專利名稱：：使用ε抑制劑化合物減輕疼痛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)不同類型疼痛的化合物的開發(fā)和使用，且其中將可能具有重疊和/或不重疊的生物化學(xué)活性機制的化合物引入到單化合物實體中(所謂的"雜種"化合物或肽)，用于治療疼痛和相關(guān)病癥。其中所述化合物包括一種或多種與至少一種載體部分偶聯(lián)的sPKC(sPKC)抑制肽，且其中抑制肽、載體部分、或二者已從原型序列得到修飾，以增加由此產(chǎn)生的化合物的穩(wěn)定性、效力、或二者。sPKC抑制肽還可以與一種或多種具有針對一種或多種其他PKC同工酶，包括PKCa，(3，5，y，e或"的特異性活性的調(diào)節(jié)肽偶聯(lián)。雜種化合物或肽超越同工酶-特異性PKC調(diào)節(jié)劑的優(yōu)勢應(yīng)該是提供更廣譜的活性，從而調(diào)節(jié)多種類型的疼痛和/或為疼痛調(diào)節(jié)化合物提供更大的效力和/或更高的安全性，和/或提供雙重治療活性，以減輕疾病病癥的多重方面(例如，組合減輕疼痛活性和消炎活性)。背景疼痛是由炎癥、神經(jīng)損傷、或?qū)C械、熱或化學(xué)刺激過度敏感的組織引起的不適感覺。它是嚴(yán)重的健康問題由于疼痛相關(guān)的病癥每年損失許多工作日。在廣泛多樣的疼痛中，神經(jīng)性疼痛是由神經(jīng)損傷引起的疾病，并且影響>1百萬美國人。該病癥由多種原因包括糖尿病、帶狀皰疹感染(水痘/帶狀皰疹)、外傷性神經(jīng)損傷、癌癥、或用化學(xué)治療試劑治療癌癥引起。炎性疼痛是另一種疼痛，其由于其多樣的病因?qū)W，構(gòu)成單獨的最大類型。關(guān)于新型止痛療法的搜索是醫(yī)學(xué)界的非常感興趣的領(lǐng)域(Reichling和Levine,1999)，因為其與其他局部或系統(tǒng)疾病，諸如自體免疫病癥如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)，并且因為其是慢性的且因此引起持久的痛苦。大部分目前的疼痛治療使用系統(tǒng)-施用的藥物，諸如非-類固醇抗炎藥物(NSAIDS)或阿片樣物質(zhì)的治療法。這些藥物中的許多引起系統(tǒng)性副作用，其范圍從心臟風(fēng)險的增高到成癮。僅存在少量使用局部施藥途徑，諸如辣椒素霜劑的疼痛治療法，所述方法不對所有類型的疼痛起作用，且引起局部刺痛(灼燒感、皮膚痛、皮膚炎癥，等)。蛋白激酶C("PKC")是參與多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)、和離子通道活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵酶。PKC同工酶家族包括至少11種不同的蛋白激酶，基于它們的同源性和對激活劑的敏感性可分為至少三個亞家族。所述家族是經(jīng)典的、新型的、和非典型的亞家族。每種同工酶包括許多同源("保守的"或"C")結(jié)構(gòu)域，其間散布有同工酶-特有的("可變的"或"V")結(jié)構(gòu)域。sPKC，連同5,ri和ePKC，都是所述"新型"亞家族的成員。該亞家族的成員典型地缺少C2同源結(jié)構(gòu)域且不需要鈣來活化。多種疾病狀態(tài)的機制中涉及了PKC的各種同工酶。已經(jīng)生成了源自sPKC的sPKC抑制肽，并顯示出影響痛覺。例如，參見專利號6,376,467和6,686,334。這種方法的一個問題是切除的片段的"裸露的"末端與它們在蛋白質(zhì)中的鄰近序列不同，在該片段與蛋白質(zhì)剩余部分附著的位置顯示出自由的胺和羧基。這些外來的部分可以致使所述肽對蛋白酶更敏感。作為這些傾向的結(jié)果，所述肽的效力可能不太理想，且體內(nèi)半衰期可能顯著縮短。現(xiàn)有技術(shù)的第二個領(lǐng)域利用類似的策略，其中將"載體"肽設(shè)計為HIV-Tat和其他蛋白的片段。這些肽片段模擬親本蛋白穿過細(xì)胞膜的能力。特別感興趣的是，"貨物"肽可以附著于這些載體肽從而將貨物和載體肽通過這些載體肽片段運載到細(xì)胞中的特性。認(rèn)識到載體肽是片段，類似的缺陷可以如上所注地適用于所述貨物肽。即，暴露的末端可以使其具有不理想的特性，包括蛋白酶易感性?，F(xiàn)有技術(shù)貨物/載體肽構(gòu)建體在貨物和載體之間使用了Cys-Cys二硫鍵，其在所述肽進(jìn)入細(xì)胞時，可以被許多試劑，諸如谷胱甘肽還原裂解。該特性已被認(rèn)為對生物活性很重要，因為貨物和載體的物理分離容許這兩個部分在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮它們獨立的作用。然而，該假說尚未得到有說服力的檢驗，且不可裂解的類似物事實上可以具有良好的活性。此外，二硫鍵難以組裝，并傾向于化學(xué)降解。某些現(xiàn)有技術(shù)貨物/載體肽的設(shè)計基于來自該蛋白的連續(xù)氨基酸序列。然而，該肽的最佳長度尚未得到充分定義，這基于理想序列的序列比較分析和理論預(yù)測，而非基于類似物測試的經(jīng)驗基礎(chǔ)。因此，由前述貨物肽的類似物可以預(yù)測增加的效力，所述類似物包含與其來源的SPKC結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的另外的殘基。附圖簡述圖1顯示修飾的sPKC抑制肽(KP-1634)的圖示。圖2顯示抑制性sPKC抑制肽(KP-1586)的化學(xué)式。圖3通過對測試肽相對濃度隨時間的變化繪圖，顯示大鼠或人血清對肽KP-1586,KP-1630,和KP-1631的穩(wěn)定性的影響。圖4通過對測試肽相對濃度隨時間的變化繪圖，顯示大鼠或人血清對肽KP-1632,KP-1633,和KP-1634的穩(wěn)定性的影響。圖5通過對測試肽相對濃度隨時間的變化繪圖，顯示大鼠或人血清對肽KP-1635,KP-1636，和KP-1637的穩(wěn)定性的影響。圖6通過對測試肽相對濃度隨時間的變化繪圖，顯示時間和溫度對肽KP-1586,KP-1630,KP-1631,KP-1632,KP-1633,KP-1634,KP-1635,KP-1636,KP-1637,和KP-1638的化學(xué)穩(wěn)定性的影響。圖7顯示福爾馬林測試的結(jié)果，以在用對照和兩種劑量的KP-1586處理的大鼠中的退縮/分鐘對比時間的圖中顯示急性疼痛的減輕。圖8在描繪角叉藻聚糖模型中針對肽KP-1586和對照肽KP-1587的爪縮回反應(yīng)時間的柱狀圖中顯示sPKC抑制肽對急性炎性疼痛的影響。圖9顯示描繪爪縮回反應(yīng)時間的柱狀圖并在大鼠慢性炎性疼痛模型中比較抑制肽KP-1586或?qū)φ针腒P-1587，其中施用角叉藻聚糖，5天后通過PGE2促進(jìn)慢性痛覺過敏。圖10示出顯示sPKC抑制肽對爪縮回閾值測量的作用的線形圖。圖11顯示在L5神經(jīng)橫斷后的大鼠(神經(jīng)性疼痛模型)中皮下輸注ePKC抑制肽對熱痛覺過敏的影響的柱狀圖。圖12顯示線形圖，其顯示在L5神經(jīng)橫斷后的大鼠中皮下推注sPKC抑制肽對熱痛覺過敏的影響，這是通過利用爪縮回反應(yīng)時間測量的。圖13顯示柱狀圖，其顯示在L5神經(jīng)橫斷后的大鼠中皮下輸注sPKC抑制肽對熱痛覺過敏的影響。圖14局部施用PKC抑制劑對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的應(yīng)答機械刺激的痛覺過敏的作用。爪縮回閾值(PWT)隨著通過皮內(nèi)(A)和皮下(B)途徑注射eVb2而增加。PWT的增加表示較小的疼痛。PWT的增加回到角叉藻聚糖前的水平稱為抗痛覺過敏作用。PWT高于角叉藻聚糖前水平的增加暗示潛在的止痛作用。圖15.單側(cè)去傳入對遠(yuǎn)離神經(jīng)交流施用于手術(shù)同側(cè)肢的PKC抑制劑的抗-痛覺過敏作用的影響。去傳入動物中，對身體同側(cè)的爪上皮內(nèi)(i.d.)施用該化合物仍能夠抑制角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的疼痛。圖16.雙側(cè)腰部交感神經(jīng)切除術(shù)加雙側(cè)腎上腺神經(jīng)節(jié)截除術(shù)對PKC抑制劑的抗-痛覺過敏作用的影響。實驗在手術(shù)后7天時進(jìn)行，從而容許SPGN(交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元)末梢的變性。外殼交感神經(jīng)切除術(shù)模仿單側(cè)去傳入手術(shù)的作用。皮下注射PKC抑制剤(sVl2-TAT)在施以交感神經(jīng)切除手術(shù)的大鼠中不再誘導(dǎo)抗-痛覺過敏/止痛作用，但是其對假裝手術(shù)的動物的影響保持不變。痛覺過敏的逆轉(zhuǎn)非常迅速，其發(fā)生在施用PKC抑制劑的5分鐘內(nèi)。圖17.注射酚妥拉明對PKC抑制劑的抗-痛覺過敏作用的影響。注射酚妥拉明，其是非選擇性a-腎上腺素受體拮抗劑，消除了注射于先前注射了酚妥拉明的肢遠(yuǎn)側(cè)的PKC抑制剤(sVl2-TAT)的疼痛-減輕作用。酚妥拉明后，sVw-TAT的抗-痛覺過敏作用消失。圖18:在大鼠中角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，皮內(nèi)KAI-1678對機械痛覺過敏的影響。在將角叉藻聚糖注射到右后爪足底側(cè)后60分鐘時，用皮內(nèi)推注注射KAI-1678處理大鼠。將KAI-1678以10mcg/kg(三角形)或100mcg/kg(圓形)給藥于身體同側(cè)的后肢(即接受角叉藻聚糖的同一肢，實心符號)或?qū)?cè)后肢(即沒有接受角叉藻聚糖的肢，空心符號)。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N:2-5只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值士SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。~90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是60g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量結(jié)果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖19:在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，皮下推注施用KAI-1678對機械痛覺過敏的影響。在將角叉藻聚糖注射到右后爪足底側(cè)后60分鐘時，將KAI-1678或KP-1723，即KAI-1678的無活性類似物的皮下推注注射施用于大鼠。將KAI-1678或KP-1723以所示劑量給藥于對側(cè)后肢(即沒有接受角叉藻聚糖的肢)。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N-2-5只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值土SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。~90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是62g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量結(jié)果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖20:在大鼠角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，給藥位置對皮下推注施用KAI-1678的影響。對用角叉藻聚糖注射到右后爪足底表面的大鼠，從角叉藻聚糖注射后60分鐘開始，給藥2次10mcg/kg皮下推注注射KAI-1678，相隔4小時。這兩次KAI-1678給藥在大鼠上的不同位點進(jìn)行，如所示。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N=2只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值土SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。~90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是~60g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量結(jié)果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖21:在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，皮下輸注KAI-1678對機械痛覺過敏的影響。在將角叉藻聚糖注射到右后爪足底側(cè)后60分鐘時，用6-小時皮下輸注KAI-1678或KP-1723,即KAI-1678的無活性類似物處理大鼠。將KAI-1678或KP-1723以所示給藥速率施用于對側(cè)后肢(即沒有接受角叉藻聚糖的肢)。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N=2-6只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值土SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。~90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是~55g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量結(jié)果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖22:在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，靜脈內(nèi)輸注KAI-1678對機械痛覺過敏的影響。