專利名稱：：抗皮膚真菌復方制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗皮膚真菌復方制劑，屬于寵物臨床藥物研制和開發(fā)領(lǐng)域。二
背景技術(shù)：
：在獸醫(yī)臨床實踐中，犬皮膚真菌病是一種十分常見和多發(fā)的疾病。致病真菌過量黏附于犬皮膚，侵入皮膚毛發(fā)或趾甲、大量增殖，引起皮膚器質(zhì)性病變的發(fā)生。犬皮膚真菌病的病程長、治愈難、易復發(fā)，并可在動物與動物，人與人、人與動物間互相傳播，造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。其平均發(fā)病率約為10%40%，發(fā)病率高、復發(fā)率亦高，已日益受到獸醫(yī)臨床工作者的關(guān)注。目前，常用的抗真菌藥主要有多烯類、哇類、丙烯胺類、細胞壁抑制劑等；這些藥物和相關(guān)療法雖都有一定的療效，但多數(shù)藥物價格較貴、具有毒副作用，并且因耐藥菌株的增多，使此類藥物的應用和療效受到限制。中藥是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢資源。研究表明，具有較好抑真菌活性的中藥多達300多種；中藥價格低廉、效果確實。近幾十年來，隨著科技水平的不斷提高，中藥的開發(fā)和利用已受到更多的重視和關(guān)注。在利用中藥進行抗真菌作用研究方面，也已取得了不少進展。中藥用于真菌病的防治，不僅效果好、副作用少，也不易產(chǎn)生耐藥性。如何充分利用這一優(yōu)勢，研制出新型的抗真菌藥物，不僅有助于發(fā)揮我國傳統(tǒng)醫(yī)學和資源的優(yōu)勢，而且有助于滿足寵物市場臨床藥物的快速需求，具有重要的應用價值。遺憾的是，至今尚未形成確實、可靠的中藥抗真菌制劑。針對犬皮膚真菌病常見病原，篩選出一種具有臨床防治作用的復方中西結(jié)合制劑，是一項十分繁雜的工作。首先要調(diào)査、分離犬皮膚真菌病原，進行中藥的制備和篩選，其次進行組方和抑真菌實驗，再次進行藥物的刺激性和毒性實驗，最后進行藥效學實驗。以期研制一種藥效穩(wěn)定、可靠，經(jīng)濟、實用、有效的復方抗真菌制劑，為寵物臨床藥物的研制和開發(fā)作出貢獻。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題-本發(fā)明的目的是針對目前獸醫(yī)臨床上尚缺乏抗真菌中藥復方的現(xiàn)實，研制一種復方中西結(jié)合抗真菌制劑。所獲復方無毒性及皮膚刺激性，抑殺真菌效率高，用藥后抑菌率達80%以上。技術(shù)方案抗皮膚真菌復方制劑，命名為"復方抗癬劑"，其特征在于，通過以下方法制成的(1)采用中藥水提取法按如下流程制備中藥原液取黃芩、玄參、川芎、土槿皮、厚樸各50g，加水10001500mL，大火開鍋、文火煮30min，藥汁用4層潔凈、滅菌紗布過濾，保留濾液；所獲濾渣再重復煎煮2次后棄渣；合并3次濾液，經(jīng)文火加熱濃縮至不足250mL，加水定容至250mL即為復方中藥原液；(2)取復方中藥原液作20倍稀釋，按1.25mg/mL添加冰醋酸，即成抗皮膚真菌復方制劑藥液?？蛊つw真菌復方制劑用法其噴劑直接均勻噴涂患部，2次/d，連用14d;藥浴時，2次/周，卩0min/次；噴涂和藥浴單獨使用，或配合使用。有益效果-本成果針對目前獸醫(yī)臨床上尚缺乏抗真菌中藥復方的現(xiàn)實，研制出復方中西結(jié)合抗真菌制劑一復方抗癬劑，提供了一種有效的犬皮膚真菌病臨床防治藥物。其主要優(yōu)點和有益效果如下1、藥物來源豐富復方中5味中藥和冰醋酸均屬普通藥物。來源豐富，價格便宜，生產(chǎn)成本相對較低，適于廣泛的臨床應用。