專利名稱：治療惡性病狀、自身免疫性疾病或傳染病的工具包的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及治療惡性病狀、自身免疫性疾病或傳染病，尤其是依靠在其表面 表達(dá)Fc Y R受體的效應(yīng)細(xì)胞。
背景技術(shù)：
在研究中越來越多地使用的抗體也是診斷和治療中選擇的工具，它們可替代常規(guī) 治療。 許多用于治療用途的來源于血漿或來源于生物技術(shù)的抗體制品正進(jìn)入市場，或處 于臨床研發(fā)階段。利用它們的特性來制備能與它們的靶點(diǎn)特異性結(jié)合并有效恢復(fù)免疫系統(tǒng) 細(xì)胞的治療工具。 最近的研究集中于改善抗體的效力，更特別地集中于對它們恒定Fc區(qū)的操作。后 者負(fù)責(zé)抗體的"效應(yīng)"特性，因?yàn)槠淇蓜訂T免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和補(bǔ)體蛋白。通過在特定效 應(yīng)細(xì)胞上存在的糖蛋白(即Fc受體(FcR))使這種能力成為可能。 一旦抗體通過其可變區(qū) 固定在靶抗原上，這些受體能與抗體的恒定區(qū)結(jié)合?？贵wFc區(qū)與效應(yīng)細(xì)胞攜帶的FcR的結(jié) 合引發(fā)后者中細(xì)胞毒性機(jī)制的激活，如吞噬作用和ADCC(依賴抗體的細(xì)胞毒性或抗體依賴 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)。在自身免疫性疾病中，天然作用為保護(hù)生物體免受侵犯的免疫系統(tǒng) 在沒有外來體時引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而其本身通過"意外地"攻擊自身分子導(dǎo)致組織損傷。不 同的自身免疫性病狀影響身體的不同組織或不同功能。例如，對于患有多發(fā)性硬化癥的那 些患者影響腦，對于患有克羅恩病(Crohn's disease)的患者靶向腸，對于患有類風(fēng)濕性多 發(fā)性關(guān)節(jié)炎的患者影響滑液、骨和軟骨。 自身免疫性疾病發(fā)展期間，可能發(fā)生幾種現(xiàn)象，如一種或多種類型的組織的漸進(jìn)
壞死、器官的非正常生長或受影響的器官的一種或多種功能的改變。自身免疫性疾病中最
常受影響的組織或器官是造血細(xì)胞、血管、結(jié)締組織、內(nèi)分泌腺、肌肉、關(guān)節(jié)和皮膚。自身免
性疫疾病通常與慢性炎癥性病狀相關(guān)。最常見的情況是兩類炎癥性關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕性多發(fā)
性關(guān)節(jié)炎和幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎是表示關(guān)節(jié)炎癥的通用術(shù)語。 很多治療有許多副作用或不能完全防止疾病的發(fā)展。目前沒有理想的治療，不能
治愈患者，最終顯然需要更有效的且能治愈以上所有病狀的新型療法。 因?yàn)锽淋巴細(xì)胞(LB)是產(chǎn)生通常負(fù)責(zé)自身免疫性疾病發(fā)展的自身抗體的細(xì)胞，通 過給藥這種細(xì)胞類型的特異性單克隆抗體來破壞它們可能對患者有利，如近來核準(zhǔn)的用于 治療類風(fēng)濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的利妥昔單抗(rituximab)所表現(xiàn)出的。 而且，盡管在改善衛(wèi)生狀況、免疫法和抗微生物療法上有相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步，傳染病仍是 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的持久且嚴(yán)重的難題。最普遍的疾病普通感冒是與最可怕的疾病AIDS(獲得性 免疫缺陷綜合征)同類的傳染病。已證實(shí)某些神經(jīng)失調(diào)類疾病(如退化性疾病)事實(shí)上與 感染有關(guān)。 傳染病在未來仍是主要的醫(yī)學(xué)難題。 傳染病中，單克隆抗體可能發(fā)揮兩種互補(bǔ)的作用在感染的急性階段期間中和致病劑或所分泌毒素的作用，和在向慢性階段過渡期間破壞儲存細(xì)胞的作用。
破壞能低噪復(fù)制致病劑的宿主細(xì)胞可防止疾病發(fā)展至慢性階段，最常見在嚴(yán)重病 狀(如自身免疫性疾病或癌癥)發(fā)展的最終進(jìn)入慢性階段。盡管目前存在真實(shí)需求，但在 慢性階段的治療中幾乎沒有有效的抗感染治療。另一方面，隨著交叉抗藥性的發(fā)展，在感染 的急性階段期間小分子(抗生素、抗寄生的、抗病毒的)的有益效應(yīng)不斷減弱。因此細(xì)菌對 抗生素表現(xiàn)出的多重抗藥性導(dǎo)致了一個公共健康難題，6_7%的住院治療患者都伴隨著或 多或少的嚴(yán)重醫(yī)院交叉感染，或每年每1. 5億住院治療患者中接近750000例有醫(yī)院交叉感 染(http:〃www. senat. fr/r即/r05-21/r05-4211. html針oc13)。每年醫(yī)院交叉感染總共造 成9000人死亡，其中4200位涉及的患者在他們所入住醫(yī)院期間短期內(nèi)不會有重要的預(yù)后。 (http://www. senat. fr/rap/r05_421/r05_4213. html). 因此，看來需要開發(fā)可為醫(yī)生和他們的患者提供可選擇的治療的新型藥物。
腫瘤是由細(xì)胞增殖失控引起的瘤塊，其可以是良性或惡性的。良性腫瘤通常保 持在局部不動。惡性腫瘤通稱為癌。術(shù)語"惡性"通常指能夠侵入和破壞鄰近結(jié)構(gòu)并擴(kuò) 散至更遠(yuǎn)位置的腫瘤，最后導(dǎo)致患者死亡(Robbins andAngell， 1976， Basic Pathology, 2d Ed. ， W. B. Saunders Co. ， Philadelphia, pp. 68-122)。癌可在許多不同位置發(fā)生并隨 其組織起源的功能而表現(xiàn)不同。目前，治療癌癥的手段是外科手術(shù)，化學(xué)療法，激素療法， 和/或放射療法，以消滅患者身上存在的腫瘤細(xì)胞(Stockdale，1998， 〃 Principles of Cancer PatientManagement〃 ， in Scientific American :Medicine， vol. 3， Rubenstein andFederman， Eds. ， Chapter 12)。所有這些治療都有主要缺陷。例如，盡管大量不同化學(xué) 分子的有效性，但化學(xué)療法導(dǎo)致許多副作用，如嚴(yán)重的反胃、骨髓發(fā)育不全、免疫抑制等。某 些這類影響嚴(yán)重時會迫使醫(yī)生中止治療。此外，盡管以幾種化學(xué)分子的組合給藥，但是大部 分腫瘤細(xì)胞有抗藥性或形成對化療劑的抗藥性。事實(shí)上，對當(dāng)前方案中對特定給藥藥劑有 抗藥性的細(xì)胞不幸地也對其他藥物有抗藥性，包括通過不同于治療方案中給藥藥劑所用的 機(jī)制起作用的那些藥劑。被稱多藥抗藥性的這種現(xiàn)象通常是標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療失敗的原 因。 因此，確實(shí)需要新型的抗癌治療，尤其是治療常規(guī)療法(如外科手術(shù)、放射療法、 化學(xué)療法或激素療法)難以治愈的癌癥。 —個有前景的可選方案是免疫療法，其中通過腫瘤抗原特異性的抗體特異地靶向
腫瘤細(xì)胞。在利用免疫反應(yīng)的特異性方面進(jìn)行了主要的努力，例如雜交技術(shù)已促使了特
異性針對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原的單克隆抗體的開發(fā)(Green M. C.等.，2000Cancer Treat
Rev. ，26 :269-286 ;Weiner L. M. ，1999Semin Oncol. 26(suppl. 14) :43-51)。 宿主有害細(xì)胞或致病劑的消除對應(yīng)于所希望的單克隆抗體的效能機(jī)制，與目標(biāo)病
狀無關(guān)。從而關(guān)鍵的是要改善這些抗體以使其與患者免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞更好地相互作用。 慢性淋巴白血病B(LLC-B)，一種以B淋巴細(xì)胞(LB)的惡性增殖為特征的疾病，是 最常發(fā)的白血病形式。目前的治療實(shí)質(zhì)是基于節(jié)制于疾病早期的治療。在臨床或血液病學(xué) 癥候?qū)W中，傳統(tǒng)地是單獨(dú)以皮質(zhì)激素類或結(jié)合抗有絲分裂分子來治療患者。對于大部分患 者，或長或短時間會出現(xiàn)對治療的抗性并通常結(jié)果是以化療抗性細(xì)胞的出現(xiàn)而導(dǎo)致治療失 敗?；瘜W(xué)治療帶來嚴(yán)重的副作用，特別是骨髓毒性從而產(chǎn)生可導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重感染、甚至
6有時死亡的免疫缺陷。評估了許多關(guān)注于盡可能特異性消除腫瘤B細(xì)胞的治療途徑。通過 腫瘤(和正常)LB對CD20分子的特異性表達(dá)，可開發(fā)基于利用人類抗CD20單克隆抗體的 治療。 單個非放射標(biāo)記的抗CD20單克隆抗體，利妥昔單抗(Rituxan , Genentech和 Mabth6raTM， Roche)，是目前可商購的。其標(biāo)明用于治療患有III-IV期的濾泡淋巴瘤的患者 并可與化學(xué)療法聯(lián)合用于治療患有擴(kuò)散CD20陽性大B細(xì)胞攻擊性非霍奇金淋巴瘤(NHL) 的患者。因?yàn)樵趩为?dú)使用時其效能保持有效且通常比較溫和(Teeling等.2004， Blood 104 (6) :1793-800)，最常將其與化學(xué)療法聯(lián)合使用。 在LLC-B患者中評估了利妥昔單抗。當(dāng)將其用于單一療法中時該抗體僅表現(xiàn)出輕 微效力，目前將其與化學(xué)療法聯(lián)合給藥。 許多原因可解釋在LLC-B患者中利妥昔單抗單一療法的失敗首先，在體外利妥 昔單抗對B細(xì)胞有輕微的ADCC活性，而與正常LB相反且在NHL中，LLC-B的LB僅在其表 面表達(dá)很少的CD20分子(通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的定量檢測，密度約小5倍)，從而限制了細(xì) 胞表面上的抗體數(shù)量以及相關(guān)的細(xì)胞毒性功能(尤其是ADCC和活性補(bǔ)體)。