從將角叉藻聚糖注射到右后爪足底側(cè)后60分鐘開始，用靜脈內(nèi)輸注KAI-1678處理大鼠。KAI-1678通過頸靜脈以所示給藥速率輸注2小時(三角形)或5小時(圓形)。5-小時輸注結(jié)束后，將10mg/kgn引哚美辛通過口服管飼法施用，從而測試該模型的響應(yīng)。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N=3或4只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值士SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是55g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量結(jié)果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖23:在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，切斷坐骨神經(jīng)和隱神經(jīng)對KAI-1678活性的影響。從大鼠左(對側(cè))后腿中手術(shù)摘除lcm坐骨神經(jīng)和隱神經(jīng)片段。次日，將角叉藻聚糖注射到手術(shù)處理的大鼠右后爪足底側(cè)中。角叉藻聚糖注射后60分鐘時，在對側(cè)肢上接近(空心圓)或遠(yuǎn)離(實心圓)神經(jīng)橫斷位點的位點處，以25mcg/kg/hr開始4-小時皮下輸注KAI-1678。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N=4只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值士SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是60g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量結(jié)果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖24:在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，外科交感神經(jīng)切除術(shù)對皮下施用的KAI-1678對機械痛覺過敏的活性的影響。在雙側(cè)腰部交感神經(jīng)切除術(shù)和腎上腺神經(jīng)節(jié)截除未后一周，將角叉藻聚糖注射到手術(shù)處理的大鼠(施以交感神經(jīng)切除手術(shù)的動物一實心圓)，或其中暴露但不摘除腰部交感神經(jīng)鏈和腎上腺神經(jīng)節(jié)的大鼠(假手術(shù)的動物一空心圓)的右后爪足底側(cè)。角叉藻聚糖注射后60分鐘時，開始以25mcg/kg/hr對每只動物在角叉藻聚糖施用位點的對側(cè)的后肢，進(jìn)行4-小時皮下輸注KAI-1678。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N:2-4只動物/組)中動物的(PWT)測量結(jié)果的平均值士SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。~90g處的虛線表示角叉藻聚糖前基線PWT測量結(jié)果；指示疾病狀態(tài)的PWT是55g。在角叉藻聚糖前基線水平處或其上的測量fe果表示對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)。圖25:在大鼠L5橫斷神經(jīng)性疼痛模型中，皮下推注施用KAI-1678對機械異常性疼痛的影響。橫斷L5脊神經(jīng)后7天，以指定的劑量對大鼠皮下推注給藥KAI-1678(時間0)。在化合物施用后指定的時刻，用vonFrey絲測試動物，以確定(左)30次測試中爪縮回的次數(shù)(每種絲5次測試)或(右)如對在5次測試中產(chǎn)生至少3次縮回的最低vonFrey絲確定的爪縮回閾值。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N二6只動物/組)中動物的平均值士SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。圖26;在大鼠L5橫斷神經(jīng)性疼痛模型中，皮下輸注KAI-1678對異常性疼痛的影響。橫斷L5脊神經(jīng)的那天，皮下植入裝有KAI-1678的滲透性微泵，以遞送指定每日劑量的化合物。在指定的時刻，(左)用vonFrey絲測試動物，以確定30次測試中爪縮回的次數(shù)(每種絲5次測試)或(右)響應(yīng)暴露于輻射熱源的爪縮回的反應(yīng)時間。數(shù)據(jù)表示為關(guān)于給定時間點時各組(N二6只動物/組)中動物的平均值土SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。圖27:IV推注后大鼠中血漿KAI-1678濃度。以300和3,000mcg/kg靜脈內(nèi)推注施用KAI-1678后的血漿濃度。顯示了來自三只大鼠(300mcg/kg)和兩只大鼠(3，000mcg/kg)的平均數(shù)據(jù)。來自這些數(shù)據(jù)的晚期半衰期的初步估計是38和~66分鐘(分別地，300mcg/kg和3,000mcg/kg)。圖28:通過IV輸注給藥的大鼠中的KAI-1678血漿濃度。以50mcg/kg/hr靜脈內(nèi)輸注施用的KAI-1678的血漿濃度。顯示來自三只大鼠的平均數(shù)據(jù)。圖29:皮下推注注射后大鼠中KAI-1678血漿濃度。以約80和800mcg/kg皮下推注施用后的KAI-1678血漿濃度。顯示來自三只大鼠(80mcg/kg)和四只大鼠(800mcg/kg)的平均數(shù)據(jù)。來自這些數(shù)據(jù)的晚期半衰期的初步估計是35分鐘。圖30:通過皮下輸注給藥的大鼠中的KAI-1678血漿濃度。通過皮下輸注2小時給藥的大鼠中的血漿KAI-1678濃度。顯示處于各種劑量水平中的兩只大鼠的平均數(shù)據(jù)。圖31:通過皮下輸注給藥5天的狗中的KAI-1678血漿濃度。通過以3,8and25mg/kg/天皮下輸注給藥的狗中的血漿KAI-1678濃度。注意，在第1天最初的4小時和在第6天在輸注結(jié)束(EOI)時回收樣品，在這期間不采樣。
發(fā)明內(nèi)容本文中的內(nèi)容涉及修飾的sPKC抑制肽，產(chǎn)生所述肽的方法，和利用sPKC抑制肽治療疼痛的方法。公開的發(fā)明還涉及局部-施用的蛋白激酶Cs(sPKC)抑制劑在抑制疼痛感覺中起的作用。使用ePKC抑制劑，特別是通過需要影響交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)的初級傳入功能和調(diào)節(jié)的機制系統(tǒng)性抑制疼痛的方法。本發(fā)明的范圍內(nèi)還考慮包括sPKC-特異性抑制劑和另一種PKC調(diào)節(jié)肽的雜種肽。任何PKC調(diào)節(jié)肽可以用于制備雜種構(gòu)建體，以使多于一種同工酶-特異性PKC調(diào)節(jié)劑的活性組合到單雜種化合物/肽中。由以下的詳細(xì)說明，本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員應(yīng)該清楚其他方面和實施方發(fā)明詳述本發(fā)明涉及修飾的肽，其抑制s蛋白激酶(sPKC)同工酶并與另一種同工酶-特異性PKC調(diào)節(jié)劑偶聯(lián)。典型地，本文中討論的sPKC抑制肽與載體部分偶聯(lián)，從而促進(jìn)該抑制肽向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運?？梢韵鄬τ谠詫φ招揎椮浳镆种齐摹⑤d體肽、或二者，以增加由此產(chǎn)生的貨物/載體肽構(gòu)建體的穩(wěn)定性。本發(fā)明的修飾的sPKC肽有效用于預(yù)防、逆轉(zhuǎn)和另外治療多種類型的疼痛，諸如急性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛。ePKC抑制蛋白還可以用于構(gòu)建雜種肽構(gòu)建體，其包括一種或多種具有針對其他PKC同工酶的活性的同工酶-特異性PKC調(diào)節(jié)肽。定義用于本說明書中時，下列詞語和短語通常意欲具有如下所示的含義，除非在使用它們的上下文中作出另外的指示。"PKC調(diào)節(jié)化合物"是任何這樣的化合物，包括小分子和肽，其能夠15調(diào)節(jié)PKC同工酶的酶活性。術(shù)語"調(diào)節(jié)"指增加和減小PKC同工酶的酶活性和其他功能活性。特異性PKC調(diào)節(jié)劑("同工酶-特異性PKC調(diào)節(jié)劑")是任何這樣的化合物，其以可檢測的程度，相對另一種同工酶，陽性地或陰性地調(diào)節(jié)一種PKC同工酶。"PKC激活劑"是任何這樣的化合物，包括小分子和肽，其能夠激活PKC同工酶的酶活性。特異性PKC激活劑是任何這樣的化合物，其以可檢測的程度，相對另一種同工酶，激活一種PKC同工酶。"PKC抑制劑"是任何這樣的化合物，包括小分子和肽，其能夠抑制PKC同工酶的酶活性和其他功能性活性。特異性PKC抑制劑是任何這樣的化合物，其以可檢測的程度，相對另一種同工酶，激活一種PKC同工酶。"sPKC激活肽"指能夠激活sPKC酶的肽。"sPKC抑制肽"指能夠抑制或滅活sPKC酶的肽。、PKC激活肽"指能夠激活YPKC酶的肽。"YPKC抑制肽"指能夠抑制或滅活yPKC酶的肽。術(shù)語"KAI-1586"指源自通過Cys-Cys二硫鍵與"封端的(capped)"HIVTat-來源的轉(zhuǎn)運肽綴合的sPKC的第一可變區(qū)的肽，并可以表示如下H-Cys-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Lys-Pro-Thr-COOH(sPKC抑制肽)I(二硫鍵)SIAc-Cys-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln陽Arg-Arg-Arg-COOH(載體)。術(shù)語"KAI-1634"指源自sPKC的第一可變區(qū)的兩個修飾的sPKC肽，其與封端的HIVTat-來源的轉(zhuǎn)運肽共價連接。該構(gòu)建體圖示在圖1中。術(shù)語"封端的"指化學(xué)修飾以改變氨基末端。羧基末端、或二者的肽。與未修飾的貨物肽二硫鍵結(jié)合的封端的載體肽顯示在圖2中。術(shù)語"載體"指促進(jìn)細(xì)胞吸收的部分，諸如陽離子聚合物、肽和抗體序歹l」，包括聚賴氨酸、聚精氨酸，觸角足(Antennapedia)-來源的肽，HIVTat-來源的肽等，如例如美國專利和公開號4，847,240,5,888,762,5,747,641，6,593,292，US2003/0104622,US2003/0199677和US2003/0206卯0中所述。載體部分的實例是"載體肽"，其為促進(jìn)細(xì)胞吸收與轉(zhuǎn)運肽化學(xué)聯(lián)合或結(jié)合的ePKC抑制肽的肽。術(shù)語"預(yù)防"指作為"治療"的要素意欲包括如本文中定義的"預(yù)防"和"抑制"。本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，在人類醫(yī)學(xué)中，不總是可能區(qū)分"預(yù)防"和"抑制"，因為一件或多件根本誘導(dǎo)事件可能是未知的、隱藏的，或患者直到該一件或多件事件徹底發(fā)生后才確定。術(shù)語"穩(wěn)定性"一般指改善保存期的修飾，例如，延遲基于保存期的cys-cys交換，通過延遲蛋白水解降解，或二者。術(shù)語"效力"涉及獲得特定結(jié)果所需要的特定肽組合物的量。當(dāng)可以減少一種肽組合物的劑量以獲得理想目標(biāo)時，該肽組合物比另一種更有效力?？梢詫o定的肽組合物進(jìn)行某些修飾，以改善該組合物的效力。s蛋白激酶C(sPKC)抑制劑存在許多已知的可以在本發(fā)明中使用的ePKC抑制劑。PKC的小分子抑制劑記述在美國專利號5，141,957,5,204,370,5,216,014,5,270,310,5，292,737，5,344,841，5,360,818，5,432,198，5,380，746，and5，489，608,(歐洲專利0,434，057)中，所有這些將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。這些分子屬于下列類型N，N'-二-(亞磺酰氨基)-2-氨基-4-亞氨基萘-l-酮；N,N'-二-(酰胺基)-2-氨基-4-亞氨基萘-l-酮；連位-取代的碳環(huán)；1,3-二嗯烷衍生物；1，4-二-(氨基-羥烷基氨基)-蒽醌；呋喃香豆素磺酰胺；二-(羥烷基氨基)-蒽醌;和N-氨基垸基酰胺，2-[l-(3-氨基丙基)-lH-吲哚-3-基]-3-(lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺，2-[l-[2-(l-甲基吡咯烷)乙基]-lH-吲哚-3-基]-3-(lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺，G67874。其他已知的小分子PKC抑制劑記述在下述出版物中(Fabre,S.,等1993.Bioorg.Med.Chem.(生物有機和醫(yī)學(xué)化學(xué))1,193,Toullec，D.,等1991.J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)266,15771，Gschwendt,M.,等1996.FEBSLett.(FEBS通信)392,77,Merritt,J.E.，等1997.CellSignal(細(xì)胞信號)9,53.，Birchall,A.M.，等1994.J.Pharmacol.Exp.Ther.(藥理學(xué)和實驗療法雜志)268,922.Wilkinson,S.E.,等1993.Biochem.J.(生物化學(xué)雜志)294,335.,Davis,P.D.,等1992.J.Med.Chem.