴定的用途。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 披膜病毒科家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的a病毒或重組a病毒，其選自Sinbis病毒、Semliki森林病毒、O，nyong，nyong病毒、Chikungunya病毒、Mayaro病毒、 Ross河病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒。
在另一個優(yōu)選具體實施-方式中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 皰疹病毒家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的馬立克病病毒或重組馬立克病病毒。 馬立克病病毒(MDV)優(yōu)選選自批準(zhǔn)的MDV疫苗株，如FC126 (HTV)、 SB-1、 301BZ1、 CVI988克隆C、 CV1988/C/R6、 CVI988/Rispens、 R2/23 (Mdl1/75)。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 嗜肝病毒家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的嗜肝病毒或重組嗜肝病毒，優(yōu)選選自 禽和人類嗜肝病毒。禽嗜肝病毒優(yōu)選選自鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、蒼鷺乙型肝 炎病毒和雪雁(SGHBV)。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中；病毒、相關(guān)病毒載休、病毒顆粒和疫苗屬于 雙RNA病毒家族，特別是傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus)。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 黃病毒家族，特別是登革熱病毒、日本腦炎病毒和西尼羅河病毒。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 冠狀病毒家族，特別是傳染性支氣管炎病毒。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 環(huán)狀病毒家族，特別是雞貧血病病毒。 '
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 逆轉(zhuǎn)錄病毒家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒，選自網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增 殖病毒、鴨傳染性貧血病毒、suck脾壞死病毒或其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 細(xì)小病毒家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的細(xì)小病毒例如鴨細(xì)小病毒或其重組細(xì) 小病毒。
在另一個優(yōu)選具體實施方式
中，病毒、相關(guān)病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于 腺病毒家族。優(yōu)選地，病毒為天然發(fā)生的腺病毒，優(yōu)選選自雞腺病毒、鵝腺病毒、 鴨腺病毒和鴿子腺病毒或其重組腺病毒。雞腺病毒的例子為雞腺病毒1 (CELO)、 雞腺病毒5 (340)、雞腺病毒4 (KR95)、雞腺病毒10 (CFA20)、雞腺病毒2 (P7-A)、 雞腺病毒3 (75)、雞腺病毒9 (A2-A)、雞腺病毒11 (380)、雞腺病毒6 (CR119)、 雞腺病毒7(YR36)、雞腺病毒8a(TR59)、雞腺病毒8b (764)和減蛋綜合征病毒。 鵝腺病毒的例子為鵝腺病毒1、鵝腺病毒2、鵝腺病毒3。鴨腺病毒的例子為鴨腺 病毒2。鴿子腺病毒的例子為鴿子腺病毒l。
重組病毒包括但不限于包含異源基因的病毒載體。在一些具體實施方式
中， 宿主細(xì)胞EBx⑧、輔助病毒、輔助質(zhì)粒提供病毒復(fù)制的輔助功能。代表性的載體包 括但不限于那些感染禽類或哺乳動物細(xì)胞的載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞用于復(fù)制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌例如衣原體、立克次氏體或柯克斯體。
本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞還可用于生產(chǎn)重組蛋白和肽。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)重 組蛋白和肽的方法，包括以下步驟(i)以表達載體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染本發(fā)明所述 EBx⑧細(xì)胞而對其進行遺傳修飾；(ii)可選地，選擇表達所述重組蛋白或肽的EBx 細(xì)胞；(iii)純化所述肽或蛋白。由EBx⑧細(xì)胞生產(chǎn)的肽和蛋白也包括在本發(fā)明的 范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述培養(yǎng)器皿更優(yōu)選為選自持續(xù)攪拌的槽生物反應(yīng)器Wave 生物反 應(yīng)器、BelloTM生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)瓶或細(xì)胞工廠.(cell factory)。通常， 細(xì)胞是使用各種大小的T形瓶、轉(zhuǎn)瓶或WaveTM生物反應(yīng)器從主要或工作細(xì)胞瓶中 按比例增加而來，優(yōu)選最終進入生物反應(yīng)器。然后通常將所得到的細(xì)胞懸浮液置 入種子生產(chǎn)生物反應(yīng)器(體積通常為20-30L)進行進一步培養(yǎng)i在一些具體實施 方式中，置入更大的生產(chǎn)性生物反應(yīng)器(體積通常為150-180L或以上)。第二個
(較大的)生物反應(yīng)器與種子生物反應(yīng)器的體積比為基于細(xì)胞系在第一個生物反 應(yīng)器中繁殖的程度，該比例通常為3:1至10:1，例如在(6-8):l的范圍內(nèi)。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式
，培養(yǎng)器皿是連續(xù)攪拌槽生物反應(yīng)器，其允許控制溫度、通氣、pH 和其它控制條件且具有合適的用于引入細(xì)胞、無菌氧氣、各種培養(yǎng)基的入口和用 于除去細(xì)胞和培養(yǎng)基的出口，_以及在生物反應(yīng)器中攪拌培養(yǎng)基的設(shè)備。
根據(jù)本發(fā)明，"無血清i音養(yǎng)基"(SFM)是指隨時可用的細(xì)胞培養(yǎng)基，也就是 說它不需要允許細(xì)胞存活和生長的動物血清添加。這種培養(yǎng)基不一定是化學(xué)上確 定的，可含有各種來源例如植物或酵母來源的水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述SFM為滿 足"非動物來源"，也就是說其不含動物或人類來源的成分(FAO狀態(tài)"不含動 物來源的")。在SFM中，天然的血清蛋白被重組蛋白替換?；蛘?，本發(fā)明所述SFM 不含蛋白(PF培養(yǎng)基"無蛋白培養(yǎng)基")和/或化學(xué)上確定的(CDM培養(yǎng)基"化 學(xué)上確定的培養(yǎng)基")。SFM培養(yǎng)基具有幾個優(yōu)點(i)首先是這種培養(yǎng)基的調(diào)控 順從性(確實沒有被外來試劑例如BSE、病毒所污染的風(fēng)險)；(ii)優(yōu)化純化過程；
(iii)由于更確定的培養(yǎng)基，所以在過程中具有更好的重現(xiàn)性?？傻玫降纳淌跾FM 培養(yǎng)基的例子為VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020、目錄號2003)、 Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019、目錄號2003)、 Episerf (InVitrogen Ref 10732-022、目錄 號2003)、 Pro 293 S隱CDM (Cambrex ref 12765Q、目錄號2003)、 LC17 (Cambrex Ref BESP302Q)、 Pro CHO 5-CDM (Cambrex refl2-766Q、目錄號2003)、 HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH30515-02)、 HyQ SFM4CHO陽Utility (Hyclone Ref SH30516.02)、 HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356.02)、 HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02)、 Excell 293培養(yǎng)基(SAFC Biosciences ref 14570-1000M)、 Excell 325 PF CHO無蛋白培養(yǎng)基 (SAFC Biosciences ref 14335-1000M)、 Excell VPRO培養(yǎng)基(SAFC Biosciences ref 14560-1000M)、 Excell 302無血清培養(yǎng)基(SAFC Biosciences ref 14312-1000M)、 Excell 65319、 Excell 65421 、 Excell 65625、 Excell 65626、 Excell 65627、 Excell 65628、Excell 65629 (JRH Biosciences) 、 Excell MDCK SFM (SAFC-Biosciences Ref. 14581C)、 Excell MDCK Prod (Ref. M3678)、基因治療培養(yǎng)基3 (無動物成分) (SIGMA-Aldrich、 ref. G-9916或Excell GTM-3)(此后稱為G9916培養(yǎng)基)、HYQ CDM4 HEK-293 (Hyclone Ref. SH30859)、 HYQ SFM4 HEK-293 (HYCLONE Ref. SH30521)、 AEM (InVitrogen)。根據(jù)第一個具體實施方式
，1號無血清培養(yǎng)基和2 號無血清培養(yǎng)基為相同的培養(yǎng)基。根據(jù)第二個具體實施方式
，1號無血清培養(yǎng)基和 2號無血清培養(yǎng)基具有不同的成分。
本發(fā)明所述方法包括除去全部1號無血清培養(yǎng)基或其一部分，然后以2號無 血清培養(yǎng)基替換。但是，更方便的是除去1號無血清培養(yǎng)基的重要部分(例如直 至約50%)然后以2號無血清培養(yǎng)基補充，同時仍然通過例如旋轉(zhuǎn)濾器(Spinfilter) 除去1號培養(yǎng)基。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式
，直接向1號無血清培養(yǎng)基中加入2號 無血清培養(yǎng)基，而不除去^部分1號無血清培養(yǎng)基。向1倍體積的1號無血清培 養(yǎng)基中加入0.25至10倍體積的2號無血清培養(yǎng)基。在優(yōu)選具體實施方式
中，向1 倍體積的1號無血清培養(yǎng)基中加入約0.5至8倍體積的2號無血清培養(yǎng)基。在更優(yōu) 選具體實施方式
中，向1倍體積的1號無血清培養(yǎng)基中加入約3至6倍體積的2 號無血清培養(yǎng)基。
1號無血清培養(yǎng)基和/或2號無血清培養(yǎng)基可補充至少一種選自氨基酸、脂肪、 脂肪酸、膽固醇、維生素、碳水化合物、非動物來源的蛋白水解產(chǎn)物及其混合物 的成分。
或者，本發(fā)明所述復(fù)制病毒的方法為批次飼養(yǎng)方法，其包含另外的步驟即用 至少一種選自氨基酸、脂肪、維生素、碳水化合物、非動物來源的蛋白水解產(chǎn)物、 表面活性劑或其混合物的成分來飼養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)第一個優(yōu)選的具體實施方式
，飼 養(yǎng)發(fā)生于本發(fā)明所述復(fù)制病毒方法的步驟a)至d)之間，或者只發(fā)生于歩驟b) 至d)，或者只發(fā)生于步驟d)。飼養(yǎng)可在每日的基礎(chǔ)上或在連續(xù)的基礎(chǔ)上進行。當(dāng) 詞養(yǎng)為不連續(xù)時，飼養(yǎng)可每天進行一次、每天進行多次或每天不足一次。
本發(fā)明所述SFM培養(yǎng)基包含一些成分，包括氨基酸、維生素、有機和無機鹽、 碳水化合物來源，每種成分以支持體外細(xì)胞培養(yǎng)的量存在。'但是，為了改善細(xì)胞 生長或病毒產(chǎn)量，向SFM培養(yǎng)基中加入另外的成分。
向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入的氨基酸的選擇可通過分析培養(yǎng)中的細(xì)胞對氨基酸的消 耗來確定；這樣的消耗由于細(xì)胞種類的不同而變化。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
， 向培養(yǎng)基中加入的氨基酸可選自天冬酰胺或谷氨酰胺或其混合物。在更優(yōu)選的具 體實施方式中，向雞EBx細(xì)胞培養(yǎng)物中加入谷氨酰胺，谷氨酰胺的給予在步驟a) 至d)之間進行以保持培養(yǎng)基中的谷氨酰胺濃度介于約0.5 mM至約5 mM，優(yōu)選 為約1 mM至約3 mM，最優(yōu)選為約2 mM。在優(yōu)選的具體實施方式
中，谷氨酰胺 的給予在連續(xù)的基礎(chǔ)上進行。有趣的是，鴨EBx⑧細(xì)胞不消耗太多的谷氨酰胺，因 為鴨細(xì)胞具有合成谷氨酰胺—的能力。因此，在鴨EBx細(xì)胞培養(yǎng)物中可加入或者不加入谷氨酰胺。
根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，向培養(yǎng)基中加入的碳水化合物選自D-葡萄糖、D-蔗糖、D-半乳糖或其混合物。根據(jù)更加優(yōu)選的具體實施方式
，所加入的碳水化合 物是D-葡萄糖。D-葡萄糖的給予在步驟a)至d)之間，更優(yōu)選在b)至d)之間 進行以保持培養(yǎng)基中的D-葡萄糖濃度介于約0.5 g/1至約25 g/1的D-葡萄糖，優(yōu)選 為約1 g/l至10 g/1的D-葡萄糖，最優(yōu)選為約2至3g/l的D-葡萄糖。在優(yōu)選的具體 實施方式中，D-葡萄糖的給予在連續(xù)的基礎(chǔ)上進行。
根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，脂肪選自膽固醇、類固醇和脂肪酸例如棕櫚酸、 棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，及其衍生物，或其混合物。更優(yōu)選 地，脂肪酸來自SIGMA-ALDRICH (Ref. F7050)且向培養(yǎng)基中加入約0.35 pl/ml的 脂肪酸溶液。
培養(yǎng)基可含有輔佐性物質(zhì)，例如緩沖液物質(zhì)例如碳酸氫鈉、氧化穩(wěn)定劑、抵 消機械壓力的穩(wěn)定劑、或蛋白酶抑制劑。如果需要，可向培養(yǎng)基中加入非離子表 面活性劑如聚丙二醇(PLURONIC F-61、 PLURONIC F-68、 SYNPERONIC F-68、 PLUR0NICF-71或PLURONICF-108)作為除泡沫劑。這些試劑通常用于保護細(xì)胞 抵抗通氣的副作用，因為不加表面活性劑的話，氣泡的上升和破裂可引起那些位 于這些氣泡("鼓泡")表面的細(xì)胞的損傷。非離子性表面活性劑的量優(yōu)選為約0.05 至約10g/L，通常為約0.1至約5 g/L。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的具體實施方式
， 細(xì)胞培養(yǎng)基中表面活性劑的濃度可被修改以調(diào)整(增加或減少)細(xì)胞簇的大小。
根據(jù)本發(fā)明所述復(fù)制病毒的方法的優(yōu)選的具體實施方式
，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加 入2號無血清培養(yǎng)基是在感染步驟b)之后進行，優(yōu)選為步驟b)之后約0.5至4 小時，更優(yōu)選為歩驟b)之后約1小時。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實施方式
，向細(xì) 胞培養(yǎng)物中加入2號無血清培養(yǎng)基是在感染步驟b)之前進行，優(yōu)選為步驟b)之 前約0.5至約4小時，更優(yōu)選為步驟b)之前約1小時。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體 實施方式，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入2號無血清培養(yǎng)基是在感染步驟b的同時進行。 步驟b)的病毒感染是以約10至l(T8的m.o.i (感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection))) 進行，優(yōu)選為10"至10'6，更優(yōu)選為約10^至l(T5，更優(yōu)選為約10"4。本領(lǐng)域技術(shù) 人員將根據(jù)病毒類型確定最佳的m.o.i。在步驟c)中，感染的細(xì)胞優(yōu)選為培養(yǎng)至 少24小時，至少48小時、至少72小時、至少96小時、至少120小時、至少144 小時。當(dāng)病毒是痘病毒時，..感染的細(xì)胞至少培養(yǎng)144小時。
在本發(fā)明所述方法中，步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物通過批次培養(yǎng)、重復(fù)批次培養(yǎng)、 饋料批次(fed-batch)培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)進行。更優(yōu)選地，步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物通 過饋料批次培養(yǎng)進行。當(dāng)細(xì)胞密度為至少約4,000,000，優(yōu)選為6，000，000個細(xì)胞/ml 的時候在批次培養(yǎng)或饋料批次培養(yǎng)方法中進行步驟b)的感染。當(dāng)使用灌注方法時， 當(dāng)細(xì)胞密度為至少8,000,000細(xì)胞/ml，優(yōu)選為約9,000,000至10,000,000個細(xì)胞/ml 或更高的時候行步驟b)的感染。步驟a)、 b)、 c)和d)的無血清培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為通過生物反應(yīng)器進行 監(jiān)控。pH值應(yīng)該介于6.5至7.8，優(yōu)選為約6.8至7.5，更優(yōu)選為約7.2。
