專(zhuān)利名稱(chēng)：抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體np11-4單鏈抗體及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體及其制備方法、應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)，制備抗血吸蟲(chóng)病單鏈抗體。單鏈抗體基因片段來(lái)自定位于日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)表膜、尾蚴膜、童蟲(chóng)膜、蟲(chóng)卵卵殼及卵內(nèi)毛蚴膜的單克隆抗體NP11-4，利用基因工程技術(shù)擴(kuò)增輕鏈、重鏈可變區(qū)基因，以VH-linker-VL形式將其與原核表達(dá)載體連接，制備單鏈抗體，用于血吸蟲(chóng)病的治療或制備抗血吸蟲(chóng)病免疫毒素。本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和血吸蟲(chóng)病的治療藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)病，廣泛流行于我國(guó)長(zhǎng)江沿岸的湖南、湖北、江西、安徽、江蘇省和大山區(qū)的四川、云南省等地。血吸蟲(chóng)的整個(gè)生活史發(fā)育過(guò)程比較復(fù)雜，尾蚴一旦進(jìn)入牛羊等哺乳動(dòng)物的皮膚，變成童蟲(chóng)移行門(mén)靜脈系統(tǒng)寄生，22天后發(fā)育為成蟲(chóng)寄生于人或哺乳動(dòng)物的腸系膜靜脈中，蟲(chóng)體移行到腸壁的小血管中產(chǎn)卵。大部分蟲(chóng)卵隨血液流入肝臟，另一部分蟲(chóng)卵損害腸壁掉入腸腔隨糞便排出體外。
日本血吸蟲(chóng)尾蚴、童蟲(chóng)、成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵等階段均可對(duì)人體產(chǎn)生不同程度的損傷和復(fù)雜的免疫病理反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，尾蚴、童蟲(chóng)、成蟲(chóng)所致的損傷，多為一過(guò)性或較輕微，而蟲(chóng)卵沉積于肝、腸等組織內(nèi)誘發(fā)的蟲(chóng)卵肉芽腫及隨之發(fā)生纖維化是血吸蟲(chóng)病的主要病理基礎(chǔ)。血吸蟲(chóng)抗原成分，如腸相關(guān)抗原、膜相關(guān)抗原和可溶性蟲(chóng)卵抗原以及蟲(chóng)體代謝或死亡產(chǎn)物，都可引起機(jī)體變態(tài)反應(yīng)性損傷。
目前血吸蟲(chóng)病的治療以吡喹酮化療為主，雖然吡喹酮的治療可取得可靠療效，但急性血吸蟲(chóng)感染死亡時(shí)有發(fā)生，慢性血吸蟲(chóng)病肝臟纖維化尚無(wú)有效的治療方法，可引起顯著的門(mén)脈高壓，由此導(dǎo)致的上消化道出血、脾腫大、腹水，是引起患者死亡、喪失勞動(dòng)力的主要原因。另外，單一化療藥物的長(zhǎng)期使用可能出現(xiàn)耐藥性問(wèn)題，長(zhǎng)期應(yīng)用還有可能誘發(fā)抗藥蟲(chóng)株。因此，血吸蟲(chóng)病的治療仍然存在很多問(wèn)題，直接影響國(guó)家的投資環(huán)境，影響和諧社會(huì)和小康社會(huì)的建設(shè)。所以，探索新的高效低毒的血吸蟲(chóng)病治療藥物就顯得尤為重要。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述不足之處提供一種抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體及其制備方法、應(yīng)用，是利用基因工程技術(shù)提取抗日本血吸蟲(chóng)表膜單克隆抗體細(xì)胞株NP11-4總RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增VH、VL基因，利用重疊延伸PCR將VH和VL基因以VH-linker-VL形式連接成單鏈抗體基因，將單鏈抗體基因與pBAD/gIII A載體連接，克隆至大腸桿菌Top10F’，誘導(dǎo)目的蛋白可溶性表達(dá)。該蛋白應(yīng)用于血吸蟲(chóng)病的治療藥物領(lǐng)域。
本發(fā)明抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體及其制備方法、應(yīng)用，制備了定位于日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)表膜、尾蚴膜、童蟲(chóng)膜、蟲(chóng)卵卵殼及卵內(nèi)毛蚴膜的單克隆抗體NP11-4，通過(guò)培養(yǎng)NP11-4雜交瘤細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后用PCR的方法擴(kuò)增NP11-4可變區(qū)基因，進(jìn)行基因工程抗體改造，制備成抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體。主要應(yīng)用于制備抗血吸蟲(chóng)病免疫毒素及治療血吸蟲(chóng)病藥物領(lǐng)域。
一種抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體，即抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體N端從第1個(gè)氨基酸到第122個(gè)氨基酸為單鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VH)，從第141個(gè)氨基酸到第254個(gè)氨基酸為單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)，兩者之間由重復(fù)的甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)18個(gè)氨基酸組成的短肽以VH-linker-VL的形式連接，全長(zhǎng)254個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為 Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Val Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Val Phe Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體的制備方法、采取以下步驟實(shí)施 復(fù)蘇NP11-4雜交瘤細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟如下將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用無(wú)菌的PBS溶液5ml清洗2遍，每10cm2面積加入1ml Trizol，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀刮細(xì)胞附著面，然后靜置5分鐘，至細(xì)胞完全溶解后，將1毫升液體吸入到DEPC處理的1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈搖晃15S，冰浴10min，12000rpm 4℃離心15min；吸取離心上清到新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，冰浴10min，12000rpm 4℃離心15min，在離心管底部可見(jiàn)有白色沉淀；加入DEPC處理的75％乙醇1ml，7500rpm 4℃離心5min，棄上清，風(fēng)干沉淀；加入30μl DEPC處理水，將沉淀混勻，即為所得的NP11-4雜交瘤細(xì)胞總RNA。RT-PCR方法獲得cDNA，設(shè)計(jì)19條VH上游引物和17條Vκ上游引物，4條VH下游引物和3條Vκ下游引物引物 Vκ5’上游引物 Vκ-1 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’ 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’ Vκ-3 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’ Vκ-4 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRACAC AGT C-3’ Vκ-5 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’ Vκ-6 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C-3’ Vκ-7 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’ Vκ-8 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’ Vκ-9 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’ Vκ-10 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C-3’ Vκ-11 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’ Vκ-12 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’ Vκ-13 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’ Vκ-14 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’ Vκ-15 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’ Vκ-16 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’ Vκ-17 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’ Vκ3’下游引物 VκR1 5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’ VκR2 5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’ VκR3 5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’ VH5’上游引物 VH1 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’ VH2 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’ VH3 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’ VH4 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’ VH5 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’ VH6 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’ VH7 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’ VH8 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’ VH9 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’ VH10 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’ VH11 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’ VH12 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’ VH13 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’ VH14 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’ VH15 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’ VH16 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’ VH17 5’-GCT GCC CAACCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’ VH18 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’ VH19 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’ VH3’下游引物 VHR1 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’ VHR2 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’ VHR3 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’ VHR4 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’ 將Vκ5’上游引物、Vκ3’下游引物、VH5’上游引物，VH3’下游引物各溶為終濃度100pmol/ul，然后均以1∶1體積比例混勻，分別擴(kuò)增VH、VL基因，擴(kuò)增條件為95℃4分鐘，95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，電泳回收、純化擴(kuò)增的基因片段，連至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，測(cè)序后獲得輕鏈、重鏈可變區(qū)序列，序列如下 VL 342bp GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATC AAA VH 366bp CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 單鏈抗體基因的克隆 根據(jù)上述測(cè)序正確的序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增單鏈抗體的VH、VL4條寡聚核苷酸引物，在VH和VL引物中分別引入NcoI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列VH上游引物5’C GCC ATG GGA TCC CTC GAGGTCCAGCTGCAGCAG 3’，VH下游引物5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC3’；VL上游引物5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGGAGCTCGATATTTTGATGACCC 3’，VL下游引物5’GGAATTCCAGGACCGCCTCCTGGTTTGATTTCCAGTTTGGTCCC3’，分別擴(kuò)增VH、VL后，采用重疊延伸PCR將輕重鏈基因連接成單鏈抗體基因，擴(kuò)增條件如下首先將純化后的輕重鏈基因混勻，在無(wú)外加引物的情況下，互為引物和模板，PCR反應(yīng)94℃ 5分鐘，94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 60秒，擴(kuò)增6個(gè)循環(huán)后，在反應(yīng)體系中加入VH上游引物和VL下游引物，PCR反應(yīng)94℃ 30秒，60℃ 50秒，72℃ 50秒，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，電泳回收、純化單鏈抗體基因片段，連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，測(cè)序驗(yàn)證得到正確的單鏈基因片段。序列如下 CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC TCC TCT GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATC AAA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取質(zhì)粒pBAD/gIII A，用NcoI和EcoRI雙酶切，核酸共沉淀法回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)，同樣用/NcoI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的單鏈抗體基因片段雙酶切，電泳回收純化后溶于去離子水內(nèi)，取等摩爾濃度的兩個(gè)酶切DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4DNA連接酶連接，使單鏈抗體基因片段插入到pBAD/gIIIA載體中，使之表達(dá)NP11-4單鏈抗體。
重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，涂布含有100μg/ml氨芐青霉素LB平板，置37℃過(guò)夜，次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBAD/gIII A的對(duì)照菌行菌液PCR鑒定。菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示重組質(zhì)粒含有目的單鏈抗體基因片段，而pBAD/gIIIA質(zhì)粒沒(méi)有此片段。將菌液PCR陽(yáng)性的菌液抽提質(zhì)粒，行雙酶切鑒定，可見(jiàn)在約4000bp和750bp處各有基因片段出現(xiàn)，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
表達(dá)單鏈抗體工程菌的篩選鑒定 將轉(zhuǎn)化子接種至2ml含有氨芐青霉素100μg/ml的2YT培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，至菌液OD260值至0.8～1.0時(shí)，加20％的L-阿拉伯糖2μl至終濃度0.02％，和40％的蔗糖200μl至終濃度4％，22℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)20小時(shí)，離心收集菌體，菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的PBS內(nèi)，冰浴超聲20s，12000rpm、4℃離心30min，分別收集超聲上清和超聲沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，超聲上清和超聲沉淀內(nèi)都表達(dá)相對(duì)分子量約為34kD的蛋白，而對(duì)照菌Top10F’無(wú)此蛋白條帶。
單鏈抗體的純化 1)表達(dá)單鏈抗體工程菌的超聲裂解 將表達(dá)單鏈抗體的誘導(dǎo)菌，8000rpm、4℃離心15min收菌，菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的平衡緩沖液內(nèi)，平衡緩沖液為20mM的磷酸鹽緩沖液pH 7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，冰浴超聲破菌，12000rpm、4℃離心30min，收集超聲上清。
