專利名稱：抗腫瘤化合物，其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的三萜生物堿化合物小葉黃楊寧G， 其制備方法，以小葉黃楊寧G化合物為活性成分的藥物組合物，以及 它在治療腫瘤疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)中藥大辭典記載中藥黃楊性平，味苦，無毒。功 用主治祛風(fēng)濕，理氣，止痛，治風(fēng)濕疼痛，胸腹脹氣，牙痛，疼痛， 跌打損傷?！侗静菥V目》記載黃楊木具有祛風(fēng)除濕、行氣活血的作用。 黃楊木粉是民間流傳治療心病的有效藥物。環(huán)維黃楊星D(Cyclovirobuxinum D)系從黃豐湯禾斗H物<J、葉黃豐湯(5zaws w /cTO/7/2少/to Sieb.etZucc.)及其同屬植物中提取的一種生物堿，亦稱黃楊寧、環(huán)常 綠黃楊堿D、黃楊堿等，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬三萜生物堿。環(huán)維黃楊星D主要 用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、脈結(jié)代、冠心病、心律失常者。 現(xiàn)代藥理研究顯示環(huán)維黃楊星D有保護(hù)神經(jīng)元、抗心律失常及心肌 缺血等作用。臨床上，對缺血性心臟病、心律失常等均具有較好的作 用，是我國成功研制的一種治療心血管疾病的新藥。多年的臨床應(yīng)用 顯示，環(huán)維黃楊星D對多種心律失常、心絞痛、冠心病、心功能不全 等具有良好的療效，并被收錄于《中國藥典)2000年版一部。環(huán)維黃楊星D作為一種非苷類強(qiáng)心藥服用藥時安全性較大，且長期應(yīng)用毒副作用低，這些都預(yù)示著這種從天然植物中提取的新藥有著 良好的應(yīng)用前景。目前有關(guān)環(huán)維黃楊星D心血管藥理作用的系統(tǒng)研 究，如鈣增敏作用、消除心肌肥大作用、對抗心肌缺血的治療機(jī)理、 對腎素一血管緊張素系統(tǒng)的影響等等，有待進(jìn)一步深入研究?，F(xiàn)有技 術(shù)中未有本發(fā)明的化合物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
. 本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有藥用價值的三萜生物堿化 合物小葉黃楊寧G。本發(fā)明的另一 目的是提供一種從小葉黃楊(^m/s m/crap/^/a Sieb.etZucc.)植物中提取本發(fā)明化合物小葉黃楊寧G的方法。 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種抗腫瘤的藥物組合物。 本發(fā)明的另一目的是提供上述化合物和組合物在制備抗腫瘤的 藥物方面的用途。尤其是在制備抗肝癌和抗白血病藥物中的用途。 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的fe術(shù)方案 本發(fā)明提供了化合物小葉黃楊寧G的制備方法，采集小葉黃楊 ^m^.m/craMy//a的地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3-4 次，每次l-2天，合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏； 所得浸膏加一定量的酸水稀釋并調(diào)pH值為2-3，用乙酸乙酯萃取2-3 次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pH為9-10，用氯仿萃取2-3 次得到總生物堿部分；氯仿部分在常壓硅膠柱上柱層析，用氯仿-甲 醇梯度洗脫進(jìn)行粗分，用TLC檢測，得到4-6個部分.氯仿-甲醇 (20:1)反復(fù)用硅膠柱層析分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，洗脫得到BM-3化合物的粗品；在經(jīng)ODS柱層析分離純化，或用Sephadex LH-20進(jìn)一步純化，得到化合物BM-3化合物的純品。更具體的方法為取小葉黃楊地上部分，粉碎后用70%丙酮常 溫滲漉提取3次，每次2天；合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出， 得浸膏，加酸水稀釋調(diào)pH-2，分別用乙酸乙酯萃取3次，得到非生物 堿部分；酸水液堿化至pH40，用氯仿萃取3次得到生物堿部分；氯 仿萃取拌硅膠在常壓硅膠柱上柱層析，氯仿-甲醇(100:0,50:1,20:1, 10:1,2:1)梯度洗脫，用TLC檢測，得到Fr.l-Fr.5 5個部分；將Fr.3部 分上硅膠柱用氯仿-甲醇(20:1 , 5:l)得至ijFr.3.1， Fr.3.2組分；Fr.3.1組 分反復(fù)上硅膠柱用氯仿-甲醇(50:1 ,20: 1， 10:1)，得到的氯仿-甲 醇(20:1)部分，經(jīng)Sephadex LH-20進(jìn)一步純化得到權(quán)利要求1化合 物。