在本發(fā)明的方法中，在收獲前步驟d)持續(xù)1至10天。根據(jù)優(yōu)選的具體實施 方式，在收獲前步驟d)持續(xù)2至5天。(歩驟e)的收獲時間根據(jù)培養(yǎng)器皿中的 細(xì)胞密度確定。本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)收獲病毒的最佳時間為活細(xì)胞密度達到其最佳 水平且開始由于病毒感染而下降之后的兩天。
細(xì)胞培養(yǎng)在32。C至39'C的溫度進行，取決于病毒的類型。對于生產(chǎn)流感病毒 和痘病毒來說，細(xì)胞培養(yǎng)感染優(yōu)選在33'C進行。
EBx⑧細(xì)胞具有以很少細(xì)胞(多達100個以上的細(xì)胞)疏松聚集成細(xì)胞簇的懸 浮培養(yǎng)方式生長的能力。不被理論所限，細(xì)胞簇的大小可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基的成分 而變化。例如，表面活性劑例如聚丙二醇(PLURONIC F-61、 PLURONIC F-68、 SYNPERONIC F-68、 PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)、攪拌、二價例子濃 度例如Mg2+和Ca2+的存在可對細(xì)胞簇的大小有影響。本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)可通過 在至少方法的步驟a)中允許本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞彼此聚集成簇來增加病毒產(chǎn)量。 在使用各種大小的T形瓶或轉(zhuǎn)瓶從主要和工作細(xì)胞瓶按比例增加至生物反應(yīng)器過 程中，懸浮細(xì)胞通常是通過稀釋進入新鮮培養(yǎng)基或是通過先離心然后將細(xì)胞沉淀 重懸進入新鮮培養(yǎng)基中，傳代至較大容器。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞傳代時，推薦的 做法是保持大的細(xì)胞簇進入培養(yǎng)物。為了這樣做，最好不要打亂細(xì)胞簇，以便改 善EBx⑧細(xì)胞中的病毒復(fù)制。例如，在T形瓶或轉(zhuǎn)瓶中步驟a)培養(yǎng)的最初時期， 推薦的做法是稀釋細(xì)胞培養(yǎng)物而將細(xì)胞傳入較大的容器，不推薦的做法是離心或 者通過吸液或攪拌而打亂細(xì)胞簇。但是，太大的簇對于高病毒產(chǎn)生來說不是最理 想的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將確定在步驟a)的最初細(xì)胞傳代時通過吸液或攪拌 而部分打亂簇是否能夠改善病毒產(chǎn)量。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，痘病毒，優(yōu)選 MVA、 ALVAC和雞痘病毒，是通過本發(fā)明所述方法中包括步驟a)的增殖成簇的 以很少細(xì)胞(達至少100個以上的細(xì)胞，至少200個細(xì)胞，至少500個細(xì)胞，至 少1000個細(xì)胞)疏松聚集的EBx⑧來獲得的。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EBx⑧細(xì)胞簇，優(yōu)選鴨EBx⑧細(xì)胞簇可能依賴于錨定非依賴性細(xì) 胞培養(yǎng)基中的Mg2+和/或Ca2+離子濃度。由于太大的簇對于高病毒產(chǎn)量來說不是 最理想的，簇的大小可通過調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)基中的Mg2+和/或Ca2+離子濃度來監(jiān)視。 對于鴨EBx⑧細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選含有濃度為0.5 mM至2.5 mM的Mg2+濃度， 優(yōu)選為約1.6mM;以及0.01 mM至0.5 mM，優(yōu)選約0.1 mM的Ca2+濃度。
本發(fā)明還涉及以本發(fā)明所述方法獲得的病毒。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明病毒 的疫苗。生產(chǎn)病毒疫苗的方法包括本發(fā)明所述復(fù)制病毒的方法，其中收獲病毒的 步驟e)包含至少一個選自過濾、濃縮、冷凍和加入穩(wěn)定劑進行穩(wěn)定的步驟。根據(jù) 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)收獲病毒。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，收獲所述病毒 的步驟包括收集從離心細(xì)胞培養(yǎng)物而獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、然后過濾、濃縮、冷凍、通過加入穩(wěn)定劑穩(wěn)定病毒制備物。例如，對于流感病毒來說，參見Furminger, In Nicholson, Webster and Hay (Eds) Textbook of influenza, chapter 24 pp324-332。
本發(fā)明所述生產(chǎn)病毒疫苗的方法還可以包括另外的步驟即將收獲的病毒滅 活。滅活優(yōu)選為通過使用甲醛、p-丙內(nèi)酯、乙醚、乙醚和去污劑(即例如Tween 80TM)、 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和Triton N102、去氧膽酸鈉和磷酸三丁酯 (tri(N-butyl)phosphate)處理而進斗亍。
根據(jù)另一個優(yōu)選的具體實施方式
，本發(fā)明還涉及從本發(fā)明所述方法獲得的病 毒制備病毒抗原性蛋白的方法，所述方法包括另外的步驟
a) 可選地，以脫氧核糖核酸限制性酶，優(yōu)選為DNAse (見EC3丄21和EC3丄22 分類)和核酸酶(見EC3丄30和EC3丄31分類)孵育包含完整病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清 液。優(yōu)選地，DNA消化酶是benzonase (Benzon核酸酶)或DNase I;
b) 添加陽離子去污劑。陽離子去污劑的例子有但不限于十六烷基三甲基銨 鹽例如CTAB，十四烷基三甲基銨鹽、脂質(zhì)體(lipofectine)、 DOTMA和Tween ;
c) 分離抗原性蛋白。后者的步驟可通過離心或超濾而進行。 疫苗中的病毒可以作為完整病毒顆粒或作為分解的病毒顆粒存在。根據(jù)具體
實施方式，疫苗為殺死的或滅活的疫苗。根據(jù)另一個具體實施方式
，疫苗為活的 減毒的疫苗其中所述疫苗主要包含由本發(fā)明所述方法獲得的EBx細(xì)胞培養(yǎng)上清 液，優(yōu)選不含血清，可選為經(jīng)過濾和/或濃縮的，并包含所述病毒。根據(jù)第三個具 體實施方式，疫苗包含從本發(fā)明所述方法制備的病毒獲得的病毒抗原性蛋白。
本發(fā)明還涉及提供一種疫苗，其包含由本發(fā)明所述方法獲得的感染的細(xì)胞系 EBx ，優(yōu)選為鴨或ev-0雞EBx ，其中感染的細(xì)胞系EBx⑧優(yōu)選為鴨或ev-0雞 EBx⑧為步驟d)中所收獲的。
本發(fā)明所述疫苗可包含本發(fā)明所述病毒結(jié)合藥學(xué)上可接受的增強免疫反應(yīng)的 物質(zhì)。增強免疫反應(yīng)的物質(zhì)的非限制性例子包括不完全氟氏佐劑、皂角苷、氫氧 化鋁鹽、溶血卵磷脂、plutonic polyol、聚陰離子、肽、卡介苗(BCG)和短小棒 狀桿菌(cwj股6ac^7'ww; an^m)。合成的佐劑的例子為QS-21 。另外，免疫刺激 蛋白(白細(xì)胞介素m、 112、 IL3、 IL4、 IL12、 IL13、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因 子等)可用于增強疫苗免疫反應(yīng)。
本發(fā)明所述疫苗優(yōu)選為液體制品、冷凍制品、脫水和冷凍制品，可選為適應(yīng) 于鼻內(nèi)給藥途徑。
本發(fā)明所述疫苗用于被前述病毒感染的人或動物的預(yù)防性和/或治療性治療。 優(yōu)選地，本發(fā)明所述病毒疫苗優(yōu)選用于被選自天花、流感、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹 病毒、RSV感染的人的預(yù)防性和/或治療性治療?；蛘?，本發(fā)明所述病毒性疫苗優(yōu) 選用于被選自流感、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、傳染性法氏囊病、感染性支 氣管炎病毒、犬瘟熱病毒、雞貧血病病毒感染的動物的預(yù)防性和/或治療性治療。 本發(fā)明所述重組病毒疫苗還可用于慢性病例如癌癥和傳染性疾病例如AIDS的預(yù)防性和/或治療性治療。
本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞系用于產(chǎn)生和生產(chǎn)重排病毒。具有分段的基因組的病毒 例如流感病毒可被重排。當(dāng)以至少兩種不同株的流感病毒同時感染本發(fā)明所述 EBx⑧細(xì)胞時，在相同宿主細(xì)胞中存在來自不同株的分段基因組的混合物。在病毒 組裝過程中，理論上可產(chǎn)生基因組片段的所有組合。因此可通過使用例如抗體選 擇或消除具有所需特性的病毒來分離特異性重排病毒(參見Kilnoume E.D in Plotkin SA and Mortimer E.A. Eds, Vaccines 1994)。本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞系還可用 于通過反向遺傳學(xué)產(chǎn)生和生產(chǎn)流感病毒(參見Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87:3802-3805 (1990); Enami et Palese， J. Virol. 65:2511-2513 (1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113 (1989》。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞系用作細(xì)胞底物以進行病毒滴定。EBx 細(xì)胞將有效地替代現(xiàn)在的用于確定病毒溶液滴度的細(xì)胞系統(tǒng)，例如含胚的卵、CEF、 DF1細(xì)胞和其它。優(yōu)選的病毒滴定為通過TCID50方法進行(Reed L， Muench H， 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am: J. Hyg. 27， 493-97)。 本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述EBx⑧細(xì)胞系用作進行衛(wèi)生檢測的細(xì)胞底物。 本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明所述病毒或其成分的診斷性組合物。 以下實施例更詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。以下制備物和實施例是為了使本領(lǐng)域技 術(shù)人員更清晰地理解和實踐本發(fā)明。但是本發(fā)明在范圍上不被示例性優(yōu)選的具體 實施方式所限制，具體實施方式
只是為了解釋本發(fā)明的單一方面，功能上同等的 方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。確實，除了本文所描述的那些以外，來自于前面的描 述和附圖的各種本發(fā)明的變體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是明顯的。對于描述的其 余部分，將參考以下


。

圖1:錨定非依賴性雞EBx細(xì)胞
圖1A:無血清培養(yǎng)基中的錨定非依賴性雞Valo EBvl3細(xì)胞。在37t在無血 清培養(yǎng)基Excell 65319 (SAFC)中懸浮培養(yǎng)EBvl3細(xì)胞。EBvl3細(xì)胞具有均一的大 小且在培養(yǎng)中以疏松的簇生長。群體加倍時間為約16-18小時，在搖晃的培養(yǎng)瓶容 器中細(xì)胞密度達到為約4,000,000至5,000,000個細(xì)胞/ml。
圖1B:無血清培養(yǎng)基中的錨定非依賴性雞EB品系O細(xì)胞。在39X:在無血清 培養(yǎng)基Excell 66444 (SAFC)中懸浮培養(yǎng)EB品系0細(xì)胞。EB品系0細(xì)胞具有均一 的大小且以寬松的簇生長。
圖2:雞Valo EBxl3細(xì)胞表達高水平的端粒酶
處于傳代pl93的EBvl3細(xì)胞確實表達高水平的端粒酶，表達水平與在處于傳 代p164 (Master cell Bank: MCB)或傳代p184 (Workin Cell bank: WCB)的雞 EB14-074細(xì)胞(見WO03/076601)的為相同的數(shù)量級。鼠胚胎干細(xì)胞(mES)用作陽性對照，鼠成纖維細(xì)胞(FED)用作陰性對照。
圖3A和3B:雞Valo EBvl3細(xì)胞對痘病毒的易感性
將EBvl3 (傳代188)以0.4xl()6細(xì)胞/ml植于100mlF175瓶中的40mlSFM Excell培養(yǎng)基65319或G9916 SFM培養(yǎng)基(SAFC)中，培養(yǎng)基中補充了 4 mM谷氨 酰胺。在37。C進行細(xì)胞生長和以MVA-GFP(M01 1(^TCID50/細(xì)胞)感染。感染后 一個小時，加入60ml的新鮮培養(yǎng)基。
圖3A: SFM Excell培養(yǎng)基65319或G9916 SFM培養(yǎng)基(SAFC)中的細(xì)胞密度 動力學(xué)。
圖3B: SFM Excdl培養(yǎng)基65319或G9916 SFM培養(yǎng)基(SAFC)中用TCID50/ml 表達的MVA生產(chǎn)力。
圖4:鴨EBx細(xì)胞的透射電子顯微鏡分析
由ARivoire博士(Lyon, France)進行犯Bx細(xì)胞的透射電子顯微鏡分析。鴨EBx 細(xì)胞顯示出典型的胚胎干細(xì)胞形態(tài)(即高細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)比)，類似于鼠胚胎干細(xì)胞 和WO2006/108846中描述的VIVALIS EB14細(xì)胞的表型。鴨EBx細(xì)胞為小的圓細(xì) 胞，具有大的細(xì)胞核和核仁，具有從細(xì)胞膜延伸的短的偽足。它們是高度代謝活 性的，具有富含核糖體和線粒體的胞漿。
圖5A和5B:鴨EBx細(xì)胞系中端粒酶的表達
通過使用羅氏端粒酶檢測試劑盒(端粒酶OCR ELISA)研究建立鴨EBx細(xì)胞的 不同時期的端粒酶表達。
圖5A:在不同的粘附性鴨EBx細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)端粒酶是高度表達的，就像在雞 EBvl3細(xì)胞中一樣。用作陰性對照的鴨上皮細(xì)胞不表達端粒酶。
圖5B:在建立懸浮鴨EBx細(xì)胞的過程中，保持了端粒酶的高度表達。在除去 飼養(yǎng)物(feeder)(有或無飼養(yǎng)細(xì)胞)期間、在使鴨EB26細(xì)胞適應(yīng)懸浮的過程中和 在dEB24 et dEB26除去血清之后研究鴨EBx細(xì)胞端粒酶的高水平。
鴨EBx細(xì)胞例如EB24和EB26表達高水平端粒酶，就像雞EB14細(xì)胞一樣。 鴨EB66也表達高水平端粒酶(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖6A和6B:鴨EBx⑧細(xì)胞未表現(xiàn)出內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶活性
圖6A:通過在Clean細(xì)胞(FRANCE)中進行直接F-PERT分析(Lovatt等人, 1999, J. Virol. Methods, 82:185-200)來研究內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶表達。鴨EBx⑧細(xì)胞系， EB26和EB5-1未表現(xiàn)出內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。在雞EB14和EBvl3細(xì)胞培 養(yǎng)物(在不同的傳代)中檢測到了高水平的RT活性，以及在源自特異性無病原 (SPF)雞品系的雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)中檢測到了較低程度的RT活性。CEM 細(xì)胞(其為RTase陰性)用作陰性對照以設(shè)定檢驗的檢測限值。
圖6B:通過ELISA檢驗(其檢測禽白血病主要衣殼抗原P27)研究鴨和雞EBx 細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的存在，無論其是復(fù)制性(即有 復(fù)制能力的)或非復(fù)制性的。鴨EBx細(xì)胞系，EB26和EB5-1，以及雞EBvl3不分泌ALV p27抗原。相反，雞EB14細(xì)胞確實表達ALV p27抗原。 圖7A和7B:鴨EBx細(xì)胞不分泌復(fù)制性禽白血病病毒(ALV) 在Bioreliance (UK)中進行鴨EBx細(xì)胞和鵪鶉QT6細(xì)胞系的共同培養(yǎng)檢驗以檢
測內(nèi)源的復(fù)制性鴨病毒的存在，已知鵪鶉QT6細(xì)胞系對內(nèi)源性和外源性ALV敏感。 圖7A:描述了QT6共培養(yǎng)的原理
圖7B:通過ELISA檢驗(其檢測禽白血病主要衣殼抗原P27)檢測可復(fù)制性 病毒的存在。
該檢驗證明所測的鴨EBx⑧細(xì)胞沒有一個分泌復(fù)制性ALV。 RAV-1病毒(其 已知在QT6中復(fù)制)用作陽性對照。