2)His-trap親和層析柱純化蛋白 將His-trap親和層析柱連至常壓層析系統(tǒng)，先用平衡緩沖液平衡，平衡液為20mM的磷酸鹽緩沖液pH 7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，后將超聲上清用0.22μm濾膜過(guò)濾后直接上樣，上樣流速為1ml/min，收集流穿，后用平衡液沖洗，然后依次用含50、100、200、300、400、500mM/L的咪唑緩沖液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用10％SDS-PAGE檢測(cè)流穿和各洗脫峰蛋白，收集100mM/L、200mM/L的咪唑緩沖液洗脫峰即為目的蛋白。
NP11-4單鏈抗體活性鑒定 采用間接ELISA法鑒定單鏈抗體與血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)的結(jié)合活性。用50mmol/L的碳酸鹽(pH 9.6)將SEA稀釋到10μg/ml后包被酶標(biāo)板，每孔200μl，4℃過(guò)夜。次日用封閉液(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH 7.4，0.5％的小牛血清)封閉，200μl/孔，37℃孵育2h。將待檢測(cè)的單鏈抗體用封閉液做倍比稀釋(1∶5倍稀釋)后依次加入待檢孔，空白對(duì)照(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH 7.4)及陰性對(duì)照(正常鼠血清)加至對(duì)應(yīng)孔中，每孔100μl，室溫孵育2h。0.05％的PBST液洗板機(jī)洗5遍，加1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗-his抗體，100μl/孔，室溫反應(yīng)2h，PBST洗5遍，加底物TMB溶液100μl，室溫避光顯色10min，加50μl 2M硫酸混勻終止反應(yīng)，用MultiskanSpectrum Microplate酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。結(jié)果顯示，純化的單鏈抗體與SEA呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與正常鼠血清不反應(yīng)，提示該單鏈抗體與SEA有較好的結(jié)合活性。
所述的抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體在制備抗血吸蟲(chóng)病免疫毒素及治療血吸蟲(chóng)病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn) 目前血吸蟲(chóng)病的治療主要以吡喹酮化療為主，但單一化療藥物的長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥性。在曼氏血吸蟲(chóng)，已發(fā)現(xiàn)耐吡喹酮的蟲(chóng)株。近年來(lái)有報(bào)道以吡喹酮和青蒿琥酯聯(lián)合用藥治療血吸蟲(chóng)病，但是化療藥物所致的毒副作用也很大。因此尋找一種高效低毒的治療血吸蟲(chóng)病的藥物迫在眉睫。
抗體藥物是是以細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的藥物?？贵w藥物亦稱(chēng)單克隆抗體治療劑。針對(duì)特定的分子靶點(diǎn)(抗原)，可以制備相應(yīng)的靶向抗體藥物。單克隆抗體是藥物良好的靶向性載體，通過(guò)藥物分子上特殊的功能基團(tuán)，將治療藥物與抗體相連接而組成化學(xué)免疫耦聯(lián)物，避免了藥物對(duì)其他正常組織的毒害作用，選擇性的發(fā)揮治療作用?？贵w藥物在感染、心血管疾患、自身免疫疾患等多種疾病的治療特別在腫瘤治療中有巨大的潛力與應(yīng)用前景，迄今為止國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)在血吸蟲(chóng)病治療藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體的制備方法，制備的定位于日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)表膜、尾蚴膜、童蟲(chóng)膜、蟲(chóng)卵卵殼及卵內(nèi)毛蚴膜的單克隆抗體NP11-4，能有效地提高血吸蟲(chóng)感染的減蟲(chóng)率及減卵率。但是單抗的異源性所引起的抗體反應(yīng)不但降低了單抗的效價(jià)，而且會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的后果。因此，對(duì)異源性單抗進(jìn)行改造成為單抗研究的重要方向。利用基因工程的方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，連接成單鏈抗體基因片段后表達(dá)單鏈抗體，有較多的優(yōu)點(diǎn) (1)單鏈抗體分子質(zhì)量很小，作為異種蛋白的抗原性較弱，降低HAMA反應(yīng)。
(2)單鏈抗體僅為整個(gè)抗體分子的1/6，所以組織穿透力強(qiáng)，易通過(guò)組織到達(dá)靶部位，而且在體內(nèi)的清除速度比傳統(tǒng)的單克隆抗體快10倍以上。
(3)單鏈抗體缺少Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)還可以降低機(jī)體的非特異反應(yīng)。
(4)單鏈抗體分子量小，可以做為載體與化療藥物或放射核素耦聯(lián)在靶向治療方面更具優(yōu)勢(shì)。



以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明 圖1是表達(dá)抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖2是用1％的Agarose凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增的NP11-4可變區(qū)重鏈、輕鏈基因片段，其中1是重鏈可變區(qū)VH，366bp；2是輕鏈可變區(qū)VL，342bp，M核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(TaKaRa DL2000)。
圖3是用1％的Agarose凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增的NP11-4單鏈抗體基因片段，1和2均為單鏈抗體基因片段，大小為762bp，M核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(TaKaRa DL2000)。
圖4是1％的Agarose凝膠檢測(cè)構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒雙酶切圖譜，用EcoRI和NcoI雙酶切，其中大片段為酶切的pBAD/gIII A片段，小片段為酶切成功的單鏈抗體基因片段，M1核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(TaKaRa DL10000)，M2核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(TaKaRa DL2000)。
圖5是表達(dá)單鏈抗體的重組菌SDS-PAGE分析結(jié)果，圖示1為表達(dá)單鏈抗體的重組菌超聲上清，2為超聲沉淀，3為培養(yǎng)上清，可見(jiàn)單鏈抗體主要在超聲沉淀中表達(dá)，而超聲上清中表達(dá)量較少，4是不含有單鏈抗體的Top10F’對(duì)照，M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas)。
圖6是表達(dá)單鏈抗體的重組菌Western-blot分析結(jié)果，1和2均為表達(dá)單鏈抗體重組菌的超聲上清，在34KD處可見(jiàn)有目的條帶，說(shuō)明蛋白可溶性表達(dá)，3為T(mén)op10F’對(duì)照，沒(méi)有目的蛋白表達(dá)，M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas)。
圖7是表達(dá)單鏈抗體純化前后的SDS-PAGE分析結(jié)果，1是表達(dá)單鏈抗體重組菌超聲上清，2是100mM咪唑洗脫液，3是200mM咪唑洗脫液，可見(jiàn)100mM、200mM咪唑能把目的蛋白洗脫下來(lái)，且在200mM咪唑洗脫條件下得到的蛋白較純，M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas)。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明 抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體的表達(dá) 提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，Over-Lap PCR連接成單鏈抗體基因。將單鏈抗體基因片段克隆至質(zhì)粒pBAD/gIII A，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，篩選獲得了高效表達(dá)單鏈抗體的工程菌，表達(dá)的目的蛋白約占菌體蛋白總量的30％左右，以包涵體和可溶性?xún)煞N形式存在。
材料與方法 1.菌種與質(zhì)粒宿主菌Top10F’及質(zhì)粒pBAD/gIII A均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