(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志)35,994)，并屬于下述類型2，3-二(lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺(二吲哚基馬來酰亞胺IV);2-[l-(3-二甲基氨基丙基)-5-甲氧基吲哚-3-基]-3-(lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺(Go6983);2-{8-[(二甲基氨基)甲基]-6,7,8，9-四氫吡啶并[l，2-a]吲哚-3-基r3-(l-甲基-lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺(Ro-32-0432);2-[8-(氮基甲基)-6,7,8,9-四氫吡啶并[1，2-a]吲哚-3-基]-3-(l-甲基-lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺(Ro-31-8425);和3-[l-[3-(脒硫代)丙基-lH-吲哚-3-基]-3-(l-甲基-lH-吲哚-3-基)馬來酰亞胺二吲哚基馬來酰亞胺IX，甲垸磺酸酯(Ro-31-8220)，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。s蛋白激酶(ePKC)抑制肽多種sPKC抑制劑記述在本文中，并可以通過本公開的方法使用。抑制肽可以源自任何結(jié)構(gòu)域，無論是可變的還是恒定的。因此，抑制肽可以源自VI,V2，V3，V4，或V5。抑制肽還可以源自恒定區(qū)Cl(Cla,Clb),C3，C4，或C5。還預(yù)期肽與這些區(qū)域中的一個或多個重疊。原型肽的另一種來源見美國專利申請?zhí)?1/011,557，標(biāo)題為"Isozyme-specificantagonistsofproteinkinaseC(蛋白激酶C的同工酶-特異性拮抗劑)"，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。在一個實施方案中，貨物肽是sVl-2的sPKC抑制肽衍生物，其包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T(SEQIDNO:X)，位于該肽的氨基或羧基末端、或位于中間的半胱氨酸殘基，和與所述貨物肽連接的載體肽。上述貨物肽還可以包括一種或多種另外的貨物肽，其彼此附著且最終附著于載體肽。對載體肽和貨物肽均進(jìn)行了修飾，其目的在于提高效力，在生物流體/組織中的穩(wěn)定性。和化學(xué)穩(wěn)定性。這些改變提供具有增強特性的sPKC抑制劑，以用于多種臨床適應(yīng)證。已經(jīng)應(yīng)用的一些修飾包括1.對貨物和/或載體肽進(jìn)行封端，從而阻礙體內(nèi)蛋白水解，并由此提高效力和/或功效持續(xù)時間；2.生成重疊肽，引入親本蛋白的另外的連續(xù)區(qū)，從而提高效力；183.制備線性肽，其在單一肽鏈中具有貨物和載體，從而提高藥物產(chǎn)品的化學(xué)穩(wěn)定性和保存期；4.制備多聚體肽，其具有兩個或更多個拷貝的活性肽，從而提高蛋白酶抗性和效力；5.制備肽的逆反(retro-irwerso)類似物，從而阻礙蛋白水解；和6.引入二硫化類似物，從而提供提高的化學(xué)穩(wěn)定性。本文中所述的修飾改進(jìn)被修飾的sPKC抑制肽的效力、血漿穩(wěn)定性、和化學(xué)穩(wěn)定性。對sPKC抑制肽的有效修飾通過選擇原型sPKC抑制肽和將這些肽修飾為用于治療疼痛的貨物肽來確定。原型肽可以是目前已知的肽或是如sPKC抑制肽一樣尚未確定的肽。盡管任何抑制性sPKC肽可以作為起始貨物序列使用，但是優(yōu)選的原型序列是E-A-V-S-L-K-P-T(SEQIDNO:X)，其中肽是未修飾的并與載體通過位于貨物和載體肽氨基末端的Cys殘基綴合。預(yù)期了多種修飾的或類似物肽。一些所述類似物包括重疊并超過原型序列延伸的氨基酸序列。其他類似物肽相對于原型是截短的。另外，原型序列的類似物相對于原型序列可以具有一個或多個氨基酸取代，其中被取代的氨基酸是丙氨酸殘基或天冬氨酸殘基。系統(tǒng)生成所述包含丙氨酸或天冬氨酸的肽稱為"掃描"。還預(yù)期生成包括所述類似物和修飾的載體肽的線性肽。對原型序列的另外的修飾針對修飾一種或多種貨物肽、一種或多種載體肽、或二者中的特異性降解位點，并引入氨基酸取代或其他化學(xué)修飾，這些修飾阻斷這些位點的降解。表1列出為了作為原型序列在本發(fā)明中使用的許多示范性sPKC抑制肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如下文中更完整討論地，優(yōu)選地，ePKC抑制肽與載體部分，諸如載體肽化學(xué)締合。在一個實施方案中，抑制肽和載體肽通過二硫鍵相連接。靜電和疏水性相互作用也可以用于化學(xué)締合載體部分和sPKC抑制肽。在形成二硫鍵的情形中，向PKC抑制肽序列或向載體肽序列添加Cys殘基可能是有利的。可以將Cys殘基添加到氨基或羧基末端，或二端。Cys殘基還可以位于貨物或載體肽的氨基酸序列內(nèi)部。這樣的內(nèi)源Cys己顯示出穩(wěn)定化載體和貨物肽之間的二硫鍵。另一種連接系統(tǒng)涉及利用甘氨酸殘基連接體線性化的目的肽。一個優(yōu)選的實施方案是KP-1678，其具有eVl-2序列和TAT載體肽，其中氨基末端是乙?；那音然┒吮话被鶊F(tuán)修飾(Ac-EAVSLKPTGGYGRKKRRQRRR-NH2)。雜種肽構(gòu)建體如上討論地，預(yù)期了對PKC調(diào)節(jié)肽的多種修飾。所述修飾的一個實例包括構(gòu)建包括例如貨物PKC調(diào)節(jié)肽和載體肽的線性肽。另一個實例的多聚體肽構(gòu)建體，其包括許多PKC調(diào)節(jié)肽和載體肽。可以修飾任一種肽設(shè)計模型，從而包括多個調(diào)節(jié)性PKC肽，并且可以對那些調(diào)節(jié)肽進(jìn)行選擇，從而使不同的PKC同工酶可以被相同的構(gòu)建體調(diào)節(jié)。雜種肽方法具有多種超越單功能肽構(gòu)建體的優(yōu)勢。例如，在同一構(gòu)建體中使用多個PKC調(diào)節(jié)肽允許一個構(gòu)建體同時調(diào)節(jié)兩種或更多種不同PKC同工酶，否則使用多個同工酶特異性調(diào)節(jié)肽進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種方式的連接修飾，盡管特異性低于單獨使用同工酶特異性肽，但其特異性仍高于使用同工酶非特異性肽調(diào)節(jié)劑和其他小分子型激酶抑制劑。同工酶特異性調(diào)節(jié)肽的使用僅是示范性的。雜種肽構(gòu)建體還可以包括特異于或非特異于任何PKC同工酶的調(diào)節(jié)肽。預(yù)期認(rèn)可PCK同工酶的肽調(diào)節(jié)劑用于構(gòu)建雜種肽構(gòu)建體。PKC同工酶家族包括至少11種不同的蛋白激酶，其可以基于它們的同源性和對激活劑的靈敏性分為至少三個亞家族。每種同工酶包括許多同源("保守"或"C")結(jié)構(gòu)域，和其間散布的同工酶-特有的("可變"或"V")結(jié)構(gòu)域。"經(jīng)典"或"cPKC"亞家族的成員，即(x，^，(3,和yPKC，含有4個同源結(jié)構(gòu)域(C1，C2，C3和C4)，并需要鈣、磷脂酰絲氨酸、和甘油二酯或佛波酯來活化。在"新型"或"nPKC"亞家族的成員，即S，s,ri和ePKC中，C2-樣結(jié)構(gòu)域位于Cl結(jié)構(gòu)域之前。然而，該C2結(jié)構(gòu)域不結(jié)合鈣并因此nPKC亞家族不需要鈣來活化。最后，"非典型"或"aPKC"亞家族的成員，即；和APKC，缺少C2和一半的C1同源結(jié)構(gòu)域并對甘油二酯、佛波酯和鈣不敏感。具有針對一種或多種PKC同工酶的活性的調(diào)節(jié)肽可以用于制備雜種肽構(gòu)建體。在優(yōu)選的實施方案中，肽構(gòu)建體包括一種或多種雜種sPKC調(diào)節(jié)肽和一種或多種YPKC調(diào)節(jié)肽。在一個優(yōu)選實施方案中，一種或多種sPKC抑制肽與一種或多種YPKC抑制肽一起使用，以構(gòu)建sPKC-yPKC雜種抑制肽。上文中討論了多種sPKC，且這些肽是可以用于制備雜種肽構(gòu)建體的一些肽的實例。多種YPKC抑制劑記述在本文中，并可以以本公開的方法使用。抑制肽可&源自任何結(jié)構(gòu)域，無論可變的還是恒定的。因此，抑制21肽可以源自VI,V2,V3,V4,或V5。抑制肽還可以源自恒定區(qū)CI(Cla,Clb),C3，C4，或C5。還預(yù)期與這些區(qū)域中的一個或多個重疊的肽。貨物肽源自多種結(jié)構(gòu)域且長度范圍是5-30個氨基酸長。更具體地，源自PKC結(jié)構(gòu)域的肽是5，6，7,8，9，10,11，12，13，14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25，26,27，28，29,或30個殘基長。原型肽的另一種來源見美國專利申請?zhí)?1/011,557，標(biāo)題為"Isozyme-specificantagonistsofproteinkinaseC(蛋白激酶C的同工酶-特異性拮抗劑)"，其采用激活肽，并將它們轉(zhuǎn)化為抑制肽，并將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。優(yōu)選的YPKC抑制肽的原型序列是R-L-V-L-A-S(SEQIDNO:XX)。以上所述關(guān)于PKC肽的所有修飾都同等地適用于預(yù)期在雜種構(gòu)建體中使用的YPKC抑制肽。下述表格列出為了作為原型序列在本發(fā)明中使用的許多示范性YPKC抑制肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>將于2007年4月6日提交的美國臨時號60/910,588中討論的所有PKC肽引入本文作為參考。載體部分發(fā)現(xiàn)意欲細(xì)胞吸收的廣泛多樣的分子(特別是大分子諸如肽)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力很差。在提議促進(jìn)細(xì)胞吸收的溶液中已經(jīng)使用了載體部分諸如陽離子(即帶正電的)聚合物，肽和抗體序列，包括聚賴氨酸、聚精氨酸、觸角足-來源的肽、HIVTat-來源的肽等。(見，例如，美國專利和公開號4,847,240,5,888,762,5，747,641,6,593,292,US2003/0104622,US2003/0199677和US2003/0206900。)貨物/載體綴合物的具體實例是KP-1634(SEQIDNO:X)，其由兩種具有氨基末端帽的sPKC-來源的肽和氨基和羧基末端均封端的一種HIVTat-來源的肽組成。其他抑制劑sPKC的其他抑制劑可以利用測量活化、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、與細(xì)胞內(nèi)受體(例如，RACK)的結(jié)合或sPKC的催化活性確定。傳統(tǒng)地，PKC家族成員的激酶活性通過在利用放射性ATP作為磷酸酯供體和組蛋白或短肽作為底物的再生磷脂環(huán)境中使用至少部分純化的PKC進(jìn)行測定。(T.Kitano,M.Go,U.Kikkawa,Y.Nishizuka,Meth.Enzymol.(酶學(xué)方法)124，349-352(1986);R.O.Messing,P.J.Peterson,C.J.Henrich,J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)266,23428-23432(1991))。近期的改進(jìn)包括迅速、高靈敏性化學(xué)發(fā)光測定，其測量處于生理學(xué)濃度的蛋白激酶活性，并可以自動化和/或用在高通量篩選中(C.Lehel，S.Daniel-Issakani,M.Brasseur,B.Strulovici，Anal.Biochem.(分析生物化學(xué))244,340-346(1997))，和使用處于分離的膜中的PKC和源自MARCKS蛋白的選擇性肽底物的測定法(B.R.Chakravarthy,ABussey，J.RWhitfield,M.Sikorska,R.E.Williams,J.P.Durkin，Anal.Biochem.(分析生物化學(xué))196,144-150(1991))。影響sPKC細(xì)胞內(nèi)遷移的抑制劑可以通過其中通過級分法(R.O.Messing,P.J.Peterson,C.J.Henrich,LBiol.Chem.(生物化學(xué)雜志)266,23428-23432(1991))或免疫組化(美國專利號5,783,405;美國專利申請系列號08/686,796現(xiàn)美國專利號6,255,057,現(xiàn)美國專利號6,255，057)確定sPKC細(xì)胞內(nèi)定位的測定法來鑒定。為了鑒定sPKC的抑制劑，應(yīng)該對sPKC進(jìn)行測定。所述sPKC抑制劑的選擇性可以通過比較抑制劑對sPKC的作用和其對其他PKC同工酶的作用來確定。將前述專利和公開物的相關(guān)部分引入本文作為參考。另外的用于鑒定sPKC抑制劑的測定法可以見美國專利號5,783,405,6,156,977，和6,423,684，將其整體引入本文作為參考。機制本文報告的實驗數(shù)據(jù)顯示(1)在神經(jīng)性和炎性疼痛模型中，局部遞送的SPKC抑制肽對測試動物的后肢產(chǎn)生抗-痛覺過敏/止痛作用；(2)認(rèn)為sPKC抑制肽的這種作用是由在坐骨和隱神經(jīng)傳入內(nèi)傳送的神經(jīng)介導(dǎo)的，其投射到后肢并因此可以成為被sPKC抑制肽抑制的神經(jīng)元反射對象的一部分；(3)sPKC抑制肽的作用似乎是交感腎上腺-依賴性的，其與這樣的報告相符，即sPKC不僅在交感神經(jīng)神經(jīng)節(jié)中存在并對神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程起作用(例如，Scholze等/A^"my"f辨經(jīng)辨學(xué)染U，22:5823-32,2002)，而且還調(diào)節(jié)C-纖維(疼痛-敏感神經(jīng))的敏化作用(Khasar，等，7VewmnW廬經(jīng)i入24:253-260,1999);和(4)ePKC抑制肽的抗-痛覺過敏/止痛作用是通過腎上腺素受體介導(dǎo)的。