可見，集中于包含特異性針對CD20抗原的抗體且能夠有效地引起腫瘤細(xì)胞(包括 輕度表達(dá)抗原的那些腫瘤細(xì)胞)裂解的可選療法是很重要的。 自身免疫的效應(yīng)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮了主要作用。它們以失 活形式天然存在(在不存在任何病狀時)，可通過不同途徑在體外或體內(nèi)將其激活，如病 原體的入侵或與免疫復(fù)合體表面表達(dá)的受體(通過抗體Fc區(qū)與FcR結(jié)合)的結(jié)合或細(xì)胞 因子，特別是炎癥現(xiàn)象期間產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子。激活誘導(dǎo)細(xì)胞溶解從而增加巨噬細(xì)胞 抗月中瘤活性(Adams D.禾卩Hamilton T. :Activation of macrophages for tumour cell kill :effector mechanismand regulation.In Heppner&Fulton(Eds)， Macrophages and cancer. CRCPress，1988， p. 27 ;Fidler I. -Macrophages and metastases. A biological approachto cancer therapy. Cancer Res，45 :4714，1985)。 此外，巨噬細(xì)胞或源于單核細(xì)胞或其前體的其它細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。由于它們 具有強(qiáng)大的將與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子結(jié)合的抗原性肽內(nèi)吞、消化和呈遞給T 淋巴細(xì)胞的能力，它們能夠誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)。 為增加利妥昔單抗效力的目標(biāo)，在體外裂解LLC-B原發(fā)性細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中評估了利 妥昔單抗與在干擾素-y (IFN-y)存在下先體外后體內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞的結(jié)合(Lefebvre ML， Stefan W. Krause， Salcedo M， Nardin A. Ex vivoactivated human macrophages kill chronic lymphocytic leukemia cells in thepresence of Rituximab :mechanism of antibody—dependent cellular cytotoxicityand impact of human serum. J. Immunother ;vol. 29， n° 4 :388-397,2006)。結(jié)果表明增加人血清的濃度強(qiáng)烈地抑制在 利妥昔單抗存在下激活的巨噬細(xì)胞對LLC-B的強(qiáng)裂解。通過利妥昔單抗-LLC細(xì)胞復(fù)合體 與巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的多種FcR的結(jié)合，這種抑制與血清中存在的多克隆免疫球蛋白競爭 相關(guān)聯(lián)。這種抑制的強(qiáng)度取決于所用的利妥昔單抗的濃度和效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞的比例(效
應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞或e : t)。 盡管存在許多治療癌癥、自身免疫性疾病或傳染病的治療工具，仍存在相對現(xiàn)存 產(chǎn)品具有明顯更強(qiáng)效力和更好安全性的新型免疫療法產(chǎn)品的實(shí)質(zhì)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是治療惡性病狀、自身免疫性疾病或傳染病的部件試劑盒(a kit of parts)，該部件試劑盒包括在其表面表達(dá)FcYRIII受體(CD16)的效應(yīng)細(xì)胞和單克 隆抗體，其中所述單克隆抗體的Fc區(qū)對CD16的親和力大于多克隆抗體的Fc區(qū)對CD16的 親和力。 有利地，在其表面表達(dá)FcYRIII受體(CD16)的效應(yīng)細(xì)胞是在其表面表達(dá) FcyRIII受體(CD16)的單核細(xì)胞，或在其表面表達(dá)Fc yRIII受體(CD16)的由單核細(xì)胞或 單核細(xì)胞前體衍生的細(xì)胞。 有利地，該細(xì)胞選自表達(dá)CD16的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)，樹突狀 細(xì)胞和全部外周血單核的細(xì)胞(外周血單核的細(xì)胞或PBMC)。 有利地，在其表面表達(dá)CD16的細(xì)胞選自表達(dá)CD16的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀 細(xì)胞。 更具體而言，在其表面表達(dá)CD16的單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生的細(xì)胞是巨噬 細(xì)胞。 有利地，由于所述CD16的單克隆抗體的Fc區(qū)的高親和力，所述單克隆抗體不會被 多克隆免疫球蛋白(尤其是血清中存在的那些)所取代。 有利地，所述單克隆抗體與所述單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生的細(xì)胞的CD16以 大于2. 106M—1的親和力相結(jié)合 在一個特別有益的方式中，以單克隆抗體組合物的形式產(chǎn)生所述單克隆抗體，其 中每個抗體具有與FcY糖基化位點(diǎn)(天冬酰胺297，根據(jù)abat)的N連接的糖鏈，其中在所 述組合物的所有抗體的所述糖基化位點(diǎn)上的N連接糖鏈中，巖藻糖的比例小于65X。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，所述單克隆抗體針對的抗原選自抗原5C5(由腎癌 細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原)、BCR(B細(xì)胞受體)、獨(dú)特型(例如抗FVIII抑制劑抗體的獨(dú)特型)、 TCR(T細(xì)胞受體)、CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD45、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD66 (a、 b、 c、 d) 、 CD74、 CD80、 CD86、 CD126、 CD138、 CD154、 MUC1 (黏蛋白1) 、 MUC2 (黏蛋白2) 、 MUC3 (黏蛋白3) 、 MUC4 (黏 蛋白4) 、 MUC 16 (黏蛋白16) 、 HM1. 24 (在多發(fā)骨髓瘤中過度表達(dá)的漿細(xì)胞特異性抗原)、 生腱蛋白(細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白)、GGT( y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、 EGFR(內(nèi)皮生長因子受體)、CEA(癌胚抗原)、CSAp(結(jié)腸特異性抗原p) 、ILGF(胰島素樣生 長因子)、胎盤生長因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、蛋白S100 (鈣結(jié)合蛋白的多基因家 族)、MART-1 (與黑色素瘤相關(guān)的腫瘤分化抗原)、TRP-1 (酪氨酸酶相關(guān)蛋白1) 、TRP-2(酪 氨酸酶相關(guān)蛋白2) 、 gp100 (100kDa糖蛋白)、淀粉樣蛋白、獼猴D抗原、I類和II類MHC分 子(如HLA-DR)、突變基因(特別是致癌基因或腫瘤抑制基因)表達(dá)形成的抗原、某些已確 定腫瘤表達(dá)的致癌基因病毒衍生的抗原、在某些腫瘤中過度表達(dá)和某些正常組織中輕微表 達(dá)的普遍抗原(如苗勒管(Mullerian)激素的II型受體)、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、 由感染細(xì)胞在膜上自身或非自身表達(dá)或暴露的分子(如磷脂酰絲氨酸)、和由致病劑(細(xì) 菌毒素、細(xì)菌或寄生蟲壁的蛋白復(fù)合物、病毒囊膜糖蛋白(例如來自HIV病毒、HBV、 HCV和 RSV等))表達(dá)或分泌的蛋白。
優(yōu)選地，所述單克隆抗體針對CD20。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗CD20抗體是由2004年11月8日以登錄號1-3314保藏在CNCM的細(xì)胞株R509產(chǎn)生的，或由2005年11月29日以登錄號1-3529保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)的細(xì)胞株R603產(chǎn)生的(CNCM-Collection Nationale de Culturede Microorganismes， Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex15-法國)。 有利地，本發(fā)明的部件試劑盒預(yù)期同時地、依次地或單獨(dú)地用于治療。 有利地，在本發(fā)明的部件試劑盒中，在其表面表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞對通過抗體與
CD16的作用所優(yōu)選的所述抗體靶向的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性活性。 有利地，在本發(fā)明的部件試劑盒中，單克隆抗體通過ADCC活性或通過所述抗體靶向的細(xì)胞的吞噬作用在表達(dá)CD16效應(yīng)細(xì)胞的存在下誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。 本發(fā)明的另一目的是含有本發(fā)明所述的部件試劑盒和藥物可接受賦形劑的藥物組合物。 本發(fā)明的另一 目的涉及本發(fā)明的部件試劑盒在藥物制備中的應(yīng)用。 本發(fā)明的另一目的涉及本發(fā)明的部件試劑盒在制備治療惡性病狀的藥物中的應(yīng)用。 有利地，所述惡性病狀選自固體腫瘤和惡性血液病。有利地，所述固體腫瘤選自黑色素瘤、癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚癌。有利地，所述癌是選自由腎癌、乳腺癌、口腔癌、肺癌、胃腸道癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌、皮膚癌和睪丸癌所組成的組中。 有利地，惡性血液病是選自淋巴組織增生、骨髓組織增生、骨髓發(fā)育不良綜合征和急性骨髓樣白血病(例如B型NHL)、急性或慢性B淋巴白血病、伯基特(Burkitt' s)淋巴瘤、毛狀白細(xì)胞(tricholeucocyte)白血病、急性或慢性骨髓樣白血病、T淋巴瘤和白血病、霍奇金(Hodgkin's)淋巴瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom's)巨球蛋白血病和多發(fā)性骨髓瘤。 本發(fā)明的另一目的涉及本發(fā)明的部件試劑盒在制備治療自身免疫性疾病和/或原發(fā)或繼發(fā)炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病具有器官特異性或是全身性的，并與致病的自身抗體相關(guān)或不相關(guān)。 有利地，自身免疫性疾病和/或炎癥疾病是選自器官移植排斥、或移植物抗宿主病、類風(fēng)濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、傳播性紅斑狼瘡、硬皮病、原發(fā)性干燥綜合征(或古熱羅-舍格倫(Gougerot-Sjogren)綜合征)、自身免疫多發(fā)性神經(jīng)病(例如多發(fā)性硬化癥)、1型糖尿病、自身免疫性肝炎、強(qiáng)直性脊椎關(guān)節(jié)炎、賴特(Reiter' s)綜合征、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、克羅恩(Crohn's)病、橋本氏(Hashimoto's)甲狀腺炎、愛迪生(Addison's)病、自身免疫肝炎、巴澤多(Basedow's)病、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎(如與ANCA(抗中性白細(xì)胞胞質(zhì)抗體)相關(guān)的系統(tǒng)性脈管炎)、自身免疫性血球減少和其他成人和兒童血液病并發(fā)癥(例如急性或慢性自身免疫性血小板減少)、自身免疫溶血性貧血、新生兒溶血病(HDN)、冷凝集素疾病、血小板減少血栓紫癜和獲得性自身免疫性血友?。还诺屡了骨?Goodpasture' s)綜合征、膜外腎病、自身免疫性大皰皮膚病、重癥肌無力、混合性冷沉球蛋白血癥、銀屑病、幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、炎癥性肌炎、皮肌炎和兒童系統(tǒng)性自身免疫病(包括抗磷脂綜合征)。
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本發(fā)明的另一目的涉及本發(fā)明的部件試劑盒在制備治療傳染病的藥物中的應(yīng)用。
