專利名稱：：一類新型胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類新型胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)類似物，及其微波促進(jìn)固相合成方法，以及新型胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)類似物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病尤其是2型糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。目前，全球約有2億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年將增加至3億。2007年，中國(guó)有4000萬(wàn)糖尿病患者，僅次于有4090萬(wàn)糖尿病人的印度居全球第二位，預(yù)計(jì)到2025年，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)將突破6000萬(wàn)，其中2型糖尿病約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%以上?，F(xiàn)有的一些口服降糖藥物是目前治療糖尿病的主要方法。主要有1.促胰島素分泌的磺酰脲類降糖藥(如格列美Jl/glimepiride)，其通過(guò)抑制p-細(xì)胞的鉀通道，刺激胰島素分泌。2.提高胰島素敏感性的藥物如PPARy激動(dòng)劑或PPARy/a雙重激動(dòng)劑噻唑烷二酮類藥物(如羅格列酮/rosiglitazone)，其可以通過(guò)促進(jìn)外周組織攝取葡萄糖，對(duì)于提高胰島素敏感性、調(diào)節(jié)脂肪代謝和保護(hù)胰島P-細(xì)胞有積極意義。3.通過(guò)減少肝臟葡萄糖輸出控制血糖的雙胍類藥物等。但由于糖尿病病因的復(fù)雜性，雖然這些口服降糖藥物的療效確切，可也存在很多不足。1.磺酰脲類降糖藥物治療2型糖尿病的藥理機(jī)制為非葡萄糖依賴，容易造成低血糖；而且由于磺酰脲類藥物是通過(guò)阻斷胰島P-細(xì)胞上的鉀通道，促進(jìn)胰島素分泌，這易引起胰島p-細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。2.噻唑垸二酮類藥物可能引起體重增加和周圍性水腫并誘發(fā)心力衰竭。3.雙胍類降糖藥如二甲雙胍有時(shí)會(huì)出現(xiàn)劑量相關(guān)的胃腸道副作用，且肝、腎功能障礙者還有發(fā)生乳酸酸中毒的危險(xiǎn)。此外，以上口服糖尿病藥物在治療2型糖尿病癥中其最大的不足是無(wú)法逆轉(zhuǎn)糖尿病的病因，即"治標(biāo)不知本"，對(duì)于胰島P-細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖無(wú)明顯作用。4.目前，治療2型糖尿病最有效的方法是注射胰島素。但是使用胰島宗會(huì)出現(xiàn)低血搪的危險(xiǎn)。受到劑量大小、注射部位、注射途徑、個(gè)體差異或注射后未進(jìn)食等因素的影響，如果使用胰島素稍有不慎，就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的低血糖副作用。因此尋找能夠安全的降血糖同時(shí)可以逆轉(zhuǎn)糖尿病病因的藥物是目前糖尿病藥物研究的當(dāng)務(wù)之急。胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)是一種葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰島素分泌而不出現(xiàn)低血糖，這種葡萄糖依賴性的促胰島素分泌特性，避免了糖尿病治療中常存在的產(chǎn)生低血糖癥的危險(xiǎn)，這些生理功能使開發(fā)GLP-l作為一種2型糖尿病治療藥物具有廣闊的前景。胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)主要由末端空腸、回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞所分泌的葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，在體內(nèi)有多種存在形式，GLP-1(736)-NH2是人體內(nèi)GLP-1主要的天然形式，約占80%;GLP-1(7~36)-NH2,氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2。GLP-1通過(guò)作用于胰島"-細(xì)胞膜上的受體GLP-1受體(GLP-1R)，促進(jìn)胰島素的分泌。GLP-1R在胰腺,-細(xì)胞膜上高度表達(dá)，是由463個(gè)氨基酸組成,屬于七次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體家族，與GLP-1高度特異性結(jié)合。GLP-l與其受體結(jié)合后可以增加胰島細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶的活性，刺激細(xì)胞內(nèi)的第二信使cAMP的增力Q，導(dǎo)致細(xì)胞膜K+通道關(guān)閉.細(xì)胞去極化,誘發(fā)電壓依賴性的Ca"通道開放，細(xì)胞外012+內(nèi)流.細(xì)胞衆(zhòng)Ca^濃度升高觸發(fā)胰島素的釋放。此外cAMP水平升高，又激活cAMP依賴的蛋白激酶A和磷酸化酶,進(jìn)而刺激盡細(xì)胞胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，刺激^細(xì)胞的增值和分化。胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)具有多種生物學(xué)效應(yīng)。如下1、具有血糖依賴性的腸促胰島素分泌作用；2、阻止胰腺/!-細(xì)胞退化，刺激》-細(xì)胞的增值和分化；3、誘導(dǎo)前胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)前胰島素的生物合成；4、增加胰島素的敏感性；5、增加生長(zhǎng)抑素分泌，抑制胰高血糖素的產(chǎn)生(此作用也是血糖依賴性)；6、抑制胃酸分泌，延遲胃排空；7、通過(guò)作用于丘腦下部的中樞抑制食欲，降低食物攝取量等作用。GLP-1的N末端6個(gè)氨基酸為GLP-1與其受體結(jié)合部位，在體內(nèi)，血漿中的DPPIV特異性識(shí)別并且切割GLP-1的N末端ffis7-Ala8二肽，其體內(nèi)半衰期不足5分鐘。His7-Alas殘基喪失，不僅導(dǎo)致GLP-1完全喪失生物活性，其降解產(chǎn)物GLP-1(936)-NH2還對(duì)GLP-1受體具有抑制作用。是通過(guò)改變GLP-1的N端DPPIV酶解部位氨基酸Alas，可以以抑制其被DPPIV的水解作用。此外，天然GLP-1類似物Exendin-4是從美國(guó)西南部一種大毒蜥的唾液中分離的含39個(gè)氨基酸殘基的多肽，它與哺乳動(dòng)物的GLP-1大約有53%的同源性。研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4與GLP-1有相似的生理功能，而且能抵抗DPPIV的降解，其體內(nèi)有效作用時(shí)間約56h，目前己經(jīng)美國(guó)在上市，而且研究表明Exendin4與GLP-l受體的親和力比胰高血糖素樣肽-1與GLP-1受體的親和力更高，活性更好。Exendin-4與胰高血糖素樣肽-1除了在DPPIV酶解位點(diǎn)Alas處不同外，其二級(jí)結(jié)構(gòu)與胰高血糖素樣肽-1也有不同之處。