值得注意地，己知腎上腺素(EPI)，即一種由腎上腺髓質(zhì)和交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元(SPGN)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，敏化C-纖維(Chen禾卩Levine，J尸az"0^t^^吉J,6:439-446，2005;Khasar,等，A^/ra"G^經(jīng)元J，24:253-260，1999)。報告了sPKC通過磷酸化N型辛丐通道(Zhu和Ikeda,乂7Vem^/z>w'o/.G^經(jīng)主^^乂志J,74:1546-60，1994)調(diào)節(jié)03++流入(80611111等，/7VeMmc/.G^經(jīng)搏學(xué)^^吉入16:4516-603,1996)，并因此調(diào)節(jié)兒茶酚胺從交感神經(jīng)神經(jīng)元中的釋放(Scholze等:J0￥經(jīng)^/^^^吉j,22:5823-32,2002)。確定sPKC抑制肽的抗-痛覺過敏作用不同于Messing和Levine中所討論的那些(USP6,686,334B2,USP6,376,467Bl禾卩2002/0151465Al)，其中外源EPI或異普萘洛爾(isopropranolol)(ISO，即一種合成的J3-腎上腺素受體激動劑)通過剌激J3-腎上腺素受體作用于C-纖維。在該項工作中，外源EPI或ISO的促-痛覺過敏作用是ePKC依賴性的且不作用于SPGN末梢上的自體調(diào)節(jié)性"2-腎上腺素受體。美國專利號6,686,334和6,376,467和公開號2002/0151465Al關(guān)注sVw對下游的抗-痛覺過敏作用，即由外源兒茶酚胺或理論上由外源兒茶酚胺在它們從交感腎上腺系統(tǒng)中釋放后引起的作用。本公開的數(shù)據(jù)不與Messing和Levine相矛盾，而是相反集中和擴展關(guān)于sPKC在疼痛神經(jīng)傳遞中所起作用的理解。此外，本文中的發(fā)現(xiàn)說明sPKC抑制肽的抗-痛覺過敏作用也通過SPGN中的"上游"神經(jīng)傳遞介導(dǎo)，并更明確突出sPKC抑制肽對交感腎上腺系統(tǒng)具有的作用。本發(fā)明顯示在遠(yuǎn)處位點局部施用SPKC抑制劑可以通過由SPGN介導(dǎo)的機制抑制疼痛，且既不受限于也不需要該抑制劑遍及身體的系統(tǒng)分布。抑制疼痛應(yīng)答所需的sPKC的遠(yuǎn)程作用、迅速開始和低劑量需要完整的神經(jīng)，因為橫斷對側(cè)肢的坐骨和隱神經(jīng)(去傳入)阻斷S.C.施用的sPKC抑制來自遠(yuǎn)處位點的疼痛的能力。此外，雙側(cè)腰部交感神經(jīng)切除術(shù)加雙側(cè)腎上腺神經(jīng)節(jié)截除術(shù)以及單側(cè)注射酚妥拉明(其為非選擇性(x-腎上腺素受體拮抗劑)消除sPKC抑制劑的減輕疼痛的作用。關(guān)于sPKC抑制劑觀察到的非常低的劑量、迅速開始和遠(yuǎn)處作用支持這樣的結(jié)論，即可能甚至更小選擇性的ePKC抑制劑(包括如果系統(tǒng)施用可能另外是有毒的抑制劑)可以用于抑制疼痛應(yīng)答。此外，因為我們顯示了局部施用非常低劑量的sPKC可以具有該作用，所以可以想到可以以非常低劑量局部施用類似非常低劑量的另外是非選擇性和系統(tǒng)毒性的sPKC抑制劑(即，比該藥物的劑量限制系統(tǒng)毒性水平低得多)，從而在不產(chǎn)生任何或僅產(chǎn)生非常有限的系統(tǒng)毒性副作用的條件下，獲得疼痛應(yīng)答的抑制。使用方法和制劑本文中所述的修飾肽有效用于預(yù)防和治療疼痛。為了該討論的目的，疼痛及其治療分類為不同的類型急性、慢性、神經(jīng)性、和炎性疼痛的治療。本文中所述的修飾的sPKC抑制肽有效用于治療急性、慢性、神經(jīng)性、和炎性疼痛。有趣地，本文中公開的化合物還有效用于減輕或預(yù)防由許多刺激引起的神經(jīng)性疼痛的發(fā)展。例如，如以下實施例7中所討論地，慢性炎性疼痛可以通過施用角叉藻聚糖和隨后施用前列腺素E2誘導(dǎo)。該現(xiàn)象起多種系統(tǒng)的模型的作用，在所述系統(tǒng)中，接受許多疼痛刺激或疼痛敏化試劑的受試者引起慢性炎性或神經(jīng)性疼痛。注意到接受TAXOL的化療患者產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛，其典型地在初始一次或多次藥物劑量后減輕。然而，接受完整TAXOL療程的化療患者留下持續(xù)性神經(jīng)性疼痛。本發(fā)明預(yù)期施用本文中所述的sPKC抑制肽，預(yù)防性地，與化療試劑一起，或在化療后，應(yīng)該有效減輕或預(yù)防慢性炎性或神經(jīng)性疼痛病癥的發(fā)展。一旦裝配了貨物/載體肽構(gòu)建體并測試出其與原型相比增加的穩(wěn)定性、效力、或二者，將該構(gòu)建體置于在疼痛誘導(dǎo)事件之前、過程中、或貫穿其間連續(xù)施用于受試者的藥用制劑中。"藥用制劑"包括適合于以這樣的方式施用修飾的SPKC抑制劑的制劑，所述方式是提供理想結(jié)果，且還不產(chǎn)生足以使醫(yī)師確信其對患者的潛在傷害高于對該患者的潛在益處的不利副作用。適合與修飾的sPKC抑制劑一起使用的藥用制劑的成分部分地通過施用途徑和方法確定。所述制劑通常包括一種或多種引入到藥用載體中的修飾的sPKC抑制肽，所述藥用載體典型地包括簡單化學(xué)劑諸如糖、氨基酸或電解質(zhì)。示范性溶液典型地用鹽水或緩沖液制備。藥用載體可以包含本領(lǐng)域中公知的賦形劑，且可以用在多種制劑中。參見，例如Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明頓制藥科學(xué)),第18版,A.R.Gennaro,編輯，MackPublishingCompany(馬克出版公司)(1990);Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓制藥學(xué)科學(xué)和實踐)，第20版，A.R.Gennaro,編輯，LippincottWilliams&Wilkins(2000);HandbookofPharmaceuticalExcipients(藥物賦形劑手冊),第3版，A.H.Kibbe,編輯，AmericanPharmaceuticalAssociation(美國藥物協(xié)會)，禾QPharmaceuticalPress(藥物出版社)(2000);和HandbookofPharmaceuticalAdditives(藥物添加劑手冊)，由Michael禾口IreneAsh匯編，Gower(1995)。抑制劑在制劑中的劑量應(yīng)該根據(jù)多種參數(shù)變化，所述參數(shù)受貨物/載體構(gòu)建體的穩(wěn)定性和效力、施用途徑、和理想給藥方案的影響。預(yù)期日劑量范圍為1昭/kg-100mg/kg體重，優(yōu)選1昭/kg-lmg/kg和最優(yōu)選10嗎/kg-lmg/kg。修飾的sPKC抑制劑可以局部或系統(tǒng)施用。局部施用可以通過局部施用、經(jīng)皮、皮內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、或皮下注射實現(xiàn)。修飾的sPKC抑制劑的系統(tǒng)施用優(yōu)選是腸胃外的，盡管也預(yù)期了口服、口腔、和鼻內(nèi)施用。腸胃外施用通常特征在于注射，通過皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、和靜脈內(nèi)。修飾的抑制肽的可注射形式可以制備為常規(guī)形式，如液體溶液或混懸液，適合于在注射前重構(gòu)為液體溶液或混懸液的固體(例如，干燥的或凍干的)形式，或如乳劑。通常，合適的賦形劑包括，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，可以使用小量非毒性輔助物質(zhì)，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、增溶劑、補劑(tonicifiers)等，包括，例如，乙酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、環(huán)糊精等。需要時，可以施用修飾的ePKC抑制肽治療疼痛。為了預(yù)防，修飾的sPKC化合物可以在疼痛-誘導(dǎo)事件之前施用。例如，該肽可以在預(yù)期的疼痛-誘發(fā)事件前5,10，15，20,25，30，35，40,45,50,55分鐘，1小時，數(shù)小時，1天，1周，或數(shù)周時施用。甚至更長時期的預(yù)防施用可以通過使用在體內(nèi)特別穩(wěn)定的修飾肽，或通過使用肽的持續(xù)不變釋放制劑，例如由鞘內(nèi)泵遞送來實現(xiàn)。實施例以下實施例起更完整描述使用上述發(fā)明的方式，以及闡明對實施本發(fā)明的不同方面所預(yù)期的最佳模式的作用。理解這些實例不以任何方式起限制本發(fā)明真實范圍的作用，而是為了舉例說明的目的而存在。本文中引用的所有參考文獻(xiàn)作為整體引入包括作為參考。實施例1ePKC抑制劑類似物的最優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)sPKC抑制序列(KP-1636)作為原型用于研究多種化學(xué)修飾對效力和穩(wěn)定性的影響。原型序列，即KP-1586作為以下所述工作中的模板使用。為了該工作，修飾多種貨物和載體肽，并將其提供在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表2中的"Tat"指HIVTat,的片段47-57，且"CapTat"指相同肽的N-乙酰基或C-酰胺類似物。術(shù)語"hC，，或"hCys"指高半胱氨酸氨基酸。實施例2sPKC抑制劑類似物的穩(wěn)定性測試了實施例1中所述的多種貨物/載體肽構(gòu)建體的血漿和化學(xué)穩(wěn)定性。該化合物的血漿穩(wěn)定性利用人和大鼠血清測試，并在30分鐘的處理后確定起始物質(zhì)的量?；瘜W(xué)穩(wěn)定性通過確定9天的處理后剩余的起始物質(zhì)的量來評估。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例3sPKC抑制劑類似物的時間進(jìn)程血漿穩(wěn)定性利用人和大鼠血清測試實施例1中所述的多種貨物/載體肽構(gòu)建體的血漿穩(wěn)定性，并隨著30分鐘的處理時間確定起始物質(zhì)的量。關(guān)于貨物/載體肽KP-1586，KP-1630,和KP-1631的時間進(jìn)程數(shù)據(jù)顯示在圖3中，關(guān)于肽KP-1632，KP-1633,和KP-1634的數(shù)據(jù)顯示在圖4中，且關(guān)于肽KP-1635,KP-1636,和KP-1637的數(shù)據(jù)顯示在圖5中。包含未封端載體肽的二聚體肽和類似物比原型物質(zhì)更穩(wěn)定。有趣的是，對貨物肽的封端對血漿穩(wěn)定性幾乎無影響，如在比較KP-1586和KP-1630的穩(wěn)定性時所觀察到的。實施例4sPKC抑制劑類似物的時間進(jìn)程化學(xué)穩(wěn)定性通過在大于200小時的時期內(nèi)檢查37。C下肽的相對濃度來測試實施例1中所述的多種貨物/載體肽構(gòu)建體的化學(xué)穩(wěn)定性。關(guān)于貨物/載體肽的時間進(jìn)程數(shù)據(jù)顯示在圖6中。來自該研究的數(shù)據(jù)顯示原型序列與類似物相比僅適度穩(wěn)定。包含線性和高半胱氨酸的構(gòu)建體與原型序列相比，均顯示提高的穩(wěn)定性。例如，KP-1637表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性。實施例5用修飾的sPKC抑制肽減輕急性疼痛使用福爾馬林-誘導(dǎo)的疼痛測試研究修飾的ePKC肽對減輕急性疼痛的能力。福爾馬林通過足底內(nèi)途徑施用于本研究中使用的所有大鼠。測試受試者在引起疼痛的試劑前15分鐘時，通過鞘內(nèi)施用接受包含修飾的sPKC肽KP-1586的制劑(預(yù)防模式)。在測試受試者中使用兩種不同濃度的修飾的肽。來自該實驗的數(shù)據(jù)顯示在圖7中。該研究的結(jié)果說明修飾的ePKC抑制肽的預(yù)防性施用在測試動物中有效減少退縮/分鐘。因此，施用修飾的sPKC肽有效減輕急性疼痛刺激。實施例6用修飾的sPKC抑制肽減輕慢性疼痛Chimg(L5神經(jīng)橫斷)是慢性(神經(jīng)性)疼痛的公知模型。本發(fā)明中提供的代表性的修飾的ePKC肽KP-1586已經(jīng)在該模型中在系統(tǒng)遞送時有效減少疼痛。來自該工作的結(jié)果顯示在圖8中。測試肽KP-1586，而非對照肽，在通過皮下滲透泵遞送許多天時，在改進(jìn)的Chung模型中抑制熱痛覺過敏。所述抑制作用是劑量依賴性的，其最初劑量是10-50pmol/日?？?痛覺過敏作用早在植入后第二天就成為可測量的，且在持續(xù)化合物遞送的條件下持續(xù)至少一周。在相同模型中，慢性皮下遞送KP-1586而非對照肽KP-1587，抑制機械異常性疼痛。該抑制在一些觀察機會中，具體地在建模后第7天的測試中是劑量依賴性的。抗-異常性疼痛作用早在植入后的那天就成為可測量的。KP-1586在鞘內(nèi)施用后，還能夠在Chung模型中改善疼痛響應(yīng)。該藥物在這種模型中的功效在單次推注施用后持續(xù)至少90分鐘。實施例7利用修飾的sPKC抑制肽減輕慢性炎性疼痛足底內(nèi)施用角叉藻聚糖后5天對大鼠爪使用前列腺素E2(PGE2)通過炎性機制導(dǎo)致急性和慢性疼痛。如圖9中所示，局部遞送本文中所述的化合物能夠減輕疼痛響應(yīng)的發(fā)展。代表性化合物是KP-1586，其在通過皮內(nèi)施用時，能夠逆轉(zhuǎn)角叉藻聚糖的疼痛作用，而對照肽KP-1587不能。實施例8皮下ePKC抑制劑逆轉(zhuǎn)炎性疼痛在機械疼痛模型中測試足底內(nèi)施用角叉藻聚糖后1小時皮下推注施用KP-1634，從而證明sPKC對爪縮回的抑制作用。如圖10中所示，爪縮回閾值在施用該抑制劑后顯著增高，而對照肽KP-1587不誘導(dǎo)該相同的作用。