2、藥效顯著實驗研究表明，復方抗癬劑對4種病原真菌均有100%的抑菌效果，藥物在較低濃度時即可起到理想的抑菌作用。臨床用藥后，對犬體表真菌的抑菌率達90.9%。3、無毒性、無皮膚刺激性復方抗癬劑既可用于噴劑，也可用于藥浴。復方的安全性和刺激性實驗表明，該復方安全無毒，對皮膚無刺激性。4、組方科學合理中醫(yī)理論認為，真菌病的病因多是濕熱蘊蒸，濕熱下注，蟲毒侵襲。復方以黃芩、玄參、川芎、土荊皮、厚樸等藥物組成。黃芩具有廣譜抗真菌和抗炎作用；玄參具有抗微生物及其毒素的作用；川芎活血行氣，有抑真菌作用，紫荊皮能殺蟲止癢、清熱燥濕，具有止痛作用；厚樸有治肌膚壞死之功、驅(qū)蟲之效。它們相互協(xié)同，具有比較明顯的體外抑真菌效果。復方中添加有1.25mg/mL冰醋酸，冰醋酸單獨使用時即具有抗真菌作用，3%濃度有直接殺菌作用，可治療各種皮膚淺部真菌感染，組方時添加濃度為0.125%，中西藥結(jié)合的體外抑菌效果表明，該方對4種常見皮膚真菌有較好的抑制作用。四圖l.真菌的分離與鑒定(l.犬小孢子菌培養(yǎng)；2.犬小孢子菌鏡檢;3.石膏樣小孢子菌培養(yǎng)4.石膏樣小孢子菌鏡檢；5.絮狀表皮癬菌培養(yǎng)；6.絮狀表皮癬菌鏡檢；7.馬拉色菌培養(yǎng)；8.馬拉色菌鏡檢)圖2.中藥抗真菌與皮膚刺激性試驗(l.部分中藥抗真菌MIC測定；2.部分單味中藥篩選試驗；3.破損皮膚顯示輕微紅斑；4.完整皮膚無明顯異常變化)五具體實施例方式(一)抗皮膚真菌復方制劑的評價方法及指標1、31味中藥體外抑真菌作用1)中藥選擇31味中藥的選擇主要根據(jù)現(xiàn)有報道中具有抑真菌活性的中藥，結(jié)合其作用效果、來源、價格等因素，用于作為組方的候選藥物。其中包括(1)清熱解毒藥生黃芩、熟地黃、苦參、黃柏、白頭翁(2)活血化淤藥川芎、玄參、丹參、夏枯草、漏蘆(3)殺蟲藥土槿皮、土茯苓、使君子、白芍、百部、檳榔、地膚子、拔契、蛇床子、虎杖、白癬皮、青蒿(4)理氣藥厚樸、丁香、菖蒲(5)芳香化濕藥霍香(6)收斂藥烏梅(7)利水藥木通(8)解表藥防風、蒿本、紫蘇葉各取50g，分別加水200300mL，開鍋后煮20min，將藥汁用紗布濾出。再重復煎煮2次，合并濾液，濃縮至50mL。制得水煎液用于實驗，濃度IOOOmg/mL。2)病原真菌分離培養(yǎng)門診犬皮膚真菌病病例，經(jīng)刮片檢查為真菌陽性或伍氏燈檢査見熒光者，于患部采集毛發(fā)數(shù)根接種于平皿。第1階段培養(yǎng)用沙氏培養(yǎng)基(SDA)于28'C培養(yǎng)34周后，作菌落宏觀檢驗(菌落生長快慢、色澤、表面形狀等)，并通過鏡檢(微觀檢査)進行真菌鑒定；未鑒定出則進入第2階段培養(yǎng)，換用其他培養(yǎng)基(DTM、PDA)培養(yǎng)34周，再根據(jù)宏觀、微觀檢查作真菌鑒定。共分離鑒定出4種常見病原真菌犬小孢子菌(必'craspor^7ca/7J^5oA'77,1902)、石膏樣小孢子菌(iZ/cmsTWiTw/gj^seu/z/i^i/,1907)、絮狀表皮癬菌(加Vejyc。p/^0/3/7occos腿泡r&，1870).和馬拉色菌(ife/assezi3/"r/i/r"o6i/^泡i^朋)《以上真菌見魏景超.真菌鑒定手冊.上?？茖W技術(shù)出版社.1979》。3)31味中藥體外抑真菌實驗(1)真菌菌液制備常規(guī)制取SDA培養(yǎng)基，將分離保存的病原真菌接種于SDA培養(yǎng)基中央，28。C活化培養(yǎng)710d;加含0.1%吐溫-20的生理鹽水2mL于活化好的菌苔表面；刮取菌苔，置于組織研磨器中研磨10min，至懸液呈毛玻璃狀；利用血細胞計數(shù)板，調(diào)整菌液濃度為(26)X106cfu/mL，備用。