專利名稱：：2α-羥基取代白樺酮酸、其制備方法及其抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及2a-羥基取代白樺酮酸及其制備方法，本發(fā)明還公開了其抗腫瘤的用途。
背景技術(shù)：
：當(dāng)今臨床使用的抗腫瘤藥物中約40%藥物來源于植物，其中白樺酮酸對多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性，己成為抗腫瘤藥物理想的篩選對象。但白樺酮酸的官能團(tuán)較少，結(jié)構(gòu)修飾的位點(diǎn)有限，主要集中在A-環(huán)和E-環(huán)的20-位及28-位，對其他位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)修飾報(bào)道較少。微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物產(chǎn)生的特異酶對外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的特定生化反應(yīng)。微生物體系中可產(chǎn)生多種酶，催化不同的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。如氧化、還原、酯化、水解、環(huán)化、縮合及裂解等反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化具有高度的立體結(jié)構(gòu)選擇性，能專一地催化特定的反應(yīng)，是天然活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的一種有效方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)式I的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>命名為2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯。本發(fā)明同時(shí)也包括結(jié)構(gòu)式I的化合物的溶劑化物。2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯的13C-NMR數(shù)據(jù)如下表l2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯的13C-NMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>藥理試驗(yàn)證明，本發(fā)明的式I化合物具有優(yōu)異的抗腫瘤效果。本發(fā)明的式I化合物優(yōu)選用生物轉(zhuǎn)化方法以白樺酮酸為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備，方法如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>I為了尋找適宜轉(zhuǎn)化白樺酮酸成2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯菌種，本發(fā)明共篩選了多個(gè)菌種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保藏號為NRRL5646菌種對白樺酮酸具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力(見表l)。篩選所用液體培養(yǎng)基200克新鮮去皮馬鈴薯加沸水500ml煮15mhi后過濾，濾液加葡萄糖20g、KH2PO43.0g、MgSO40.75g、Vbl10.0mg，加蒸餾水定容至l.OL，加NaOH或HC1調(diào)pH值至6.0，150ml三角燒瓶每瓶分裝30ml液體培養(yǎng)基，121°C、0.15MPa滅菌20min。篩選菌種時(shí)，保存菌種所用斜面培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂，15ml具塞試管每管5ml，121°C、0.15MPa滅菌20min冷卻后制成。菌種的保存與活化菌種活化采用兩步活化法，參見Nair,M.S.R.,andBasile,D.V.BioconversionofarteniumBtoartmisi皿.天然產(chǎn)物雜志(JounalofNaturalProducts)1993,56(9):1559。先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28°C180r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24-48h后，轉(zhuǎn)接于另一液體培養(yǎng)基，接種量1-5%(V/V)，同條件培養(yǎng)24h后加樣。樣品的制備及加樣白樺酮酸溶于乙醇，配成10.0mg/ml溶液備用；每瓶經(jīng)兩步活化的菌液(30ml)加0.5ml樣品溶液，使每瓶菌液含白樺酮酸5mg。同條件培養(yǎng)120h后，中止反應(yīng)，過濾菌體，發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌體用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，將兩種浸膏和并，加少許乙酸乙酯溶解后備薄層鑒定用?？瞻讓φ湛瞻讓φ赵O(shè)陽性對照(底物+培養(yǎng)基)、陰性對照(培養(yǎng)基+菌)、溶劑對照(培養(yǎng)基+菌+乙醇)，培養(yǎng)和萃取條件同上。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的薄層鑒定薄層條件1.薄層板0.7%的CMC-Na制成的硅膠G板。2.展開劑乙酸乙酯石油醚(1:3)上行法展開。3.顯色劑10%硫酸乙醇溶液。操作轉(zhuǎn)化萃取物和空白對照萃取物分別點(diǎn)于薄層板，充分展開后取出自然晾干，噴以10%的硫酸乙醇，電吹風(fēng)加熱顯色。轉(zhuǎn)化結(jié)果見表l。表1微生物轉(zhuǎn)化白樺酮酸篩選結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從篩選結(jié)果看，有四種菌可以轉(zhuǎn)化，其中NRRL5646轉(zhuǎn)化效果最好，經(jīng)測算，轉(zhuǎn)化率可達(dá)60%，而其余三種轉(zhuǎn)率均較低，轉(zhuǎn)化率不足0.5%。因此，本發(fā)明選用菌株NRRL.5646，以白樺酮酸為原料來制備2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯。本發(fā)明公開了一種制備式I化合物的制備方法，用保藏號為NRRL5646菌株對白樺酮酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得。更優(yōu)選的方法是以白樺酮酸為底物，利用保藏號為NRRL5646的菌株，將底物和該菌株在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3~8天，終止反應(yīng)，用有機(jī)溶劑萃取，濃縮萃取液，通過硅膠柱層析分離即得。其中有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲垸、甲苯、甲酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇、四氫呋喃中的一種或幾種。更優(yōu)選乙酸乙酯。硅膠柱層析分離為用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。培養(yǎng)基含1030%的馬鈴薯煎煮液、KH2P04、MgS04、維生素B1和選自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一種或幾種的碳源，培養(yǎng)基pH-5.07.0。為重量百分比。其中按20%馬鈴薯煎煮液100毫升計(jì)，培養(yǎng)基中各組分優(yōu)選的含量為KH2P04含0.1~0.5克；MgSO4含0.10.5克；葡萄糖或蔗糖含0.5-2.5克。