實施例9利用皮下施用sPKC抑制肽預(yù)防神經(jīng)性疼痛在Chung模型中使用sPKC肽KP-1586測試皮下施用的sPKC抑制肽預(yù)防神經(jīng)性疼痛的能力。測試肽以l,10,50，禾B100pmol/日施用。來自該工作的結(jié)果顯示在圖11中。測試肽KP-1586，而非對照肽1587，在改進(jìn)的Chung模型中通過皮下滲透泵遞送并在手術(shù)后l，3和5天測試時，抑制熱痛覺過敏。38實施例10利用皮下施用ePKC抑制肽逆轉(zhuǎn)神經(jīng)性疼痛在Chung模型中使用sPKC肽KP-1586測試皮下施用的sPKC抑制肽逆轉(zhuǎn)神經(jīng)性疼痛的能力。測試肽以O(shè).l，1，10,50,1000pmol/日施用。來自該工作的結(jié)果顯示在圖12中。圖13顯示通過利用泵皮下輸注以lOpmole/曰施用的抑制劑的作用，所述泵是在橫斷事件后7天時植入的。實施例11交感神經(jīng)末梢在大鼠中由抑制劑PKC￡抑制角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏中的作用X-角叉藻聚糖(CaiT)-誘導(dǎo)的炎性疼痛涉及交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)的活性。由于交感神經(jīng)神經(jīng)元，如感覺神經(jīng)元，富含蛋白激酶C的￡同工酶(sPKC)，且由于￡P(guān)KC抑制劑減輕Carr-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏，所以假設(shè)ePKC抑制劑需要交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)(SPGN)末梢的作用機制。通過使用BasileAnalgesymeter對輕微受限的大鼠量化感受傷害的屈肌反射(Randall-Selitto測試)。炎性痛覺過敏由注射Carr(l%，5uL,i.d.)誘導(dǎo)，所述Carr是在施用化合物前1小時單側(cè)注射到后爪背中的。sPKC抑制肽(eVl-2)通過系統(tǒng)途徑注射。皮下注射sVl-2劑量依賴性地抑制Carr-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏，其與施藥位點無關(guān)(身體同側(cè)或?qū)?cè)后肢或背部軀干)。相反，當(dāng)遠(yuǎn)離坐骨和隱神經(jīng)的橫斷皮下施用sVl-2時，不再存在對Carr-誘導(dǎo)的對側(cè)爪的機械痛覺過敏的抑制。該結(jié)果提示這些神經(jīng)中緊張神經(jīng)元信號傳導(dǎo)可以是eVl-2的作用位點。此外，在實驗前7天手術(shù)摘除雙側(cè)腰部交感神經(jīng)鏈(L2-L4)和雙側(cè)腎上腺神經(jīng)節(jié)完全消除eVl-2的抗-痛覺過敏作用。手術(shù)交感神經(jīng)切除術(shù)的作用通過使用腎上腺素能拮抗劑諸如酚妥拉明(10ug,s.c.注射于對側(cè)肢，在即將Carr注射前)模擬。來自該研究的結(jié)果提示sPKC的作用機制，并證明系統(tǒng)遞送的sVl-2的抗-痛覺過敏作用。這些結(jié)果支持ePKC抑制劑作為炎性疼痛的新型療法的潛在發(fā)展。實施例12利用選擇性調(diào)節(jié)蛋白激酶C的肽調(diào)節(jié)疼痛響應(yīng)已知人-角叉藻聚糖(Carr)-誘導(dǎo)的炎性疼痛涉及交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)的活性。由于交感神經(jīng)神經(jīng)元，如感覺神經(jīng)元，富含蛋白激酶C的s同工酶(sPKC)，并且由于sPKC抑制劑減輕Carr-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏，所以假設(shè)ePKC抑制劑作用的機制需要交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)(SPGN)末梢。通過使用BasileAnalgesymeter對輕微受限的大鼠量化感受傷害的屈肌反射(Randall-Selitto測試)。炎性痛覺過敏由注射Carr(l%，5uL，i.d.)誘導(dǎo)，所述Carr是在施用化合物前1小時單側(cè)注射到后爪背中的。sPKC抑制肽(sVl-2)通過系統(tǒng)途徑注射。皮下注射sVl-2劑量依賴性地抑制Carr-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏，其與施藥位點無關(guān)(身體同側(cè)或?qū)?cè)后肢或背部軀干)。相反，當(dāng)遠(yuǎn)離坐骨和隱神經(jīng)的橫斷皮下施用eV,.2時，不再存在對Carr-誘導(dǎo)的對側(cè)爪的機械痛覺過敏的抑制。該結(jié)果提示這些神經(jīng)中緊張神經(jīng)元信號傳導(dǎo)可以是sV,-2的作用位點。此外，在實驗前7天手術(shù)摘除雙側(cè)腰部交感神經(jīng)鏈(L2-L4)和雙側(cè)腎上腺神經(jīng)節(jié)完全消除eVw的抗-痛覺過敏作用。手術(shù)交感神經(jīng)切除術(shù)的作用通過使用腎上腺素能拮抗劑諸如酚妥拉明(10ug,s.c.注射于對側(cè)肢，在即將Carr注射前)模擬。參見圖14-17。實施例12KAI-1678的非臨床藥理學(xué)已經(jīng)在大鼠炎性疼痛(角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的疼痛)和神經(jīng)性疼痛(L5脊神經(jīng)橫斷)模型中評估了KAI-1678減輕異常性疼痛、對正常無害刺激提高的響應(yīng)、和痛覺過敏、對疼痛剌激提高的響應(yīng)的能力。在角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中，局部皮內(nèi)施用KAI-1678顯示出有效減輕機械痛覺過敏。然而，皮內(nèi)施用KAI-1678到遠(yuǎn)處位點是同等有效的；這提示局部施用KAI-1678可以提供全系統(tǒng)范圍的疼痛減輕。該結(jié)論得到這樣的觀察結(jié)果的支持，即KAI-1678在以皮下施用時是有效的，無論是推注還是持久的輸注，到動物的任何位點，包括遠(yuǎn)離角叉藻聚糖注射位點的那些。40盡管KAI-1678似乎具有全系統(tǒng)范圍的活性，但是靜脈內(nèi)輸注該化合物，即使以足以獲得是在獲得最大功效的皮下輸注結(jié)束時測量的血漿穩(wěn)定水平的5-10倍高的血漿穩(wěn)定水平的給藥速度，也不抑制角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏。對KAI-1678的位點作用的說明正在進(jìn)行中，但是兩個觀察結(jié)果幫助定義該化合物的靶標(biāo)。手術(shù)破壞角叉藻聚糖注射位點對側(cè)后肢上的坐骨和隱神經(jīng)消除遠(yuǎn)離而非接近神經(jīng)破壞位點施用的化合物的活性，這提示需要功能性神經(jīng)支配化合物的注射位點以獲得功效。另外的研究說明KAI-1678在遠(yuǎn)離創(chuàng)傷位點施用時具有活性需要完整無損的交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)和(x腎上腺素能受體信號傳導(dǎo)。由這些研究產(chǎn)生一種假說，即KAI-1678作用在注射位點處的局部神經(jīng)上，可能在真皮或表皮中，且通過未確定的機制，引起遞減的疼痛-抑制信號，所述信號取決于a腎上腺素能受體信號傳導(dǎo)。在用于研究KAI-1678在神經(jīng)性疼痛中的功效的L5脊神經(jīng)橫斷單神經(jīng)性疼痛模型中獲得與在角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中獲得的那些相類似的結(jié)果。在的L5脊神經(jīng)橫斷單神經(jīng)性疼痛模型中，皮下施用KAI-1678導(dǎo)致創(chuàng)傷-誘導(dǎo)的異常性疼痛水平的降低。然而，盡管KAI-1678在這兩種神經(jīng)性疼痛模型中均具有活性，但是最大響應(yīng)和獲得最大響應(yīng)所需的劑量在這兩種模型中充分變化。在這些研究中，由L5神經(jīng)橫斷誘導(dǎo)的創(chuàng)傷似乎更易受使用KAI-1678處理的影響，因為創(chuàng)傷-誘導(dǎo)的異常性疼痛的完全逆轉(zhuǎn)利用皮下推注或輸注施用低總劑量的化合物實現(xiàn)?？傊桥R床藥理學(xué)研究支持KAI-1678在炎性和神經(jīng)性疼痛中的活性。這些研究還提示最大效應(yīng)和獲得最大效應(yīng)所需要的劑量可以根據(jù)導(dǎo)致疼痛的創(chuàng)傷類型和來源變化。正在努力確定在各種這些模型中的作用位點和作用機制。KAI-1678在角叉藻聚糖炎性疼痛模型中的活性大鼠角叉藻聚糖模型己經(jīng)廣泛用于評估對炎性疼痛調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)。在用于以下所述研究的模型中，單次5pL注射1%角叉藻聚糖溶液到右后爪的足底表面中用于引起導(dǎo)致局部浮腫和機械痛覺過敏的炎性響應(yīng)。機械痛覺過敏如前述利用響應(yīng)角叉藻聚糖注射位點處機械疼痛刺激的感受傷害的屈肌反射的測量(Randall-Selitto爪縮回測試)來量化。在這些研究中使用的條件下，Randall-Sdi加測試中的爪縮回閾值(PWT)典型地由角叉藻聚糖注射前的90g減至在對未處理動物角注射角叉藻聚糖后1小時測量的55g。在不存在其他處理的條件下，PWT保持穩(wěn)定在55g持續(xù)數(shù)小時，這使得可能使用該模型在形成疾病狀態(tài)后至少6小時的期間內(nèi)評估響應(yīng)處理的時間進(jìn)程。皮內(nèi)施用KAI-1678以前的出版物報告了局部皮內(nèi)施用KAI-1678類似物在角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中有效。為了確定皮內(nèi)施用KAI-1678在該模型中是否具有活性，對右后爪中注射角叉藻聚糖后1小時的大鼠使用皮內(nèi)注射10或100mcg/kgKAI-1678到與角叉藻聚糖注射的同一(身體同側(cè))后爪或另一只(對側(cè))后爪中進(jìn)行處理。如圖18中所示，皮內(nèi)施用10mcg/kgKAI-1678到身體同側(cè)位點能夠完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏，正如PWT恢復(fù)到角叉藻聚糖前的水平的事實所表明的。施用100mcg/kgKAI-1678到身體同側(cè)位點比10mcg/kg劑量更有效，其增高PWT超過角叉藻聚糖前的水平，并維持PWT處于或高于角叉藻聚糖前水平一段較長的時期。引人注目地，KAI-1678的作用證明對機械痛覺過敏作用的迅速開始，在施用10mcg/kg劑量后5分鐘時基本上逆轉(zhuǎn)，并在施用100mcg/kg劑量后5分鐘時間點時完全逆轉(zhuǎn)。皮內(nèi)施用KAI-1678到對側(cè)后爪也能夠完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏，其在各劑量的最大逆轉(zhuǎn)程度與對身體同側(cè)后爪施用相同劑量所觀察到的類似(圖18)。值得注意地，如在接近角叉藻聚糖注射位點施用KAI-1678的情形中，皮內(nèi)施用KAI-1678到對側(cè)爪分別在關(guān)于較低和較高劑量的5分鐘時間點時，導(dǎo)致接近的或完全的逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏作用的迅速開始。然而，作用的持續(xù)時間上存在差別，與對側(cè)后爪相比，當(dāng)KAI-1678施用于身體同側(cè)后爪時該作用在這兩種劑量水平均更持久。雖然局部(身體同側(cè))施用與KAI-1678在結(jié)構(gòu)相關(guān)的選擇性肽sPKC抑制劑的功效在以前有所報告，但是沒有預(yù)期關(guān)于皮內(nèi)施用KAI-1678到對側(cè)后爪同樣有效的說明。該結(jié)果提示在遠(yuǎn)處位點局部施用KAI-1678基于其在炎性疼痛模型中減輕機械痛覺過敏的能力，可以引起全系統(tǒng)范圍的疼痛抑制。皮下施用KAI-1678皮下施用KAI-1678，從而測試通過該途徑施用該化合物是否可以在角叉藻聚糖炎性疼痛模型中抑制機械痛覺過敏。如圖19中所示，在對側(cè)后肢大腿皮下推注施用KAI-1678導(dǎo)致對疼痛響應(yīng)的劑量依賴性抑制，低至0.1mcg/kg的劑量短期完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏。在高至100mcg/kg的劑量下，響應(yīng)的持續(xù)時間增加。然而，在高于100mcg/kg的劑量下，響應(yīng)的持續(xù)時間隨劑量增加而減少，這提示關(guān)于持續(xù)時間的拋物線型劑量-應(yīng)答。還用100mcg/kgKP-1723，即無活性對照肽對動物組給藥(見上)。如圖19中所示，KP-1723對機械痛覺過敏無作用，這說明對KAI-1678觀察到的作用不是載體部分的非特異性作用的結(jié)果。為了確定以皮下推注施用KAI-1678的位置是否影響其在該模型中的活性，對角叉藻聚糖-注射的大鼠，在角叉藻聚糖注射后1小時的時候，將10mcg/kg皮下推注的KAI-1678給藥到接近角叉藻聚糖注射位點的身體同側(cè)后肢、對側(cè)后肢、或?qū)?cè)后肢以上的中間軀干中。4小時后，對各動物給藥第二次10mcg/kg皮下施用的化合物到不同位置，作為關(guān)于可能的動物-與-動物之間可變性的對照。圖20中所示的結(jié)果顯示第一劑量化合物的功效類似，與化合物施用的位點無關(guān)，且使用第二劑量的響應(yīng)持續(xù)時間相對于第一次施用減小。該后者觀察結(jié)果提示重復(fù)皮下推注施藥可以導(dǎo)致快速抗藥反應(yīng)。