(2)藥基制備常規(guī)制取SDA培養(yǎng)基，分裝至132只試管內(nèi)，每管1.5mL，置斜面，冷卻備用；生藥濃度為1000mg/mL的中藥水溶液，加入上述試管內(nèi)各1.5ml;每味中藥作4只試管，共計31X4=124只，分別編號；設(shè)陽性對照組4只試管，分別加入濃度為25mg/mL的特比萘芬1.5mL，終濃度為12.5mg/mL;設(shè)陰性對照組4只試管，分別加入生理鹽水1.5mL;共計試管132只。115'C高壓滅菌15min，置斜面，冷卻備用。(3)接種用微量加樣器吸取菌液5ul，接種于藥基表面，涂布均勻；置于28'C恒溫培養(yǎng)2周，觀察生長情況。按照真菌生長發(fā)育情況，以"+"或"一"表示中藥對病原真菌"有"或"無"抑制生長的作用。結(jié)果表明，不同中藥的抑真菌效果有所差異。根據(jù)中獸醫(yī)學理論擇優(yōu)篩選出12味中藥，分別是青蒿、厚樸、黃柏、藿香、使君子、烏梅、生黃芩、白頭翁、川芎、玄參、青蒿和土槿皮。2、12味中藥最低抑菌濃度(MIC)測定1)菌液制備同31味中藥體外抑真菌實驗中菌液制備的方法。2)藥'基制備中藥原濃度為1000mg/mL;針對一種病原真菌，準備試管60只，另加陽性對照和陰性對照各l只，共計62只，分別編號。每只試管內(nèi)加入SDA培養(yǎng)基2.25mL;12味中藥，每味中藥作5個濃度梯度。取2mL注射器，吸取藥液0.5mL，加入含培養(yǎng)基試管內(nèi)0.25mL，藥物濃度稀釋為10%(即100mg/mL)。繼續(xù)抽取生理鹽水至0.5mL刻度，再加入含培養(yǎng)基試管內(nèi)0.25mL，藥物濃度稀釋為5%(即50mg/ml);依次制備2.5%(25mg/mL)、1.25%(12.5mg/mL)、0.625%(6.25mg/mL)的藥基，115'C高壓滅菌15min，置斜面，冷卻備用。需要做4組重復，以針對4種不同的病原真菌。故共需試管248支。3)接種微量加樣器吸取菌液5ul，接種于藥基表面，涂布均勻；置于28'C恒溫培養(yǎng)2周，觀察生長情況。4)最,抑菌濃度(MIC值)的判定按照真菌生長發(fā)育情況，以"一"、"+"、"++"、"+++"、"++++"5個級別，表示中藥的抑菌效果。4株真菌各培養(yǎng)2周左右，然后用視覺法判定終點。與生長對照組比較，生長完全抑制，培養(yǎng)基清亮所對應的最低藥物濃度為藥物的最低抑菌濃度。12味中藥的抑菌效果見表1。_表112種中藥提取物的MIC值(MIC:mg/mL)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果表明，中藥濃度為10%(100mg/mL)時，對4種病原真菌都有抑制作用的中藥包括黃柏、使君子、烏梅、生黃芩、川芎、玄參、土槿皮。中藥濃度為5%(50mg/mL)時，對4種病原真菌都有抑制作用的中藥有黃柏、使君子、烏梅、生黃芩、川芎、玄參。中藥濃度為2.5%(25mg/mL)時，對4種病原真菌都有抑制作用的中藥包括使君子、生黃芩、玄參。3、西藥最低抑菌濃度(MIC)測定選取抗癬特片(特比萘酚100mg/片)、里素勞(酮康唑片200mg/片)、冰醋酸(1000mg/ml)3種臨床使用效果較好的抗真菌西藥。1)菌液制備同31味中藥體外抑真菌試驗中菌液制備的方法。2)藥基制備制備SDA培養(yǎng)基；分裝至68只試管內(nèi)，1.5mL/管。配制特比萘芬藥基時，取特比萘芬1片，磨碎，加適量DMSO溶解，補充生理鹽水至50raL，濃度為2mg/raL原液。使用時，(1)取原液1.5mL(含純藥3mg)，加入1.5mL培養(yǎng)基中，終濃度為1mg/mL;(2)取原液0.5mL(含純藥lmg)，加入4.5mL生理鹽水，達到濃度為0.2mg/mL;取此液1.5mL(含純藥0.3mg)，加入1.5mL培養(yǎng)基中，終濃度為0.1mg/mL;(3)依次得到終濃度為0.01mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL的藥基3raL。