有利地，所述傳染病是選自由病毒(人類免疫缺陷病毒或HIV、乙型或丙型肝炎病毒(HBV、 HCV)、非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒或EBV、巨細(xì)胞病毒或CMV、腸病毒、甲型、乙型和丙型流感病毒、多核呼吸病毒或SRV、或HTLV)、細(xì)菌和/或它們的毒素(破傷風(fēng)、白喉、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌、包含甲氧西林抗性形式的葡萄球菌、克雷伯氏(Klebsiellas)菌、志賀氏(Shigellas)菌、假單胞菌、腸道菌或包括醫(yī)源性疾病在內(nèi)的抗生素抗性病狀)、寄生蟲(瘧疾、利什曼蟲病、錐蟲病)誘發(fā)的疾??；以及新出現(xiàn)的疾病，例如切昆汞亞熱(Chikungunya)、禽流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒或SARS、引起出血性(熱如埃博拉(Ebola)或登革(Dengue)熱)的病毒或西尼羅(WestNile)病毒；和與生物恐怖主義相關(guān)的那些，如炭疽、食物中毒、瘟疫、天花和痘病毒、兔熱病(Tularaemia)、出血性發(fā)熱劑、普魯斯(brucellosis)病、葡萄球菌B腸毒素、白喉毒素或病毒性腦炎。
潘i式齊檢 術(shù)語"部件試劑盒"表示藥物組合，該藥物組合的基本組分由于它們的常規(guī)意義形成功能單位。 更具體而言，本發(fā)明的部件試劑盒是含有作為活性物質(zhì)的在其表面表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞和單克隆抗體的藥物組合，其中所述單克隆抗體的Fc區(qū)對CD16的親和力大于多克隆免疫球蛋白Fc區(qū)對CD16的親和力，所述效應(yīng)細(xì)胞和單克隆抗體可以同時地、單獨(dú)地或依次地應(yīng)用于治療惡性病狀、自身免疫性疾病或傳染病。 所述單克隆抗體和所述在其表面表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞共同形成單個部件試劑盒形式的組合物，其組分對于同時、單獨(dú)或隨時間交錯應(yīng)用均有效。本發(fā)明部件試劑盒還可以是混合物的形式。 由于新型的常規(guī)效力和常規(guī)意義，所述單克隆抗體和所述表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞形成功能單位。 在其表面表達(dá)Fc YRIII受體(CD16)的效應(yīng)細(xì)胞"在其表面表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞"表示在由免疫復(fù)合物的結(jié)合誘導(dǎo)的細(xì)胞激活后具有效應(yīng)子活性(尤其是ADCC的細(xì)胞毒性活性、吞噬作用或在另一領(lǐng)域中的抗原呈遞和體液反應(yīng)特性)的任何細(xì)胞，所述免疫復(fù)合物由抗體與Fc Y RIII或CD16膜受體特異性抗原結(jié)合而形成。這些細(xì)胞需要在其表面表達(dá)CD16。 有利地，這種細(xì)胞可以是源于在其表面表達(dá)CD16的單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生細(xì)胞的細(xì)胞、CD16+單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，且不限于此。 因此，還可擴(kuò)展至天然殺傷(NK)細(xì)胞和PBMC(外周血單核細(xì)胞)細(xì)胞。以"NK細(xì)
胞"表示能夠在沒有先前免疫下自發(fā)細(xì)胞毒性活性的巨大顆粒淋巴細(xì)胞。以"PBMC"表示任
何外周血中的單核的細(xì)胞(單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)，且在其表面表達(dá)CD16。 由于單克隆抗體Fc區(qū)和細(xì)胞表達(dá)的CD16受體之間的結(jié)合，在存在本發(fā)明的單克
隆抗體時，這種細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC活性。 所述效應(yīng)細(xì)胞優(yōu)選是巨噬細(xì)胞。 所述CD16+單核細(xì)胞(即在其表面表達(dá)CD16)是在其膜表面表達(dá)CD16的單核細(xì)胞亞群。CD16+單核細(xì)胞能夠吞噬和誘導(dǎo)ADCC活性。 巨噬細(xì)胞是固有免疫的主要參與者之一并參與了適應(yīng)性免疫。它來自于單核細(xì)胞的分化。 以舉例方式，巨噬細(xì)胞可以來源于富含單核細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，包括在適宜的含有M-CSF(單核細(xì)胞集落剌激因子)或GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子)的培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute的RPM^培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的步驟以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。例如可在培養(yǎng)6-7天后產(chǎn)生巨噬細(xì)胞。 還可以通過由在健康個體上執(zhí)行的細(xì)胞單采法(cyt即heresis)獲得的富含血細(xì)胞的組合物，并通過在含有M-CSF(單核細(xì)胞集落剌激因子)或GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞的步驟來制備巨噬細(xì)胞。 任選地，可以有利地在該培養(yǎng)步驟之前先進(jìn)行分離步驟，在由細(xì)胞單采法獲得的血液衍生組合物中首先分離單核的細(xì)胞、其次紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和部分血小板，再進(jìn)行清除步驟，清洗部分血小板和之前步驟剩余的抗凝血藥。 通常通過對含有單核細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行密度梯度離心來實(shí)現(xiàn)上述細(xì)胞懸浮液的單核細(xì)胞富集步驟，特別是在密度約為1. 0-1. 3g/ml的溶液中(如密度為1. 077g/ml的Ficoll Paque型溶液(Pharmacia))中離心。 任選地，含有巨噬細(xì)胞、和/或樹突狀細(xì)胞、和/或NK細(xì)胞的組合物可從富含血細(xì)胞、尤其是白血球(如單核細(xì)胞或其前體)的人源血液衍生組合物獲取，特別是如通過細(xì)胞單采法獲取的血液衍生組合物，所述方法包括以下步驟 有利地，以適宜的生理溶液稀釋所述血液衍生組合物，特別是按其約2-3倍體積； 洗滌所述血液衍生組合物，有利地通過簡單離心并洗滌由上述離心獲得的沉淀，
在適宜的生理洗滌溶液中特別是在袋(轉(zhuǎn)移袋類型)中回收沉淀，例如通過在所述袋上施
加壓力，然后將所述洗滌溶液排至另一袋或其他容器中，以恢復(fù)組合物并去除了任何可能
的抗凝血藥和任何多種殘?jiān)?，并清除了血小板? 如果需要，重復(fù)上述洗滌步驟，特別是1-2次； 培養(yǎng)經(jīng)上述洗滌步驟之后獲得的血液衍生組合物中含有的細(xì)胞，通過將該血液衍生組合物置于適宜培養(yǎng)基中，特別是在有利的疏水袋中放置約6-10天(特別是6-7天)；
該培養(yǎng)步驟是，在清除除可能存在于起始組合物中的單核細(xì)胞或其前體以外的所有或部分組分(特別是血小板、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的清除步驟之前，將在培養(yǎng)步驟之前的洗滌步驟之后獲得的血液衍生組合物與針對所有或部分上述組分的抗體接觸，并回收含有單核細(xì)胞或其前體的溶液，而所有或部分上述組分保留固定在抗體上，和/或在清除除巨噬細(xì)胞以外的所有或部分組分的清除步驟之后，將培養(yǎng)步驟之后獲取的血液衍生組合物與如上文所述的抗體接觸，并回收含有巨噬細(xì)胞的溶液，而所有或部分上述組分保留固定在抗體上； 和/或在純化步驟之后，特別是通過洗脫，物理地將巨噬細(xì)胞與培養(yǎng)步驟之后獲
得的組合物的其它組分分離，特別是與血小板、紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分離。 更普遍的是，獲取在其表面表達(dá)CD16的巨噬細(xì)胞的任何其它方法也可應(yīng)用于本發(fā)明。 此外，在本發(fā)明中以"巨噬細(xì)胞"表示從單核細(xì)胞獲得的任何細(xì)胞，按照已確定的
11方法進(jìn)行分化，從而在細(xì)胞中表達(dá)以下膜標(biāo)記CD14+、 CD16+、 CD32+、 CD64+、 CDllb+。尤其是，CD16+細(xì)胞的百分比為至少20%、優(yōu)選50%、或70%或包含在70_100%之間。
單克降抗體 為本發(fā)明的目的，"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"的表述是指源于細(xì)胞克隆的并具有同一和單一特異性的抗體分子制備物。 免疫球蛋白分子是由4條多肽鏈組成相同的2條50kDa重鏈(H，重)和相同的2條25kDa輕鏈(H，輕)。輕鏈由可變結(jié)構(gòu)域V和恒定結(jié)構(gòu)域C兩個結(jié)構(gòu)域組成，其在空間上彼此獨(dú)立折疊，稱為VL和CL。重鏈也包含稱為VH的V結(jié)構(gòu)域和稱為CH1-CH4的3或4個C結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域包含約110個氨基酸且結(jié)構(gòu)相當(dāng)。2條重鏈通過二硫橋連接而且每條重鏈也通過二硫橋連接一條輕鏈。 可變部分形成決定抗體對抗原的特異性的區(qū)域，而恒定部分可與效應(yīng)細(xì)胞的Fc
受體相互作用或與如補(bǔ)體蛋白的分子相互作用以形成不同的功能特性。 關(guān)于重鏈和輕鏈的可變區(qū)，可觀察到在序列上可變性分布不均等。實(shí)際上，可變區(qū)
是由4個稱為"框架"(FR) (FR1-FR4)的僅輕微變化的區(qū)域和具有極強(qiáng)可變性的區(qū)域(總共
3個"高變"區(qū)或CDR(互補(bǔ)決定區(qū))(CDR1-CDR3))所組成的。 有利地，本發(fā)明的抗體是嵌合的、人源化的或人類的抗體。 本發(fā)明抗體優(yōu)選是嵌合的。 以"嵌合抗體"表示輕鏈和重鏈的可變區(qū)與輕鏈和重鏈的恒定區(qū)屬于不同物種的抗體。因此，本發(fā)明所述的抗體還具有鼠、大鼠、兔、猴、山羊、或人源的可變區(qū)和屬于與產(chǎn)生抗體不同的物種的恒定區(qū)。在這個方面，可能采用哺乳動物的所有族和種屬，尤其是人、猴、大鼠和小鼠、豬、牛、馬、貓、犬、例如還有鳥。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體的每條重鏈和每條輕鏈的恒定區(qū)是人類恒定區(qū)。本發(fā)明這個優(yōu)選實(shí)施方式可降低抗體在人體內(nèi)的免疫原性從而改善其在對人的給藥治療期間的效力。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的恒定區(qū)是k型的。任何同種異型(allotype)都適宜于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例如Km(l) 、 Km(1、2) 、 Km(1、2、3)或Km(3)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的恒定區(qū)是A型的。
在本發(fā)明的特定方面，特別是本發(fā)明的抗體的每條重鏈和每條輕鏈的恒定區(qū)是人類恒定區(qū)時，抗體每條重鏈的恒定區(qū)是Y型的。根據(jù)這種變化，所述抗體的每條重鏈的恒定區(qū)可以是Yl型、Y2型、Y3型，這三個類型的恒定區(qū)具有配合人類補(bǔ)體的特殊特性，或甚至可以是Y4型。重鏈具有Y型恒定區(qū)的抗體被歸類為IgG。 G型免疫球蛋白(IgG)是由彼此通過二硫橋連接的2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成的異二聚體。在每條鏈的N末端位置由可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域(重排基因V-J編碼輕鏈的而V-D-J編碼重鏈)構(gòu)成，其對抗體針對的抗原是特異性的，在C末端位置，輕鏈?zhǔn)怯梢粋€CL結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的恒定區(qū)或重鏈?zhǔn)怯?個結(jié)構(gòu)域(CH1、 CH2和CH3)構(gòu)成的恒定區(qū)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域與重鏈和輕鏈的CH1和CL結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成Fab片段，該Fab片段可通過非常靈活的鉸鏈區(qū)與Fc區(qū)連接，使得每個Fab固定在其抗原靶點(diǎn)上，而介導(dǎo)抗體的效應(yīng)特性的Fc區(qū)保持對效應(yīng)分子(如Fc Y R和Clq受體)的易感性。由2個球形結(jié)構(gòu)域C y 2和C y 3構(gòu)成的Fc區(qū)在C y 2結(jié)構(gòu)域水平上被糖基化，2條鏈的每一條都存在連接于天冬酰胺297上的二分枝(biante皿a)的N-多糖。