本發(fā)明提供的化合物小葉黃楊寧G的結(jié)構(gòu)式如下所示6本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述化合物為活性成分， 以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的化合物和組合物可用于制備治療腫瘤疾病的藥物。 上文所述的的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載 體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑 如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油; 崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面 活性劑如十六垸醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、 硬脂酸鈣和鎂、以及和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它 輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃 外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成 常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或 油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將 其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、膠囊 和注射劑。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方 法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需 的劑型。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1%~99.5%的活性成分， 最優(yōu)選含有重量比為0.5%~95%的活性成分。本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所 治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是0.01~10mg/kg體重，優(yōu)選0.1 5mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯谩?br> 具體實施方式
.-下面的實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不 以任何方式限制本發(fā)明。 實施例h取小葉黃楊(^m^ ^^ /7/7少//")地上部分14&8，粉碎后用70%丙 酮常溫滲漉提取3次，每次2天；合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出， 得到浸膏800 g，加酸水3000ml稀釋調(diào)pH-2，分別用3000ml乙酸乙酯 萃取3次，得到非生物堿部分。酸水液堿化至pH-lO，用3000ml氯仿 萃取3次得到生物堿部分135 g。氯仿萃取(135 g)拌硅膠180 g在常 壓硅膠柱(硅膠400 g)上柱層析，氯仿-甲醇(100:0, 50:1,20:1, 10:1, 2:1)梯度洗脫，用TLC檢測，得到5個部分(Fr.l-Fr.5)。 Fr.2(18 g)硅 膠柱層次石油醚-丙酮(20:l ,5:1)得到Fr.2.1， Fr.2.2兩個組分。Fr.3 (14 g)硅膠柱用氯仿-甲醇(20:1 ,5:1)得到Fr.3.1 ， Fr.3.2。 Fr.3.1 (2 g) 反復(fù)上硅膠柱用氯仿-甲醇(50:l ,20: 1， 10:1)，得到的氯仿-甲醇 (20:1)部分經(jīng)Sephadex LH-20進(jìn)一步純化得到BM-3 (42 mg)。 BM-3化合物的結(jié)構(gòu)表征BM-3化合物C36H54N205,白色結(jié)晶(甲醇)，mp286。C， [a]24D 8.6 (c 1.52， CHC13)， UV(MeOH) anax (log s ) 218(2.76)， 235(2.51)， 295(2.79)， 321(3.54)nm; HRESIMS附/z 595.4108[M + H]+。氫核磁共振譜數(shù)據(jù)5 (ppm， CDC13: CD30D (5:1)， 500MHz): 3.95(m， 3-H)， 3.97(m,16-H)， 0.26， 0.44(dd, /= 3.9， 19-H), 0.79(d， 7=6.4， 21-CH3)， 2.92， 3.25(AB， 《/=12.8， 30鄰，0.87(s， 18-CH3)， 0.55(s， 31-CH3)， 1.02(s， 32-CH3)， 6.92(dd， /=8.0， 1.6， 3'-H)， 6.74(d,J-8.0， 4'-H)， 6.95(d， 1.6， 7'-H)， 6.24(d， J =15.6， r-H)， 7.42(d， 《/= 15.6， 2"-H)。