圖8:在鴨EBx和雞EB14細(xì)胞系中受體SAa2-3和SAa2-6的細(xì)胞表面表達 以地高辛標(biāo)記的植物lL凝素(lectin)孵育細(xì)胞Sambuca nigra凝集素 (agglutinin)植物血凝素特異性與Sia2-6Gal結(jié)合，而山槐(Maackia amurensis) 凝集素植物血凝素特異性與Sia2-3Gal結(jié)合。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)使用 FITC標(biāo)記的抗-地高辛抗體來顯示與細(xì)胞結(jié)合的植物血凝素。以熒光細(xì)胞分選儀 (FACS)對FITC標(biāo)記的細(xì)胞進行計數(shù)。人們已經(jīng)描述的SAa2-3和SAa2-6分子 分別是禽和人流感病毒的受體。幾乎所有的鴨EBx細(xì)胞高度表達細(xì)胞表面受體 SAa2-3和SAa2隱6。
圖9A和9B:在感染的鴨EBx細(xì)胞中MVA-GFP病毒的繁殖 圖9A:在T175攪拌槽培養(yǎng)瓶中在細(xì)胞生長SFM培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖過程中 使鴨EBx⑧細(xì)胞形成小的簇。然后以10—2 TCIDs。/細(xì)胞的MVA-GFP病毒感染簇， 將混合物在生產(chǎn)性SFM培養(yǎng)基中稀釋。在37'C 6天病毒繁殖期的過程中，每天 對UV照射的感染細(xì)胞進行照相。在感染后(pi)第4天達到MVA感染的高峰。 在pi第6天，感染細(xì)胞開始死亡。
圖9B:在3 L的饋料批次生物反應(yīng)器中在鴨EBx⑧細(xì)胞中繁殖的MVA-GFP 病毒滴定。(左側(cè)圖板)使源自鴨EBx的生物量在Excell生長培養(yǎng)基(SAFC)中 在細(xì)胞增殖期累積。在第4天，細(xì)胞密度達到4,000,000個細(xì)胞/ml。然后以10—1 TCIDW細(xì)胞的MVA-GFP病毒感染細(xì)胞，在1.5 L的Excell培養(yǎng)基中稀釋混合物。 在37'C 6天的病毒繁殖期中，每日收集樣品，在反應(yīng)動力學(xué)終端進行TCID5c滴定 (右側(cè)圖板)。在4 p.i.時達到了 8.5 log TCID5。/細(xì)胞的產(chǎn)量，對應(yīng)于205 TCID50/ 細(xì)胞的產(chǎn)量。
圖10: SFM培養(yǎng)基中鈣和鎂的濃度對EBx⑧細(xì)胞簇大小的影響
圖10A:首先將雞EBvl3細(xì)胞培養(yǎng)于來自SAFC Biosciences的SFM培養(yǎng)基，
該培養(yǎng)基包含高濃度的鈣離子(Ca2+)(約0.79mM)和鎂(Mg2+)離子)；在此
培養(yǎng)基中，細(xì)胞在培養(yǎng)時產(chǎn)生大的聚集體。
在以包含較低濃度的(^:2+ (終濃度0.03mM)和Mg2十(終濃度1.6mM)的
同樣的SFM培養(yǎng)基改變細(xì)胞培養(yǎng)基3天之后，細(xì)胞形成較小的聚集體。圖10B:首先將鴨EB24、 EB26和EB66細(xì)胞培養(yǎng)于來自SAFC Biosciences 的SFM培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含高濃度的鈣離子(Ca2+)(約0.79 mM)和鎂(Mg2+) 離子)；在此培養(yǎng)基中，細(xì)胞在培養(yǎng)時產(chǎn)生大的聚集體。
在以包含較低濃度的Ca2+ (終濃度0.03mM)和Mg2+ (終濃度1.6mM)的 同樣的SFM培養(yǎng)基改變細(xì)胞培養(yǎng)基3天之后，細(xì)胞形成較小的聚集體。
圖11A和11B:在3L的生物反應(yīng)器中在鴨EBx細(xì)胞中產(chǎn)生流感病毒株A
在37'C時使鴨EBx⑧的生物量在細(xì)胞生長培養(yǎng)基中在細(xì)胞增殖期時累積。然 后以l(T4 TCIDso/細(xì)胞的A/H1N1/Beijing/262/95或A/H3N2/New York/55/2004流感 病毒感染細(xì)胞，在1.5 L的添加了 0.75 USP/ml的胰蛋白酶的Excell生產(chǎn)培養(yǎng)基中 稀釋混合物，將溫度降至33"C。在14天的病毒繁殖期中，每日收集樣品并儲存于 -80°C。
圖11 A:以A/H1N1/Beijing/262/95流感病毒株感染的鴨EBx細(xì)胞的生長動力
學(xué)
左側(cè)圖板細(xì)胞密度(菱形，xl()S個細(xì)胞/ml)和病毒滴度(以logTCID50/ml
表示)。 '. '
右側(cè)圖板細(xì)胞總數(shù)目(正方形)、存活性(黑色圓圈，％)和血凝素濃度(以 呢/ml表示)(紅色圓圈，％)。
病毒產(chǎn)量達到每毫升培養(yǎng)上清液20嗎的血凝素。
圖11B:以A/H3N2/New York/55/2004流感病毒株感染的鴨EBx細(xì)胞的生長 動力學(xué)
左側(cè)圖板細(xì)胞密度(菱形，xl(^個細(xì)胞/ml)。
右側(cè)圖板細(xì)胞總數(shù)目(正方形)、存活性(黑色圓圈，％)和血凝素濃度(以 昭/ml表示)(紅色圓圈，％)。
病毒產(chǎn)量達到每毫升培養(yǎng)上清液30嗎的血凝素。 圖12:鴨EBx⑥細(xì)胞中流感病毒株B的生產(chǎn)
在37'C時使鴨EBx⑧的生物量在細(xì)胞生長培養(yǎng)基中在細(xì)胞增殖期時累積。然 后以l(T3 TCID5o/細(xì)胞的B/Jiangsu/10/2003流感病毒感染細(xì)胞，在1.5 L的添加了 0.75USP/ml的胰蛋白酶的Excell生產(chǎn)培養(yǎng)基中稀釋混合物，將溫度降至33。C。在 14天的病毒繁殖期中，每日收集樣品并儲存于-8(TC。
左側(cè)圖板細(xì)胞密度(菱形，xl(^個細(xì)胞/ml)。
右側(cè)圖板細(xì)胞總數(shù)目(正方形)、存活性(黑色圓圈，％)和血凝素濃度(以 嗎/ml表示)(紅色圓圈，％)。
病毒產(chǎn)量達到每ml培養(yǎng)上清液25 pg的血凝素。
圖13:鴨EB66細(xì)胞中NDV生產(chǎn)力和病毒蛋白表達的分析(MOI 10—3， 0.75 USP/mL胰蛋白酶)
鴨和雞EBx細(xì)胞對NDV La Sota株是敏感的且復(fù)制NDV La Sota株。在鴨EB66細(xì)胞中生產(chǎn)的NDV的滴度(以TCID50/ml表示)從第0天至pi第2天增長至達 到106'83TCID5o/mL的平均值(圖13左側(cè)圖板)。
Western blot分析(圖13右側(cè)圖板)顯示NDV病毒蛋白(HN， Fo/F， NP和M) 的表達。鴨EB66細(xì)胞中產(chǎn)生的NDV病毒的病毒蛋白組成與用雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生 的NDV病毒獲得的病毒蛋白組成相類似。另外，雞和鴨EBx細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒 的釋放動力學(xué)也類似。
圖14:組織培養(yǎng)瓶中的無血清培養(yǎng)基中的鴨EB66細(xì)胞(MOI lO—1或10—2)懸浮
液中重組麻疹病毒復(fù)制的分析
鴨EB66細(xì)胞至少是與VERO細(xì)胞一樣對麻疹病毒感染敏感的。在感染后6 天鴨EB66細(xì)胞中生產(chǎn)的表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組麻疹病毒的滴度(以 TCID50/ml表示)達到了 107TCID50/mL。
圖15A和15B:鴨EB66細(xì)胞中SSEA-1、 EMA-1和端粒酶的表達
通過使用羅氏端粒酶檢測試劑盒(端粒酶OCR ELISA)研究在搖瓶中培養(yǎng)的不 同傳代的鴨EB66的端粒酶的表達。通過FACS分析研究在搖瓶中培養(yǎng)的不同傳代 的鴨EB66的SSEA-1和EMA-1 。
圖15A:在不同傳代(138、 144、 147、 150、 154)的懸浮的鴨EB66細(xì)胞系 中發(fā)現(xiàn)端粒酶高度表達。
圖15B:在不同傳代(138、 144、 147、 150、 154)的懸浮的鴨EB66細(xì)胞系 中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA-1和EMA-1高度表達。
圖16:鴨EB66細(xì)胞的核型分析
鴨EB66細(xì)胞的核型分析由Pr. Franck, ENVL, Lyon進行。EB66細(xì)胞為雙倍體 細(xì)胞。
實施例
實施例1:來自SPF雞VALO品系的雞EBvl3細(xì)胞系
1.1原始材料
蚤
特異性無病原(SPF)品系稱為Valo。 Valo品系為白色來亨雞品系，由Lohmann 從德國生產(chǎn)和輸送。測試了那些SPF雞蛋(提供分析合格證)的CAV、禽腺病毒 (組l、血清型1-12和組3)、 EDS、禽腦脊髓炎病毒、禽白血病病毒/RSV (包括 血清型ALV-J)、禽腎炎病毒、禽呼腸孤病毒、雞痘病毒、感染性支氣管炎病毒、 傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、感染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngo Tracheitis Vims)、流感病毒A型、馬立克氏病病毒、支原體病(Mg+Ms)、鳥分支桿菌 (Mycobacterium avium)、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、雞白痢沙門氏菌 (Salmonella pullorum)、其它沙門氏菌感染、禽鼻氣管炎病毒(ART)、副雞嗜血 桿菌(Hemophilus paragallinarum)。 Valo雞蛋只進行凈化齊U (decontaminant)的消毒以避免在運輸過程中操作雞蛋相關(guān)的任何污染風(fēng)險。 緣銀應(yīng)
在建立EBvl3的方法的第一個步驟中，鼠源的細(xì)胞(STO細(xì)胞)用作飼養(yǎng)層 以保持雞干細(xì)胞的多能性。在植到塑料上之前使用伽馬射線(45至55 Gray)使那 些詞養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂失活。該射線劑量為亞致死劑量，其誘導(dǎo)細(xì)胞周期的決定 性停滯但仍然允許生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，這些生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)對 于未分化細(xì)胞的細(xì)胞生長的促進是必需的。
STO細(xì)胞系由A. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada從SIM (Sandos同系繁殖小鼠)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的持續(xù)系中得到，由美國典型微生物保 藏中心(ATCC)(STO產(chǎn)品編號CRL-1503,批次號1198713)提供。飼養(yǎng)細(xì)胞層每 周制備兩次，通常在星期一和星期四。分離指數(shù)期細(xì)胞并進行計數(shù)。將一部分細(xì) 胞種植以保持活培養(yǎng)，另一部分進行照射。為了照射，我們準(zhǔn)備了管中的10x106 個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞暴露于45至55grey的劑量并植在塑料上。植完 以后，在最長5天的時間內(nèi)使用以鈍化的飼養(yǎng)細(xì)胞包被的碟或板。
線基
DMEM陽HamF12 (Cambrex， Cat n° BE04-687) Optipro培養(yǎng)基(Invitrogen， Cat n° 12309) EX-CELL 65195, 60947和65319 (SAFC,訂制培養(yǎng)基) 添身激
谷氨酰胺(Cambrex, Cat n° BE17-605E) 青霉素/鏈霉素(Cambrex, Cat n° BE17-602E)) 非必需氨基酸(Cambrex, Cat n° BE13-114E) 丙酮酸鈉(Cambrex, Cat n°BE13-l 15 ) 維生素(Cambrex， Catn。 13-607C) (3巰基乙醇(Sigma， Cat n° M7522)
餅掩鄉(xiāng)敘y PBS IX (Cambrex, Cat n0 BE17-516F) 多聚甲醛4 % (Sigma, Cat n。 P6148) KC1 5,6 % (Sigma, Cat n° P9333)
甲醇/乙酸(3/l):甲醇(Merck, Cat n° K34497209 ;乙酸Sigma Cat n°A6283) 秋水仙胺(Colcemid) , Karyomax (Gibco， Cat n。 15212-046)
二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, Cat n° D2650)鮮
使用了兩種不同的重組因子
□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) (Peprotechlnc， Cat n° 450-13)
□重組人胰島素樣因子1 (IGF-1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11)
這兩種因子在大腸桿菌細(xì)菌中生產(chǎn)。應(yīng)宇虛獰
效微縱付薪F斷(7做,Cfl/"°",
在本程序中使用的未受輻照的血清是在美國收集和生產(chǎn)的'。用于收集的動物為經(jīng)USDA檢驗的和適于屠宰的。在禽干細(xì)胞培養(yǎng)過程中將其加入到培養(yǎng)基中。該批次不進行輻照以避免破壞被鑒定為對保持培養(yǎng)中的干細(xì)胞至關(guān)重要的關(guān)鍵蛋白或成分。
經(jīng)親銜游虛薪/鵬Cfl,"。"，
在本程序中使用的經(jīng)輻照的批次也是在美國收集的。在用于培養(yǎng)STO或FED細(xì)胞(詞養(yǎng)細(xì)胞)的DMEM培養(yǎng)基中補充該經(jīng)輻照的批次。那些細(xì)胞不像干細(xì)胞一樣需要特定質(zhì)量的血清用于培養(yǎng)中的生長和保持。為了使培養(yǎng)基中的血清高濃度最小化，我們將STO細(xì)胞適應(yīng)于在只有4%的FBS中生長。
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鏈霉蛋白酶是由Roche Diagnostics, Germany生產(chǎn)的重組蛋白酶，用于粘附性禽干細(xì)胞的分離。
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胰蛋白酶用于STO或FED細(xì)胞的分離和在晚期傳代時用于適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的禽細(xì)胞的分離。這種豬來源的酶由經(jīng)驗證的無菌過濾方法，根據(jù)cGMP參考條件無菌生產(chǎn)并根據(jù)現(xiàn)行E.P.測試。該原材料(在制劑之前經(jīng)輻照)嚴(yán)格按照9/CFR113.53進行豬細(xì)小病毒的測試。
求朦游潘遞分庸薦鄉(xiāng)—，Orf "o C5，
該分離試劑為隨時可用的制劑，用于將細(xì)胞溫和地從培養(yǎng)器皿生長表面中分離下來。配方不含蛋白，并允許在不使用酶的情況下移走細(xì)胞。保留細(xì)胞蛋白用于依賴細(xì)胞表面蛋白識別的可能的免疫化學(xué)研究。該酶用于在對生物標(biāo)記像EMA-l (上皮膜抗原l)和SSEA1 (階段特異性胚胎抗原-l)進行FACS分析前分離細(xì)胞。
1.2建立EBvl3細(xì)胞系的方法
打開雞蛋，在打開的過程中蛋黃從蛋白中分離出來。使用巴斯德移液管或使用小的吸附性濾紙(Whatmann 3M紙)(事先用打孔器就該濾紙打成穿孔環(huán)形式)直接從蛋黃中移出胚胎。穿孔的直徑為約5mm。在烤箱中通過干熱對這些小環(huán)進行滅菌約30分鐘。將該小紙環(huán)置于蛋黃表面和胚胎正中，因此胚胎被紙環(huán)環(huán)繞。然后以小的剪刀剪掉紙環(huán)，將其除掉的整個置于皮氏培養(yǎng)皿中，以PBS或生理鹽水覆蓋。因此將由環(huán)切下的胚胎在介質(zhì)中清洗掉多余的蛋黃，'以巴斯德移液管收集因此不含多余蛋黃素的胚盤。
將雞Valo胚胎置于含有生理介質(zhì)(1XPBS， Tris葡萄糖，培養(yǎng)基等)的管中。然后將Valo胚胎機械分離并在39'C接種到完全培養(yǎng)基中的詞養(yǎng)細(xì)胞STO細(xì)胞層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以約2.7x 104個細(xì)胞/(^12植于瓶中。完全培養(yǎng)基由商售基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-HamF12組成，其中補充了 10%胎牛血清；終濃度為1 ng/ml的IGF1和CNTF;和1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.2 mM的P-巰基-乙醇；終濃度為2.9 mM的谷氨酰胺；含有終濃度為100U/ml的青霉素和終濃度為100 pg/ml的鏈霉素的抗生素初始混合物。在第一次細(xì)胞傳代后的短時l、臥內(nèi)即不再向培養(yǎng)基添加抗生素混合物。術(shù)語"短時間內(nèi)"通常應(yīng)理解為在最初3至5次傳代之后。
當(dāng)來自雞Valo胚胎的禽ES細(xì)胞是從一個培養(yǎng)碟傳代至另一個時，培養(yǎng)碟的種植是以約7xl0VcmS至8xl0"ct^個禽ES細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進行。優(yōu)選地，種植以約7.3 x 104/cm2(4x 1()6個細(xì)胞/55cm2或4x 106個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)碟)進行。禽細(xì)胞，優(yōu)選步驟a)的禽胚胎細(xì)胞在幾個傳代中培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基。在第15次傳代時，從完全培養(yǎng)基中除去生長因子IGF1和CNTF。在一個傳代到另一個傳代時，在一個步驟中直接除去。胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選禽胚胎干細(xì)胞在幾個傳代中培養(yǎng)于不含IGF1和CNTF生長因子的完全培養(yǎng)基。