GLP-1從Thru到Glu2i，和從Gln23到Gly35為兩條穩(wěn)定的a螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，而Exendin4相應(yīng)的序列的序列為一條穩(wěn)定的a螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)镚LP-1中Gly22為柔性結(jié)構(gòu)，而Exendin-4相應(yīng)的氨基酸為Glu，具有促螺旋作用。所以Exendin4比GLP-l更加穩(wěn)定，這可能主要也是由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的差別造成。多肽可以通過(guò)基因工程的方法或者化學(xué)合成的方法得到，1963年Merrifield創(chuàng)立并開發(fā)了固相合成多肽的方法。畫相多肽合成一般有兩種策略即Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略和Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，其中FmocABu正交保護(hù)固相合成策略則反應(yīng)條件溫和的多。當(dāng)近年來(lái)微波技術(shù)運(yùn)用于多肽的固相合成中后，使多肽的合成技術(shù)產(chǎn)生了一個(gè)飛躍。微波促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)是由于其使極性分子在微波場(chǎng)中快速旋轉(zhuǎn)，使得一些反應(yīng)速率較常規(guī)加熱方法快10到1000倍，而且產(chǎn)率大大提高。如何高效的合成長(zhǎng)肽(大于30肽)在世界上仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).而使用微波促進(jìn)固相合成多肽，可以克服困難肽字，合成傳統(tǒng)固相方注無(wú)法得到的多肽.而且合成時(shí)間大大縮短，且顯荖提高多肽粗品純度及收率，使得產(chǎn)品的純化大大方便，只要經(jīng)過(guò)一次制備型HPLC就能得到純度較高的產(chǎn)品。因此，我們?cè)贕LP-1類似物的合成中采用此種方法快速高效的合成得至IJGLP-1系列類似物。
發(fā)明內(nèi)容胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)是葡萄糖依賴性的促胰島素分泌腸降血糖多肽激素，其有治療糖尿病的優(yōu)點(diǎn)突出，但是其生物半衰期短。本發(fā)明的目的是針對(duì)其易被二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV，DPPIV)及體內(nèi)其它活性酶(如中性肽鏈內(nèi)切酶neutralendopeptidase24.1l水解)的缺點(diǎn)，首先將其易被水解部位的氨基酸用其它氨基酸替換，以期望達(dá)到延長(zhǎng)半衰期的效果；再在此基礎(chǔ)上將GLP-1的柔性部位殘基Gly22替換為具有促螺旋作用的氨基酸Glu，使GLP-l的柔性連接區(qū)的a螺旋程度增加，以進(jìn)一步增加其降糖活性。合成了一類GLP-1衍生物。其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式His-Xaa-Glu-GIy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala陽(yáng)Lys-Glu-Phe-Ile，Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:1)Xaa:Gly，Phe，Asp，Met,Ile，Thr，Ser，Val，Leu，Lys，Gu。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.提出的一種GLP-l類似物，將其易被水解部位的氨基酸用其它氨基酸替換，可以提高GLP-1的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)作用時(shí)間。具有抗DPPIV等酶解作用，生物半率期較GLP-1原型長(zhǎng)。2.將GLP-1的柔性部位殘基Gly22替換為具有促螺旋作用Gki，使GLP-1的柔性連接區(qū)的a螺旋程度增加，將GLP-1的肽鏈主要中間部分的結(jié)構(gòu)固定為一條穩(wěn)定的a螺旋結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)被改造為活性優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)，提高了其與GLP-1受體的親和能力，在GLP-1原型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了GLP-1的降糖活性。上文對(duì)本發(fā)明做了一般性描述，下面附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案。其中圖1顯示的是GLP-1(7~36)-NH2與DPPIV溫孵Oh和4h的HPLC分析譜圖2顯示的是改造后的Gly8-Glu22-GLP-(7~36)-NH2與DPPTV溫孵Oh和4h的HPLC分析譜圖。具體實(shí)施例方式在本說(shuō)明書全文中采用以下縮寫Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基嗎啉；D正A:N,N'-二異丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺；DMSO:二甲亞砜；DCM:二氯甲烷；FmOC:N-9荷甲氧羰基；DIC:N，N'-二異丙基碳二亞胺；CDI:N，N'-羰基二咪唑；DMAP:4-二甲氨基吡啶；HOSU:N-羥基琥珀酰亞胺；EDC.HC1:l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU:苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU:6-氯苯并三氮唑-U，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT:1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT:l-羥基-苯并三氮唑；PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC:高效液相色譜；ESI-MS:電噴霧質(zhì)譜；Gly:甘氨酸；Ser:絲氨酸；Ala:丙氨酸Thr:蘇氨酸；Vd:纈氨酸；lie:異亮氨酸；Leu:亮氨酸；Tyr:酪氨酸；Phe:苯丙氨酸；His:組氨酸；Pro:脯氨酸；Asp:天門冬氨酸；Met:蛋氨酸；GU:谷氨酸；Trp:色氨酸Lys:賴氨酸；Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺；Gin:谷氨酰胺。'本發(fā)明是通過(guò)下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明的，但這些實(shí)施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。實(shí)施例1Gy8-GI.u22-GLP-(7~36)-NH2(SEQ.IDNO:2)的微波促進(jìn)固相合成(1)樹脂的溶脹稱取Fmoc-rinkamide-MBHAResin50mg(取代量0.4腿ol/g)，經(jīng)7mLDCM溶脹30min，抽濾去DCM，再用10mLNMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM,NMP7mL沖洗干凈。