2.分子生物學(xué)試劑限制性?xún)?nèi)切酶NcoI、EcoRI、T4DNA連接酶及質(zhì)粒純化試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-his抗體購(gòu)自Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠回收DNA片段的試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 3.擴(kuò)增的可變區(qū)基因片段測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
4.基因克隆方法DNA的酶切、連接、電泳；質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)化；蛋白的SDS-PAGE及Western-blot分析等一般的克隆方法按常規(guī)方法進(jìn)行。其他按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
結(jié)果 1.單克隆抗體NP11-4可變區(qū)基因克隆 復(fù)蘇NP11-4雜交瘤細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟如下將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用無(wú)菌的PBS溶液5ml清洗2遍，每10cm2面積加入1ml Trizol，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀刮細(xì)胞附著面，然后靜置5分鐘，至細(xì)胞完全溶解后，將1毫升液體吸入到DEPC處理的1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈搖晃15S，冰浴10min，12000rpm 4℃離心15min；吸取離心上清到新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，冰浴10min，12000rpm 4℃離心15min，在離心管底部可見(jiàn)有白色沉淀；加入DEPC處理的75％乙醇1ml，7500rpm 4℃離心5min，棄上清，風(fēng)干沉淀；加入30μl DEPC處理水，將沉淀混勻，即為所得的NP11-4雜交瘤細(xì)胞總RNA。RT-PCR方法獲得cDNA，設(shè)計(jì)19條VH上游引物和17條VL上游引物，4條VH下游引物和3條Vκ下游引物引物 Vκ5’上游引物 Vκ-1 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’ Vκ-2 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’ Vκ-3 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’ Vκ-4 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRA CAC AGT C-3’ Vκ-5 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’ Vκ-6 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C-3’ Vκ-7 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’ Vκ-8 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’ Vκ-9 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’ Vκ-10 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C-3’ Vκ-11 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’ Vκ-12 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’ Vκ-13 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’ Vκ-14 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’ Vκ-15 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’ Vκ-16 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’ Vκ-17 5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’ Vκ3’下游引物 VκR1 5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’ VκR2 5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’ VκR3 5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’ VH5’上游引物 VH1 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’ VH2 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’ VH3 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’ VH4 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’ VH5 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’ VH6 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’ VH7 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’ VH8 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’ VH9 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’ VH10 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’ VH11 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’ VH12 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’ VH13 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’ VH14 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’ VH15 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’ VH16 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’ VH17 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’ VH18 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’ VH19 5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’ VH3’下游引物 VHR1 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’ VHR2 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’ VHR3 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’ VHR4 5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’ 將Vκ5’上游引物、Vκ3’下游引物、VH5’上游引物，VH3’下游引物各溶為終濃度100pmol/ul，然后均以1∶1體積比例混勻，分別擴(kuò)增VH、VL基因，擴(kuò)增條件為95℃ 4分鐘，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，電泳回收、純化擴(kuò)增的基因片段，連至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，測(cè)序后獲得輕鏈、重鏈可變區(qū)序列，序列如下 VL 342bp GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATC AAA VH 366bp CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 2、scFv基因的克隆 根據(jù)上述序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增單鏈抗體的VH、VL4條寡聚核苷酸引物。在VH和VL引物中分別引入NcoI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列。