然后在除去生長因子IGF1和CNTF之后通過在幾個傳代中逐漸降低詞養(yǎng)細(xì)胞的濃度而除去飼養(yǎng)細(xì)胞。實踐中，同樣濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞被用于2至4個傳代，然后使用較低濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)2至4個傳代，以此類推。最初瓶中植入2.7x104個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后為約2.2 x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/0112，然后為約1.8 x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后為約L4x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/0112，然后為約1.1 x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/ 112，然后為約0.9xl(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后為約0.5xl(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2。然后在瓶中植入6.5 x 104個禽細(xì)胞/ 112至7.5 x 104個禽細(xì)胞/0112，且無飼養(yǎng)細(xì)胞。在約第21個傳代開始除去飼養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)束于約65個傳代。在除去飼養(yǎng)細(xì)胞時，將雞ValoES細(xì)胞以低于步驟a)中的濃度植于培養(yǎng)瓶，濃度為約4xl(^個細(xì)胞/cm2至5xl04個細(xì)胞/cm2。假設(shè)ValoES細(xì)胞在瓶中的飼養(yǎng)細(xì)胞濃度降低后不處于好的形狀，則將禽細(xì)胞在相同濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞中進一步培養(yǎng)幾個傳代以進行飼養(yǎng)細(xì)胞的消除。
在除去生長因子和飼養(yǎng)細(xì)胞后除去血清。在除去血清開始時，培養(yǎng)基由基礎(chǔ)商售培養(yǎng)基DMEM-HamF12組成，其中補充了 10%胎牛血清；1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.2 mM的p-巰基乙醇；終濃度為2.9 mM的谷氨酰胺。將雞Valo細(xì)胞適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基生長，分兩個步驟進行:第一，將雞Valo細(xì)胞迅速適應(yīng)于由商售無血清培養(yǎng)基(SFM)，優(yōu)選為ExCell 60947 (SAFC3iosciences)組成的培養(yǎng)基，其中補充了 10%胎牛血清和1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為lmM的丙酮酸鈉；終濃度為0.2 mM的(3-巰基乙醇；終濃度為2.9 mM的谷氨酰胺。 一旦完成向新培養(yǎng)基(DMEM-HamF12至Excell 60947)中的迅速適應(yīng)，進行第二個步驟即進行在SFM培養(yǎng)基中，緩慢適應(yīng)于動物血清濃度降低。通過逐漸降低而除去血清，從SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的10%血清開始，然后7.5%，然后5%，然后2.5%，然后1.25%,然后0.75%血清濃度，至最終達到SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的0%血清。在第103次傳代開始除去血清，在第135次傳代時結(jié)束。
當(dāng)SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中剩余血清的濃度為0.75%或0%時即去除血清過程的結(jié)尾，開始將錨定依賴性EBvl3細(xì)胞適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。在幾個分離錨定非依賴性EBvl3細(xì)胞的嘗試中，成功了62.5%，得到了懸浮EBv13細(xì)胞的不同分離體。根據(jù)群體加倍時間(約18小時)、最佳的瓶培養(yǎng)中細(xì)胞濃度(約4,000,000個細(xì)胞/ml)、細(xì)胞存活性、細(xì)胞培養(yǎng)物均一性(細(xì)胞簇的存在和大小)和細(xì)胞操作的容易性而選擇了一個EBv13細(xì)胞的分離體(圖1)。
在除去血清的終端，錨定依賴性雞Valo細(xì)胞即EBvl3能夠生長于不含生長因子、不含飼養(yǎng)細(xì)胞、不含血清的培養(yǎng)基中。然后通過每天逐漸'降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度0.5。C/天而將EBvl3細(xì)胞適應(yīng)于在37'C生長。
實施例2:來自SPF雞ELL-0株的雞EB品系0細(xì)胞系
1.1原始材料
稱為ELL-0 (East Lansing品系0)的雞特異性無病原(SPF)株由禽類疾病和腫瘤學(xué)實驗室(USDA-ARS-MWA,USA)提供。那些SPF雞蛋由仔細(xì)檢測了各種禽病原體的群體中產(chǎn)生。所檢測的疾病包括雞白痢沙門氏菌、雞沙門氏菌(5^/mowe〃aga〃/w"r"附)、X鳥敗血支原f本(w少co/ /aywa ga〃^e/ ria/w)、滑液囊支原體(wycop/aCT^ ^wov/ae)、禽白血病病毒A-D和J,馬立克病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、禽腺病毒、感染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、禽流感病、新城疫病、禽腦脊髓炎和禽逆呼腸孤病毒。品系0雞蛋只進行消毒劑的消毒以避免在運輸過程中操作雞蛋相關(guān)的任何污染風(fēng)險。線微
在建立EB品系0的方法的第一個步驟中，鼠源的細(xì)胞(STO細(xì)胞)用作飼養(yǎng)層以保持雞干細(xì)胞的多能性。在植到塑料上之前使用伽馬射線(45至55Gmy)使那些飼養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂失活。該射線劑量為亞致死劑量，其誘導(dǎo)細(xì)胞周期的決定性停滯但仍然允許生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，這些生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)對于未分化細(xì)胞的細(xì)胞生長的促進是必需的。
STO細(xì)胞系由A. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada從SIM(Sandos同系繁殖的小鼠)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的持續(xù)系中得到，由美國典型微生物保藏中心(ATCC)(STO產(chǎn)品編號CRL-1503,批次號1198713)提供。詞養(yǎng)細(xì)胞層每周制備兩次。分離指數(shù)期細(xì)胞并進行計數(shù)。將一部分細(xì)胞種植以保持活培養(yǎng)，另一部分進行照射。為了照射，我們準(zhǔn)備了管中的10xl()S個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞暴露于45至55 grey的劑量并植在塑料上。植完以后，在最長5天的時間內(nèi)使用以鈍化的飼養(yǎng)細(xì)胞包被的碟或板。線基
DMEM陽HamF12 (Cambrex, Cat n° BE04-687)GTM-3培養(yǎng)基(Sigma, Cat n° G9916)
EX-CELL ^ 66522, 65788和66444培養(yǎng)基(SAFC，訂制培養(yǎng)基)
谷氨酰胺(Cambrex, Cat n° BE17-605E)青霉素/鏈霉素(Cambrex, Cat n° BE17-602E))非必需氨基酸(Cambrex, Cat n° BE13-114E)丙酮酸鈉(Cambrex, Cat n°BE13-l 15 )維生素(Cambrex, Catn。 13-607C)(3巰基乙醇(Sigma, Cat n。 M7522)酵母自溶液(SAFC, Cat n° 58902C)
餅發(fā)爾敘y
PBS IX (Cambrex, Cat n° BE17-516F)冷茶疾iW淑
二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, Cat n° D2650)尿f
使用了六種不同的重組因子
□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) (PeprotechInc，Catn°450-13)
□重組人胰島素樣因子1 (IGF-1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11)
□重組人白細(xì)胞介素6(IL6) (Peprotech Inc， Cat n° 200-06)
□重組人可溶性白細(xì)胞介素6受體(sIL6r) (Peprotech Inc， Cat n° 200-06 R)
□重組人干細(xì)胞因子(SCF) (Peprotech Inc, Cat n° 300-07)
□重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) (Peprotech Inc, Catn。 100-18B)
除了 IL6r之外所有的因子均在大腸桿菌細(xì)菌中生產(chǎn)?？扇苄訧L6r在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中表達。,安薪厲效應(yīng)扭斷F蹄(3^FC, Cfl, "o
在本程序中使用的未受輻照的血清是在澳大利亞收集和生產(chǎn)的。用于收集的
動物為USDA檢驗的適于屠宰的。在禽干細(xì)胞培養(yǎng)過程中將其加入到培養(yǎng)基中。
該批不進行輻射照射以避免破壞被鑒定為對保持培養(yǎng)中的干細(xì)胞至關(guān)重要的關(guān)鍵
蛋白或成分。
經(jīng)^:^游虛獰「// ^, c^"。"卯7j
在本程序中使用的經(jīng)輻照的批次是在澳大利亞收集的。在用于培養(yǎng)STO或FED細(xì)胞(飼養(yǎng)細(xì)胞)的DMEM培養(yǎng)基中補充該經(jīng)輻照的批次。那些細(xì)胞不像干細(xì)胞一樣需要特定質(zhì)量的血清用于培養(yǎng)中的生長和保持。為了使培養(yǎng)基中的血清高濃度最小化，我們將STO細(xì)胞適應(yīng)于在只有4%的FBS中生長。
分庸微
2.2建立品系0細(xì)胞系的方法
按照實施例1.2中所述的方法收集來自品系0的雞的13個雞蛋的胚胎。然后，將品系0胚胎置于含有IX PBS的管中，然后將胚胎機械分離并在39'C接種到完全培養(yǎng)基中的詞養(yǎng)細(xì)胞STO細(xì)胞層上。詞養(yǎng)細(xì)胞以約2.7x 104個細(xì)胞/^112植于碟中。完全培養(yǎng)基由商售基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-HamF12組成，其中補充了 10%胎牛血清；終濃度為lng/ml的IGFl、 CNTF、 bFGF、 IL6、 IL6r禾QSCF;禾卩1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.2 mM的(3-巰基-乙醇；終濃度為2.9mM的谷氨酰胺；1X的酵母自溶液；含有終濃度為100U/ml的青霉素和終濃度為100 pg/ml的鏈霉素的抗生素初始混合物。在傳代7次后不再向培養(yǎng)基添加抗生素的混合物。
當(dāng)來自雞品系0胚胎的禽ES細(xì)胞是從一個培養(yǎng)碟轉(zhuǎn)移至另一個時，培養(yǎng)碟的種植是以約7 x 104/(^12至8 x 1(TVcn^個禽ES細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進行。優(yōu)選地，種植以約7.3 x 104/cm2 (4 x 106個細(xì)胞/55^112或4 x 106個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)碟)進行。禽細(xì)胞，優(yōu)選步驟a)的禽胚胎細(xì)胞在幾個傳代中培養(yǎng)于補充了 10M或15。/。FBS的完全培養(yǎng)基。在第7次傳代時，從完全培養(yǎng)基中除去生長因子bFGF、 IL6、 IL6r和SCF。在一個傳代到另一個傳代時，在一個步驟中直接除去。胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選禽胚胎干細(xì)胞在幾個傳代寧培養(yǎng)于不含那4種生長因子的完全培養(yǎng)基。在第12次傳代時，從培養(yǎng)基中除去最后兩種因子IGF1和CNTF，在不含因子的情況下擴增細(xì)胞。
為了促進細(xì)胞生長，連續(xù)使用3個基礎(chǔ)培養(yǎng)基從第1次傳代到第18次傳代使用DMEM Ham F12，從第18次傳代到第26次傳代使用Exell GTM-3，從第26次傳代后使用Excell 66788和Excell 66522的混合物。
在第30次傳代后，在幾個傳代中通過逐漸降低飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度而除去詞養(yǎng)細(xì)胞，然后按照上面描述的逐步過程進行。在這個除去飼養(yǎng)物的過程中，使用Exdl66444作為生長培養(yǎng)基將一些能夠懸浮生長的細(xì)胞分離出來，然后啟動血清的去除(圖1B)。
實施例3:鴨EBx細(xì)胞系EB66
3.1原始材料
辯歪
來自北京株GL30的鴨蛋從GRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbidre,Roussay France)獲得。親代鴨進行針對以下的疫苗接種大腸桿菌(^foc/ en'c/z/"Co/O (自生的疫苗Coli 01 & 02)、多殺巴氏桿菌(P"Wet^〃a ffw/to"V/fl)(Landavax)、鴨月干炎病毒(Hepatovax),紅夢王丹毒絲菌(￡>j^j! e/of/zr/x Atrn'opa/Zz/ae)(Ruvax)、禽變性肺病毒(metapneumovirus) (Nemovac)、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌(5^/wo"e//0 /y; Www/tw7 & ￡>7&r/(^50 (自生的疫苗)、甲鳥疫里氏;H"-菌(7 /6mere〃aa"印e勸;/^)(自身菌苗Riemerella)、禽變性肺病毒(滅活的Nobilis RTV)和紅斑丹毒絲菌(五ow^/o^"/xr/zz^/印a^/加)(Ruvax)。接受以后，受精的北京鴨蛋在次氯化物浴中進行消毒然后以Fermacidal (熱)進行消毒以避免與蛋殼上粘附的灰塵相關(guān)的任何污染風(fēng)險。
繊微
在方法的第一個步驟中，鼠源的細(xì)胞(STO細(xì)胞)用作飼養(yǎng)層以保持鴨干細(xì)胞的多能性。在植到塑料上之前使用伽馬射線(45至55 Gray)使那些伺養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂失活。該射線劑量為亞致死劑量，其誘導(dǎo)細(xì)胞周期的決定性停滯但仍然允許生長因子和細(xì)胞外基威的產(chǎn)生，這些生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)對于未分化細(xì)胞的細(xì)胞生長的促進是必需的。STO細(xì)胞由A. Bernstein, Ontario Cancer Institute,Toronto, Canada從SIM (Sandos同系繁殖小鼠)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的持續(xù)系中得到，由美國典型微生物保藏中心(ATCC) (STO產(chǎn)品編號CRL-1503,批次號1198713)提供。飼養(yǎng)細(xì)胞層每周制備兩次。分離指數(shù)期細(xì)胞并進行計數(shù)。將一部分細(xì)胞種植以保持活培養(yǎng)，另一部分進行照射。為了照射，我們準(zhǔn)備了管中的10 x 106個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞暴露于45至55grey的劑量并植在塑料上。植完以后，在最長5天的時間內(nèi)使用以鈍化的飼養(yǎng)細(xì)胞包被的碟或板。
薦孝基
EX-CELL 65788, 65319, 63066和66444培養(yǎng)基(SAFC，訂制培養(yǎng)基)GTM陽3培養(yǎng)基(Sigma, Cat n。 G9916)DMEM國HamF12 (Cambrex， Cat n° BE04-687)DMEM (Canibrex， Cat n° BE 12-614F)微激
谷氨酰胺(Cambrex， Cat n° BE17-605E) '青霉素/鏈霉素(Cambrex, Cat n° BE17-602E))非必需氨基酸(Cambrex, Cat n° BE13-114E) 丙酮酸鈉(Cambrex， Catn°BE13-115 ) 維生素(Cambrex， Catn。 13-607C) P巰基乙醇(Sigma， Cat n° M7522) 酵母自溶液(SAFC， Cat n° 58902C)
餅淑礴定浙 PBS IX (Cambrex， Cat n0 BE17-516F)
二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, Cat n° D2650) 厲f
使用了兩種不同的重組因子二 □重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) (PeprotechInc， Cat n° 450-13) □重組人胰島素樣因子1 (IGF-1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11)
這兩種因子在大腸桿菌細(xì)菌中生產(chǎn)。
求菱薪厲游應(yīng)扭薪F邵Cflf w° "卿J
在本程序中使用的未受輻照的血清是在澳大利亞收集和生產(chǎn)的。用于收集的 動物為USDA檢驗的適于屠宰的。在禽干細(xì)胞培養(yǎng)過程中將其加入到培養(yǎng)基中。 該批不進行輻射照射以避免破壞被鑒定為對保持培養(yǎng)中的干細(xì)胞至關(guān)重要的關(guān)鍵 蛋白或成分。
經(jīng)^:席/^^獰r"/及/r， cw"。"^7j