與該觀察結(jié)果相一致，重復(fù)施用KAI-1678的oPKC抑制劑類似物顯示出響應(yīng)量級和持續(xù)時間的減小，其與施用之間的時間長度反相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。明顯快速抗藥反應(yīng)的基礎(chǔ)正處于研究中。圖17(皮內(nèi)給藥)中所示結(jié)果與圖18(皮下給藥)中所示結(jié)果的比較顯示這兩種施藥途徑均導(dǎo)致迅速的響應(yīng)，其在早在以較高劑量給藥后5分鐘時發(fā)生完全逆轉(zhuǎn)機械角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的痛覺過敏。然而，皮下推注施用后的作用持續(xù)時間比鄰近角叉藻聚糖注射位點皮內(nèi)施藥觀察到的更短。在試圖延長抗-痛覺過敏作用持續(xù)吋間中，從皮內(nèi)注射角叉藻聚糖后1小時開始，以皮下輸注將KAI-1678施用于大鼠。如圖21中所示，皮下輸注KAI-1678以劑量依賴性方式延長響應(yīng)的持續(xù)時間。然而，對皮下輸注的響應(yīng)以兩個階段發(fā)生。第一階段，持續(xù)約1小時，由在全部測定的劑量迅速和完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏組成。第二階段，典型地在開始輸注后2-3小時之間形成，是劑量依賴性的，其伩在較高劑量(225mcg/kg/hr)的KAI-1678時完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏，如爪縮回閾值恢復(fù)到角叉藻聚糖前的基線水平所示。在250mcg/kg/hr下，疼痛的逆轉(zhuǎn)是迅速的，且在無任何痛覺過敏復(fù)發(fā)的條件下維持；盡管在輸注過程中，在開始輸注后60分鐘觀察到爪縮回閾值的少量下降。值得注意地，KAI-1678的25,000mcg/kg/hr給藥速度在隨后的皮下輸注實驗中測試。該給藥速度，其是圖21中所示的實驗中測定的？50mcg/kg/hr給藥速度的100倍，產(chǎn)生與用該250mcg/kg/hr輸注觀察到的作用相當(dāng)?shù)淖饔?數(shù)據(jù)未顯示)。因此，皮下輸注KAI-1678似乎不顯示在該模型中以皮下推注施用該化合物時觀察到的拋物線劑量-響應(yīng)(見圖19)。當(dāng)皮下輸注速度S25mcg/kg/小時，第二階段過程中獲得的功效在輸注期間內(nèi)維持，但在輸注結(jié)束后被迅速逆轉(zhuǎn)(圖21)。如下所述，血漿KAI-1678水平在皮下輸注結(jié)束時下降，但具有30分鐘的最終半衰期。因此，在皮下輸注結(jié)束時功效的下降似乎比血槳濃度的降低更迅速，這暗示血漿濃度不是確定功效的主要因素。靜脈內(nèi)施用KAI-1678上述皮內(nèi)和皮下研究顯示KAI-1678在施用于遠(yuǎn)離創(chuàng)傷位點的位點處時是有效的，這提示該化合物可以具有全系統(tǒng)范圍的效應(yīng)。我們因此研究通過靜脈內(nèi)(IV)途徑系統(tǒng)施用KAI-1678在角叉藻聚糖炎性疼痛模型中是否有效?；谒幬飫恿W(xué)實驗的結(jié)果(見下)，選擇在這些研究中使用的IV輸注給藥速度，以獲得匹配或超越與完全有效的皮下輸注KAI-1678有關(guān)的那些的血槳KAI-1678水平(例如，225mcg/kg/hr)。如圖22中所示，以高達(dá)1000mcg/kg/hr的速度IV輸注KAI-1678長達(dá)5小時對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏無作用。盡管沒有采集血漿樣品作為這些功效研究的一部分，但是藥物動力學(xué)研究提示處于100mcg/kg/hrIV給藥速度的血漿KAI-1678水平應(yīng)該近似或高于用25mcg/kg/hr皮下輸注獲得的那些(圖20)，且處于1，000mcg/kg/hrIV給藥速度的血漿KAI-1678水平應(yīng)該是比用250mcg/kg/hr皮下輸注獲得的那些高5-10倍。IVKAI-1678不能影響角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的痛覺過敏似乎不歸因于任何技術(shù)問題，因為口服吲哚美辛，即一種顯示出減輕角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的痛覺過敏的已知止痛劑，在5-hrIV輸注KAI-1678結(jié)束后施用時完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏。而且，IV活性的缺乏似乎不是KAI-1678獨有的，因為在該模型中在皮內(nèi)或皮下施藥后有效的結(jié)構(gòu)相關(guān)￡P(guān)KC抑制劑在IV輸注施藥時無活性(數(shù)據(jù)未顯示)。'大鼠角叉藻聚糖模型中關(guān)于KAI-1678作用位點的研究KAI-1678似乎引起全系統(tǒng)范圍的響應(yīng)，但僅當(dāng)皮內(nèi)或皮下施用時引起的表現(xiàn)提示該化合物的主要作用位點可以在外周。該假說，結(jié)合關(guān)于對KAI-1678的響應(yīng)非常迅速，甚至在將該化合物施用于對側(cè)肢時的觀察結(jié)果，提示在化合物施用位點處皮膚中的傳入神經(jīng)可能對作用的迅速開始是必要的。因為通過對側(cè)后肢上皮膚中的外周傳入神經(jīng)傳播的信號應(yīng)該必須通過坐骨和隱神經(jīng)傳輸，從而影響身體同側(cè)后爪上的角叉藻聚糖注射位點處的機械痛覺過敏，研究了對化合物施用側(cè)完整無損的坐骨和隱神經(jīng)的需要。在圖23中所示的實驗中，從大鼠左后腿摘除1-cm的坐骨和隱神經(jīng)片段。次日，當(dāng)大鼠從手術(shù)中恢復(fù)過來后，將角叉藻聚糖注射到大鼠的右后爪的足底表面，從而引起炎性應(yīng)答。注射角叉藻聚糖到右后爪后60分鐘，將KAI-1678以皮下輸注施用到左后肢上接近或遠(yuǎn)離摘除l-cm坐骨和隱神經(jīng)片段位點的位點。如圖23中所示，當(dāng)化合物施用位點接近而非遠(yuǎn)離神經(jīng)橫斷位點時，25mcg/kg/hr皮下輸注KAI-1678有效消除角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏。與過去的數(shù)據(jù)(圖21)相比，針對接近坐骨和隱神經(jīng)橫斷位點施用的KAI-1678的響應(yīng)類似于在通過手術(shù)首次用于實驗的大鼠中觀察到的應(yīng)答(見圖21)，盡管第二階段活性的開始似乎在接近神經(jīng)橫斷位點皮下輸注施用KAI-1678的大鼠中更迅速。盡管手術(shù)過程的其他次生效應(yīng)可能影響了對遠(yuǎn)離神經(jīng)橫斷位點的皮下輸注的響應(yīng)，但是該實驗的結(jié)果提示KAI-1678功效需要施藥位點處的神經(jīng)支配。因為坐骨和隱神經(jīng)45含有運動神經(jīng)元、初級感覺傳入神經(jīng)元、和交感神經(jīng)神經(jīng)元，這些數(shù)據(jù)不容許我們將作用明確地分配到這些神經(jīng)元子集之一。該發(fā)現(xiàn)提示1678可以作用于"正常"神經(jīng)元，從而傳遞主要引起全系統(tǒng)范圍疼痛抑制的信號。該調(diào)節(jié)可以發(fā)生背角中；然而，當(dāng)將KAI-1678施用于受到疼痛剌激影響的皮區(qū)以外的位點時觀察到功效，這提示全系統(tǒng)范圍的疼痛抑制發(fā)生在脊髓水平以上(見下)。早期的研究報告了來自交感腎上腺系統(tǒng)的兒茶酚胺參與角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的炎性疼痛，且sPKC表達(dá)在交感神經(jīng)系統(tǒng)中。我們因此研究是否需要完整無損的交感腎上腺系統(tǒng)來維持遠(yuǎn)處施用的KAI-1678的功效。如圖24中所示，雙側(cè)腰部交感神經(jīng)切除術(shù)加腎上腺神經(jīng)節(jié)截除術(shù)不改變針對角叉藻聚糖的疼痛響應(yīng)。然而，以25mcg/kg/hr皮下輸注施用于對側(cè)后肢的KAI-1678逆轉(zhuǎn)角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的機械痛覺過敏的能力在這些動物中消失。如圖24中所示，交感神經(jīng)切除術(shù)和腎上腺神經(jīng)節(jié)截除術(shù)消除針對皮下KAI-1678輸注的雙階段響應(yīng)的早期和后期階段。在先前關(guān)于包含nVl-2的KAI-1678類似物的實驗中，我們還證明了外科交感神經(jīng)切除術(shù)，如上所述，消除以推注注射施用于遠(yuǎn)處的皮下位點、以及鄰近創(chuàng)傷的皮內(nèi)位點的sPKC抑制劑的作用。上述交感神經(jīng)切除術(shù)實驗需要進(jìn)行手術(shù)干涉和在用角叉藻聚糖干涉前使動物恢復(fù)l周。如圖24中所示，無交感神經(jīng)切除術(shù)的假手術(shù)，可以部分地減小KAI-1678的功效。因此，我們試圖通過研究藥理學(xué)阻斷交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用來補充該研究，這是通過使用cc-腎上腺素能拮抗劑酚妥拉明實現(xiàn)的，由此消除對手術(shù)的需要。在角叉藻聚糖注射時施用該試劑不影響疼痛的形成，盡管消除了遠(yuǎn)處位點皮下推注施用包含nVl-2的KAI-1678類似物的作用，并也消除皮內(nèi)局部施用到傷害位點的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，包含口Vl-2的KAI-1678類似物在第二種神經(jīng)性疼痛模型中在皮下推注施用后的功效也通過預(yù)先施用酚妥拉明消除，盡管，同樣地，酚妥拉明不妨礙該模型中疼痛的形成(數(shù)據(jù)未顯示)。因此手術(shù)切除交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)和藥理學(xué)阻斷a腎上腺素能受體阻斷sPKC抑制劑的抗-痛覺過敏活性。這些作用是否反映在CNS中對交感神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)或?qū)δI上腺素能受體信號傳遞的依賴性尚不清楚。角叉藻聚糖炎性疼痛模型研究的總結(jié)以上數(shù)據(jù)證明KAI-1678在皮下施用于傷害位點和皮內(nèi)或皮下施用于遠(yuǎn)處位點時，可以逆轉(zhuǎn)炎性疼痛。使用靜脈內(nèi)施藥沒有觀察到功效，即使處于與在有效的皮下輸注過程中獲得的那些相等的KAI-1678血漿水平。我們還證明了遠(yuǎn)處位點的皮下KAI-1678功效取決于施藥位點處的神經(jīng)支配，這提示KAI-1678的遠(yuǎn)處位點功效通過對在施藥位點處暴露于KAI-1678的皮下神經(jīng)元的作用而介導(dǎo)。解釋這些數(shù)據(jù)的一種假說是，通過對皮膚痛覺感受器的作用，KAI-1678引起初級傳入神經(jīng)元中升高的信號，其起始脊椎或脊椎上反射，最終導(dǎo)致對角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的痛覺過敏遞減的疼痛抑制。備選地，KAI-1678可以通過減小注射位點處神經(jīng)元中的緊張信號傳導(dǎo)發(fā)揮作用，且該抑制可以導(dǎo)致遞減的疼痛抑制。遞減的調(diào)節(jié)可以涉及a腎上腺素能信號傳導(dǎo)，其應(yīng)該與酚妥拉明對KAI-1678功效的作用相一致。因此，在脊髓中，沒有從遞減的途徑中釋放的腎上腺素通過對初級傳入痛覺感受器中央末梢上的(x-2A-腎上腺素受體的抑制作用(突觸前抑制)，通過對疼痛中間神經(jīng)元的直接a-2-腎上腺素能作用(突觸后抑制)，和通過(x-l-腎上腺素受體-介導(dǎo)的抑制性中間神經(jīng)元活性而抑制疼痛。該假說與其他ePKC作用模型相反，在所述其他sPKC作用模型中提議了關(guān)于sPKC響應(yīng)炎性刺激，在初級傳入神經(jīng)末梢調(diào)節(jié)膜通道和膜去極化中的作用。KAI-1678在神經(jīng)性疼痛模型中的活性在L5橫斷模型或改善的Chung模型評估了KAI-1678的活性，所述改善的Chung模型是一種單神經(jīng)性疼痛模型，其中手術(shù)橫斷L5脊神經(jīng)，其導(dǎo)致迅速形成持續(xù)的疼痛。KAI-1678在該模型中的活性記述在下文中。KAI-1678在大鼠L5脊神經(jīng)橫斷單神經(jīng)性疼痛模型中的活性大鼠L5脊神經(jīng)橫斷模型己用于評估對神經(jīng)性疼痛的調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)。在以下所述的研究中，手術(shù)橫斷L5脊神經(jīng)用于引起特征為神經(jīng)性疼痛的機械異常性疼痛、機械痛覺過敏和熱痛覺過敏。在該模型中，神經(jīng)性作用在一天內(nèi)形成，并被報告持續(xù)l-2個月。機械異常性疼痛和機械痛覺過敏利用校準(zhǔn)的vonFrey絲引起屈肌縮回應(yīng)答(爪縮回應(yīng)答)測量，這是通過將它們壓在神經(jīng)橫斷同側(cè)后爪的足底表面上實現(xiàn)的。使用2g，6g和lOgvonFrey絲評估異常性疼痛，因為這些刺激對通常對首次用于實驗的動物無害。使用15g,26gand60g的絲評估痛覺(對有害刺激的應(yīng)答)，因為這些刺激在首次用于實驗的動物中引起爪縮回，并被認(rèn)為代表疼痛刺激。神經(jīng)橫斷后疾病狀態(tài)的存在基于用2g和10g的絲進(jìn)行的測試驗證。當(dāng)用總共3組，每組10次測試(總共30次測試)進(jìn)行測試時，響應(yīng)2gvonFrey絲的爪縮回典型地由神經(jīng)損傷前的1-2次增加到手術(shù)后的12-15次爪縮回。類似地，響應(yīng)10g絲的爪縮回次數(shù)典型地由神經(jīng)損傷前的2-3次增加到手術(shù)后的20-23次爪縮回。在不存在其他處理的條件下，機械異常性疼痛保持穩(wěn)定至少3周，這使得使用該模型評估響應(yīng)推注施用或長期輸注的處理的時間進(jìn)程成為可能，其連續(xù)的測量典型在形成疾病狀態(tài)后1-2周的期間內(nèi)進(jìn)行。