抗體每條重鏈的恒定區(qū)優(yōu)選是Y 1型，因?yàn)檫@種抗體在最多數(shù)量的(人類)個體
12中表現(xiàn)出引發(fā)ADCC活性(抗體依賴的細(xì)胞毒性)的能力。在這個方面，任何同種異型都適 宜于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例如Glm(3) 、Glm(1、2、17) 、Glm(1、17)或Glm(1、3)。
可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來構(gòu)建本發(fā)明的嵌合抗體，具體 而言利用如在Morrison等 ， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ，81 :6851-55(1984)所述嵌合 抗體構(gòu)建技術(shù)，其中DNA重組技術(shù)用于以人免疫球蛋白的相應(yīng)區(qū)域置換源于非人哺乳動 物抗體的重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)。這種抗體及其制備方法也已記載在例如專利EP 173494，文獻(xiàn)Neuberger， M. S.等 ， Nature 1985Mar 21-27 ;314(6008) :268-70.，以及文 獻(xiàn)EP 125023中。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可普遍獲取的。例如，可利用每 條鏈的載體分別表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈，或?qū)⑺鼈冋系揭粋€載體中。
表達(dá)載體是核酸分子，該核酸分子中插入了編碼抗體每條重鏈或輕鏈的可變區(qū)的 核酸序列和/或優(yōu)選人類的編碼抗體每條重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的核酸序列，以便將所述表 達(dá)載體引入并保留在宿主中。這些外來核酸片段可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)因?yàn)樗哂羞M(jìn)行表 達(dá)的獨(dú)立序列(啟動子，多聚腺苷酸化序列)。載體可以是例如質(zhì)粒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒 或噬菌體，而宿主細(xì)胞可以是任何哺乳動物細(xì)胞，例如SP2/0、YB2/0、 IR983F、Namalwa人骨 髓瘤、PERC6、 CH0細(xì)胞系(特別是CH0-K-1、 CH0-Lec10、 CH0-Lecl、 CH0_Lecl3、 CHO Pro_5、 CH0 dhfr-) 、 Wil_2、 Jurkat、 Vero、 Molt_4、 C0S_7、293_HEK、 BHK、 K6H6、 NS0、 SP2/0_Agl4和 P3X63Ag8. 653。 為了構(gòu)建本發(fā)明的嵌合抗體的表達(dá)載體，可在PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增反應(yīng)期 間將合成的信號序列和適宜的限制性位點(diǎn)融合到可變區(qū)中。然后將所述可變區(qū)與抗體(特 別是人IgGl)的恒定區(qū)結(jié)合。從而利用兩個獨(dú)立載體(每條鏈一個)或單個載體，將由此 構(gòu)建的基因克隆到在啟動子(例如RSV啟動子)的控制下和多聚腺苷酸化位點(diǎn)的上游。所 述載體還提供本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的篩選基因，例如dhfr基因、新霉素抗性基因。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如與磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射等)通 過將重鏈表達(dá)載體的輕鏈表達(dá)載體或單個載體共轉(zhuǎn)染或單獨(dú)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞來制備本發(fā) 明的嵌合抗體。 以人源化抗體表示含有來自于非人抗體的CDRs區(qū)而抗體分子的其他部分來 自于一個(或多個)人類抗體的抗體?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的CDR移植方法 ("CDR移植")制備這種抗體(美國專利5， 225， 539， US6， 180， 370 ;Jones等.，Nature 321(6069) :522-5. (1986) ;Verhoeyen等.，Bioessays8(2) :74-8(1988) ;Riechmann 等 ， Nature 332 :323-7 (1988) ;Queen C.等.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (24): 10029-33(1989) ;Lewis A. P.和Crowe J. S. ， Gene 101(2) :297-302(1991) ;Daugherty BL等.，Nucleic Acids Res. 19(9) :2471—6(1991) ;Carter等 ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 :4285(1992) ;Singer等 ， J.Immunol. 150(7) :2844-57(1993) ;Presta等 ， J. Immunol. ， 151 :2623(1993))。對為制備人源化抗體要移植的人類可變結(jié)構(gòu)域的選擇對 于降低抗體免疫原性且不改變其對靶點(diǎn)親和力很重要。在人源化抗體的制備方法中，鼠抗 體的可變結(jié)構(gòu)域序列與已知人類可變區(qū)的序列文庫進(jìn)行比對并保留與人類可變序列最接 近的鼠序列作為人源化的FR區(qū)("框架")[Riechmann等.，Nature 332 :323-7(1988); Queen C.等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24) :10029-33(1989) ;Sims等.，J. Immunol.， 151:2296(1993)]。人FR區(qū)域的另一篩選方法是將每個鼠FR序列亞區(qū)(FR1、 FR2、 FR3和FR4)的序列和已知的人FR序列文庫進(jìn)行比對，例如為每個FR區(qū)選擇最接近人FR序列的 鼠序歹lj [美國專利2003/0040606 ;Singer等.，J. Immunol. 150(7) :2844-57(1993) ;Sato K.and al，Mol. Immunol. 31 (5) :371-81(1994) ;Leung S. 0.等.，Mol. Immunol. 32 (17-18): 1413-27 (1995)]。另一方式是使用了來自于人類抗體重鏈或輕鏈的特定亞族的共有序列的 特定FR區(qū)[Sato K.and al，Mol. Immunol. 31 (5) :371-81(1994)]。在大多數(shù)情況中通過消 除位于人FRs中的某些關(guān)鍵殘基以保留人源化抗體對其靶點(diǎn)的良好親和力來完成CDR移植 [Holmes M. A. and Foote J. ， J. Immunol. 158 (5) :2192-201 (1997)]。
本發(fā)明的人源化抗體優(yōu)選應(yīng)用于體外診斷方法，或體內(nèi)預(yù)防和/或治療方法。
本發(fā)明的嵌合或人源化抗體具有對人體有更佳耐受力的優(yōu)勢，且至少與起源抗體 一樣有效。在特定的有利方法中，所得的嵌合或人源化抗體具有相應(yīng)天然抗體兩倍的細(xì)胞 毒性。在更為有利的方法中，所得的嵌合或人源化抗體的細(xì)胞毒性比相應(yīng)天然抗體大10 倍、或甚至100倍或優(yōu)選大于500倍。 以人類抗體表示每個區(qū)域都來自于人類抗體的抗體。這種抗體可源于攜帶人類抗 體基因的轉(zhuǎn)基因鼠或源于人類細(xì)胞[Jakobovits等.，Curr OpinBiotechnol. Oct ;6(5): 561-6(1995) ;Lonberg N.禾口D. Huszar. Internal Review ofImmunology 13:65-93(1995); Tomizuka K.等.，Proc. Natl. Acad， Sci.USA97(2) :722-727(2000)]。 優(yōu)選通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明的人源化或人類嵌合 抗體。優(yōu)選通過例如選自SP2/0、YB2/0、IR983F、Namalwa人骨髓瘤、PERC6、CH0細(xì)胞系(特 別是CH0-K-1、 CH0-Lec10、 CH0-Lecl、 CH0_Lecl3、 CH0 Pro_5、 CH0 dhfr-) 、 Wil_2、 Jurkat、 Vero、 Molt-4、 C0S_7、293_HEK、 BHK、 K6H6、 NS0、 SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8. 653且不限于此 的分離細(xì)胞制備本發(fā)明的單克隆抗體。 也可通過轉(zhuǎn)基因動物的途徑制備本發(fā)明的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因是通過將外源DNA 引入多細(xì)胞生物體的基因組中并可傳遞至其后代的分子遺傳技術(shù)。傳遞至后代是在發(fā)育早 期將所述DNA穩(wěn)定整合到胚胎基因組中。 例如，本發(fā)明范圍內(nèi)可能采用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)之一是將裸露DNA顯微注射到受精哺 乳動物卵細(xì)胞的原核或胚胎干細(xì)胞中，在一定數(shù)量的情況下其會導(dǎo)致部分顯微注射的DNA 整合到宿主基因組中?？梢允褂闷渌夹g(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，特別是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的將外 源DNA引入活體細(xì)胞的技術(shù)，特別是電穿孔、通過磷酸鈣沉淀方式的轉(zhuǎn)染、通過經(jīng)修飾的脂 質(zhì)體或脂類(如lipofectamine⑧(IN VITR0GEN))的轉(zhuǎn)染。 優(yōu)選通過轉(zhuǎn)基因動物的乳制備本發(fā)明單克隆抗體。在這種方式中，編碼目的蛋白 的基因與在乳中特異性表達(dá)的基因調(diào)控元件(例如WAP基因的啟動子、乳清酸性蛋白)結(jié) 合。在顯微鏡下將制得的表達(dá)載體顯微注射到單細(xì)胞期的哺乳動物胚胎中。然后將胚胎轉(zhuǎn) 入雌性受體中。 例如，妊娠一個月后，在其基因組中整合了轉(zhuǎn)基因的第一代哺乳動物(F0)出生， 并通過耳活組織PCR分析對其進(jìn)行鑒定。它們將作為產(chǎn)生第二代轉(zhuǎn)基因哺乳動物的首建者 (founders)。根據(jù)它們在乳中產(chǎn)生目的蛋白的效率選擇首建者以用于產(chǎn)生第二代轉(zhuǎn)基因兔 (Fl)。 通過耳活組織的PCR分析鑒定Fl代。然后以非轉(zhuǎn)基因雄性的精子對性成熟的Fl 雌性受精。以機(jī)械手段收集乳并表征重組蛋白以便為大規(guī)模制備和發(fā)展純化策略(GLP、