(2)微波促進(jìn)Fmoc保護(hù)基的脫除將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0.1MHOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)1min，微波功率為15W,反應(yīng)溫度控制在5(TC以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含O.lMHOBT的259b哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在5(TC，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護(hù)基的樹脂。(3)微波促進(jìn)Fmoc-Arg(Pbf)-rinkamide-MBHAResin的合成將Fmoc陽(yáng)Arg(Pbf)-OH(0.04翻ol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04腿ol)禾卩DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在5(KC，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL;'先滌樹脂3次((4)偶合效率的檢測(cè)用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測(cè)樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下一個(gè)偶合循環(huán)。茚三酮法取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml0.001MKCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于IO(TC加熱5分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。溴酚蘭法取少量樹脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1%的溴酚藍(lán)二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。(5)肽鏈的延長(zhǎng)按照GJy8-Glu22-GLP-(7~36)-NH2的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進(jìn)反應(yīng)時(shí)間520min不等。得到連有Gly8-Glu22-GLP-(7~36)-NH2的樹脂。(6)樹脂上多肽的裂解將上述得到的連有Glys-Gu22-GLP-(7~36)-NH2的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑RegeantK(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5,V/V)10mL，先在0。C下振搖30min，再在常溫F反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)朿后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品。最終得到Glys-Glu22-GLP-(7~36)-NH2粗品64.4mg，收率為95.9%。(7)Gly8-Glu22-GLP-(7~36)-NH2粗品的純化將上面得到的Gly8-Gu22-GLP-(7~36)-NH2粗品，溶于少量的水中，用島淳制備型反相HPLC純化粗品。純化中采用C18反相制備柱(340mmx28mm，5pm);流動(dòng)相A:0.1%TFA/水(V/V)，流動(dòng)相B:0.1免TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B20X65W，40min;流速為6m!7min;檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。收集的溶液凍干得純品，最終得到純品29.7mg。ESI-MSm/z:found[M+3H〗3+1119.5,[M+4H]4+840.0，[M+5H產(chǎn)680.0;calu[M+3H]3+1119.6，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+679.8。理論相對(duì)分子質(zhì)量為3283.6,實(shí)際相對(duì)分子量為3355.7。實(shí)施例211根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實(shí)施例228的多肽，通過(guò)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。實(shí)施例2His-Phe-Gin-GW-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va卜Ser-Ser-Tvr-Leu-G〗u-Glu-Gln墨Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-ne-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:3);理論相到分子質(zhì)量為3445.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1149.4,[M+4H]4+862.4，fM+4H+K]5+697.6:calu[M+3H產(chǎn)1149.6,[M+4H]4+862.5，[M+4H+K]5+697.8。實(shí)施例3ffis-Asp-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ak-LYS-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:4);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3413.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1138.5,[M+4H]4+854.3，[M+5H產(chǎn)691.3;calu[M+3H13+1138.9，「M+4HJ4+854.4,[M+4H+K]5+691.4。實(shí)施例4His-M^-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:5);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3429.9。ES1-MSm/z:found[M+3H]3+1144.2,[M+4H]4+858.4，[M+3H+Na]4+864.0,[M+5H]5+687.0;calu[M+3H]3+1144.3，[M+4H]4+858.5,[M+3H+Na]4+864.0，[M+5H產(chǎn)687.0。實(shí)施例5His-Ik-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:6);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3411.8。ESI-MSm/z:found|M+3H]3+i138.2,[M+4HJ4+854.。，[M+5H]5+683.4;calu[M+3H3+U3&3，fM+4Hj"854.0，[M+5H]5+683.4。