一旦證實了疾病狀態(tài)，機械異常性疼痛或痛覺過敏程度的評估通過觀察針對5次利用各種vonFrey絲的測試應(yīng)答的爪縮回次數(shù)確定。結(jié)果典型地表示為關(guān)于異常性疼痛絲(2g,6g和10g，總共15次測試)或痛覺絲(15g,26g和60g，總共15次測試)的爪縮回總數(shù)，或表示為組中的動物在5次使用特定絲的測試中具有定義為S3次縮回的平均陽性應(yīng)答的最低的絲。連同測量化合物處理對機械異常性疼痛和痛覺過敏的作用，利用Hargreaves測試，在該模型中確定了熱痛覺水平響應(yīng)L5脊神經(jīng)橫斷的變化。在這些研究中，將大鼠置于放射熱源上的玻璃表面上，所述放射熱源集中在受影響的后爪的橫向足底表面。當(dāng)打開熱源時，玻璃表面隨著時間升溫。直到動物抬起其后爪的時間(爪縮回反應(yīng)時間，以秒測量)是熱痛覺的指示。在本研究使用的條件下，爪縮回反應(yīng)時間由神經(jīng)損傷前的10-12秒縮短到L5神經(jīng)橫斷后的6-8秒，這指示熱痛覺過敏的形成。在不存在其他處理的條件下，熱痛覺過敏保持穩(wěn)定至少3周。皮下施用KAI-167848在橫斷后第7天，用推注皮下給藥0.00025—0.25mcg/大鼠(0.001-1mcg/kg)范圍內(nèi)的KAI-1678處理L5脊神經(jīng)橫斷的大鼠。在施用該化合物之前和之后至多3小時，基于針對6種不同vonFrey絲的爪縮回次數(shù)，評估機械異常性疼痛和痛覺過敏的程度。為了比較，一些大鼠用0.250mcg/大鼠(1mcg/kg)KP-1723，即KAI-1678的無活性類似物給藥。如圖25中所示，KAI-1678處理在劑量20.01mcg/kg時，導(dǎo)致機械異常性疼痛和機械痛覺過敏的劑量依賴性減小d基于用15g,26g禾卩60gvonFrey絲的綜合測量(圖25，左)，KAI-1678在0.1和1mcg/kg完全逆轉(zhuǎn)機械痛覺過敏，如回到手術(shù)前的應(yīng)答所表示的。在這兩種劑量下痛覺過敏的完全逆轉(zhuǎn)在化合物施用后30-60分鐘之間觀察到，且觀察到抗-痛覺過敏作用持續(xù)至少2小時。與使用KAI-1678獲得的結(jié)果相反，KP-1723處理在1mcg/kg下對機械痛覺過敏無作用。在使用2g，6g和10gvonFrey絲測量KAI-1678對L5-橫斷-誘導(dǎo)的機械異常性疼痛的作用時，獲得與上述類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)通過確定在5次刺激中引起3次爪縮回的最小vonFrey絲測量爪縮回閾值時，KAI-1678在該模型中的功效也很明顯(圖25，右)。為了確定KAI-1678在該模型中的功效是否隨著持續(xù)遞送、皮下暴露而延長，將遞送0.00025-0.25mcg/B(~0.001-1mcg/kg/日)KAI-1678或0.25mcg/日(1mcg/kg/日)KAI-1723的滲透小泵，在橫斷后第2天皮下植入肩胛骨之間。機械異常性疼痛在橫斷后第3,5,7,9，11天(泵植入后第1,3,5,7,9天)利用2g和10g的絲測量。如圖26(左)中所示，來自使用10g絲的測試結(jié)果顯示KAI-1678給藥速度^).0025mcg/日(0.01mcg/kg/日)能夠充分減小機械異常性疼痛水平，其中0.025和0.25mcg/day(0.1禾口1mcg/kg/hr)給藥速度產(chǎn)生接近完全的機械異常性疼痛逆轉(zhuǎn)，該逆轉(zhuǎn)持續(xù)直到泵植入后的第7天。以最高給藥速度時，在遲至橫斷后第11天觀察到減小機械異常性疼痛的證據(jù)。利用2g絲獲得類似的結(jié)果，從而評估機械異常性疼痛(數(shù)據(jù)未顯示)，并利用Hargreaves測試評估熱痛覺過敏(圖26，右)。在含有KAI-1678的泵的存在下，痛覺過敏完全逆轉(zhuǎn)約5天后，我們注意到功效的消失。這不歸因于對藥物的耐受，因為在這時皮下推注施用藥物引起疼痛的完全逆轉(zhuǎn)(數(shù)據(jù)未顯示)，且其可能是這樣的，即作用的消失歸因于泵未能保持遞送。神經(jīng)性疼痛模型研究的總結(jié)以上數(shù)據(jù)證明KAI-1678在L5脊神經(jīng)橫斷單神經(jīng)性疼痛模型中非常有效。皮下推注施用的KAI-1678在逆轉(zhuǎn)L5脊橫斷模型中的機械和熱異常性疼痛的效力相當(dāng)。當(dāng)通過皮下輸注施用時，KAI-1678比在角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中更有效約1000倍。關(guān)于L5-橫斷模型對KAI-1678處理的高靈敏性的原因尚未知，但是其可能反映該模型對選擇性sPKC抑制劑的響應(yīng)性，因為該模型對KAI-1678的結(jié)構(gòu)相關(guān)類似物表現(xiàn)出類似的高靈敏性。KAI-1678在兩種神經(jīng)性疼痛模型中具有活性的證明提示該化合物可能具有管理人中神經(jīng)性疼痛的臨床效用。來自大鼠藥理學(xué)研究的結(jié)論在大鼠炎性和神經(jīng)性疼痛模型中評估了KAI-1678的活性。皮下施用該化合物在所示模型中是有效的。通過皮下推注施用的KAI-1678的效力在模型之間是相似的，如測試的作用的迅速開始和持續(xù)時間，盡管在模型之間的總作用大小確實有變化。模型之間對不同輸注給藥速度的應(yīng)答也不同。具體地，L5橫斷單神經(jīng)性疼痛模型似乎對KAI-1678特別靈敏，其在該模型中具有活性的劑量比在角叉藻聚糖模型中低大約1000倍。在繼續(xù)使用這些模型的實驗的同時，在其他疼痛模型中進(jìn)行另外的工作。具體地，Brennan切口模型和單省(singlespared)神經(jīng)模型中的初步結(jié)果提示KAI-1678在這些模型中，在處于與在角叉藻聚糖模型中具有活性的那些相類似的劑量時也具有活性?？傊色@得的動物功效數(shù)據(jù)提示KAI-1678在多種疼痛模型中可以是有效的，且支持化合物的繼續(xù)開發(fā)。動物中的藥物動力學(xué)KAI-1678的藥物動力學(xué)在以靜脈內(nèi)推注和輸注或以皮下推注和輸注施用該化合物的大鼠中研究。KAI-1678的毒性動力學(xué)在以皮下輸注施用該化合物的狗中研究，作為毒性研究的一部分。在這些研究中，利用凱制藥(KAIPharmaceuticals)開發(fā)的基于夾心式的ELISA測定確定了血漿KAI-1678水平。該測定量化的下限是約0.3ng/mL。開發(fā)了類似的測定法以測量組織KAI-1678水平。在大鼠中，KAI-1678在靜脈內(nèi)推注施用后，迅速從系統(tǒng)循環(huán)中清除。當(dāng)以50mcg/kg/hr進(jìn)行2-小時靜脈內(nèi)輸注施用時，似乎在60分鐘時獲得約10-20ng/mL的穩(wěn)態(tài)血漿濃度，并在輸注結(jié)束時迅速下降。通過就那么途徑推注和輸注施用KAI-1678的最終半衰期分別是約50和25分鐘。以推注(約80或800mcg/kg)或輸注(19和190mcg/kg/hr)對大鼠皮下施用KAI-1678導(dǎo)致對測試的劑量的暴露與劑量成比例的增加。血漿KAI-1678濃度在分別對于皮下推注和輸注約IO分鐘和1小時達(dá)到最大，且然后一旦不再施用該肽，分別以約35和45分鐘的半衰期減小。通過皮下途徑施用的KAI-1678生物適用性在大鼠中約是10%。盡管最終半衰期不確定，但是KAI-1678在持續(xù)皮下輸注5天后施用KAI-1678的狗中也迅速從系統(tǒng)循環(huán)中清除。在該研究中，在來自在輸注結(jié)束時摘除的各種器官的(最著名地，腎、肝和肺)不同組織樣品中檢測KAI-1678，而腦和脊髓中的KAI-1678水平一貫很低。大鼠的藥物動力學(xué)靜脈內(nèi)施用為了最初表征KAI-1678在大鼠中的藥物動力學(xué)，通過尾靜脈以IV推注注射對雄性大鼠施用劑量為100禾P1,000mcg/大鼠(300和3,000mcg/kg)的KAI-1678。注射后至多2小時內(nèi)周期性采取血液樣品，以進(jìn)行KAI-1678水平的血漿分析。100和1,000mcg劑量組中分別有3和2只動物，且各劑量組中動物之間存在KAI-1678血漿濃度的一致性。如圖27中所示，KAI-1678的C皿血漿水平針對測試的劑量以與劑量成比例的方式增加。這些數(shù)據(jù)的初步分析顯示關(guān)于300mcg/kg和~3,000mcg/kg劑量水平的最終半衰期分別是約38和66分鐘。皮下施用通過將KAI-1678皮下推注或輸注施用于大鼠進(jìn)行了大部分動物功效研究。因此，基于血漿KAI-1678濃度的測量評估了通過皮下途徑施用的KAI-1678的藥物動力學(xué)。在圖29中所示的實驗中，以皮下推注注射(將20(^L注射到左后腿中)對雄性大鼠施用劑量25或250mcg/動物(分別地，約80和800mcg/kg)的KAI-1678。在施用該化合物后2小時內(nèi)在不同時間點獲取血液樣品，從而確定血漿KAI-1678濃度。25和250mcg/動物的劑量組中分別有3和4只動物，且各劑量組中動物之間KAI-1678血漿濃度測量值是一致的。Cmax發(fā)生在注射后IO分鐘內(nèi)，且針對兩種測試的劑量以與劑量成比例的方式增加。來自這些數(shù)據(jù)的初步最終半衰期評估對于兩種劑量水平均是35分鐘。關(guān)于以靜脈內(nèi)推注和以皮下推注施用的KAI-1678的血漿濃度對比時間曲線下面積的比較顯示通過皮下途徑施用的KAI-1678的生物適用性在大鼠中，在該施用位點處是約10%。在圖30中所示的實驗中，以持續(xù)皮下輸注2小時對雄性大鼠施用劑量為19和190mcg/kg/hr的KAI-1678。在貫穿輸注始終和輸注結(jié)束后1小時內(nèi)的不同時間點獲取血液樣品，從而確定血漿KAI-1678濃度。存在2只動物/劑量組，且各劑量組中動物之間的血漿KAI-1678濃度測量值相一致。以較低的給藥速度(19mcg/kg/hr)時，血漿濃度在60分鐘時達(dá)到穩(wěn)態(tài)(3ng/mL)，且在剩余輸注過程中保持相對恒定。以較高給藥速度(190mcg/kg/hr)時，血漿KAI-1678濃度在整個輸注過程中上升，且似乎在2小時輸注過程中不達(dá)到穩(wěn)定水平或穩(wěn)態(tài)(Cmax60ng/mL)。以這兩種給藥速度，血漿KAI-1678濃度在輸注結(jié)束后迅速下降，盡管在輸注結(jié)束后1小時，在這兩種劑量水平仍能檢測到化合物。圖28和圖30中的數(shù)據(jù)的比較顯示50mcg/kg/hr靜脈內(nèi)輸注KAI-1678會產(chǎn)生高于以19mcg/kg/hr皮下輸注獲得濃度(3ng/mL)和接近以190mcg/kg/hr皮下輸注所獲得的水平(60ng/mL)的化合物血漿濃度(10-20ng/mL)。有趣的是，這些劑量似乎與血漿濃度和功效無關(guān)，因為利用iv施用KAI-1678，即使以高于通過皮下輸注該化合物獲得最大功效所需劑量的劑量，沒有觀察到功效。狗的藥物動力學(xué)作為范圍-發(fā)現(xiàn)毒理學(xué)研究的一部分，以3,8and25mg/kg/日的劑量水平對6只畢爾格獵犬(1只/組)連續(xù)皮下輸注施用KAI-16785天。在第1天(輸注開始)和第6天(輸注結(jié)束后)的不同時間收集血液樣品。血漿KAI-1678濃度在輸注最初的4小時期間內(nèi)增加，且在大多數(shù)情形中，在第5天輸注結(jié)束時再增高2-3倍，這提示以測試的劑量水平皮下輸注4小時內(nèi)未達(dá)到穩(wěn)態(tài)(圖31)。然而，以所有劑量水平，血漿水平在停止輸注時迅速下降，盡管由于可獲得少量數(shù)據(jù)點，計算不出最終半衰期。作為該研究的一部分，在給藥結(jié)束時，從動物子集中收獲組織。制備和分析組織提取物，以確定KAI-1678的存在，其在來自兩個最高劑量組的組織子集中檢測肝、肺、腎、腦(大腦)、脊髓、注射位點(由皮膚及其下面的骨骼肌組成)、左前肢中的外周神經(jīng)、和腿中的肌肉(不接近輸注位點)。通常，主要器官(腎、肝和肺)中的組織KAI-1678水平隨著劑量增加而增加，且反映出在血漿水平中觀察到的差異。如預(yù)料到地，KAI-1678濃度在輸注位點皮膚中最高(即對于25,000mcg/kg/日的動物)，盡管其下面的肌肉具有相對低的水平。神經(jīng)系統(tǒng)(脊髓和尺骨神經(jīng))和外周組織(肌肉和皮膚)中的KAI-1678水平在動物和劑量組之間不太一致。在腦和脊髓中的水平，在許多剛剛高于量化界限的情形中，在極大程度上，一貫很低，這表明這些組織相對低地暴露于皮下輸注的KAI-1678。表4:在KAI-1678以25mg/kg/日皮下輸注施用5天的狗中的組織KAI-1678水平動物4001動物4501(25mg/kg/日雄性)(25mg/kg/曰雌性)平均值(ng標(biāo)準(zhǔn)平均值(ng標(biāo)準(zhǔn)KAI-1678/g組織)偏差KAI-1678/g組織)偏差腦6*1.271.3脊髓111.314013外周神經(jīng)4295615514月市254221364150肝224151505176腎689843054522骨骼肌13320334給藥位點肌肉111141003155給藥位點皮膚1139886165998*包括至少一個低于量化特定界限的數(shù)據(jù)點。5權(quán)利要求1.修飾的ε蛋白激酶C(εPKC)抑制性構(gòu)建體用于在受其痛苦的受試者中減少疼痛的用途，其中所述構(gòu)建體與原型序列相比更穩(wěn)定，更有效力，或二者。2.修飾的s蛋白激酶C(sPKC)抑制性構(gòu)建體用于在需要其的受試者中實現(xiàn)系統(tǒng)抗-痛覺過敏的用途，其包括通過皮下途徑將有效量的修飾的e蛋白激酶C(sPKC)抑制性構(gòu)建體施用于受試者，其中所述修飾的sPKC肽與原型序列相比更穩(wěn)定，更有效力，或二者，由此實現(xiàn)系統(tǒng)性抗-痛覺過敏。3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述受試者患有的疼痛選自由急性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛、和炎性疼痛組成的組。4.權(quán)利要求1或2的用途，其中增加的效力是由比所述原型序列更快開始作用或更長的活性持續(xù)時間引起的。5.