VHforward5’CGCC ATG GGA TCC CTC GAGGTCCAGCTGCAGCAG 3’，VHreverse5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC3’，VLforward5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGGAGCTCGATATTTTGATGACCC3’，VLreverse5’GGAATTCCAGGACCGCCTCCTGGTTTGATTTCCAGTTTGGT CCC3’，分別擴(kuò)增VH、VL后，采用重疊延伸PCR將輕重鏈基因連接成單鏈抗體基因，擴(kuò)增條件如下首先將純化后的輕重鏈基因混勻，在無(wú)外加引物的情況下，互為引物和模板，PCR反應(yīng)94℃ 5分鐘，94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 60秒，擴(kuò)增6個(gè)循環(huán)后，在反應(yīng)體系中加入VHforward和VLreverse引物，PCR反應(yīng)94℃ 30秒，60℃ 50秒，72℃ 50秒，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。電泳回收純化單鏈抗體基因片段，連接至pMD-18T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，測(cè)序驗(yàn)證得到正確的單鏈抗體基因片段。序列如下 CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC TCC TCT GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATC AAA 3、重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取質(zhì)粒pBAD/gIII A，用NcoI和EcoRI雙酶切，核酸共沉淀法回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用NcoI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的單鏈抗體基因片段雙酶切，電泳回收純化后溶于去離子水內(nèi)。取等摩爾濃度的兩個(gè)酶切DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，使單鏈抗體基因片段插入到pBAD/gIII A載體中，使之表達(dá)NP11-4單鏈抗體。
4、重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，涂布含有100μg/ml氨芐青霉素LB平板，置37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBAD/gIIIA的對(duì)照菌行菌液PCR鑒定。菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示重組質(zhì)粒含有目的單鏈抗體基因片段，而pBAD/gIII A質(zhì)粒沒(méi)有此片段。將菌液PCR陽(yáng)性的菌液抽提質(zhì)粒，行雙酶切鑒定，可見(jiàn)在約4000bp和750bp處各有基因片段出現(xiàn)，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
5、表達(dá)單鏈抗體工程菌的篩選鑒定 將轉(zhuǎn)化子接種至2ml含有氨芐青霉素100μg/ml的2YT培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)3h，至菌液OD260至0.8-1.0時(shí)，加20％的L-阿拉伯糖2μl至終濃度0.02％，和40％的蔗糖200μl至終濃度4％，22℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)20小時(shí)，離心收集菌體，菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的PBS內(nèi)，冰浴超聲20s，12000rpm、4℃離心30min，分別收集超聲上清和超聲沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，超聲上清和超聲沉淀內(nèi)都表達(dá)相對(duì)分子量約為34kD的蛋白，而對(duì)照菌Top10F’無(wú)此蛋白條帶。
表達(dá)單鏈抗體的純化 材料和方法 1、主要試劑 親和層析柱為GE公司的His-trap HP，L-阿拉伯糖、DTT、咪唑購(gòu)自Sigma公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?br> 2、表達(dá)單鏈抗體工程菌的超聲裂解 將表達(dá)單鏈抗體的誘導(dǎo)菌，8000rpm、4℃離心15min收菌，菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的平衡緩沖液內(nèi)，平衡緩沖液為20mM的磷酸鹽緩沖液PH 7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，冰浴超聲破菌，12000rpm、4℃離心30min，收集超聲上清。
3、His-trap親和層析柱純化蛋白 將His-trap親和層析柱連至常壓層析系統(tǒng)，先用平衡緩沖液平衡，平衡液為20mM的磷酸鹽緩沖液pH 7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，后將超聲上清用0.22μm濾膜過(guò)濾后直接上樣，上樣流速為1ml/min，收集流穿，后用平衡液沖洗，然后依次用含50、100、200、300、400、500mM/L的咪唑緩沖液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用10％SDS-PAGE檢測(cè)流穿和各洗脫峰蛋白，確定哪個(gè)組分內(nèi)含有目的蛋白。
結(jié)果 將各穿過(guò)峰的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示，單鏈抗體主要存在于100mM/L、200mM/L的咪唑緩沖液內(nèi)，100mM/L咪唑緩沖液內(nèi)有較多目的蛋白，但也含有其它蛋白峰，200mM/L的咪唑緩沖液內(nèi)蛋白純度較高。
純化單鏈抗體結(jié)合活性的鑒定及應(yīng)用 將純化的單鏈抗體用間接ELISA法檢測(cè)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵可溶性抗原，以鑒定該抗體的結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該重組蛋白與血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵可溶性抗原有很好的結(jié)合活性，可用應(yīng)用于血吸蟲(chóng)病的治療藥物領(lǐng)域。
材料和方法 1、酶聯(lián)反應(yīng)材料96孔板為Costar公司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-his抗體購(gòu)自Invitrogen公司。其它材料為酶聯(lián)反應(yīng)的常規(guī)材料。
2、ELISA實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA法檢測(cè)單鏈抗體與血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵可溶性抗原的結(jié)合活性。基本步驟為用50mmol/L的碳酸鹽(pH 9.6)將SEA抗原稀釋到10μg/ml后包被酶標(biāo)板，每孔200μl，4℃過(guò)夜。次日用封閉液(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.4，0.5％的小牛血清)封閉，200μl/孔，37℃孵育2h。將待檢測(cè)的單鏈抗體用封閉液做倍比稀釋(1∶5倍稀釋)后依次加入待檢孔，空白對(duì)照(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.4)及陰性對(duì)照(正常鼠血清)加至對(duì)應(yīng)孔中，每孔100μl，室溫孵育2h。0.05％的PBST液用洗板機(jī)洗5遍后加1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-his抗體，100μl/孔，室溫反應(yīng)2h，PBST洗5遍，加底物TMB溶液100μl，室溫避光顯色10min，加50μl2M硫酸混勻終止反應(yīng)，用Multiskan Spectrum Microplate酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。
結(jié)果 間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純化的單鏈抗體能與SEA抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與正常鼠血清不反應(yīng)，說(shuō)明該抗體與SEA抗原具有較好的結(jié)合活性。
純化單鏈抗體的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A450)
A空白對(duì)照 B陰性對(duì)照 C～H1∶2倍稀釋的單鏈抗體
抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體蛋白序列表
<110>南京醫(yī)科大學(xué)
<120>抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體及其制備方法、應(yīng)用
<160>2
<210>1
<211>254
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>一種抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體，即抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體N端從第1個(gè)氨基酸到第122個(gè)氨基酸為單鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VH)，從第141個(gè)氨基酸到第254個(gè)氨基酸為單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)，兩者之間由重復(fù)的甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)18個(gè)氨基酸組成的短肽以VH-linker-VL的形式連接，全長(zhǎng)254個(gè)氨基酸。