在本程序中使用的經(jīng)輻照的批次是在美國收集的。在用于培養(yǎng)STO細(xì)胞(飼 養(yǎng)細(xì)胞)的DMEM培養(yǎng)基中補充該經(jīng)輻照的批次。那些細(xì)胞不像干細(xì)胞一樣需要 特定質(zhì)量的血清用于培養(yǎng)中的生長和保持。為了使培養(yǎng)基中的血清高濃度最小化， 我們將STO細(xì)胞適應(yīng)于在只有4%的FBS中生長。
分顏效
鏈霉歪^r斷/Jo由，Cfl,"° 765 ""
鏈霉蛋白酶是由Roche Diagnostics, Germany生產(chǎn)的重組蛋白酶，用于粘附性 禽干細(xì)胞的分離。
廯^^朦^Dr萃謹(jǐn)^jc， "o5￡77-/,
胰蛋白酶用于STO細(xì)胞的分離和在晚期傳代時用于適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基的禽 細(xì)胞的分離。這種豬來源的酶通過經(jīng)驗證的無菌過濾方法，根據(jù)cGMP參考條件 無菌制造并根據(jù)現(xiàn)行E.P.測試。該原材料(在制劑之前經(jīng)輻照)嚴(yán)格按照9/CFR 113.53進行豬細(xì)小病毒的測試。Trypzean溶液用在谷類中表達的牛胰蛋白酶重組體配制，并由Sigma Aldrich使用 ProdiGene擁有的轉(zhuǎn)基因植物蛋白表達系統(tǒng)生產(chǎn)。優(yōu)化該產(chǎn)品用于在無血清和補充 血清的粘附性細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞分離。
求蘑,絲潘應(yīng)分蓐霧發(fā)(S/g挑fl， ° C5W力
該分離試劑為隨時可用的制劑，用于將細(xì)胞溫和地從培養(yǎng)器皿生長表面中分 離下來。配方不含蛋白，并允許在不使用酶的情況下移走細(xì)胞。保留細(xì)胞蛋白用 于進行依賴細(xì)胞表面蛋白識別的可能的免疫化學(xué)研究。該酶用于在對生物標(biāo)記像 EMA-1 (上皮膜抗原l)和SSEA1 (階段特異性胚胎抗原-l)進行FACS分析前分 離細(xì)胞。
3.2建立鴨EBx細(xì)胞系EB66的方法
打開約360個受精的鴨蛋，在打開的過程中蛋黃從蛋白中分離出來。使用小的 吸附性濾紙(Whatmann 3M紙)(事先用打孔器就該濾紙打成穿孔環(huán)形式)從蛋黃 中移出胚胎。穿孔的直徑為約5 mm。在烤箱中通過干熱對這些小環(huán)進行滅菌30 分鐘。在實踐中，在胚胎收集的步驟中，將小紙環(huán)置于蛋黃表面和胚胎正中，因 此胚胎被紙環(huán)環(huán)繞。然后以小的剪刀剪掉紙環(huán)，將其除掉的整個置于注滿PBS的 皮氏培養(yǎng)皿中。因此在介質(zhì)中將由環(huán)切下的胚胎清洗掉多余的蛋黃，以巴斯德移 液管收集不含多余蛋黃素的胚盤。
將鴨胚胎置于含有l(wèi)XPBS50ml的管中。然后將鴨胚胎機械分離，用PBS清 洗，并在39'C， 7.5。/。C02接種到完全培養(yǎng)基中鈍化的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì) 胞以約2.7 x 104個細(xì)胞/ 112植于6孔板或碟中。完全培養(yǎng)基由無血清培養(yǎng)基 DMEM-HamF12組成，其中補充了 10%胎牛血清；終濃度為1 ng/ml的IGF1 、CNTF;
和1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM的丙酮酸鈉；
終濃度為0.5 mM的卩-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺；終濃度為100 U/ml 的青霉素；終濃度為100 ng/ml的鏈霉素；1X的酵母自溶液。在第4次傳代后的 短時間內(nèi)不再向培養(yǎng)基添加抗生素。
鴨ES細(xì)胞在DMEM-HSin F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第4次傳代。第4次傳代后， 修改基礎(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM-HamF12完全培養(yǎng)基被SFMGTM-3培養(yǎng)基替換，SFM GTM-3培養(yǎng)基中補充了 10%胎牛血清；終濃度為1 ng/ml的IGF1、 CNTF;和1% 非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM的丙酮酸鈉；終 濃度為0.5mM的p-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺；1X的酵母自溶液。 然后在這個新的培養(yǎng)基中在第14次傳代中繼續(xù)培養(yǎng)鴨ES細(xì)胞，然后在第18個傳 代時除去生長因子。從培養(yǎng)基中同時除掉IGF1和CNTF，因此從第19個傳代至第 24個傳代，培養(yǎng)基是GTM-3培養(yǎng)基，其中補充了 10%胎牛血清；1%非必需氨基 酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.5 mM 的卩-巰基-乙醇；終濃度為2.1mM的谷氨酰胺；1X的酵母自溶液。當(dāng)來自北京鴨胚胎的鴨ES細(xì)胞是從一個培養(yǎng)碟傳代至另一個時，培養(yǎng)碟的種 植是以約7 x 104/ 112至12 x 104/ 112個鴨ES細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進行。
然后，在第24次傳代后，通過在幾個傳代中逐漸降低飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度而除去 飼養(yǎng)細(xì)胞。最初碟中植入約2.7 xl(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第25次至31次傳代 為約1.8 x 1(/個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第32次至35次傳代為約1.4 x 104個飼養(yǎng)細(xì) 胞/cm2，然后在第36次至41次傳代為約lxl(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第42次 至44次傳代為約0.7 x 1(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，最終從第45次傳代開始只植入禽細(xì)胞 而無飼養(yǎng)細(xì)胞。在除去飼養(yǎng)細(xì)胞末尾，碟中植入9^104個禽細(xì)胞/0112至12.7x104 個禽細(xì)胞/cm2。在第25個傳代開始除去飼養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)束于第45個傳代。在除去飼 養(yǎng)細(xì)胞時，將鴨ES細(xì)胞以高于步驟a)中的濃度植于培養(yǎng)碟，濃度為約9xl0"個 細(xì)胞/cm2至12.7 x 1(^個細(xì)胞/cm2。
在不含飼養(yǎng)細(xì)胞進行幾個傳代后，研究生長參數(shù)(群體加倍時間(PDT)和密 度)以確認(rèn)細(xì)胞穩(wěn)定性和強壯性，并開始除去氨基酸、維生素、(3巰基乙醇、丙酮 酸鈉和酵母自溶液。如果PDT在約40小時以下且細(xì)胞密度在約26xl(^個細(xì)胞/cm2 以上，則認(rèn)為細(xì)胞足夠強壯可以進行這樣的去除。
在發(fā)育鴨EBx 細(xì)胞即EB66的情況下，從第52次傳代開始除去維生素、丙
酮酸鈉、非必需氨基酸和r巰基乙醇。從培養(yǎng)基中同時除去所有的這些添加物。
因此，從第52個傳代至第59個傳代，培養(yǎng)基是SFMGTM-3培養(yǎng)基，其中補充了 谷氨酰胺、酵母自溶液和FBS。在一小段時間的適應(yīng)于新培養(yǎng)條件之后，開始降 低溫度。在第60個傳代至第67個傳代之間逐漸降低溫度。在第67個傳代之后細(xì) 胞能夠在37t:生長。在第67個傳代之后，基礎(chǔ)培養(yǎng)基GTM-3被新的SFM基礎(chǔ)培 養(yǎng)基替換，稱為Excel165788。所以，在第67個傳代之后培養(yǎng)基為Excel165788， 其中補充了 10。/。的FBS、 2.5mM谷氨酰胺和1X酵母自溶液。在第80個傳代，將 化106個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至超低粘附性(ULA)碟并保持恒定搖晃以啟動錨定非依賴性細(xì) 胞生長。為了促進懸浮生長，修改基礎(chǔ)培養(yǎng)基，血清的百分率從10%降至5%以植 于ULA碟。因此，從第80個傳代至第85個傳代，培養(yǎng)基是SFM GTM-3，其中 補充了5。/。FBS、 2.5 mM谷氨酰胺和1X酵母自溶液。從第85個傳代后開始緩慢 降低EB66細(xì)胞懸浮液中的FBS。通過逐漸降低血清而除去血清，從2.5%血清開 始，然后是SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中1.5%的血清濃度，最終至SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中0% 的血清。血清的去除開始于第86個傳代，結(jié)束于第94個傳代。在去除血清的末 尾，錨定非依賴性dEB66細(xì)胞能夠在37'C在不含生長因子、巧含飼養(yǎng)細(xì)胞的無血 清培養(yǎng)基中生長。 '
在獲得能夠在37'C在補充了 2.5 mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生長的EB66 鴨細(xì)胞之后，通過稀釋或逐漸適應(yīng)于新的SFM配方例如Excell 63066、 Excell 66444、 Excdl CHO ACF而進一步進行對SFM培養(yǎng)基的適應(yīng)。
也可在酵母自溶液存在或不存在的情況下進行懸浮鴨EB66細(xì)胞的亞克隆。實施例4:鴨EBx細(xì)胞系EB26 4.1原始材料
搏蛋、嫁孝潘應(yīng)、添J7激、緩M^浙廚定^/、冷茶疾i^浙、，教^^淳浙辦庫 微r鏈雄5柳麗J
使用來自北京株GL30的鴨蛋。 潛#基
培養(yǎng)基EX-CELL 65319—, 63066和66444 (SAFC，訂制培養(yǎng)基) 培養(yǎng)基GTM-3 (Sigma， Cat n° G9916) DMEM (Cambrex, Cat n。 BE 12-614F) 尿f
使用了六種不同的重組因子
□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) (Peprotechlnc， Cat n° 450-13)
□重組人胰島素樣因子1 (IGF-1) (Peprotech Inc， Cat n° 100-11)
□重組人白細(xì)胞介素6(IL6) (Peprotech Inc， Cat n° 200-06)
□重組人可溶性白細(xì)胞介素6受體(sIL6r) (Peprotech Inc， Cat n° 200-06 R)
□重組人干細(xì)胞因子(SCF) (Peprotech Inc， Cat n° 300-07)
□重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) (Peprotech Inc, Cat n° 100-18B)
除了 IL6r之外所有的因子均在大腸桿菌細(xì)菌中生產(chǎn)?？扇苄訧L6r在轉(zhuǎn)染的 HEK293細(xì)胞中表達。
4.2建立鴨細(xì)胞系EBx細(xì)胞系EB26的方法
按照前述方法從EB66中收集鴨胚胎。將鴨胚胎置于含有IX PBS的50 mL的 管中。然后將鴨胚胎機械分離，在PBS中洗滌并在39'C， 7.5%(302接種到完全培 養(yǎng)基中的鈍化的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以約2.7 x 104個細(xì)胞/0112植于6孔 板或碟中。完全培養(yǎng)基由無血清的GTM3組成，其中補充了5%胎牛血清；終濃度 為l ng/ml的IGFl、 CNTF、 11-6、 I1-6R、 SCF禾卩FGF;和1%非必需氨基酸；1% 商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.5 mM的卩-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺；終濃度為100 U/ml的青霉素和終濃度 為100 pg/ml的鏈霉素；1X的酵母自溶液。在第一次傳代后的短時間內(nèi)即不再向 培養(yǎng)基添加抗生素。術(shù)語"短時間內(nèi)"通常應(yīng)理解為前3至9次傳代。鴨ES細(xì)胞 在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第9..j欠傳代。第9次傳代后，從完全培養(yǎng)基中除去部分因 子。因此，從第10個傳代至第13個傳代，從培養(yǎng)基中除去SCF、Il-6、Il-6r和bFGF， 只保持濃度為1 ng/mL的重組IGF1和CNTF。然后在第13個傳代至第16個傳代 之間同時降低IGF1和CNTF的濃度，最終至第17次傳代時獲得能夠在不含重組 因子時生長的細(xì)胞。通過逐漸適應(yīng)于低濃度因子進行因子的去除。當(dāng)來自北京鴨 胚胎的鴨ES細(xì)胞是從一個培養(yǎng)碟傳代至另一個時，培養(yǎng)碟的種植是以約7 x10"cir^至12 x 104/0112個鴨ES細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進行。優(yōu)選地，種植以約7.3 x 104/cm2 (4 x 106個細(xì)胞/55cm2或4 x 106個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)碟)進行。在除去重組 因子后，在第23次傳代時降低酵母自溶液的濃度，達到最終的濃度即0.5X。然后， 在第31次傳代后，通過在幾個傳代中逐漸降低飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度而除去飼養(yǎng)細(xì)胞。 最初碟中植入約2.7 x104個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第32次至38次傳代為約1.8 x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第39次至44次傳代為約1.4 x 1(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2， 然后在第45次至47次傳代為約1 x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/0112，然后在第48次至50次 傳代為約0.7 x 104個飼養(yǎng)細(xì)胞/0112，最終從第51次傳代開始只植乂禽細(xì)胞而無詞 養(yǎng)細(xì)胞。在除去詞養(yǎng)細(xì)胞末尾，碟中植入9xl(^個禽細(xì)胞/cr^至12.7xl(^個禽細(xì) 胞/cm2。在第32個傳代開始除去飼養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)束于第51個傳代。在除去飼養(yǎng)細(xì)胞 時，將鴨ES細(xì)胞以高于步驟a)中的濃度植于培養(yǎng)碟，濃度為約9 x 10"個細(xì)胞/ctn2 至12.7x 1(/個細(xì)胞/cm2。在不含飼養(yǎng)細(xì)胞進行幾個傳代后，研究生長參數(shù)(群體 加倍時間(PDT)和密度)以確認(rèn)細(xì)胞穩(wěn)定性和強壯性，并開始細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。 如果PDT在約40小時以下且細(xì)胞密度在約26xl(^個細(xì)胞/cm2以上，則認(rèn)為細(xì)胞 足夠強壯可以進行懸浮培養(yǎng)。此外，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)該是圓形、有折射力的、非常 小且細(xì)胞不應(yīng)該附著于塑料碟太多。
在培育EB26細(xì)胞的情況下，從第53次傳代開始進行懸浮培養(yǎng)。將7xl(^個細(xì) 胞轉(zhuǎn)移至超低粘附性碟并保持約50至70rpm的恒定搖晃。為了后續(xù)傳代，將細(xì)胞 以0.4-0.5xl()6個細(xì)胞/ml的濃度植于T175瓶(Sarsted, ref 831812502)。在適應(yīng)于新 培養(yǎng)條件之后的較短時間，細(xì)胞PDT從約160小時降至40小時。對于這種良好的 進化，在第59次傳代，進行新一輪的去除。因此，除去維生素、丙酮酸鈉、(3-巰 基乙醇和非必需氨基酸。因此在第59次傳代后，培養(yǎng)基為只補充5%FBS、 0.5X 酵母自溶液和2.5mM谷氨酰胺。在從已經(jīng)除去了生長因子、詞養(yǎng)細(xì)胞、維生素、 非必需氨基酸、丙酮酸鈉和p-巰基乙醇的細(xì)胞懸浮液中除去血清。通過逐漸降低 血清而除去血清，從5%血清開始，然后是SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中2.5。/。，然后1.5%的 血清濃度，最終至SFM細(xì)板培養(yǎng)基中0%的血清。血清的去除開始于第61個傳代， 結(jié)束于第79個傳代。在去除血清的末尾，錨定非依賴性鴨EB26細(xì)胞能夠在39。C 在不含生長因子、不含詞養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中生長。然后在第80次傳代通過 降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度而將EB26細(xì)胞適應(yīng)于在37。C在不含0.5X酵母自溶液的情況下 生長。
在獲得能夠在37t在補充了 2.5 mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生長的EB66 細(xì)胞之后，通過稀釋或逐漸適應(yīng)于新的SFM配方例如Excell 63066、 Excell 66444、 Excell CHO ACF而進一步進行適應(yīng)。也可在酵母自溶液存在或不存在的情況下進 行懸浮鴨EB26細(xì)胞的亞克隆。
實施例5:鴨EBx細(xì)胞系EB24
5.1原始材料簿歪、銜孝潘蘑、添慮激、麥#發(fā)浙腐定^/、冷茶疾^^/、 ^孕虛獰浙分庸
試淑r鍵雄j w膽柳
使用來自北京株GL30的鴨蛋。 潛孝基
培養(yǎng)基EX-CELl/M65319, 63066和66444 (SAFC，訂制培養(yǎng)基)
培養(yǎng)基GTM-3 (Sigma, Cat n° G9916)
DMEM F12 (Cambrex, Cat n。 BE04-687)
DMEM (Cambrex, Cat n° BE 12-614F)
鮮
使用了六種不同的重組因子 .