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述修飾的sPKC抑制肽在受試者接受疼痛刺激之前、過程中、或之后施用于所述受試者。6.權(quán)利要求1或2的用途，其中將所述修飾的sPKC抑制肽施用于所述受試者，其中所述受試者患有慢性疼痛。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述抑制肽在疼痛刺激前5，10，15,20,25，30,35,40,45,50,55,一小時，數(shù)小時，一天，數(shù)天，一周，或數(shù)周施用。8.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述修飾的sPKC抑制肽直接或間接地與yPKC抑制肽共價連接。9.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述構(gòu)建體包括與細(xì)胞內(nèi)載體肽共價連接的sPKC抑制肽，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽、所述抑制肽、或二者在C-末端修飾。10.權(quán)利要求9的用途，其中所述抑制肽包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T，所述細(xì)胞內(nèi)載體肽包括氨基酸序列Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R，且所述抑制肽和所述細(xì)胞內(nèi)載體肽通過G-G連接形成線性肽。11.治療疼痛的方法，其包括將有效量的修飾的S蛋白激酶C(SPKC)抑制性構(gòu)建體施用于患有疼痛的受試者，其中所述構(gòu)建體與原型序列相比更穩(wěn)定，更有效力，或二者。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述受試者患有的疼痛選自由急性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛、和炎性疼痛組成的組。13.權(quán)利要求ll的方法，其中增加的效力是由比所述原型序列更快開始作用或更長的活性持續(xù)時間引起的。14.權(quán)利要求ll的方法，其中所述修飾的sPKC抑制肽在受試者接受疼痛刺激之前、過程中、或之后施用于所述受試者。15.權(quán)利要求ll的方法，其中將所述修飾的ePKC抑制肽施用于所述受試者，其中所述受試者患有慢性疼痛。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述抑制肽在疼痛刺激前5，10,15,20，25，30，35,40,45，50,55，一小時，數(shù)小時，一天，數(shù)天，一周，或數(shù)周施用。17.權(quán)利要求ll的方法，其中所述修飾的sPKC抑制肽直接或間接地與yPKC抑制肽共價連接。18.權(quán)利要求ll的方法，其中所述構(gòu)建體包括與細(xì)胞內(nèi)載體肽共價連接的sPKC抑制肽，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽、所述抑制肽、或二者在C-末端修飾。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抑制肽包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T，所述細(xì)胞內(nèi)載體肽包括氨基酸序列Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R，且所述抑制肽和所述細(xì)胞內(nèi)載體肽通過G-G連接形成線性肽。20.實現(xiàn)系統(tǒng)抗-痛覺過敏的方法，其包括通過皮下途徑將有效量的修飾的s蛋白激酶C(sPKC)抑制性構(gòu)建體施用于受試者，其中所述修飾的sPKC肽與原型序列相比更穩(wěn)定，更有效力，或二者，由此實現(xiàn)系統(tǒng)性抗-痛覺過敏。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述受試者患有的疼痛選自由急性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛、和炎性疼痛組成的組。22.權(quán)利要求20的方法，其中增加的效力是由比所述原型序列更快開始作用或更長的活性持續(xù)時間引起的。23.權(quán)利要求20的方法，其中所述修飾的sPKC抑制肽在受試者接受疼痛剌激之前、過程中、或之后施用于所述受試者。24.權(quán)利要求20的方法，其中將所述修飾的sPKC抑制肽施用于所述受試者，其中所述受試者患有慢性疼痛。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述抑制肽在疼痛刺激前5,10，15,20,25，30，35，40,45,50,55,—小時，數(shù)小時，一天，數(shù)天，一周，或數(shù)周施用。26.權(quán)利要求20的方法，其中所述修飾的sPKC抑制肽直接或間接地與yPKC抑制肽共價連接。27.權(quán)利要求20的方法，其中所述構(gòu)建體包括與細(xì)胞內(nèi)載體肽共價連接的sPKC抑制肽，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽、所述抑制肽、或二者在C-末端修飾。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抑制肽包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T，所述細(xì)胞內(nèi)載體肽包括氨基酸序列Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R，且所述抑制肽和所述細(xì)胞內(nèi)載體肽通過G-G連接形成線性肽。29.e蛋白激酶C(sPKC)抑制肽組合物，其包括與細(xì)胞內(nèi)載體肽共價連接的sPKC抑制肽，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽、所述抑制肽、或二者在C-末端修飾。30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述PKC抑制肽通過二硫鍵與所述細(xì)胞內(nèi)載體肽連接。31.權(quán)利要求29的組合物，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽是修飾的tat肽，其包括YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:)。32.權(quán)利要求29的組合物，其中所述胞內(nèi)載體肽是修飾的tat肽，其包括CYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:)。33.權(quán)利要求31或32的組合物，其中所述修飾的tat肽在其N-末端被?；③?、或磺酰基基團(tuán)取代。34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述修飾的tat肽在其N-末端?；?5.權(quán)利要求28的組合物，其中所述修飾的M肽進(jìn)一步在其C-末端修飾。36.權(quán)利要求28的組合物，其中所述抑制肽包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T和末端Cys。37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述末端Cys位于所述抑制肽的C-末順o38.權(quán)利要求29的組合物，其中所述tat肽通過在其C-末端形成酰胺進(jìn)一步修飾。39.權(quán)利要求29的組合物，其中所述PKC抑制肽共價連接于所述修飾的tat肽的氨基酸側(cè)鏈。40.權(quán)利要求39的組合物.，其中所述PKC抑制肽共價連接于選自半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸、和酪氨酸和谷氨酰胺的殘基的側(cè)鏈。41.權(quán)利要求29的組合物，其中所述PKC抑制肽在氨基末端修飾。42.權(quán)利要求29的組合物，其中所述PKC抑制肽共價連接于N-末端半胱氨酸殘基的側(cè)鏈。'43.權(quán)利要求29的組合物，其中所述tat肽的N-末端半胱氨酸是?；摹?4.權(quán)利要求29的組合物，其中所述tat肽的C-末端精氨酸是伯酰胺。45.權(quán)利要求41的組合物，其中所述PKC抑制肽在其N-末端通過?；揎棥?6.權(quán)利要求45的組合物，其中所述PKC抑制肽在其C-末端通過酰胺化修飾。47.權(quán)利要求29的組合物，其中所述所述tat肽是Ac-YGRKKRRQRRRC-NH2。48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述PKC抑制肽與所述tat肽通過所述tat肽的半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)共價連接。49.權(quán)利要求29的組合物，其中所述抑制肽包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T，所述細(xì)胞內(nèi)載體肽包括氨基酸序列Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R，且所述抑制肽和所述細(xì)胞內(nèi)載體肽通過G-G連接形成線性肽。50.權(quán)利要求29的組合物，其還包括第二膜轉(zhuǎn)運肽。51.線性治療肽，其包括載體肽和￡P(guān)KC抑制性貨物肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過肽鍵連接。52.權(quán)利要求51的線性治療肽，其還包括位于所述載體肽和所述貨物肽之間的連接肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過肽鍵與所述連接肽連接。53.權(quán)利要求52的線性治療肽，其中所述貨物和載體肽通過至少一個甘氨酸殘基連接。54.權(quán)利要求52的線性治療肽，其中所述肽包括序列EAVSLKPTGGYGRKKRRQRRR-NH2。55.權(quán)利要求52的線性治療肽，其中所述肽包括序列Ac-EAVSLKPTGGYGRKKRRQRRR-NH2。56.雜種肽蛋白激酶C(PKC)抑制肽組合物，其包括sPKC(sPKC)抑制肽；yPKC(yPKC)抑制肽;禾口細(xì)胞內(nèi)載體肽，其中所述ePKC抑制肽、所述yPKC抑制欣、和所述細(xì)胞內(nèi)載體肽共價連接。57.權(quán)利要求56的組合物，其中所述sPKC抑制肽、所述yPKC抑制肽、和所述細(xì)胞內(nèi)載體肽通過二硫鍵連接。58.權(quán)利要求56的組合物，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽是修飾的tat肽，其包括YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:)。59.權(quán)利要求56的組合物，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽是修飾的tat肽，其包括CYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:)。60.權(quán)利要求59的組合物，其中所述修飾的tat肽在其N-末端被?；?、烷基、或磺?；鶊F(tuán)取代。61.權(quán)利要求60的組合物，其中所述修飾的tat肽在其N-末端?；?。62.權(quán)利要求56的組合物，其中所述tat肽進(jìn)一步在其C-末端修飾。63.權(quán)利要求56的組合物，其中所述sPKC抑制肽包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T和末端Cys。64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述末端Cys位于所述抑制肽的C-末端。65.權(quán)利要求56的組合物，其中所述tat肽通過在其C-末端形成酰胺進(jìn)一步修飾。66.權(quán)利要求56的組合物，其中所述PKC抑制肽共價連接于所述修飾的tat肽的氨基酸側(cè)鏈。67.權(quán)利要求66的組合物，其中所述PKC抑制肽共價連接于選自半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、和酪氨酸和谷氨酰胺的殘基的側(cè)鏈。68.權(quán)利要求66的組合物，其中所述PKC抑制肽共價連接于N-末端半胱氨酸殘基的側(cè)鏈。69.權(quán)利要求66的組合物，其中所述tat肽的N-末端半胱氨酸是?；?。70.權(quán)利要求66的組合物，其中所述tat肽的C-末端精氨酸是伯酰胺。71.權(quán)利要求66的組合物，其中所述PKC抑制肽通過在其N-末端酰化，或在通過其C-末端酰胺化，或通過既在其N-末端?；乙苍谄銫-末端酰胺化進(jìn)行修飾。72.權(quán)利要求56的組合物，其中所述tat肽是Ac-YGRKKRRQRRRC-NH2。73.權(quán)利要求72的組合物，其中所述PKC抑制肽與所述tat肽通過所述tat肽的半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)共價連接。74.權(quán)利要求56的組合物，其還包括第二膜轉(zhuǎn)運肽。75.權(quán)利要求56的組合物，其中所述YPKC抑制肽包括氨基酸序列R-L-V-L-A-S。全文摘要本文中的公開內(nèi)容涉及修飾的εPKC抑制肽，產(chǎn)生所述肽的方法，和使用εPKC抑制肽治療疼痛的方法。文檔編號A61K38/00GK101678063SQ200880008422公開日2010年3月24日申請日期2008年1月22日優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日發(fā)明者尹凱文,德里克·麥克萊恩申請人:凱制藥公司