配制酮康唑藥基時，取酮康唑1片，磨碎，加適量二甲亞楓(DMSO)溶解，補充生理鹽水至100mL，濃度為2mg/mL原液；同2中步驟制得濃度分別為1mg/mL，0.1mg/mL，0.01mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL的藥基3mL。配制冰醋酸藥基時，抽吸冰醋酸0.5mL(含純藥300mg)，加入生理鹽水24.5mL，至20rag/mL，為原液；抽吸原液3mL，將1.5mL藥液注入1.5mL培養(yǎng)基中，終濃度為10mg/mL;剩余藥液繼續(xù)抽吸至3mL，再將1.5mL藥液注入1.5mL培養(yǎng)基中，終濃度為5mg/mL;依次制得2.5mg/mL;1.25mg/mL;0.625mg/mL藥基各3mL。3)接'種與培養(yǎng)具體試驗操作方法與單味中藥體外抑真菌中MIC測定方法一致；設(shè)陽性對照和陰性對照組。(注臨床使用冰醋酸濃度為30mg/ml)。結(jié)果表明，對4種病原真菌生長的最低抑制濃度，特比萘酚為O.Olmg/ml;酮康唑為0.01mg/ml;冰醋酸為2.5mg/mL。4、中西結(jié)合組方抑菌試驗根據(jù)單味中藥和單純西藥的體外抑真菌試驗結(jié)果，篩選藥物進行組方。組方中涉及到3個因i:中藥復方、所選西藥、藥物濃度(表2)。根據(jù)單位中藥抑菌試驗結(jié)果和單純西藥抑菌試驗結(jié)果，確定3組受試中藥合劑，分別為復方中藥組l(理論組方)黃芩、玄參、川芎、土槿皮、厚樸復方中藥組2(最佳單味組方)使君子、黃芩、玄參、黃柏復方中藥組3(門診對照方)土槿皮、百部、蛇床子、地膚子表2中西藥結(jié)合復方因素表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗結(jié)果表明，對4種不同病原真菌的抑菌作用中，各因素之間差異不顯著。其中"中藥組合"在組方里起到了相對關(guān)鍵的作用。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，綜合各種因素，抗癬劑的最佳復方組合為A凡C3，即理論組方(黃芩、玄參、川芎、土槿皮、厚樸)、中藥總濃度為5%、加冰醋酸濃度為1.25mg/mL。這個組方對4種病原真菌均有100%的抑菌效果，命名為"復方抗癬劑"。5、復方抗癬劑的安全性和刺激性實驗1)安全性實驗中藥濃度為300mg/mL，調(diào)整冰醋酸為30mg/mL。測定小鼠最大耐受量(MTD)。取健康昆明小鼠40只，體重2030g，隨機分為試驗組和對照組，'每組20只，雌雄各半。試驗組采用300mg/mL濃度的藥物(為藥物的最高濃度),按0.4mL/10g體重灌胃給藥3次,每次間隔8h(累積折合日用藥量為中藥36000mg/kg體重、冰醋酸3600mg/kg體重)；對照組以生理鹽水代替藥物，灌藥后連續(xù)觀察7d。第7天全部小鼠采用頸椎脫臼法致死，剖檢并記錄心、肝、脾、肺、腎等組織器官的病理變化。結(jié)果表明，小鼠精神、食欲、活動與對照相比均未見異常變化，內(nèi)臟器官未出現(xiàn)任何病理變化；表明該復方不具有毒性作用。2)皮膚刺激性實驗家兔2只，體重1.5kg左右。于給藥前24h將兔脊柱兩側(cè)用8%硫化鈉去毛,去毛區(qū)為15cm2,去毛后24h檢査去毛皮膚是否因去毛而受傷。分為2組，即完整皮膚組、破損皮膚組。破損皮膚的制作采用消毒針頭將去毛消毒皮膚上劃字，以皮膚滲血為度，左右兩j則皮膚的破損程度基本一致。(1)完整皮膚組。一側(cè)用生理鹽水5mL涂抹，作為對照；另一側(cè)用復方抗癬劑5mL涂抹；并分別用浸有生理鹽水和復方抗癬劑的紗布敷料隔離受試部位。(2)破損皮膚組。