□重組人睫狀祌經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) (Peprotechlnc, Cat n° 450-13)
□重組人胰島素樣因子1 (IGF-1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11)
□重組人白細(xì)胞介素6(IL6) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06)
□重組人可溶性白細(xì)胞介素6受體(sIL6r) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06 R)
□重組人干細(xì)胞因子(SCF) (Peprotech Inc， Cat n° 300-07)
□重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) (Peprotech Inc， Cat n° 100-18B)
除了 IL6r之外所有的因子均在大腸桿菌細(xì)菌中生產(chǎn)。可溶性IL6r在轉(zhuǎn)染的 HEK293細(xì)胞中表達。 —
5.2建立鴨細(xì)胞系EBx⑧細(xì)胞系EB24的方法
按照前述方法從EB66中收集鴨胚胎。將鴨胚胎置于含有IX PBS的50 mL的 管中。然后將鴨胚胎機械分離，并在39"C， 7.5%(:02接種到完全培養(yǎng)基中的鈍化 的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以約2.7xl(^個細(xì)胞/m^植于6孔板或碟中。完 全培養(yǎng)基由無血清的DMEM-HamF12組成，其中補充了 10%胎牛血清；終濃度為 lng/ml的IGFl、 CNTF、 11-6、 I1-6R、 SCF和FGF;和1%非必需氨基酸；1%商業(yè) 來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.5 mM的卩-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺；終濃度為100U/ml的青霉素和終濃度為100 pg/ml的鏈霉素；1X的酵母自溶液。在細(xì)胞第一次傳代后的短時間內(nèi)不再向培養(yǎng) 基添加抗生素。術(shù)語"短時間內(nèi)"通常應(yīng)理解為前3至9次傳代。
鴨ES細(xì)胞在DMEM-Ham F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第7次傳代。第7次傳代后， 修改基礎(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM-Ham F12完全培養(yǎng)基被GTM-3培養(yǎng)基替換，GTM-3培 養(yǎng)基中補充了 10%胎牛血清；終濃度為lng/ml的IGFl、 CNTF、 11-6、 I1-6R、 SCF 和FGF; 1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM的丙 酮酸鈉；終濃度為0.5mM的[3-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺；終濃度 為100 U/ml的青霉素和終濃度為100 pg/ml的鏈霉素；IX的酵母自溶液。因此， 在第11次傳代時，將血清濃度降低至5%，并從培養(yǎng)基中除去SCF、 IL-6、 IL6r和bFGF。所以，從第11個傳代開始，培養(yǎng)基由下列組成5。/。FBS;終濃度為lng/ml 的IGF1和CNTF; 1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為O.l mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.5 mM的卩-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺； 終濃度為100 U/ml的青霉素和終濃度為100 pg/ml的鏈霉素；IX的酵母自溶液。 在第22次傳代時，同時除去IGF1和CNTF。在第22個傳代后，GTM-3培養(yǎng)基中 不存在重組因子。在第23次傳代至第28次傳代之間在這樣的培養(yǎng)基中保持鴨細(xì) 胞。當(dāng)來自北京鴨胚胎的鴨ES細(xì)胞是從一個培養(yǎng)碟傳代至另一個時，培養(yǎng)碟的種 植是以約7 x 104/cm2S 12 x 104/0112個鴨ES細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進行。優(yōu)選地， 種植以約7.3 x 104/cm2 (4 x—106個細(xì)胞/550112或4 x 106個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)碟)進 行。然后，在第28次傳代后，通過在幾個傳代中逐漸降低飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度而除去 飼養(yǎng)細(xì)胞。最初碟中植入約2.7xl(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第29次至33次傳代 為約1.8 x 10"個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第34次至37次傳代為約1.4 x 104個飼養(yǎng)細(xì) 胞/cm2，然后在第38次至42次傳代為約lxl0"個詞養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在第43次 至46次傳代為約0.7 x 1(^個飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，最終從第47次傳代開始只植入禽細(xì)胞 而無飼養(yǎng)細(xì)胞。在除去飼養(yǎng)細(xì)胞末尾，碟中植入9xl(^個禽細(xì)胞/cr^至12.7x104 個禽細(xì)胞/cm2。除去飼養(yǎng)細(xì)胞在第29個傳代開始，結(jié)束于第47個傳代。在除去飼 養(yǎng)細(xì)胞時，將鴨ES細(xì)胞以高于步驟a)中的濃度植于培養(yǎng)碟，濃度為約9xl0"個 細(xì)胞/cm2至12.7xl(^個細(xì)胞/cm2。在不含飼養(yǎng)細(xì)胞進行幾個傳代后，研究生長參 數(shù)(群體加倍時間(PDT)和密度)以確認(rèn)細(xì)胞穩(wěn)定性和強壯性，并開始細(xì)胞懸浮 生長。如果PDT在約40小時以下且細(xì)胞密度在約26xl(^個細(xì)胞/cn^以上，則認(rèn) 為細(xì)胞足夠強壯可以進行懸浮培養(yǎng)。此外，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)該是圓形、有折射力的、 非常小且細(xì)胞不應(yīng)該附著于塑料碟太多。在培育EB24細(xì)胞的情況下，從第48次 傳代開始進行懸浮培養(yǎng)。將8xl(^個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至超低粘附性碟并保持約50至70rpm 的恒定搖晃。為了下一次傳代，將細(xì)胞以0.4-0.5xl0"個細(xì)胞/mi的濃度植于T175 瓶(Sarsted,ref831812502)。在適應(yīng)于新培養(yǎng)條件之后的較短時間，細(xì)胞PDT從約 248小時降至128小時，然后進行后續(xù)去除步驟。因此，在第52次傳代，維生素、 非必需氨基酸、丙酮酸鈉和P巰基乙醇被除去。對于這種達到44小時的PDT的良 好進化，在第56次傳代，從第57次傳代后，進行血清的去除。因此從第57次傳 代開始，GTM-3培養(yǎng)基為只補充5%FBS、 IX酵母自溶液和2.5 mM谷氨酰胺。從 己經(jīng)除去了生長因子、詞養(yǎng)細(xì)胞、維生素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和P-巰基乙 醇的細(xì)胞懸浮液中除去血清。通過逐漸降低血清而除去血清，從5%血清開始，然 后是SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中2.5%，然后2%。然后1.5%的血清濃度，最終至SFM細(xì) 胞培養(yǎng)基中0%的血清。血清的去除開始于第57個傳代，結(jié)束于第77個傳代。在 去除血清過程中，也進行在37。C生長的適應(yīng)。因此在第65次傳代，生長于補充了 2.5% FBS的培養(yǎng)基的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至37'C以避免逐漸的溫度變化。在去除血清的末 尾，錨定非依賴性鴨EB24細(xì)胞能夠在37t:在不含生長因子、不含飼養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中生長。在獲得能夠在37。C在補充了 2.5 mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生長的鴨EB24 細(xì)胞之后，通過稀釋或逐漸適應(yīng)于新的SFM配方例如Excell 63066、 Excell 66444、 Excell CHO ACF而進行進一步的適應(yīng)。也進行了懸浮鴨EB24的亞克隆，由于其 有效復(fù)制病毒的較好表現(xiàn)而選擇了鴨EB24-12亞克隆。實施例6: SPF鴨番鴨EBx細(xì)胞系6.1原始材料贈歪來自番鴨品系鴨SPF蛋從Le Couvoir de Cerveloup (France)獲得。那些SPF鴨蛋由仔細(xì)檢測了各種禽病原體的群體中產(chǎn)生。所檢測的疾病包括雞白痢沙門氏菌gfl〃/wan^/w-/ w〃on/w)、滑、 夜囊霍形體(綺cop/tw附a s少wow'ae)、 火 又鳥支原4本(鄉(xiāng)co/ /oyOT6( we/gagnV￡y)、 X鳥敗血支原體(聊co/ /os附aga〃/e; "cM附)、 馬立克病病毒、禽流感病毒、2型副粘病毒、3型副粘病毒、新城疫病毒、3型腺 病毒(EDS)、甘波羅(Gumboro)病、禽呼腸孤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、 禽腦脊髓炎、感染性鼻氣管炎(rhinotracheitis)病毒和衣原體病(Chlamydiosis)。 番鴨蛋只進行消毒劑的消毒以避免在運輸過程中操作鴨蛋相關(guān)的任何污染風(fēng)險。嫁孝雄f參避娜,雄J潛孝基EX-CELL 66444培養(yǎng)基(SAFC,訂制培養(yǎng)基) GTM-3培養(yǎng)基(Sigma, Cat n。G9916) DMEM隱HamF12 (Cambrex， Cat n° BE04-687) 添*激谷氨酰胺(Cambrex, Cat n° BE17-605E) 青霉素/鏈霉素(Cambrex, Cat n° BE17-602E)) 非必需氨基酸(Cambrex, Cat n° BE13-114E) 丙酮酸鈉(Cambrex, Cat n°BE13-l 15 ) 維生素(Cambrex， Catn。 13-607C) 卩巰基乙醇(Sigma, Cat n° M7522) 酵母自溶液(SAFC, Cat n° 58902C)餅發(fā)爾慈 PBS IX (Cambrex， Cat n。 BE17-516F)二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, Cat n° D2650)使用了兩種不同的重組因子□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) (Peprotechlnc， Cat nb 450-13) □重組人胰島素樣因子1 (IGF-1) (Peprotechlnc, Cat n° 100-11)這兩種因子在大腸桿菌細(xì)菌中生產(chǎn)。求安薪厲游應(yīng)付塘fF斷(J紐，"o "卿J在本程序中使用的未受輻照的血清是在澳大利亞收集和生產(chǎn)的。用于收集的 動物為USDA檢驗的和適于屠宰的。在禽干細(xì)胞培養(yǎng)過程中將其加入到培養(yǎng)基中。 該批不進行輻射照射以避免破壞被鑒定為對保持培養(yǎng)中的干細(xì)胞至關(guān)重要的關(guān)鍵 蛋白或成分。經(jīng)薪厲顏薪/愿,Cfl7"。",在本程序中使用的經(jīng)輻照的批次是在澳大利亞收集的。在用于培養(yǎng)STO細(xì)胞 (飼養(yǎng)細(xì)胞)的DMEM培養(yǎng)基中補充該經(jīng)輻照的批次。那些細(xì)胞不像干細(xì)胞一樣 需要特定質(zhì)量的血清用于培養(yǎng)中的生長和保持。為了使培養(yǎng)基中的血清高濃度最 小化，我們將STO細(xì)胞適應(yīng)于在只有4%的FBS中生長。分廖試效鏈霉蛋力斷及oc/ie, Cfl, "° /65 92" 6.2建立番鴨EBx細(xì)胞系的方法按照實施例3中描述的方法從20個番鴨受精SPF卵中收集胚胎。將鴨胚胎置 于含有l(wèi)XPBS的50mL的管中。然后將鴨胚胎機械分離，并以PBS洗滌，植于 用鈍化的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層包被的12孔培養(yǎng)板的孔中。將鴨胚胎細(xì)胞植于完全培養(yǎng) 基并在39'C， 7.5%5%<:02轉(zhuǎn)移。飼養(yǎng)細(xì)胞以約2.7乂104個細(xì)胞/ 112種植。使用的 完全培養(yǎng)基由DMEM-HamF12組成，其中補充了 10%胎牛血清；終濃度為1 ng/ml 的IGF1和CNTF;和1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為 0.1 mM的丙酮酸鈉；終濃度為0.5 mM的P-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨 酰胺；終濃度為100 U/ml的青霉素和終濃度為100嗎/ml的鏈霉素；IX的酵母自 溶液。在第2次傳代，以GTM-3基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換DMEM-HamF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 在第4次傳代后，不再向培養(yǎng)基中添加抗生素混合物。鴨ES細(xì)胞在GTM-3完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第8次傳代。第8次傳代后，IGF1 和CNTF的濃度降至0.5 ng/ml。繼續(xù)在此新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)鴨ES細(xì)胞傳代兩次， 然后在第10次傳代除去生長因子。從培養(yǎng)基中同時除去IGF1和CNTF。因此，從第10次傳代至第37次傳代，培養(yǎng)基為GTM-3培養(yǎng)基，其中補充了10%胎牛血清；1%非必需氨基酸；1%商業(yè)來源的維生素混合物；終濃度為0.1 mM 的丙酮酸鈉；終濃度為0.5i]aM的卩-巰基-乙醇；終濃度為2.1 mM的谷氨酰胺；和 1X的酵母自溶液。當(dāng)來自番鴨胚胎的鴨ES細(xì)胞是從一個培養(yǎng)碟傳代至另一個時，培養(yǎng)碟的種植 是以約12 x 104/(^2個鴨ES細(xì)胞在培養(yǎng)基中進行。有時可使用一些條件培養(yǎng)基用 于細(xì)胞種植以改善分離后的細(xì)胞恢復(fù)。然后，在第37次傳代后，在幾次傳代中通過逐漸降低飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度而除去 詞養(yǎng)細(xì)胞，然后進行上面描述的逐步過程。在去除飼養(yǎng)細(xì)胞期間，分離出一些能夠懸浮生長的細(xì)胞并適應(yīng)于在無添加物和 血清的情況下生長(圖4C)。錨定非依賴性番鴨EBx細(xì)胞表達ES細(xì)胞標(biāo)記，例如 端粒酶、SSEA-1和EMEA-1 (數(shù)據(jù)未顯示)。實施例7: EBx細(xì)胞系的鑒定7.1雞VALOEBvl3細(xì)胞的鑒定7丄l-端粒酶活性使用Roche Applied Science研發(fā)的7fe/o TAGGG端粒酶PCR ELISA根據(jù)提供 者的說明書(Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP) - Cat. No. 11 854 666910 )進行端粒酶的檢測。7fe/o TAGGG端粒酶PCR ELISA允許與非放射性檢測結(jié) 合的端粒酶介導(dǎo)的延伸產(chǎn)物的擴增，按照ELISA程序進行。當(dāng)在檢驗中使用1 x 103個細(xì)胞當(dāng)量時，如果陰性對照的吸收值小于或等于0.25A450^-A69o皿時并且如果陽性對照的吸收值高于或等于1.5 A45Gnm - A6,m時該檢驗是有效的。如果吸收的 差異在0.2 A45()nm - A69()nm單位以上則認(rèn)為樣品是端粒酶陽性的。使用兩種對照 陰性對照為鼠成纖維細(xì)胞(FED細(xì)胞)；陽性對照為FGB8細(xì)胞(由Vivalis從129 SV 小鼠胚胎建立的胚胎干細(xì)胞)和以前在WO 03/076601中建立的雞EB14-074細(xì)胞。在圖2中總結(jié)了獲得的結(jié)果，EBvl3確實表達高水平端粒酶，在傳代pl93和 195，端粒酶的活性與一個雞EB14-074細(xì)胞的端粒酶活性相當(dāng)。7.1.2-ES細(xì)胞的生物標(biāo)記胚胎干細(xì)胞的特征為在"細(xì)胞膜上表達生物標(biāo)記。通過FACS分析評估了 EBvl3 細(xì)胞上EMA-1 (上皮膜抗原-l)和SSEA-1 (階段特異性胚胎抗原-l)的表達。以 4% PFA(多聚甲醛)固定10分鐘后，漂洗細(xì)胞樣品和對照，然后以EMA-1或SSEA-1 的特異性單克隆抗體預(yù)先孵育。使用與FITC偶聯(lián)的第二抗體檢測表達所選的2個 生物標(biāo)記的細(xì)胞。使用來自Coulter的FACS (熒光激活細(xì)胞分選儀)通過流式細(xì) 胞術(shù)分析樣品。FACS分析在作為陰性對照的小鼠成纖維細(xì)胞(FED細(xì)胞)、作為陽性對照的 鼠ES FGB8細(xì)胞和作為陽性對照的雞EB14-074細(xì)胞以及EBx細(xì)胞和EBvl3細(xì)胞 上進行。