<400>1
Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn
20 25 30
Phe Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Val Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Val Phe Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Ser Ser Arg Ser
115 120 125
Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Asp Ile
130 135 140
Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln
145 150 155 160
Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly
165 170 175
Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys
180 185 190
Pro Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
210 215 220
Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His
225 230 235 240
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210>2
<211>762
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(762)
<220>
<221>V_region
<222>(1)...(366)
<223>抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因序列。
<220>
<221>N_region
<222>(367)...(420)
<223>抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體linker部分基因序列。
<220>
<221>V_region
<222>(421)...(762)
<223>抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體輕鏈可變區(qū)基因序列。
<400>2
CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT 45
Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
1 510 15
GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC 90
Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25 30
ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA 135
Thr Asn Phe Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly
35 40 45
CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT 180
Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Val Tyr Ile Asn
50 55 60
TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA 225
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr
65 70 75
TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG 270
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
80 85 90
GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT 315
Asp Val Phe Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp Gly Ser
95 100 105
AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 360
Ser Gln Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
TCT GCA GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC TCC TCT GGT GGC GGT GGC 405
Ser Ala Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
125 130 135
TCG GGC GGT GGT GGG GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA 450
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro
140 145 150
CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC 495
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys
155 160 165
AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA 540
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
170 175 180
GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG ATC 585
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
185 190 195
TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT 630
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
200 205 210
GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG 675
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
215 220 225
GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT 720
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His
230 235 240
GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATC AAA 762
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
權(quán)利要求
1、一種抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體，即抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體N端從第1個(gè)氨基酸到第122個(gè)氨基酸為單鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VH)，從第141個(gè)氨基酸到第254個(gè)氨基酸為單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)，兩者之間由重復(fù)的甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)18個(gè)氨基酸組成的短肽以VH-linker-VL的形式連接，全長(zhǎng)254個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為
Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Leu Gly
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro
Gly Gly Val Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
Asp Val Phe Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Ser
Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Ser Ser
Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Asp Ile
Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ash Gly Asn Thr Tyr Leu
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
Ile Lys。