與完整皮膚組操作相同。24h后用溫水去除受試物并觀察，然后涂抹相同受試物，連續(xù)7d，并于末次涂藥后1、24、48和72h觀察脫毛區(qū)皮膚反應。結(jié)果表明，復方抗癬劑未造成動物皮膚紅斑、水腫等異常情況。剌激強度評價結(jié)果表明，該復方無皮膚刺激性。(二)抗皮膚真菌復方制劑(命名為"復方抗癬劑")的制備和使用制備方法取5味生藥各50g，加水10001500mL，大火開鍋、文火煮30min，藥汁用4層潔凈、滅菌紗布過濾，保留濾液；所獲濾渣再重復煎煮2次后棄渣；合并3次濾液，經(jīng)文火加熱濃縮至不足250mL，加水定容至250mL為復方中藥原藥液(復方中藥總濃度為1000mg/mL)。取原藥液作20倍稀釋，并按1.25mg/mL添加冰醋酸，即成抗皮膚真菌復方制劑(復方抗癬劑)藥液。用法及試驗效果其噴劑直接均勻噴涂患部，2次/d，連用14d;藥浴時，2次/周，30min/次。噴涂和藥浴可單獨使用，也可配合使用。試驗結(jié)果表明，受試犬用藥前共24個被毛樣本，分離出真菌22株，占樣本總量91.7%;對照犬共8個被毛樣本，分離出真菌8株，檢出率為100%;用藥后再次從取樣部位拔毛分離培養(yǎng)真菌，受試犬24個被毛樣本共分離出真菌2株，占樣本總量8.3%，抑菌率為90.9%;對照組抑菌率為25%。本發(fā)明的技術(shù)核心在于采用了系統(tǒng)、可靠、有效的中藥篩選方法，科學合理的組方原則，以及較為標準、行之有效的產(chǎn)孢絲狀真菌的體外中藥敏感性試驗方法。本發(fā)明所參考的M38—A方案，是由美國國家臨床實驗標準委員會(NCCLS)于2003年針對產(chǎn)抱絲狀真菌抗真菌藥物敏感性試驗推出的方案。M38—A方案是一個測定絲狀真菌對不同抗真菌藥物敏感性的標準化程序，制定該方案的目的是希望經(jīng)過相同的標準化程序，使不同實驗室獲得的藥物敏感性結(jié)果具有可比性或者可重復性。權(quán)利要求1、抗皮膚真菌復方制劑，命名為“復方抗癬劑”，其特征在于，該制劑是通過以下方法制備而成的(1)取黃芩、玄參、川芎、土槿皮、厚樸生藥各50g，加水1000～1500mL，大火開鍋、文火煮30min，藥汁用4層潔凈、滅菌紗布過濾，保留濾液；所獲濾渣再重復煎煮2次后棄渣；合并3次濾液，經(jīng)文火加熱濃縮至不足250mL，加水定容至250mL即為復方中藥原液；(2)取復方中藥原液作20倍稀釋，按1.25mg/mL添加冰醋酸，即成抗皮膚真菌復方制劑藥液。2、權(quán)利要求1所述的抗皮膚真菌復方制劑的用法，包括用權(quán)利要求1所述的抗皮膚真菌復方制劑噴劑直接均勻噴涂患部，2次/d，連用14d;藥浴時，2次/周，30min/次；噴涂和藥浴單獨使用，或配合使用。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗皮膚真菌復方制劑，命名為“復方抗癬劑”，屬于寵物臨床藥物研制和開發(fā)領(lǐng)域。取5味中藥(黃芩、玄參、川芎、土槿皮、厚樸)各50g，加水1000～1500mL，水煎液經(jīng)文火加熱濃縮至250mL為復方中藥原液；取復方中藥原液作20倍稀釋，按1.25mg/mL添加冰醋酸，即成抗皮膚真菌復方制劑藥液。復方抗癬劑的刺激性和安全性實驗表明，該復方制劑無皮膚刺激性、無毒性作用；藥效學研究表明，該復方制劑可有效抑制犬體表真菌。用復方抗癬劑全身藥浴，2次/周，30min/次，結(jié)合使用復方抗癬劑制成的噴劑噴涂患部，2次/d，連用14d，用藥后抑菌率達90.9％。文檔編號A61K36/808GK101313955SQ20081012442公開日2008年12月3日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者宋大魯,榮芮,琪馬申請人:南京農(nóng)業(yè)大學