如所預(yù)期的那樣，F(xiàn)ED細(xì)胞不表達生物標(biāo)記而FGB8和EB14-074細(xì)胞表 現(xiàn)出重要的染色，對EMA-l來說分別是60.13%和78.7%;對SSEA-1來說分別是94.45%和95% (數(shù)據(jù)未顯示)。雞valo EBvl3細(xì)胞群對EMA1沒有顯示出任何染 色(2%)，對SSEA-1為很少的染色(22%)。 7.1.3 _核型進行了核型分析以檢查細(xì)胞的雙倍性和EBW3細(xì)胞的禽來源性。收獲處于指 數(shù)生長期的細(xì)胞并以秋水仙胺(0.02嗎/mL)處理2個小時。洗滌和離心后，使用 KCl(0.56。/。)對細(xì)胞進行低滲處理20分鐘。然后將EBvl3細(xì)胞固定于甲醇/乙酸(3/1) 并儲存于-2(TC過夜。第二天，分裂中期點至玻璃，以:wright/gi6msa溶液染色并在 顯微鏡下觀察。觀察到了幾個系列的分裂中期，這確認(rèn)了 EBvl3細(xì)胞的雞來源。 沒有觀察到多倍體的證據(jù)。7.1.4-細(xì)胞培養(yǎng)基成分對EBvl3細(xì)胞簇大小的影響本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用于EBx細(xì)胞培養(yǎng)和感染的無血清培養(yǎng)基中鈣和鎂的濃度對于 簇的大小有影響。圖10顯示當(dāng)EBvl3細(xì)胞從高Ca2+和Mg2+濃度轉(zhuǎn)移到低Ca2+和Mg2+濃度 的培養(yǎng)基時，簇的大小降低。 7.2-鴨EBx細(xì)胞系的鑒定7.2.1 -鴨EBx細(xì)胞形態(tài)dEBx⑧細(xì)胞的透射電子顯微鏡分析由Dr. A Rivoire (Lyon, France)進行。鴨 EBx⑧細(xì)胞顯示出典型的胚胎干細(xì)胞形態(tài)(即高細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)比)，類似于鼠胚胎 干細(xì)胞和WO2006/108846中描述的VIVALIS EB14細(xì)胞的表型。鴨EBx⑧細(xì)胞為 小的圓細(xì)胞(直徑 10^n)，具有大的細(xì)胞核和核仁，具有從細(xì)胞膜延伸的短的偽 足(圖4)。它們?yōu)楦叨却x活性的，具有富含核糖體和線粒體的胞漿。它們含有 很多細(xì)胞內(nèi)液泡、非常發(fā)達的高爾基體系統(tǒng)和顆粒狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。7.2.2 -鴨EBx⑧細(xì)胞的端粒酶表達使用羅氏端粒酶檢測試劑盒(Telomerase OCR ELISA)研究建立鴨EBx⑧細(xì)胞過 程中不同階段的端粒酶的表達。在粘附性鴨EBx⑧細(xì)胞中，以及在除去飼養(yǎng)物過程 中，在將鴨EBx⑧細(xì)胞適應(yīng)于懸浮的過程中和在除去飼養(yǎng)物過程中發(fā)現(xiàn)端粒酶是高 度表達的。圖5顯示鴨EB24和EB26表達高水平的端粒酶，就像雞EB14細(xì)胞一 樣。鴨EB66也在所有細(xì)胞傳代中表達高水平端粒酶。在EB66細(xì)胞適應(yīng)于不同的 SFM后在EB66細(xì)胞中這種高端粒酶活性是穩(wěn)定的(圖15)。7.2.3-鴨EBx⑧細(xì)胞顯示出無內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶活性通過在Clean細(xì)胞(FRANCE)中進行直接F-PERT分析(Lovatt等人，1999, J. Virol. Methods, 82:185-200)來研究內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶表達。鴨EBx⑧細(xì)胞系、EB24(數(shù) 據(jù)未顯示)、EB66 (數(shù)據(jù)未顯示)、EB26和EB51未表現(xiàn)出內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶(RT) 活性(圖6A)。在雞EB14細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測到了RT活性，以及在源自特異性無 病原體(SPF)雞株的雞胚胎成纖維細(xì)胞中檢測到了較低程度的RT活性。通過ELISA檢驗(其檢測禽白血病主要衣殼抗原P27)來研究鴨和雞EBx 細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的存在，無論病毒顆粒是復(fù)制性 或非復(fù)制性的(圖6B)。所有的鴨EBx⑧細(xì)胞系(EB26、 EB51、 EB24、 EB66等) 以及雞EBvl3不分泌ALV p27抗原。相反，雞EB14細(xì)胞確實表達ALVp27抗原。7.2.4-鴨EBx細(xì)胞不分泌復(fù)制性禽白血病病毒(ALV)進行了鴨EBx細(xì)胞和鵪鶉QT6細(xì)胞系的共同培養(yǎng)的檢驗以檢測內(nèi)源性可復(fù)制 鴨病毒的存在，已知鵪鶉QT6細(xì)胞系對內(nèi)源性和外源性ALV敏感。圖7A描述了 QT6共培養(yǎng)的原理。通過ELISA (其檢測禽白血病主要衣殼抗原P27)檢驗可復(fù) 制性病毒的存在。該檢驗證明所測的鴨EBx細(xì)胞中沒有一個分泌復(fù)制性(即有復(fù) 制能力)ALV (圖7B)。7.2.5 -鴨EBx細(xì)胞表達禽和人類流感病毒受體鴨EBx細(xì)胞上的針對禽(Siaa2-3Gal)和人(Siaa2-6Gal)流感病毒的受體的檢測 通過使用地高辛標(biāo)記的植物血凝素(Boehringer)以熒光細(xì)胞分選儀分析進行 Saw6wram'gra (SNA)凝集素植物血凝素特異性與Sia2-6Gal結(jié)合； Ma"cha awwmw" (MAA)凝集素植物血凝素特異性與Sia2-3Gal結(jié)合。 在10 mM HEPES、 150 mM NaCl pH7.5中洗滌雞EB14和鴨EBx細(xì)胞并以 5xl06的終濃度重懸于同樣的緩沖液。在冰上孵育細(xì)胞30分鐘，然后在SNA或 MAA存在的情況下繼續(xù)孵育15至30分鐘。在10 mM HEPES、 150 mMNaCl pH7.5 中洗滌植物血凝素處理的細(xì)胞，然后在冰上以FITC標(biāo)記的抗-地高辛抗體孵育15 至30分鐘。然后在0.9%的NaCl中洗滌細(xì)胞并進行FACS分析。雞EB14和EBx細(xì)胞表達細(xì)胞表面受體，該受體包含帶有Siaa2-3Gal和 Siaa2-6Gal殘基的寡聚糖(圖8)。 ''7.2.6 -核型進行了核型分析以檢査細(xì)胞的雙倍性和鴨EB24和EB66細(xì)胞的禽來源性。收 獲處于指數(shù)生長期的細(xì)胞并以秋水仙胺(0.6 mg/mL)處理3-6個小時。洗滌和離 心后，使用KCl(0.56。/。)對細(xì)胞進行低滲處理20分鐘。然后將鴨EB24和EB66細(xì) 胞固定于甲醇/乙酸(3/1)并儲存于-2(TC過夜。第二天，分裂中期點至玻璃，以 wright/giemsa溶液染色并在顯微鏡下觀察。觀察到了幾個系列的分裂中期，這確認(rèn)了 EBx細(xì)胞的鴨來源。沒有觀察到多 倍體的證據(jù)。圖16顯示了鴨EBx66細(xì)胞的雙倍體核型(圖16)。實施例6:雞EBvl3細(xì)Jfa系中的痘病毒復(fù)制使用編碼GFP基因(綠色熒光蛋白)的重組修飾的安卡拉牛痘(MVA)來研 究EBvl3細(xì)胞對痘病毒感染的易感性。使用以下方案在感染前3天，將0.4X106 EBvl3細(xì)胞(傳代188)/mL植于T175 培養(yǎng)瓶中的40 mL的SFM Excell 65319 (SAFC)培養(yǎng)基，其中補充了 4 mM的谷氨 酰胺。以10—2 TCID50/細(xì)胞的重復(fù)性感染進行感染(MVA-GFP JIt存液為10e9.7 TCID/ml)。感染后一個小時，向培養(yǎng)瓶中加入60ml的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)和感染在37°C, 7.5 % C02和60 rpm的搖晃中進行。感染后每一天均收集細(xì)胞懸浮液的等份 并冷凍。在動力學(xué)末尾，按照TCID50方法進行生產(chǎn)率的評價。簡單來說，在DF-1 細(xì)胞上進行感染性MVA-GFP病毒的滴定。將細(xì)胞以15x103細(xì)胞/孔植于96孔平 底培養(yǎng)板中的DMEM培養(yǎng)基(Biowhittaker)，其中補充了 5 。/。胎牛血清(FCS) (SAFC) 和2 mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker)。 24小時后，細(xì)胞以DMEM中10倍系列稀釋 的樣品感染并在37°C， 5 % C02的潮濕空氣中孵育一周。通過顯微鏡下觀察全局性 細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)和暴露于UV的感染細(xì)胞而測定病毒感染力。然后根據(jù)Reed 禾口 Muench的方法(1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97)計算TCID50滴度。在實驗全程監(jiān)視細(xì)胞增殖和存活性。雞Valo EBvl3細(xì)胞似乎對MVA-GFP感染為高敏感性(圖3A-3B)。
實施例8:鴨EBx細(xì)胞系中的痘病毒復(fù)制 ' 使用編碼GFP的重組修飾的安卡拉牛痘來研究鴨EBx細(xì)胞對痘病毒感染的易 感性。按照前面對于雞EBvl3細(xì)胞所描述的方法進行病毒滴定。 8.1 -細(xì)胞培養(yǎng)方法
鴨EBx儲存于-196。C的液氮中的冷凍管中(20x106細(xì)胞/管)。將冷凍管直接在 +37 。C預(yù)熱的水浴中融化。然后將細(xì)胞懸浮液置于有30 ml預(yù)熱培養(yǎng)基的50 ml 的無菌管中。離心(300 ±20 g室溫，5分鐘)后，向沉淀中加入15新鮮培養(yǎng)基并輕 輕混勻。使用臺盼藍(lán)(Trypan blue)進行樣品計數(shù)。應(yīng)有2 20 x106細(xì)胞和大于70% 的存活率以保證良好的培養(yǎng)。
將細(xì)胞懸浮液置于T75《m2培養(yǎng)瓶并在+ 37 。C、 7.5 % C02空氣下在50 rpm的 軌道振動器上孵育。每日添加新鮮培養(yǎng)基。然后為了植于3L-生物反應(yīng)器，將細(xì)胞 傳代以增加細(xì)胞生物量。需要320xl06個細(xì)胞以接種于3L-生物反應(yīng)器。輕輕混合 后拿出樣品以使用臺盼藍(lán)進行計數(shù)從而確定細(xì)胞密度。制備150 mL的細(xì)胞混合物 以獲得生物反應(yīng)器中800ml最終培養(yǎng)體積中0.4x106細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在植入 細(xì)胞之前，將容器中的pH設(shè)定為7.2(因為pH將被C02表面噴射所降低)。將p02 設(shè)定為50% 02飽和(將質(zhì)量流量控制器調(diào)整為100%，這對應(yīng)于50 ml/min的最大 噴灑流速)。在過程開始，由C02表面噴射控制pH。后來，通過加入7.5。/。NaHC03 而控制。以0.3ml/min的空氣流速開始進行表面充氣?；诔Ｒ?guī)進行細(xì)胞計數(shù)。
培養(yǎng)三天后細(xì)胞密度應(yīng)該達到4-5 x 106 cells/ml以上。如果達到預(yù)期的細(xì)胞密 度，則在l(^的MOI進行病毒感染。將容器溫度設(shè)定為33°C。在冰上使病毒株溶 化。在10 ml的生產(chǎn)培養(yǎng)基中制備感染混合物。將感染混合物接種于生物反應(yīng)器之 后，在l小時內(nèi)進行病毒吸附。最終的生產(chǎn)培養(yǎng)基這樣制備1.5L的生產(chǎn)培養(yǎng)基 中，加入胰蛋白酶以獲得容器中0.3 U/ml的終濃度(總體為2.3 L)。然后加入預(yù)熱 的最終生產(chǎn)培養(yǎng)基。每天從生物反應(yīng)器中收集約15ml樣品以進行細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞 形態(tài)分析并觀察CPE。使用BioProfile Basic軟件分析培養(yǎng)全短中的代謝物例如谷 氨酸鹽、谷氨酰胺、乳酸鹽和葡萄糖。如果需要的話調(diào)整代謝物的濃度。例如，如果需要的話將谷氨酰胺的濃度調(diào)整為2mM。如果需要的話將葡萄糖的濃度調(diào)整 為2 g/L。
在實驗?zāi)┪彩褂盟占乃袠悠愤M行病毒滴定。 8.2-結(jié)果
8.2.1 -3L饋料批次生物反應(yīng)器中鴨EBx⑧細(xì)胞的生長動力學(xué)
鴨EBx⑧細(xì)胞在攪拌槽式生物反應(yīng)器中常規(guī)培養(yǎng)。使源于鴨EBx⑧的生物量在 37°C在細(xì)胞生長培養(yǎng)基中累積直至達到5-6^106的細(xì)胞密度。然后將混合物稀釋約 3至10倍，在10天的時間段內(nèi)監(jiān)視細(xì)胞生長動力學(xué)。在這樣的條件下，通常在約 第5天至第8天達到12-20 x 1()S細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。因此鴨EBx⑧細(xì)胞顯示出至 少10至15倍的分裂率范圍一。
8.2.2 -MVA-GFP病毒感染鴨EBx細(xì)胞過程中培養(yǎng)基成分對簇大小的影響 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用于EBx細(xì)胞培養(yǎng)和感染的無血清培養(yǎng)基中鈣和鎂的濃度對于
簇的大小有影響。鴨EBx細(xì)胞的小簇的存在改善了病毒的感染和繁殖，引起高的 MVA病毒滴度(圖9A)。
8.2.3 - 3L-生物反應(yīng)器中MVA病毒的生產(chǎn)
使鴨EBx⑧來源的生物量在Excell 66444生長培養(yǎng)基中在細(xì)胞增殖期累積。然 后以l(T2 TCID5Q/細(xì)胞的MVA-GFP病毒感染細(xì)胞并在Excell 66444生產(chǎn)培養(yǎng)基中 稀釋混合物。加入新鮮Excell培養(yǎng)基之后，在第2天細(xì)胞密度下降，在第4天感 染的細(xì)胞的細(xì)胞密度上升并達到12xl(^細(xì)胞/ml。在這樣的條件下，MVA-GFP生 產(chǎn)率是高的。從感染后第4天開始，MVA-GFP滴度為約108TCID50/ml (圖9B)。 在鴨EBx⑧細(xì)胞中得到205 TCID50/細(xì)胞的MVA-GFP產(chǎn)量。
實施例9:鴨EBx細(xì)胞系中流感病毒的生產(chǎn)
9.1-材料和方法
9.1.1- 流感病毒感染性檢驗(TCID50)
在MDCK細(xì)胞上進行感染性流感病毒的滴定。簡單來說，'將細(xì)胞以3xl(^細(xì) 胞/孔的密度在補充了 2.5 mM L-谷氨酰胺的UltraMDCK培養(yǎng)基中植于96孔平底 培養(yǎng)板中。24小時后，以含有6ng.mU1胰蛋白酶-EDTA的UltraMDCK中的10倍 系列稀釋的樣品感染細(xì)胞，并在33°C, 5 % C02潮濕空氣中孵育1周。然后在HA 檢驗中使用雞紅血細(xì)胞測試病毒復(fù)制，根據(jù)Reed和Muench的方法(1938fJReed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints.爿附. / /fyg. 27, 493-97計算TCID50滴度。
9.1.2- 單向輻射狀免疫擴散法(SRID)
按照Wood及其同事描述的方法確定源自流感病毒感染的EB14細(xì)胞樣品中的 血凝素濃度。簡單來說，以含有抗流感血清(由NIBSC提供推薦濃度)的瓊脂糖 凝膠包被玻璃板。設(shè)定凝膠;t后，在3mm0打孔中加入lOnL的合適稀釋的參考 和樣品。在室溫下潮盒中孵育18-24小時后，將板浸于0.9%NaCl并以蒸餾水洗滌。然后壓縮凝膠并干燥。以考馬斯蘭溶液對板進行染色15分鐘，在甲醇和乙酸的混 合物脫色兩次直至可以看見清晰確定的染色區(qū)。將板干燥以后，在兩個成直角的 方向測定環(huán)繞抗原孔的染色區(qū)的直徑。建立針對表面的抗原稀釋的劑量反應(yīng)曲線， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)斜率分析方':法計算結(jié)果。*Wood JM.等人 "An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines" (J. Biol. Stand" 1977， 5(3):237-47)。 9.1.3-流感血凝素蛋白的western blot分析
按照Laemmli UK (1970， Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685)的描述在10 %聚丙烯酰胺凝膠中 進行SDS-PAGE。通過半干式印跡程序(Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose (J Biochem Biophys Methods 10:203-209)4每變'性蛋白 (1 % SDS， 70mM P-巰基乙醇)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(hybond P， Amersham)。在室溫 下以補充了 P/。FCS(SAFC)的TBST中的5n/。脂肪干奶粉組成的混合物中將印跡封 閉一個小時。然后將印跡在補充了特異性多克隆抗HA綿羊血清(1:500 (NIBSC) 的封閉溶液中孵育過夜。以TBST洗滌印跡6次，然后在室溫下在封閉溶液中以 hrp偶聯(lián)的兔抗-綿羊IgG多克隆抗體(1:5000 (Rockland)孵育1個小時。以TBST洗 滌印跡6次后，最終以化學(xué)發(fā)光(ECL kit, Amersham)和膠片(Hyperfilm, Amersham) 顯示蛋白-偶聯(lián)物復(fù)合體。
9.2- 3L生物反應(yīng)器中鴨EBi^細(xì)胞的流感病毒感染
9.2.1-材料和方法 細(xì)胞融化材料
o T75 cm2培養(yǎng)瓶(Sarstedt, Cat# 831813502)
o培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)
o L-谷氨酰胺200mM(Biowhittaker,Cat#BE17-605E) o軌道振動器IKA gS260 (Fisher Bioblock, Cat# F35044) 細(xì)胞擴增材料
o T175cm2培養(yǎng)瓶(Sarstedt,Ca快831812502)
o培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)Excell 65319 (JRH, Cat# 65319-1000M1687)