實(shí)施例6His-Thr-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala陽(yáng)Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:7);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3399.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1134.2,[M+4H]4+850.9，[M+5H]5+681.0;calu[M+3H產(chǎn)1134.3，[M+4H]4+850.9，[M+5H]5+681.0。實(shí)施例7His-Ser-Glu-Glv-Thr-Phe畫Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu墨GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe畫ne-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-GIy-Arg-NH2(SEQ.IDNO:8);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3385.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1129.7,[M+4H]4+847.6，[M+5H]5+678.5;calu[M+3H3+1129.6,[M+4H]4+847.4，[M+5H]5+678.3。實(shí)施例8His-巡-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-GIu-Phe-Ile-A!a-Trp-Leu-Va'-Lys-Gy-Arg-NH:(SEQ.IDNO:9):論*對(duì)分-丁'質(zhì)量為？397.8,ESI-Mm/z:found[M+3H13—1133.5'〖M+4H14+850.5，[M+5H]5+680.5;calu[M+3HJ3+1133.6,|M+4H]4+850.4,[M+5H]5+680.6。實(shí)施例9His-Leu-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-11e-A]a-Trp-Leu-Val-Lys-Giy-Arg-NH2(SEQ.IDNO:10);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3411.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1138.3，[M+4H]4+853.9，[M+5H]5+683.5;calu[M+3H]3+1138.3，[M+4H]4+853.9,[M+5H]5+683.4。實(shí)施例10ffis-Lys-GIu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-TYr-Leu-Glu-GIu匿Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe墨De-Aa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:11);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3426.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1143.2,[M+4H]4+857.7，[M+5H]5+686.3;calu[M+3H]3+1143.3，[M+4H]4+857.7，[M+5Hj5+686.4。實(shí)施例11His-Glu-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-G]y-Arg-NH2(SEQ.IDNO:12);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3427.8。ESI-MSm/z:found[M+3H〗3+1143.6,[M+4H]4+857.9，[M+5H]5+686.6;calufM+3H]3+1143.6,[M+4H]4+857.9，LM+5H產(chǎn)686.6。實(shí)施例12GLP-1及其類似物對(duì)DPPIV的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)純化后的GLP-1或其類似物5nmol和5mU的DPPIV在200濃度為50mM的Tris-HCL緩沖溶液中，37。C溫孵4h，pH7.4。最后加入10|aL20%的乙腈/水溶液終止反應(yīng)。分別取0h,4h點(diǎn)的溫孵溶液，離心，取上清液，進(jìn)HPLC分析；柱尾收集降解產(chǎn)物GLP-1(9~36)-NH2。分析采用C18反相柱(150mrnx4.6mm，5jam);流動(dòng)相A:0.1%TFA/7夂(V/V)，流動(dòng)相B:0.1免TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B10免45免，22min;流速為1mL/min;柱溫為40°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。如圖l，圖2所示，結(jié)果顯示未經(jīng)改造的天然GLP-1在與DPPIV溫孵4h后，基本上皆被水解為無(wú)活性的GLP-1(936)-NH2，完整的肽鏈小于10%。而改造后的GLP-1類似物與DPPIV溫孵4h后基本上都仍保持原型，未見有降解，完整的肽鏈大于90%。結(jié)果表明通過(guò)對(duì)GLP-1易被DPPIV水解的部位改造，可以使GLP-1類似物抵抗DPPIV的酶解作用，從而能保持肽鏈的完整性。實(shí)施例13GLP-1及其類似物體內(nèi)降糖活性實(shí)驗(yàn)取10周齡雄性昆明小鼠(體重1822g)，隨機(jī)分組，每組6只。只給飲水，禁食過(guò)夜。一組按照小鼠體重每千克腹腔注射lSmmo〖的葡萄糖溶液〔濃度209fc.)和生理鹽水其他組按照小鼠體重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液和25nmol的GLP-1類似物溶液(10Hmol/L)。在0，15，30，45，60用血糖儀測(cè)定血糖值。如表1所示，在將其易被水解部位的氨基酸Ala8用其它氨基酸替換的基礎(chǔ)上，將其柔性部位殘基Gly22替換為具有促螺旋作用Glu，使GLP-1的柔性連接區(qū)的a螺旋程度增加，在GLP-1原型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了GLP-1的降糖活性，其中Glys-Glu22-GLP-(7~36)-NH2(SEQ.IDNO:12)是所有的GLP-1類似物中活性最好的一個(gè)。