14pre-GMP、GMP)選擇最佳株。 平行地，按照FDA和歐洲范例的推薦收集F1轉(zhuǎn)基因雄性的精子(主要精子庫 (Master Sperm Bank), MSB)并冷凍保存在液氮中。該精子將被用于非轉(zhuǎn)基因雌性的人工受 精以產(chǎn)生第二代(F2)。收集F2轉(zhuǎn)基因雄性的精子(工作精子庫(Working Sperm Bank), WSB)，并在15-20年內(nèi)用于產(chǎn)生F3轉(zhuǎn)基因雌性，該F3轉(zhuǎn)基因雌性將在乳中產(chǎn)生產(chǎn)業(yè)數(shù)量的 單克隆抗體。在例如專利EP 0527063中描述了這類技術(shù)。
Fcy受體 CD16也稱為III型Fcy受體(Fc YRIII)，是存在于許多免疫系統(tǒng)細(xì)胞中的受體。 CD32 (Fc y RII)和CD64 (Fc y RI)以及CD16是IgG抗體重鏈恒定片段(Fc)的特異性受體。 免疫復(fù)合物通過IgG的Fc與免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞中存在的這類CD16、CD32和CD64受體的結(jié) 合激活了所述效應(yīng)細(xì)胞，特別是激活免疫復(fù)合物吞噬作用。 本發(fā)明的效應(yīng)細(xì)胞在其細(xì)胞膜上表達(dá)3類Fc受體CD16、 CD32和CD64。
CD16受體傳統(tǒng)上稱為"低親和力受體"，基本上是在單核細(xì)胞亞群的PMNs(多形核 中性白細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)中構(gòu)成型表達(dá)。CD16涉及 了多重效應(yīng)功能，例如吞噬作用、免疫復(fù)合物或顆粒的調(diào)理作用、和ADCC活性。
本發(fā)明部件試劑盒的單克隆抗體具有對本發(fā)明效應(yīng)細(xì)胞中存在的Fc受體(尤其 是對CD16)表現(xiàn)出強(qiáng)親和力的Fc區(qū)。本發(fā)明描述了本發(fā)明的單克隆抗體的Fc區(qū)和部件試 劑盒的效應(yīng)細(xì)胞的CD16之間的協(xié)同作用。這種親和力使得在含抗體和效應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基 中添加人多價血漿IgG(外周血的重要組分)對所述單克隆抗體和所述效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn) 生的ADCC活性沒有或幾乎沒有影響。這是由于所述單克隆抗體的Fc區(qū)對CD16的親和力 大于生理?xiàng)l件中存在的人IgG的親和力。因此，在體內(nèi)不以血清IgG取代目的抗體，也不會 降低在體外可觀察到的ADCC活性。實(shí)際上，血漿和血清含有高濃度的多價免疫球蛋白(也 稱為多價血漿IgG或多克隆IgG或血清IgG)。所述部件試劑盒的單克隆抗體通過Fc受體 (CD16和CD64)誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的活化，其中CD16和CD64通過ADCC或吞噬作用導(dǎo)致細(xì)胞裂 解?，F(xiàn)在普遍公認(rèn)的是多價血漿IgG通過CD64抑制效應(yīng)細(xì)胞的裂解機(jī)制，后者被存在的多 價IgG所飽和。 本申請顯示了部件試劑盒中聯(lián)合的其Fc區(qū)比血漿部分分離的IgG具有對CD16更 強(qiáng)的親和力的單克隆抗體令人驚奇地誘發(fā)了ADCC活性，且在體外其不被添加的血漿IgG所 抑制，從而使在體內(nèi)保持治療活性變得可行。在體內(nèi)這種治療活性對應(yīng)著腫瘤細(xì)胞、被致病 劑感染的細(xì)胞或產(chǎn)生自身抗體的細(xì)胞的裂解。 因此，有利地，在添加人血漿IgG的情況下單克隆抗體不會被多價IgG所取代。
由于抗體Fc區(qū)對CD16的強(qiáng)親和力，所述單克隆抗體會結(jié)合到所述效應(yīng)細(xì)胞上，甚 至在高血清濃度下這種結(jié)合也不會被人多價血漿IgG所取代。 因此，本發(fā)明的部件試劑盒甚至以低濃度的單克隆抗體也能實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的最佳裂 解。 有利地，所述部件試劑盒的單克隆抗體的濃度小于在傳統(tǒng)單一療法中用于治療惡 性病狀、自身免疫性疾病或傳染病的具有相同特異性的抗體的濃度。 在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體的Fc區(qū)與CD16的結(jié)合常數(shù)至 少是2. 106M—、
15
有禾U地是按照文獻(xiàn)Maenaka等(Katsumi Maena， P. Anton van der Me潔， David I. Stuart， E. Yvonne Jones，禾口 Peter Sondermann ;The Human Low AffinityFcy receptors IIa，Iib，and III bind IgG with Fast Kinetics and DistinctThermodynamic Properties. J. Biol. Chem. ， Vol. 276， Issue 48,44898-44904， November 30,2001)所述的
方法來測定本發(fā)明抗體的結(jié)合常數(shù)。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述部件試劑盒中的單克隆抗體的濃度優(yōu)選小于 lmg/2億細(xì)胞。 考慮在病狀中或注射后使用本發(fā)明上述的部件試劑盒。效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比值不 需要太高，即小于10、或甚至1或0. 1。 在本發(fā)明的特定方面，所述單克隆抗體對所述效應(yīng)細(xì)胞CD16的結(jié)合親和力為至 少2. 106M—、 例如，可通過專利申請W0 01/77181中描述的方法制備本發(fā)明的單克隆抗體。這
種用于制備能激活表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞的單克隆抗體的方法包括以下步驟 a)純化從多種克隆中獲取的單克隆抗體，所述多種克隆來自于選自雜交瘤(特別
是異源雜交瘤)和通過含有編碼所述抗體的基因的載體所轉(zhuǎn)染的動物或人細(xì)胞系的細(xì)胞
系； b)將步驟a)中獲得的每種抗體添加到不同的反應(yīng)混合物中，該反應(yīng)混合物包含 i.所述抗體的靶細(xì)胞， ii.含表達(dá)FcyRIII的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞， iii.多價IgG， c)測定靶細(xì)胞的裂解百分比并篩選可激活引起靶細(xì)胞明顯裂解的效應(yīng)細(xì)胞的單 克隆抗體(依靠FcyRIII的ADCC活性)。 對于每種抗原的特異性，本發(fā)明的單克隆抗體實(shí)際上是含有單克隆抗體的組合 物，它們在一級結(jié)構(gòu)水平上都是相同的因?yàn)樗鼈儊碜杂谙嗤募?xì)胞克隆。但是，單克隆抗 體組合物的所有抗體不會表現(xiàn)出相同的多糖譜。人和動物抗體在其每條重鏈的CH2域上 具有N-連接的寡糖。對于G免疫球蛋白，該寡糖的結(jié)合位點(diǎn)是天冬酰胺297 (Asn297，根據(jù) Kabat)。該天冬酰胺殘基也被稱為"FcY糖基化"。 與Asn297結(jié)合的寡糖鏈的末端被稱為"還原末端"，而相反末端被稱為"非還原末
丄山"順。 在IgG抗體的Fc區(qū)中，有兩個Fc Y糖基化位點(diǎn)；因此每個抗體分子可結(jié)合兩條寡 糖鏈。 因此在單克隆抗體組合物中，根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞系所賦予的糖基化，所述寡糖鏈具
有不同的結(jié)構(gòu)。但是，這些鏈具有共同的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)
《與Asn297結(jié)合
GlcNAc
像甘露糖
16
這種所有單克隆抗體共有的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步包含以下糖N-乙酰葡糖胺
(GlcNAc)、巖藻糖(fuc)和半乳糖(gal)。 N_寡糖的主要糖基化形式如下所示
□
o、
\一/
承 甲
GOF Gl GIF
:甘露糖參半乳糖 :巖藻糖
因?yàn)槊織l寡糖鏈可包含一個或多個這些糖，從而其本身以上文圖示的GO、 GOF、 Gl 或GIF形式而存在，在單克隆抗體組合物中有許多寡糖的組合，其為單克隆抗體組合物帶 來每種糖的一定比例，在抗體組合物彼此之間該比例是不同的。因此，源于相同細(xì)胞株的集 落可產(chǎn)生其中聚糖組合物可以變化的抗體組合物。 因此，在應(yīng)用中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)巖藻糖比例小于65%的單克隆抗體組合物對 CD16具有高親和力。具體而言，這種類型的單克隆抗體組合物的區(qū)域?qū)D16的親和力高于 多價IgG對CD16的親和力。此外，所述組合物的單克隆抗體不被血清Ig所取代。
例如在專利申請WO 01/77181中給出了制備這種單克隆抗體組合物的方法。在本 發(fā)明的有利實(shí)施方式中，由具有在還原末端的N-乙酰葡糖胺上添加巖藻糖的低酶活性的 細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體組合物，此種酶優(yōu)選巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可以使酶(例如巖藻糖苷酶)對單克隆抗體組合物 發(fā)生作用，以便獲得含有所述比例巖藻糖的單克隆抗體組合物。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，在YB2/0(ATCC CRL-1662)中產(chǎn)生所述單克隆抗 體組合物。 以優(yōu)選方式，本發(fā)明部件試劑盒的單克隆抗體是針對5C5抗原(由腎癌細(xì)胞表 達(dá)的腫瘤抗原)、BCR(B細(xì)胞受體)、獨(dú)特型(例如抗FVIII抑制劑抗體的獨(dú)特型)、TCR(T 細(xì)胞受體)、CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD45、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD66 (a、 b、 c、 d) 、 CD74、 CD80、 CD86、 CD126、 CD138、 CD154、 MUCl(黏蛋白1) 、 MUC2(黏蛋白2) 、 MUC3(黏蛋白3) 、 MUC4(黏蛋白 4) 、MUC16 (黏蛋白16) 、HM1. 24 (在多發(fā)骨髓瘤中過度表達(dá)的漿細(xì)胞特異性抗原)、生腱蛋白 (細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白)、GGT(Y谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、EGFR(內(nèi)皮生長 因子受體)、CEA (癌胚抗原)、CSAp (結(jié)腸特異性抗原p) 、 ILGF (胰島素樣生長因子)、胎盤生 長因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、 IL-6、蛋白S100 (鈣結(jié)合蛋白的多基因家族)、MART-1 (與 黑色素瘤相關(guān)的腫瘤分化抗原)、TRP-1 (酪氨酸酶相關(guān)蛋白1) 、 TRP-2 (酪氨酸酶相關(guān)蛋白 2)、gpl00(100kDa糖蛋白)、淀粉樣蛋白、獼猴D抗原、I類和II類MHC分子(如HLA-DR)、 突變基因(特別是致癌基因或腫瘤抑制基因)表達(dá)形成的抗原、源于某些腫瘤表達(dá)的致癌 基因病毒的抗原、在某些腫瘤中過度表達(dá)和某些正常組織輕微表達(dá)的普通抗原例如苗勒管 激素的II型受體、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、由感染的細(xì)胞在膜上自身或非自身表達(dá)
GO