加入2.5mM谷氨酰胺 o L-谷氨酰胺200mM (Biowhittaker, Cat# BE17-605E) o D (+)葡萄糖(45 %) (Sigma, Cat# G8769)
生產(chǎn)材料o生產(chǎn)培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)Excell 65629 (JRH, Cat# 65629)補充
2.5mM谷氨酰胺
o L-谷氨酰胺200mM (Biowhittaker， Cat# BE17-605E)
o D (+)葡萄糖(45 %) (Sigma, Cat# G8769)
o Trypzean IX (Sigma, Cat# T3449)
o 7.5 %碳酸氫鈉溶液(Sigma, Cat# 205-633-8) o流感病毒株(冷凍于-80。C)
9.2.2-細(xì)胞培養(yǎng)方法
(與實施例7.1中MVA復(fù)制方法相同) 在實驗?zāi)┪彩褂盟占乃袠悠愤M行病毒滴定、血凝素分析(HAU)和HA 抗原定量(western blot, SRID)。 9.3-結(jié)果
本發(fā)明人證明鴨EBx細(xì)胞為用于各種流感病毒株A和B復(fù)制的可信賴的和有 效的細(xì)胞底物。可在各種容器例如培養(yǎng)瓶和旋轉(zhuǎn)器(spinner)(數(shù)據(jù)未顯示)和生 物反應(yīng)器中進行流感病毒的生產(chǎn)。本發(fā)明人獲得了 3L和30L攪拌槽式生物反應(yīng)器 中的可重復(fù)性和有效的流感病毒生產(chǎn)的饋料批次過程。使用流感病毒株A和B在 培養(yǎng)瓶和生物反應(yīng)器中常規(guī)獲得了 15 mg/1以上和多達50 mg/1的血凝素的病毒產(chǎn) 量(圖11和12)。
實施例10:鴨EBx細(xì)胞系中新城疫病毒的復(fù)制
使用NDV La Sota株研究了鴨EBx細(xì)胞對新城疫病毒感染的易感性
10.1-方法
鴨EBx⑧細(xì)胞在37 °C和7.5 % C02空氣下在60 rpm軌道振動器上生長于T175 培養(yǎng)瓶中的Excell培養(yǎng)基(SFAC)中。在第0天以0.4x106細(xì)胞/mL在40 ml新鮮 培養(yǎng)基中植入細(xì)胞。在37°C, 7.5 % C02在搖動下(60 rpm)孵育細(xì)胞培養(yǎng)物。監(jiān)視細(xì) 胞生長動力學(xué)直至達到濃度為4xl()S至6xl(^細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度(通常在植入后第 3天)。在該點，使用NDV La Sota株以兩個不同的MOI (l(T3和10'4 TCIDW細(xì)胞) 接種細(xì)胞并繼續(xù)在37°C， 7.5 % C02在搖動下(60 RPM)孵育1個小時。然后加入 60mL新鮮的病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋并繼續(xù)在37°C和7.5 %(202在搖動 下(60rpm)進行孵育。在7天的時間內(nèi)進行細(xì)胞生長和病毒生產(chǎn)的動力學(xué)。作為蛋 白酶的來源，每天向培養(yǎng)基中加入重組胰蛋白酶(SAFC);測試了兩種濃度的胰蛋 白酶(0.4禾n 0.75 USP/mL)。每天取出等份用于細(xì)胞計數(shù)、病毒滴定和western blotting 分析。
以10% SDS-PAGE分離樣品并通過半干技術(shù)印跡至PDVF膜(Amersham)。使 用針對NDV的雞多克隆抗血清(1:2000, CHARLES RIVER laboratories),然后以堿 性磷酸酶-偶聯(lián)的兔抗-雞(l:5000， SIGMA)進行免疫檢測。使用ECL-化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)試劑盒(ROCHE)檢測結(jié)合的第二抗體。10.2-結(jié)果
鴨和雞EBx細(xì)胞對NDV La Sota株是敏感的并且復(fù)制NDV La Sota株。鴨EBx⑧細(xì)胞中產(chǎn)生的NDV的滴度(以TCID50/ml表示)從pi第0天至第2天升高，達到106 83 TCID50/mL的平均值(圖13左側(cè)圖板)。
Western blot分析(圖13右側(cè)圖板)顯示NDV病毒蛋白(N, Fo/F, NP & M)的表達。鴨EBx⑧細(xì)胞中產(chǎn)生的NDV病毒的病毒蛋白組成與使用雞EBx⑥細(xì)胞中產(chǎn)生的NDV病毒所獲得的病毒蛋白組成相似。此外，雞和鴨EBx細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒的釋放動力學(xué)是相似的。
實施例11:鴨EB66細(xì)胞系中麻疹病毒的復(fù)制
使用表達綠色熒光蛋白的重組麻疹病毒研究了鴨EB66細(xì)胞對麻疹病毒感染的易感性
11.1- 方法
EB66細(xì)胞在37 °C和7.5 % C02空氣下在60 rpm軌道振動器上生長于T175培養(yǎng)瓶中的Excell培養(yǎng)基中。在第0天以0.4x106細(xì)胞/mL在40 ml新鮮培養(yǎng)基中植入細(xì)胞。在37。C, 7.5y。CO2在搖動下(60rpm)孵育細(xì)胞。監(jiān)視細(xì)胞生長動力學(xué)直至達到濃度為4xl()S至6xl()S細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度(通常在植入后第3天)。在該點，使用重組麻疹病毒以兩個不同的MOI (10"禾卩10—2 TCID5o/細(xì)胞)接種細(xì)胞并繼續(xù)在37°C, 7.5 % C02在搖動下(60 RPM)孵育1個小時。然后加入60mL新鮮的病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋并繼續(xù)在37°C和7.5 %<:02在搖動下(60 rpm)進行孵育。在7天的時間內(nèi)進行細(xì)胞生長和病毒生產(chǎn)的動力學(xué)。每天取出等份用于細(xì)胞計數(shù)和病毒滴定。
11.2- 結(jié)果
EB66細(xì)胞對麻疹病毒是敏感的并且復(fù)制麻疹病毒。在非最優(yōu)化條件下，EB66細(xì)胞中生產(chǎn)的麻疹病毒的滴度(以TCID50/ml表示)達到107TCID50/ml的平均值(圖14)。
權(quán)利要求
1、一種獲得源自禽胚胎干細(xì)胞(ES)的持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系即 id="icf0001" file="A2008800132570002C1.tif" wi="10" he="3" top= "32" left = "154" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>的方法，其中所述禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包括以下步驟a)在約產(chǎn)卵期發(fā)育階段分離鳥胚胎，其中所述鳥的基因組中不含有易于產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的內(nèi)源性前病毒序列；b)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮通過分離步驟a)中的胚胎獲得的胚胎干(ES)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基添加以下物質(zhì)-胰島素生長因子(IGF-1)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)；-動物血清；和可選地，選自白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)或成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的生長因子；c)將步驟b)中獲得的ES細(xì)胞懸浮液植于飼養(yǎng)細(xì)胞層上并繼續(xù)培養(yǎng)ES細(xì)胞至少一個傳代；d)可選地從培養(yǎng)基中除去選自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生長因子并繼續(xù)培養(yǎng)ES細(xì)胞持續(xù)至少一個傳代；e)從培養(yǎng)基中除去IGF-1和CNTF，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至少一個傳代；f)逐步降低培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度，以在幾個傳代之后完全除去飼養(yǎng)層，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；g)可選地，逐步降低培養(yǎng)基中動物血清的濃度，以在幾個傳代之后完全除去動物血清；和h)獲得能夠在不含生長因子、飼養(yǎng)層，可選地不含動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖的源自ES細(xì)胞的粘附性禽類 id="icf0002" file="A2008800132570002C2.tif" wi="10" he="3" top= "177" left = "86" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>細(xì)胞系，且其中所述持續(xù)的雙倍體禽細(xì)胞系不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；i)可選地，使粘附性禽 id="icf0003" file="A2008800132570002C3.tif" wi="10" he="3" top= "191" left = "75" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)條件。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述鳥選自雁形目。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述鳥是鴨，優(yōu)選為北京鴨。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述鳥選自雞形目。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述鳥是ev-0家雞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的方法獲得的持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞系，其中所述禽細(xì)胞系的細(xì)胞具有至少一個以下特性-高細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)比；-內(nèi)源性端粒酶活性；- 約10pm的直徑；-在37'C時群體加倍時間為約30小時或30小時以下；-可選地，所述細(xì)胞可表達一種或多種另外的選自堿性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、 ENS1的標(biāo)記；且其中所述細(xì)胞不產(chǎn)生有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
7、 一種在權(quán)利要求6所述持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞中或在根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的方法獲得的持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞系中復(fù)制病毒的方法，包括以下步驟a) 以目的病毒感染所述禽細(xì)胞；b) 培養(yǎng)所述感染的禽細(xì)胞以復(fù)制所述病毒；c) 在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和/或在所述細(xì)胞內(nèi)收獲病毒。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒選自痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、皰疹病毒、嗜肝病毒、腺病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒、冠狀病毒、黃病毒、披膜病毒、雙RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述病毒是痘病毒或重組痘病毒，選自修飾的安卡拉牛痘(MVA)病毒、Lister-Elstree牛痘病毒、LC16m8牛痘病毒、CVI78牛痘病毒、雞痘病毒、金絲雀痘病毒(即ALVAC)、 NYVAC、雪雞痘病毒、八哥痘病毒、鴿痘病毒、鸚鵡痘病毒、鵪鶉痘病毒、麻雀痘病毒、椋鳥痘病毒或火雞痘病毒。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒為副粘病毒或重組副粘病毒，優(yōu)選選自麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、Sendai病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副流感病毒I和III型、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒、新城疫病毒、鴨副流感病毒。
11、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒為正粘病毒或重組正粘病毒或重排正粘病毒，選自人類流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒、貓流感病毒。
12、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒為披膜病毒，優(yōu)選選自Sinbis病毒、Semliki森林病毒、O，nyong，nyong病毒、Chikungunya病毒、Mayaro病毒、Ross河病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒或其重組披膜病毒。
13、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒，選自網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、鴨傳染性貧血病毒、suck脾壞死病毒或其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。
14、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中病毒為細(xì)小病毒，優(yōu)選為鴨細(xì)小病毒或其重組細(xì)小病毒。
15、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中病毒為腺病毒，優(yōu)選選自雞腺病毒、鵝腺病毒、鴨腺病毒或鴿子腺病毒或其重組腺病毒。
16、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中病毒為雙RNA病毒，優(yōu)選為傳染性法氏囊病病毒。
17、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中病毒為黃病毒，優(yōu)選選自登革熱病毒、日本腦炎病毒或西尼羅河病毒。
18、 根據(jù)權(quán)利要求7-17任一項所述的方法獲得的病毒。
19、 一種包含權(quán)利要求18所述病毒的疫苗，如果合適的話該病毒與藥學(xué)上可接受的增強免疫反應(yīng)的物質(zhì)組合。
20、 根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗，其中病毒選自作為完整病毒顆粒存在的病毒或作為分解的病毒顆粒存在的病毒。
21、 一種疫苗，其包含至少一種從權(quán)利要求18所述病毒獲得的病毒抗原性蛋白，如果合適的話該病毒與藥學(xué)上可接受的增強免疫反應(yīng)的物質(zhì)組合。
22、 一種包含禽細(xì)胞的疫苗，禽細(xì)胞源自權(quán)利要求6所述的禽細(xì)胞系或是由權(quán)利要求1至5任一項所述的方法獲得的禽細(xì)胞系，并且所述禽細(xì)胞被病毒感染。
23、 一種生產(chǎn)重組蛋白和肽的方法，包括以下步驟-a) 通過以表達載體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染從而對根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述方法獲得的或如或權(quán)利要求6所述的持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞系進行遺傳修飾；b) 可選地，選擇表達所述重組蛋白或肽的所述經(jīng)修飾的持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞系；和C)純化由所述經(jīng)遺傳修飾的持續(xù)雙倍體禽細(xì)胞系所表達的重組肽或蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及開發(fā)和生產(chǎn)病毒疫苗。特別地，本發(fā)明涉及病毒載體和疫苗的工業(yè)生產(chǎn)的領(lǐng)域，更特別地涉及禽胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選為源自鴨胚胎干細(xì)胞的EBx細(xì)胞系在生產(chǎn)病毒載體和病毒之中的用途。本發(fā)明特別用于防止人類和動物病毒感染的病毒疫苗的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號A61K39/145GK101668539SQ200880013257
公開日2010年3月10日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月24日
發(fā)明者F·格埃納克, K·莫羅, M·埃斯諾, M·梅赫泰利 申請人:維渦里斯公司