表1GLP-1及其類似物降血糖的效應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><110>中國(guó)藥科大學(xué)<120>—類新型胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物及其應(yīng)用<丄60>12<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>30<212二PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gy，Phe，Asp,Met,He,Thr,Ser,Val,Leu，Lys，或Glu<400>1HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTipLeuValLysGlyArg202530<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>2HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTipLeuValLysGlyArg202530<210>3<211>30<二12>PRT<213>人工序列<400>3HisPheGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>4<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>4HisAspGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>5<211>30<212>PRT<213>尺工序列<4()()>5HisMetGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>6<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>6HislieGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>7<211>30<212>PRT<213〉人工序列<400>7HisThrGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>8<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>8HisSerGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTipLeuValLysGlyArg202530<210>9<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>9HisValGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<CKh>10<211>30<212>PRT<23>人工序列<4()0>10HisLeuGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>11<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>11HisLysGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>12<211>30<212>PRT<213>人工序列<4()0>12HisGluGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530權(quán)利要求1.一種含有式I(SEQ.IDNO1)結(jié)構(gòu)的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，得到的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物；其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO1)XaaGly，Phe，Asp，Met，Ile，Thr，Ser，Val，Leu，Lys，Glu。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，具有如下序列Hi,、-G!\-Giii-GJv-Thi--Phe層Thr-Ser層Asp-VaI-Ser-Ser-Tvr-Leu-Giu-Gk:-Glii-Ala-Ah-Lvs-Giu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va]-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:2);His-Phe-Glu-G]v匿Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va1-Ser-Ser-Tyr-Leu-GIu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:3);His-Asp-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-As。-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:4);His-MM-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:5);His-Iie-Glu-Gly-Thr匿Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:6);His-Thr-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-AIa-Ala-Lys匿Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:7);His-Ser-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Gu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:8);His-Val-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp匿Val-Ser-Ser-Tyr陽(yáng)Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:9);ffis-Leu-Glu-GlY-Thr-Phe-Thr-Ser-AsD-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala匿Ala-LYS-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:10);ffis-Lvs-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys匿Gly-Arg匿NH2(SEQ.IDNO:11);His-Glu-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:12);3.—種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的GLP-1類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。4.權(quán)利要求l中所述的GLP-1類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑在制備用于治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一類新型GLP-1類似物及其應(yīng)用。通過(guò)對(duì)天然GLP-1的8，22氨基酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行改造得到具有更穩(wěn)定且降糖活性更強(qiáng)的GLP-1類似物；其化學(xué)合成是通過(guò)微波促進(jìn)固相合成方法高效快速實(shí)現(xiàn)，粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相純化，最后凍干得到GLP-1類似物。文檔編號(hào)A61P3/00GK101337989SQ20081012464公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月28日優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日發(fā)明者倪帥鍵,周映紅,周金培,張惠斌,遲玉石,海錢,黃文龍申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)