最為優(yōu)選的制備方法是將保藏號為NRRL.5646的菌株由斜面接種到液體培養(yǎng)基中，置28°C，轉(zhuǎn)速為180r/m的搖床中培養(yǎng)48小時(shí)成為種子液，種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵液后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，加入轉(zhuǎn)化底物；繼續(xù)培養(yǎng)144小時(shí)后終止催化反應(yīng)，過濾菌體，發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏A;菌體用乙醇提取，回收乙醇，得到提取浸膏B，將兩種浸膏合并，浸膏經(jīng)硅膠拌樣后柱層析分離；以石油醚與乙酸乙酯為洗脫系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得到白色粉末狀轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。藥理試驗(yàn)證明，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I化合物具有優(yōu)異的抗腫瘤作用，以下是試驗(yàn)方法及結(jié)果2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯對小鼠S-180(表格中簡稱式I化合物)的抑制作用實(shí)驗(yàn)方法在無菌條件下取S-180小鼠的實(shí)體腫塊，用剪刀剪碎，經(jīng)勻槳器磨成勻漿(加生理鹽水)，每只小鼠皮下接種2.0><106個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用小鼠隨機(jī)分成空白對照組(生理鹽水)、陽性藥對照組(5-氟尿嘧啶)、2ot-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯給藥組(0.025g/kg、0.1g/kg、0.4g/kg)。每組10只小鼠，各組小鼠于接種后24小時(shí)開始給藥，每天一次，連續(xù)給藥10天。給藥停止后處死小鼠，剝離腫塊稱重。體內(nèi)抑瘤作用于表5。表22a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯對小鼠S-180的抑制作用分組給藥方式g/kgx次數(shù)小鼠體重給藥前(g)給藥后瘤重(g)抑瘤率(%)對照組一20.727.92.64±0.63一5-氟尿嘧啶0.025x1020.626.51.03±0.26**61.0%式I化合物0.025x1020.727.11.82±0.43**31.1%0.1x1020.926.91.26±0.29*52.3%0.4x1020.626.80.52±0.11**80.3%注與空白對照組比較，*P<0.05;**P<0.01由表2可見，本發(fā)明的2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯對腫瘤的抑制效果顯著。本發(fā)明的2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯，可單獨(dú)或與其它藥物聯(lián)合使用。一般地，本發(fā)明的2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯用于治療時(shí)，劑量范圍為1-900mg/天，也可根據(jù)劑型的不同和疾病嚴(yán)重程度，使用劑量超出該范圍。本發(fā)明的2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯可與藥學(xué)上可接受的載體混合，用于制備治療用藥物組合物?？芍苽涑伤巹W(xué)上通用的劑型，如膠囊、片劑、丸劑、口服液、顆粒劑、酎劑、透皮貼劑、緩釋劑、注射劑等胃腸道給藥劑型及注射劑、外用制劑等胃腸外給藥劑型。具體實(shí)施例方式實(shí)施例12a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯的制備底物白樺酮酸110mg溶于llmL無水乙醇；菌種NRRL.5646由4"C的固體斜面接種至液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基按100毫升20%馬鈴薯煎煮液中含KH2P040.2克；MgS040.1克；葡萄糖l克；微生素Bi0.01克配制，液體培養(yǎng)基分裝至150mL的三角瓶，每瓶裝液30mL)，至搖床中培養(yǎng)48小時(shí)(28°C，180r/m)，肉眼觀察到大量的白色顆粒狀菌體，即為種子液；將種子液在無菌條件下轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同前)中，在搖床中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。可見大量菌體時(shí)加入轉(zhuǎn)化底物；加樣培養(yǎng)144小時(shí)后終止反應(yīng)。過濾菌體，發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌體用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，將兩種浸膏和并，得浸膏0.5g，稱取100-200目硅膠1.5g與殘?jiān)鶆虬铇樱鶎游?00300目15g干法裝柱，乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，在乙酸乙酯-石油醚=1:60的洗脫餾分中，可得目標(biāo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯，經(jīng)乙醇水重結(jié)晶，得到白色針晶60mg。實(shí)施例2片劑取實(shí)施例l制得的2a-乙酰氧基-白樺酮酸甲酯100g與淀粉50g,糊精50g混合，用適量30%乙醇作濕潤劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，制成片劑。權(quán)利要求1、結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物2、權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物的制備方法，其特征是用保藏號為NRRL5646菌株對白樺酮酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得。3、權(quán)利要求2的制備方法，其中生物轉(zhuǎn)化方法如下以白樺酮酸為底物，利用保藏號為NRRL5646的菌株，將底物和該菌株在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)38天，終止反應(yīng)，用有機(jī)溶劑萃取，濃縮萃取液，通過硅膠柱層析分離即得。4、權(quán)利要求3的制備方法，其中有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲苯、甲酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇、四氫呋喃中的一種或幾種。5、權(quán)利要求4的制備方法，其中有機(jī)溶劑是乙酸乙酯。6、權(quán)利要求3的制備方法，其中硅膠柱層析分離為用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。7、權(quán)利要求3的制備方法，培養(yǎng)基含10~30%的馬鈴薯煎煮液、KH2P04、MgS04、維生素Bl和選自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一種或幾種的碳源，培養(yǎng)基pl^5.07.0。8、權(quán)利要求3的制備方法，其中按20%馬鈴薯煎煮液100毫升計(jì)，培養(yǎng)基中KH2P04含0.1-0.5克；MgSO4含0.10.5克；葡萄糖或蔗糖含0.5-2.5克。9、一種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物及藥學(xué)上可接受的載體。10、權(quán)利要求l的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物用于制備治療腫瘤藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及2α-羥基取代白樺酮酸(I)，本發(fā)明公開了其制備方法用保藏號為NRRL5646菌株對白樺酮酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得。本發(fā)明還公開了其抗腫瘤的用途。文檔編號A61K31/56GK101412743SQ20081023624公開日2009年4月22日申請日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者余伯陽,劉吉華,劍張,朱羽堯,錢利武,陳乃東申請人:中國藥科大學(xué)