釃GlcNAc或暴露的分子(如磷脂酰絲氨酸)、和由致病劑(細(xì)菌毒素、細(xì)菌或寄生蟲壁的蛋白復(fù)合物、 病毒囊膜糖蛋白(例如來自HIV病毒、HBV、HCV和RSV等))表達(dá)或分泌的蛋白，但不限于 此。 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體針對CD20 。 CD20抗原是存在于成熟B淋巴細(xì)胞表面的分子量為35-37kDa的疏水跨膜蛋白 (Valentine等 1987， Proc Natl Acad Sci U. S. A. 84(22) :8085-9 ;Valentine等 1989， J. Biol. Chem. 264(19) :11282-11287)。它是在B淋巴細(xì)胞從早期前B階段向漿細(xì)胞分化的 發(fā)育期間表達(dá)的，在漿細(xì)胞階段此種表達(dá)消失。CD20抗原存在于正常B淋巴細(xì)胞和惡性B 細(xì)胞中。更具體而言，CD20抗原在大部分B表型(phenotype)淋巴瘤(80%的淋巴瘤)中 表達(dá)它在例如多于90X的淋巴細(xì)胞B非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多于95X的B型慢性淋巴 樣白血病(LLC-B)中表達(dá)。CD20抗原在造血干細(xì)胞或槳細(xì)胞中不表達(dá)。
CD20的功能仍未完全探明，盡管其可作為鈣通道并干涉B淋巴細(xì)胞分化 (Golay等 1985， J Immunol. ;135(6) :3795-801)和增殖(Tedder等 1986， Eur J Immunol. 1986Aug ;16(8) :881-7)第一步的調(diào)控。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗CD20抗體的組合物是由YB2/0產(chǎn)生的且?guī)r藻糖比 例小于65%。 在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，這種抗體及其制備方法在專利申請W02006/064121 中有描述。 有利地，這種抗體的重鏈的氨基酸序列是如SEQ ID NO : 1所示的序列。 有利地，這種抗體的輕鏈的氨基酸序列是如SEQ ID N0:2或SEQ IDNO :3所示的序列。 簡言之，根據(jù)專利申請W02006/064121的教導(dǎo)，可通過由能表達(dá)上文所述輕鏈和 重鏈的載體所轉(zhuǎn)染的YB2/0細(xì)胞獲得這種抗體。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗CD20的單克隆抗體組合物的巖藻糖比例小于 65%、優(yōu)選包含在20-40%之間，或巖藻糖/半乳糖比值小于0. 6。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述部件試劑盒的單克隆抗體是由以登錄號CNCM 1-3314保藏在CNCM的R509克隆所產(chǎn)生的。 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述部件試劑盒的單克隆抗體是由以登錄號 CNCM 1-3529保藏在CNCM的R603克隆所產(chǎn)生的。 本申請顯示了本發(fā)明的部件試劑盒對治療LLC-B是有效的，因?yàn)長LC-B患者的惡 性細(xì)胞先體外后體內(nèi)被裂解，甚至在E : T比值小于或等于10，或甚至5或甚至2，在低濃 度抗體下，包括存在人血清時。 從而本發(fā)明的部件試劑盒可實(shí)現(xiàn)由抗體可變區(qū)識別的靶的最佳裂解，因?yàn)樾?yīng)細(xì) 胞與抗體Fc區(qū)之間的物理相互作用(結(jié)合)，其強(qiáng)到足以不被多價IgG取代。
有利地，用于治療LLC-B的本發(fā)明的部件試劑盒中所含的單克隆抗體的濃度小于 375mg/m 。 因?yàn)槠涞投拘?、特異性和降低劑量的?yōu)勢，可用含有抗CD20抗體的部件試劑盒給 藥而用于治療以下病狀CD20陽性B淋巴細(xì)胞的淋巴組織增生綜合征的惡性病狀(例如B 型NHL)、或急性或慢性B淋巴白血病、自身免疫性疾病和/或炎癥疾病(如器官移植排斥、
18或移植物抗宿主病、類風(fēng)濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、傳播性紅斑狼瘡、硬皮病、原發(fā)性干燥綜合征 (或古熱羅_舍格倫綜合征)、自身免疫多發(fā)性神經(jīng)病(例如多發(fā)性硬化癥)、I型糖尿病、 自身免疫性肝炎、強(qiáng)直性脊椎關(guān)節(jié)炎、賴特綜合征、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、克羅恩病、橋本氏 甲狀腺炎、愛迪生病、自身免疫性肝炎、巴澤多病、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎(如與ANCA(抗中 性白細(xì)胞胞質(zhì)抗體)相關(guān)的系統(tǒng)性脈管炎)、自身免疫性血球減少和其他成人和兒童血液 病并發(fā)癥(例如急性或慢性自身免疫性血小板減少)、自身免疫溶血性貧血、新生兒溶血病 (HDN)、冷凝集素疾病、血小板減少血栓紫癜和獲得性自身免疫性血友??；古德帕斯丘綜合 征、膜外腎病、自身免疫大皰皮膚病、重癥肌無力、混合性冷沉球蛋白血癥、銀屑病、幼年型 慢性關(guān)節(jié)炎、炎癥性肌炎、皮肌炎和兒童系統(tǒng)性自身免疫病(包括抗磷脂綜合征)，但不限 于此。 有利地，本發(fā)明的部件試劑盒是可注射的溶液。這種可注射的溶液優(yōu)選是以局部 或全身性可注射溶液的形式。在特定實(shí)施方式中，對患者給藥6次。 一種給藥是一周內(nèi)每 天或每兩天給藥一次，然后一月或兩月內(nèi)一周給藥一次， 一種給藥是每月給藥三次，治療可 重復(fù)幾次。 在補(bǔ)充實(shí)施方式中，按每次注射104_109效應(yīng)細(xì)胞的劑量給藥所述效應(yīng)細(xì)胞。
在另一補(bǔ)充實(shí)施方式中，按每次注射l-500mg抗體的劑量給藥本發(fā)明的抗體。
在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方式中，所述效應(yīng)細(xì)胞重復(fù)給藥高達(dá)IO次，每次給藥之 間的時間間隔在2天-12個月之間。在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方式中，所述單克隆抗體重 復(fù)給藥高達(dá)10次，每次給藥之間的時間間隔在2天-12個月之間。在本發(fā)明的另一實(shí)施方 式中，所述單克隆抗體和所述效應(yīng)細(xì)胞被同時給藥。 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述單克隆抗體和所述效應(yīng)細(xì)胞被依次給藥，所述 單克隆抗體的給藥在所述效應(yīng)細(xì)胞之前。 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述單克隆抗體和所述效應(yīng)細(xì)胞被依次給藥，所述 單克隆抗體的給藥在所述效應(yīng)細(xì)胞之后。 本發(fā)明的另一目的是含有本發(fā)明的部件試劑盒的藥物組合物。 本發(fā)明的另一目的涉及本發(fā)明的部件試劑盒在制備治療惡性病狀、自身免疫性疾
病和傳染病的藥物中的應(yīng)用。 這種藥物或藥物組合物優(yōu)選含有賦形劑和/或藥物可接受載體。
所述賦形劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與藥物用途相容的任何溶液，如鹽的、 生理的、等滲的、緩沖的溶液等，以及懸浮液、凝膠、粉末等。本發(fā)明的組合物還可含有選自 分散劑、助溶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑等的一種或多種試劑或載體。此外，本發(fā)明的 組合物可含有其它試劑或活性成分。 本發(fā)明的另一 目的是本發(fā)明的部件試劑盒在藥物制備中的應(yīng)用。 本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明的部件試劑盒在制備治療惡性病狀的藥物中的應(yīng)用。 有利地，這種惡性病狀是選自固體腫瘤和惡性血液病。固體腫瘤選自黑色素瘤、
癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚癌。所述癌是選自由腎癌、乳腺癌、口腔癌、肺癌、胃腸道癌、卵
巢癌、前列腺癌、子宮癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌、皮膚癌和睪丸癌所組成的組中。 惡性血液病選自淋巴組織增生、骨髓組織增生、骨髓增生異常綜合征和急性骨髓
樣白血病(例如B型NHL)、急性或慢性B淋巴白血病、伯基特淋巴瘤，毛狀白細(xì)胞白血病、急性或慢性骨髓樣白血病、T淋巴瘤和白血病、霍奇金淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血病和 多發(fā)性骨髓瘤，但不限于此。 本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明的部件試劑盒在制備預(yù)期治療自身免疫性疾病和/ 或原發(fā)或繼發(fā)炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病具有器官特異性或是全身性的，并與致 病的自身抗體相關(guān)或不相關(guān)，這些疾病選自器官移植排斥、或移植物抗宿主病、類風(fēng)濕性多 發(fā)性關(guān)節(jié)炎、傳播性紅斑狼瘡、硬皮病、原發(fā)性干燥綜合征(或古熱羅_舍格倫綜合征)、自 身免疫多發(fā)性神經(jīng)病(例如多發(fā)性硬化癥)、1型糖尿病、自身免疫性肝炎、強(qiáng)直性脊椎關(guān)節(jié) 炎、賴特綜合征、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、克羅恩病、橋本氏甲狀腺炎、愛迪生病、自身免疫性肝 炎、巴澤多病、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎(如與ANCA(抗中性白細(xì)胞胞質(zhì)抗體)相關(guān)的系統(tǒng)性 脈管炎)、自身免疫性血球減少和其他成人和兒童血液病并發(fā)癥(例如急性或慢性自身免 疫性血小板減少)、自身免疫溶血性貧血、新生兒溶血病(HDN)、冷凝集素疾病、血小板減少 血栓紫癜和獲得性自身免疫血友??；古德帕斯丘綜合征、膜外腎病、自身免疫大皰皮膚病、 重癥肌無力、混合性冷沉球蛋白血癥、銀屑病、幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、炎癥性肌炎、皮肌炎和兒 童系統(tǒng)性自身免疫病(包括抗磷脂綜合征)，但不限于此。 本發(fā)明的另一 目的是本發(fā)明部件試劑盒在制備治療傳染病的藥物中的應(yīng)用。
有利地，所述傳染病選自由病毒(人類免疫缺陷病毒或HIV、乙型或丙型肝炎病毒 (HBV、 HCV)、非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒或EBV、巨細(xì)胞病毒或CMV、腸病毒、甲型、乙型和丙型流感 病毒引起的流感、多核呼吸病毒或SRV、或HTLV)、細(xì)菌和/或它們的毒素(破傷風(fēng)、白喉、肺 炎雙球菌、腦膜炎球菌、葡萄球菌(包含甲氧西林抗性形式)、克雷伯氏菌、志賀氏菌、假單 胞菌、腸道菌或包括醫(yī)源性疾病在內(nèi)的抗生素抗性病狀)、寄生蟲(瘧疾、利什曼蟲病、錐蟲 病)誘發(fā)的疾病；以及新出現(xiàn)的疾病，例如切昆汞亞熱、禽流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒 或SARS、引起出血性發(fā)熱(如埃博拉或登革熱)的病毒或西尼羅病毒；和與生物恐怖主義 相關(guān)的那些，如炭疽、食物中毒、瘟疫、天花和痘病毒、兔熱病、出血性發(fā)熱劑、普魯斯病、葡 萄球菌B腸毒素、白喉毒素或病毒性腦炎，但不限于此。 將在以下實(shí)施例中描述本發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢，其應(yīng)該理解為示例性的并不限 制本發(fā)明的范圍。


圖1 :通過競爭試驗(yàn)研究抗D R297 EMABling抗體和AD1抗體與巨噬細(xì)胞 CD16(Fc yRIII受體)的結(jié)合。 圖2 :在多種濃度的多克隆免疫球蛋白(IVIg)存在下，巨噬細(xì)胞誘發(fā)的EMABling R297抗體和AD1抗體的ADCC活性。 圖3 :在多種濃度的免疫球蛋白(IVIg)和6. 25ii g/ml濃度的抗CD163G8抗體存 在下，巨噬細(xì)胞誘發(fā)的EMABling R297抗體和AD1抗體的ADCC活性 圖4 :在多種濃度的免疫球蛋白(IVIg)存在下，由EMABling R297抗體和AD1抗 體誘導(dǎo)的CD16+巨噬細(xì)胞對Rh+紅細(xì)胞的吞噬作用