2、權(quán)利要求1所述的抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體的制備方法，該蛋白是利用基因工程技術(shù)制備，具體方法如下
單克隆抗體NP11-4可變區(qū)基因克隆
復(fù)蘇抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4雜交瘤細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟如下將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用無(wú)菌的PBS溶液5ml清洗2遍，每10cm2面積加入1ml Trizol，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀刮細(xì)胞附著面，然后靜置5分鐘，至細(xì)胞完全溶解后，將1毫升液體吸入到DEPC處理的1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈搖晃15S，冰浴10min，12000rpm 4℃離心15min；吸取離心上清到新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，冰浴10min，12000rpm4℃離心15min，在離心管底部可見(jiàn)有白色沉淀；加入DEPC處理的75％乙醇1ml，7500rpm 4℃離心5min，棄上清，風(fēng)干沉淀；加入30μl DEPC處理水，將沉淀混勻，即為所得的NP11-4雜交瘤細(xì)胞總RNA；RT-PCR方法獲得cDNA，設(shè)計(jì)19條VH上游引物和17條VL上游引物，4條VH下游引物和3條
Vκ下游引物引物
Vκ5’上游引物
Vκ-1
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’
Vκ-2
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’
Vκ-3
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’
Vκ-4
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRACAC AGT C-3’
Vκ-5
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’
Vκ-6
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C-3’
Vκ-7
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’
Vκ-8
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’
Vκ-9
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’
Vκ-10
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C-3’
Vκ-11
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’
Vκ-12
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’
Vκ-13
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’
Vκ-14
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’
Vκ-15
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’
Vκ-16
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’Vκ-17
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’
Vκ3’下游引物
VκR1
5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’
VκR2
5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’
VκR3
5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’
VH5’上游引物
VH1
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’
VH2
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’
VH3
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’
VH4
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’
VH5
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’
VH6
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’
VH7
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’
VH8
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’
VH9
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’
VH10
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’
VH11
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’
VH12
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’
VH13
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’
VH14
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’
VH15
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’
VH16
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’
VH17
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’
VH18
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’
VH19
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’
VH3’下游引物
VHR1
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’
VHR2
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’
VHR3
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’
VHR4
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’
將Vκ5’上游引物、Vκ3’下游引物、VH5’上游引物，VH3’下游引物各溶為終濃度100pmol/μl，然后均以1∶1體積比例混勻，分別擴(kuò)增VH、VL基因，擴(kuò)增條件為95℃4分鐘，95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，電泳回收、純化擴(kuò)增的基因片段，連至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，測(cè)序后獲得輕鏈、重鏈可變區(qū)序列，序列如下
VL342bp
GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA
GAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA
AAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG
ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT
GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG
GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG
ACC AAA CTG GAA ATC AAA
VH366bp
CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA
GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT
TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT
GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT
GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG
GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT
CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA
單鏈抗體基因的克隆