具體實(shí)施方式

實(shí)施例
實(shí)施例1 :單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化 通過Ficol和Percol密度梯度的分級從外周血中分離單核細(xì)胞，然后在含10% SVF并添加了 M-SCF(單核細(xì)胞集落克隆因子)(50ng/ml)的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。7天 之后，獲得的巨噬細(xì)胞是CD14+， CD16+， CD32+， CD64+， CDllb+， CDla-， CD80-， CD83-表型。
因此，M-SCF分化可使巨噬細(xì)胞表面表達(dá)CD16。
實(shí)施例2 :抗D抗體與巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD16的相互作用 將抗D R297抗體(也稱為"EMABling R297")的結(jié)合與AD1抗體的結(jié)合進(jìn)行比 較。在文獻(xiàn)WO 01/77181中描述了抗D R297抗體，并且該抗體是按此文獻(xiàn)描述的方法所產(chǎn) 生的。該抗體是在YB2/0細(xì)胞(ATCC CRL-1662)中產(chǎn)生的。 將R297抗體和巨噬細(xì)胞CD16的結(jié)合與AD1抗體(如文獻(xiàn)WO 01/77181中描述的， 由異源骨髓瘤表達(dá)的)和巨噬細(xì)胞CD16的結(jié)合進(jìn)行比較。 抗CD16抗體(產(chǎn)生者克隆3G8)的取代試驗(yàn)可測量單克隆抗體與這些巨噬細(xì)胞的 CD16受體的結(jié)合，無關(guān)于其特異性。 在多種濃度(0-83 ii g/ml)的抗D抗體(R297或AD1)和確定濃度的偶聯(lián)熒光染料 的抗CD163G8抗體(3G8-PE)中溫育純化的巨噬細(xì)胞。 洗滌之后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法評估抗體3G8-PE與巨噬細(xì)胞CD16受體的結(jié)合。能 夠?qū)⒆陨斫Y(jié)合到CD16上的抗體進(jìn)入了與3G8抗體結(jié)合的競爭中，結(jié)果，導(dǎo)致了 MFI (平均熒 光強(qiáng)度)的降低。結(jié)果以熒光平均值(MFI)表示，其是待估算抗體數(shù)量的函數(shù)。
圖1顯示了與AD1抗體相比R297抗體與巨噬細(xì)胞CD16的結(jié)合非常牢固。
在平穩(wěn)狀態(tài)下，所述EMABling抗體誘導(dǎo)的取代比AD1抗體大至少6倍。
實(shí)施例3 :抗CD20EMAB6和EMAB603抗體與巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD16的相互作用
將抗CD20EMAB603抗體(由以編號1-3529保藏在CNCM的R603克隆產(chǎn)生)和EMAB6 抗體(由以編號1-3314保藏在CNCM的R509克隆產(chǎn)生)和巨噬細(xì)胞CD16的結(jié)合與利妥昔 單抗和巨噬細(xì)胞CD16的結(jié)合進(jìn)行比較。按專利申請W02006/064121中特別是26-33頁描 述的方法產(chǎn)生抗CD20EMAB6和EMAB603抗體。此外，產(chǎn)生這種抗體的克隆可在CNCM分別按 登錄號CNCM 1-3314和CNCM 1-3529獲取。 抗CD16抗體(產(chǎn)生者克隆3G8)的取代試驗(yàn)可測量單克隆抗體與CD16受體的結(jié) 合，無關(guān)于其特異性。在多種濃度(0-83 ii g/ml)的抗CD20抗體(EMAB6、 EMAB603或利妥昔單抗)和確
定濃度的偶聯(lián)熒光染料的抗CD163G8抗體(3G8-PE)中溫育巨噬細(xì)胞。 洗滌之后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法評估抗體3G8PE與巨噬細(xì)胞CD 16受體的結(jié)合。能
夠?qū)⒆陨斫Y(jié)合到CD16上的抗體進(jìn)入了與3G8抗體結(jié)合的競爭中，結(jié)果導(dǎo)致了 MFI (平均熒
光強(qiáng)度)的降低。結(jié)果以熒光平均值(MFI)表示，其是待估算抗體數(shù)量的函數(shù)。 利用PRISM統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算了 Imax值(3G8結(jié)合的最大抑制)和IC50值(誘
導(dǎo)50% Imax的3G8結(jié)合抑制所需要的抗CD20抗體的濃度)。 結(jié)果EMABling R603和EMAB6抗體與巨噬細(xì)胞CD16的相互作用比以利妥昔單抗 所獲得的相互作用大得多。 因?yàn)樵撛囼?yàn)是在沒有抗原靶點(diǎn)的存在下進(jìn)行的，因此本發(fā)明的抗CD20抗體具有 與巨噬細(xì)胞CD16牢固結(jié)合的能力。
實(shí)施例4 :抗D/Rh+紅細(xì)胞/巨噬細(xì)胞ADCC活性。多價IVIg(TegelinJ)的作用。
通過ADCC技術(shù)研究了抗D抗體的細(xì)胞毒性能力。在多種濃度的多價免疫球蛋白 (IVIg) (Tegeline⑧)存在下將抗D抗體、巨噬細(xì)胞(在M-CSF中分化的單核細(xì)胞)和獼猴 D+紅細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比值接近2/1)在37t:溫育16h。然后通過比色法定量在上 清液中由裂解的紅細(xì)胞所釋放的血紅蛋白的量，來測量由所述抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性。 以裂解百分比表示特異性裂解結(jié)果。 圖2的結(jié)果表明存在巨噬細(xì)胞時，在高濃度的IVIg存在下EMABlingR297抗體具
有強(qiáng)的持續(xù)ADCC活性，相反地AD1抗體在不存在IVIg時單獨(dú)誘導(dǎo)了 ADCC引起的裂解。 因此，沒有多價免疫球蛋白時，兩個抗D抗體(EMABling R297和AD1)達(dá)到29%的
ADCC活性。相反地，在濃度為5mg/ml的多價免疫球蛋白下，EMABling抗體表現(xiàn)出至少20
倍的更高的活性(23X裂解相對于AD1的1% )。在更高濃度的多價免疫球蛋白(25mg/ml)
下這種優(yōu)勢仍存在，EMABling和AD1抗體相應(yīng)的裂解百分比是16和1%。 實(shí)施例5 :抗D/Rh+紅細(xì)胞/巨噬細(xì)胞ADCC活性。多價1￥18(丁6861^16@)的作用。 按實(shí)施例4所述的相同方案，還研究了存在Raji細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(在M-CSF中
分化的單核細(xì)胞)時抗CD20的ADCC活性。在巨噬細(xì)胞、Raji細(xì)胞和多種濃度的多價
IVIg (丁6§^116@)存在下溫育抗CD20抗體(由R603克隆或利妥昔單抗產(chǎn)生的)。37。C溫
育16h之后，通過比色法定量在上清液中由Raji細(xì)胞釋放的胞內(nèi)LDH(乳酸脫氫酶)的量，
來測量由抗體誘導(dǎo)的ADCC活性。以裂解百分比表示特異性裂解結(jié)果。結(jié)果表明在表達(dá)CD16的巨噬細(xì)胞和Tegeline⑧的存在下，抗CD20R603抗體的
ADCC活性比利妥昔單抗誘導(dǎo)的ADCC活性至少大2倍。這種ADCC活性取決于由巨噬細(xì)胞表
達(dá)的CD16，例如由抗CD163G8的抑制子效應(yīng)所示。 實(shí)施例6 :抗D/Rh+紅細(xì)胞/巨噬細(xì)胞ADCC活性。 存在IVIg時CD16的突出性 存在最高濃度的試驗(yàn)IVIg時，抗CD16抗體、3G8的添加抑制了由EMABling抗體誘 導(dǎo)的ADCC，這表明誘導(dǎo)的裂解取決于巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD16(圖3)。 實(shí)施例7 :存在IVIg時由EMABling R297抗體誘導(dǎo)的CD16+巨噬細(xì)胞對獼猴+紅 細(xì)胞的吞噬作用。 通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究了抗D R297抗體誘導(dǎo)CD16+巨噬細(xì)胞對獼猴+紅細(xì)胞 的吞噬作用的能力。在多種濃度的多價IVIg(Tegeline⑧)存在下，將抗D抗體、由PKH67 標(biāo)記的巨噬細(xì)胞(在M-CSF中分化的單核細(xì)胞)和由PKH26標(biāo)記的獼猴+紅細(xì)胞(效應(yīng)細(xì) 胞/靶細(xì)胞比值是5/1)在4。C和37。C溫育3h。 結(jié)果對應(yīng)PKH67/PKH26雙標(biāo)記的百分比，即吞噬了至少一個紅細(xì)胞。
結(jié)果在4t:，在細(xì)胞計(jì)數(shù)法中巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞出現(xiàn)在不同窗口中，每個都以特 定熒光染料標(biāo)記。吞噬百分比非常低，沒有IVIg時達(dá)到4X，存在IVIg時是l-2X。 fC的 這些值可按公式系統(tǒng)地推算出37t:的吞噬百分比。 在37°C ，對于兩個試驗(yàn)抗體(R297EMABling和AD1)，在沒有IVIg時PKH67/PKH26 雙標(biāo)記的百分比增加。存在IVIg時，只有EMABling抗體具有吞噬Rh+紅細(xì)胞的能力，而 AD1抗體則相反。因此，在0、1或2mg/ml的IVIg下，吞噬百分比保持在15_20%之間，顯示了添加IVIg并不抑制由EMABling抗體誘導(dǎo)的吞噬作用。在lmg/ml的濃度下，EMABling抗體比AD1抗體至少大5倍。濃度大于2mg/ml時，
EMABling抗體的吞噬百分比是16.9X，而AD1抗體的不明顯(0值)。 實(shí)施例8 :存在IVIg時由R603抗體誘導(dǎo)的CD16+巨噬細(xì)胞對獼猴+紅細(xì)胞的吞
噬作用 也研究了存在IVIg時由R603抗體誘導(dǎo)的CD16巨噬細(xì)胞對CD20Raji細(xì)胞的吞噬 作用。 通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究了抗CD20抗體誘導(dǎo)CD16+巨噬細(xì)胞對Raji細(xì)胞的吞噬 作用的能力。在多種濃度的多價IVIg(Tegeline⑧)存在下，將抗CD20抗體、由PKH67標(biāo)記 的巨噬細(xì)胞(在M-CSF中分化的單核細(xì)胞)和由PKH26標(biāo)記的Raji細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞/靶 細(xì)胞比值是5/1、 10/1和20/1)在4。C和37。C溫育3h。 結(jié)果對應(yīng)PKH67/PKH26雙標(biāo)記的百分比，即吞噬了至少一個Raji細(xì)胞。
結(jié)果 在4t:，在細(xì)胞計(jì)數(shù)法中巨噬細(xì)胞和Raji細(xì)胞出現(xiàn)在不同窗口中，每個都以特定 熒光染料標(biāo)記。吞噬百分比非常低，沒有或有IVIg時均小于5X。 4t:的這些值可按公式系 統(tǒng)地推算出37t:的吞噬百分比。 在37。C，對于兩個試驗(yàn)抗體(抗CD20R603和利妥昔單抗)，在沒有IVIg時PKH67/ PKH26雙標(biāo)記的百分比增加。 存在IVIg時，只有EMABling抗體具有比利妥昔單抗大2倍、4倍、或甚至10倍的 吞噬Raji細(xì)胞的能力。因此，在0、1或2mg/ml的IVIg存在下，吞噬百分比總保持在大于 利妥昔單抗所誘導(dǎo)的吞噬百分比，顯示了存在IVIg時EMABling抗體誘導(dǎo)0016+巨噬細(xì)胞 的吞噬作用。
權(quán)利要求
一種治療惡性病狀、自身免疫性疾病或傳染病的部件試劑盒，該部件試劑盒包括表面表達(dá)FcγRIII受體(CD16)的效應(yīng)細(xì)胞，和單克隆抗體，其中所述單克隆抗體的Fc區(qū)對CD16的親和力大于多克隆免疫球蛋白的Fc區(qū)對CD16的親和力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的部件試劑盒，其中，所述表面表達(dá)FcYRIII受體(CD16)的效 應(yīng)細(xì)胞是表面表達(dá)FcYRIII受體(CD16)的單核細(xì)胞、或由單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生 的表面表達(dá)FcyRIII受體(CD16)的細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的部件試劑盒，其中，所述由單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生 的表面表達(dá)CD16的細(xì)胞選自表達(dá)CD16的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK)、樹突狀 細(xì)胞、和所有外周血單核細(xì)胞(或PBMC)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的部件試劑盒，其中，所述由單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生的 表面表達(dá)CD16的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，由于所述單克隆抗體的 Fc區(qū)對CD16的所述親和力，所述單克隆抗體不會被多克隆免疫球蛋白所取代，特別是人血 清中的那些多克隆免疫球蛋白。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，所述單克隆抗體與所述 由單核細(xì)胞或單核細(xì)胞前體衍生的細(xì)胞的CD16以大于2. 106M—1的親和力結(jié)合。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，所述單克隆抗體是以單 克隆抗體組合物的形式產(chǎn)生的，在該單克隆抗體組合物中的每種抗體具有連接在FcY糖 基化位點(diǎn)(根據(jù)Kabat的天冬酰胺297)上的N連接的糖鏈，其中在所述組合物的所有抗體 的所述糖基化位點(diǎn)上的所有N連接的糖鏈中，巖藻糖的比例小于65X。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，所述單克隆抗體針對的 抗原選自抗原5C5 (由腎癌細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原)、B細(xì)胞受體、獨(dú)特型(例如抗FVIII抑 制劑抗體的獨(dú)特型)、T細(xì)胞受體、CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD45、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD66a、 CD66b、 CD66c、CD66d、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、CD154、黏蛋白1、黏蛋白2、黏蛋白3、黏蛋白 4、黏蛋白16、HM1.24(在多發(fā)骨髓瘤中過度表達(dá)的漿細(xì)胞特異性抗原)、生腱蛋白(細(xì)胞外 基質(zhì)的蛋白)、Y谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮生長因子受體、癌胚抗原、結(jié)腸特 異性抗原P、胰島素樣生長因子、胎盤生長因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、S100蛋白(鈣 結(jié)合蛋白的多基因家族)、MART-1 (與黑色素瘤相關(guān)的腫瘤分化抗原)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白 1、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2、100kDa糖蛋白、淀粉樣蛋白、獼猴D抗原、I類和II類MHC分子(如 HLA-DR)、突變基因(特別是致癌基因或腫瘤抑制基因)表達(dá)形成的抗原、源于某些已確定 腫瘤表達(dá)的致癌基因病毒的抗原、在某些腫瘤中過度表達(dá)和某些正常組織輕微表達(dá)的普通 抗原(如苗勒管激素的II型受體)、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、由感染的細(xì)胞在膜上自 身或非自身表達(dá)或暴露的分子(如磷脂酰絲氨酸)、和由致病體表達(dá)或分泌的蛋白(細(xì)菌毒 素、細(xì)菌或寄生蟲壁的蛋白復(fù)合物，例如HIV病毒、HBV、HCV和RSV的病毒囊膜糖蛋白)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的部件試劑盒，其中，所述單克隆抗體針對CD20。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的部件試劑盒，其中，所述抗CD20抗體是由登錄號為1-3314 的保藏在CNCM的細(xì)胞株R509、或由登錄號為1-3529的保藏在CNCM的細(xì)胞株R603產(chǎn)生的。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，所述部件試劑盒同時地、依次地或單獨(dú)地用于治療中。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，所述表面表達(dá)CD16的 效應(yīng)細(xì)胞對所述抗體的靶細(xì)胞具有細(xì)胞毒性活性，所述抗體與CD16的相互作用促進(jìn)該細(xì) 胞毒性活性。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒，其中，在表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì) 胞的存在下，所述單克隆抗體通過ADCC活性或所述抗體的靶細(xì)胞的吞噬作用而誘導(dǎo)細(xì)胞 毒性。
14. 一種藥物組合物，該藥物組合物包括權(quán)利要求1-13中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑 盒，和藥物可接受的賦形劑。
15. 權(quán)利要求1-13中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒在藥物制備中的應(yīng)用。
16. 權(quán)利要求1-13中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒在制備治療惡性病狀的藥物中的 應(yīng)用。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的部件試劑盒的應(yīng)用，所述藥物用于治療選自固體腫瘤和惡 性血液病的惡性病狀。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的部件試劑盒的應(yīng)用，其中，所述固體腫瘤選自黑色素瘤、 癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚癌。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的部件試劑盒的應(yīng)用，其中，所述癌選自由腎癌、乳腺癌、口 腔癌、肺癌、胃腸道癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌、皮膚癌和 睪丸癌所組成的組中。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的部件試劑盒的應(yīng)用，其中，所述惡性血液病選自淋巴組織 增生、骨髓組織增生、骨髓發(fā)育不良綜合征和B型NHL急性骨髓樣白血病、急性或慢性B淋 巴白血病、伯基特淋巴瘤、毛狀白細(xì)胞白血病、急性和慢性骨髓樣白血病、T淋巴瘤和白血 病、霍奇金淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血病和多發(fā)性骨髓瘤。
21. 權(quán)利要求1-13中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒在制備預(yù)期治療自身免疫性疾病 和/或原發(fā)或繼發(fā)炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病具有器官特異性或是全身的，并與 致病的自身抗體相關(guān)或不相關(guān)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的部件試劑盒的應(yīng)用，所述藥物用于治療自身免疫性疾病和 /或原發(fā)或繼發(fā)炎癥疾病，所述疾病具有器官特異性或是全身性的，并與致病的自身抗體相 關(guān)或不相關(guān)，所述疾病選自器官移植排斥、或移植物抗宿主病、類風(fēng)濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、傳 播性紅斑狼瘡、硬皮病、原發(fā)性干燥綜合征、包括多發(fā)性硬化癥在內(nèi)的自身免疫多發(fā)性神經(jīng) 病、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、強(qiáng)直性脊椎關(guān)節(jié)炎、賴特綜合征、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、克 羅恩病、橋本氏甲狀腺炎、愛迪生病、自身免疫性肝炎、巴澤多病、潰瘍性結(jié)腸炎、包括抗中 性白細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)的系統(tǒng)性脈管炎在內(nèi)的脈管炎、包括急性或慢性自身免疫血小板減 少在內(nèi)的自身免疫性血球減少和其他成人和兒童血液病并發(fā)癥、自身免疫溶血性貧血、新 生兒溶血病、冷凝集素疾病、血小板減少血栓紫癜和獲得性自身免疫血友??；古德帕斯丘綜 合征、膜外腎病、自身免疫大皰皮膚病、重癥肌無力、混合性冷沉球蛋白血癥、銀屑病、幼年 型慢性關(guān)節(jié)炎、炎癥性肌炎、皮肌炎和包括抗磷脂綜合征在內(nèi)的兒童系統(tǒng)性自身免疫病。
23. 權(quán)利要求1-13中的任意一項(xiàng)所述的部件試劑盒在制備治療傳染病的藥物中的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的部件試劑盒的應(yīng)用，所述藥物用于治療選自以下的傳染 病由病毒(人類免疫缺陷病毒或HIV、乙型或丙型肝炎病毒、非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒或EBV、 巨細(xì)胞病毒或CMV、腸病毒、甲型、乙型和丙型流感病毒引起的流感、多核呼吸病毒或SRV、 或HTLV)、細(xì)菌和/或它們的毒素(破傷風(fēng)、白喉、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌、包含甲氧西林抗 性形式的葡萄球菌、克雷伯氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、腸道菌或包括醫(yī)源性疾病的抗生素 抗性病狀)、寄生蟲(瘧疾、利什曼蟲病、錐蟲病)誘發(fā)的疾?。恍鲁霈F(xiàn)的疾病，例如切昆汞 亞熱、禽流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒或SARS、引起出血性發(fā)熱(如埃博拉或登革熱)的 病毒或西尼羅病毒；以及，與生物恐怖主義相關(guān)的那些疾病，如炭疽、食物中毒、瘟疫、天花 和痘病毒、兔熱病、出血性發(fā)熱齊U、普魯斯病、葡萄球菌B腸毒素、白喉毒素或病毒性腦炎。
全文摘要
治療惡性病狀、自身免疫性疾病或傳染病的部件試劑盒，該部件試劑盒包括在其表面表達(dá)FcγRIII受體(CD16)的效應(yīng)細(xì)胞和單克隆抗體，其中所述單克隆抗體的Fc區(qū)對CD16的親和力大于多克隆免疫球蛋白的Fc區(qū)對CD16的親和力。
文檔編號A61K35/14GK101784284SQ200880013210
公開日2010年7月21日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者C·德羅默夫, N·富尼耶, N·費(fèi)爾南德斯 申請人:Lfb生物科技公司