根據(jù)上述測(cè)序正確的序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增單鏈抗體的VH、VL4條寡聚核苷酸引物，在VH和VL引物中分別引入NcoI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列VH上游引物5’C GCC ATG GGA TCC CTC GAGGTCCAGCTGCAGCAG 3’，VH下游引物5’GGAAGATCTAGA GGAACCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC3’；VL上游引物5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGGAGCTCGATATTTTGATGACCC 3’，VL下游引物5’GGAATTCCAGGACCGCCTCCTGGTTTGATTTCCAGTTTGGTCCC3’，分別擴(kuò)增VH、VL后，采用重疊延伸PCR將輕重鏈基因連接成單鏈抗體基因，擴(kuò)增條件如下首先將純化后的輕重鏈基因混勻，在無(wú)外加引物的情況下，互為引物和模板，PCR反應(yīng)94℃5分鐘，94℃50秒，55℃50秒，72℃60秒，擴(kuò)增6個(gè)循環(huán)后，在反應(yīng)體系中加入VH上游引物和VL下游引物，PCR反應(yīng)94℃30秒，60℃50秒，72℃50秒，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，電泳回收、純化單鏈抗體基因片段，連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，測(cè)序驗(yàn)證得到正確的單鏈基因片段，序列如下
CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA
GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT
TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCT
GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT
GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG
GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT
CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GGT GGT TCC TCT
AGA TCT TCC TCC TCT GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG GAG CTC GAT ATT
TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC TCC
ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA
GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT
TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA
GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC
TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA
ATC AAA
重組質(zhì)粒的構(gòu)建
提取質(zhì)粒pBAD/gIII A，用NcoI和EcoRI雙酶切，核酸共沉淀法回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)，同樣用NcoI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的單鏈抗體基因片段雙酶切，電泳回收純化后溶于去離子水內(nèi)，取等摩爾濃度的兩個(gè)酶切DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使單鏈抗體基因片段插入到pBAD/gIII A載體中，使之表達(dá)NP11-4單鏈抗體；
重組質(zhì)粒的篩選及鑒定
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，涂布含有100μg/ml氨芐青霉素LB平板，置37℃過(guò)夜，次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBAD/gIII A的對(duì)照菌行菌液PCR鑒定；菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示重組質(zhì)粒含有目的單鏈抗體基因片段，而pBAD/gIII A質(zhì)粒沒(méi)有此片段；將菌液PCR陽(yáng)性的菌液抽提質(zhì)粒，行雙酶切鑒定，可見(jiàn)在約4000bp和750bp處各有基因片段出現(xiàn)，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；
表達(dá)單鏈抗體工程菌的篩選鑒定
將轉(zhuǎn)化子接種至2ml含有氨芐青霉素100μg/ml的2YT培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，至菌液OD260值至0.8～1.0時(shí)，加20％的L-阿拉伯糖2μl至終濃度0.02％，和40％的蔗糖200μl至終濃度4％，22℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)20小時(shí)，離心收集菌體，菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的PBS內(nèi)，冰浴超聲20s，12000rpm、4℃離心30min，分別收集超聲上清和超聲沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，超聲上清和超聲沉淀內(nèi)都表達(dá)相對(duì)分子量約為34kD的蛋白，而對(duì)照菌Top10F’無(wú)此蛋白條帶；
單鏈抗體的純化
1)表達(dá)單鏈抗體工程菌的超聲裂解
將表達(dá)單鏈抗體的誘導(dǎo)菌，8000rpm、4℃離心15min收菌，菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的平衡緩沖液內(nèi)，平衡緩沖液為20mM的磷酸鹽緩沖液pH7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，冰浴超聲破菌，12000rpm、4℃離心30min，收集超聲上清；
2)His-trap親和層析柱純化蛋白
將His-trap親和層析柱連至常壓層析系統(tǒng)，先用平衡緩沖液平衡，平衡液為20mM的磷酸鹽緩沖液pH7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，后將超聲上清用0.22μm濾膜過(guò)濾后直接上樣，上樣流速為1ml/min，收集流穿，后用平衡液沖洗，然后依次用含50、100、200、300、400、500mM/L的咪唑緩沖液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用10％SDS-PAGE檢測(cè)流穿和各洗脫峰蛋白，收集100mM/L、200mM/L的咪唑緩沖液洗脫峰即為目的蛋白。
3、權(quán)利要求1所述的抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體，其特征在于利用基因工程技術(shù)，可以用細(xì)菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)制備。
4、權(quán)利要求1所述的抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體在制備抗血吸蟲(chóng)病免疫毒素及治療血吸蟲(chóng)病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體及其制備方法、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)及血吸蟲(chóng)病治療藥物領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用定位于日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)表膜、尾蚴膜、童蟲(chóng)膜、蟲(chóng)卵卵殼及卵內(nèi)毛蚴膜的單克隆抗體NP11-4，利用基因工程技術(shù)提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增VH、VL基因，利用重疊延伸PCR將VH和VL基因以VH-linker-VL形式連接成單鏈抗體基因，然后與pBAD/gIIIA載體連接，克隆至大腸桿菌Top10F’，誘導(dǎo)目的蛋白可溶性表達(dá)。表達(dá)的抗血吸蟲(chóng)單克隆抗體NP11-4單鏈抗體N端從第1個(gè)氨基酸到第122個(gè)氨基酸為單鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VH)，從第141個(gè)氨基酸到第254個(gè)氨基酸為單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)，兩者之間的linker由重復(fù)的甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)18個(gè)氨基酸組成，單鏈抗體全長(zhǎng)254個(gè)氨基酸。
文檔編號(hào)A61P33/12GK101348525SQ20081012464
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者馮振卿, 紅 李, 顧春艷, 任勇亞, 進(jìn) 朱, 張慧林, 管曉虹 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)