碳核磁共振譜數(shù)據(jù)S(ppm， CDC13: CD30D(5:1)， 500MHz): 32.5 (t， C-l)， 26.0 (t， C-2)， 51.4 (d， C-3)， 44.4 (s， C-4)， 40.4 (d， C-5)， 20.7(t， C-6)， 27.2(t，C-7)， 47.9 (d， C-8)， 19.3 (s， C國9)， 25.6 (s， C-IO)， 25.7 (t， C-ll)， 31.3 (t， C-12)， 44.6 (s， C-13)， 47.2 (s， C國14)， 44.1 (t， C-15)， 79.0 (d， C-16)， 62.4 (d， C-17)， 18.9 (q， 18國CH3)， 30.5 (t， C-19), 56.2 (d， C-20)， 9.5 (q， 21-CH3)， 63.9 (t， C-30)， 11.2(q， 31-CH3)， 21.0(q， 32-CH3)， 167.9 (s， C-l')， 126.8(s， C-2')， 110.2 (d， C-3，)， 115.1 (d， C-4')， 147.9 (s， C-5')， 147.3 (s， C-6')， 122.0(d， C國7')， 116.9(d， C-l")， 141.8 (d， C-2")， 55.7(q， 3"-CH3)。紅外光譜數(shù)據(jù)IR(KBr)vmax: 3410， 3364， 2972， 2935， 1629， 1523， 1279cm-l。BM-3化合物名稱小葉黃楊寧G (BuxmicrophyllineG)。實施例2:化合物BM-3的抗腫瘤生物活性體外抗腫瘤細(xì)胞毒性的生物活性測定方法抗腫瘤藥物篩選的細(xì)胞系培養(yǎng)于含5%胎牛血清，2mML-谷氨 酸的RPMI 1640培養(yǎng)基中。 一個典型的篩選過程如下于96孔板中 每孔加入100^1密度為5x104-4x105 /ml的細(xì)胞。細(xì)胞密度的選擇依 賴于細(xì)胞傳代的時間即由一個細(xì)胞變?yōu)閮蓚€細(xì)胞所需要的時間。然 后置于37。C， 5%C02， 95%空氣，100%相對濕度環(huán)境下培養(yǎng)24小 時。24小時后，每個細(xì)胞系取兩塊板，用含TCA的situ固定，以 測定藥物加入前的細(xì)胞數(shù)(Tz)。待測藥物用DMSO溶解，終濃度 為所需濃度的400倍，冷凍保存。按所需取出藥物，融化，用含 50ug/ml慶大霉素的完全培養(yǎng)基稀釋至濃度為所需最大濃度的2 倍。除4倍梯度稀釋外，也采用10倍或者l/21og梯度稀釋藥物。每個藥物5個梯度，設(shè)對照。然后向含細(xì)胞的孔中每孔加入稀釋好 的藥物100ul，那么藥物濃度為所需濃度。加藥后，37°C， 5%C02， 95°/?？諝猓?00%相對濕度環(huán)境下培 養(yǎng)48小時。對于貼壁細(xì)胞，通過加入冰冷的TCA殺死細(xì)胞。具體 操作如下逐滴加入50〖il含50% (w/v) TCA (重濃度10。/。TCA)， 4°C，放置60分鐘，固定細(xì)胞，去上清，逐滴加入水，洗滌5次， 空氣中干燥。每孔加入100^1 0.4% (w/v且用1°/。乙酸稀釋)，室溫 孵育10分鐘。染色結(jié)束后用1%乙酸洗滌5次，除去未結(jié)合的染料， 空氣中干燥。結(jié)合的染料用10Mm trizma base溶解。自動讀板儀測 定光吸收(515nm)。對于懸浮細(xì)胞，殺死細(xì)胞時逐滴加入80% TCA(終濃度16%)，將細(xì)胞固定于板底，其余步驟與貼壁細(xì)胞相同。用7個光吸收值(加入藥物前的TZ;對照C;五個藥物濃度 Ti;)，可以計算各個藥物濃度下細(xì)胞的生長水平。 藥物對腫瘤細(xì)胞生長抑制的計算如下當(dāng)Ti^Tz時，在藥物濃度i的生長抑制率為[(Ti-Tz) / (C-TZ) ]xlOO;當(dāng)Ti蕓Tz時，在藥物濃度i的生長抑制率為[(Ti- Tz)/Tz]xlOO;反映量效的三個參數(shù)的計算如下GI50 (生長抑制50%)可由[(Ti-Tz) / (C-Tz) ]><100=50計算 得出。其反映藥物導(dǎo)致試驗組蛋白增加比對照組增加減少50%時的 藥物濃度。TGI (生長完全抑制)可由T—Tz計算得出。LC50 (導(dǎo)致藥物處理后蛋白的含量比處理前減少50%的藥物濃 度)，顯示處理后細(xì)胞的凈損失，其可以由〖(Ti- Tz) /Tz]xlOO=50 計算得出。如果活性達(dá)到一定水平的話，可以計算出這三個參數(shù)值。 如果活性太低或者太高，參數(shù)的值可以用大于或者小于最大或者最 小的試驗濃度來表示。表l化合物BM-3， BM-8的細(xì)胞毒生物生物活性(IC50inpM)CompoundCell line HepG2 (肝癌細(xì)胞株) K562 (白血病細(xì)胞株)BM-30.89 4.44Control Cisplatin1.45 8.54從表1中數(shù)據(jù)可以看出化合物BM-3對腫瘤細(xì)胞系HepG2(肝癌 細(xì)胞株)、K562(白血病細(xì)胞株)的細(xì)胞毒生物活性(IC50 in pM)十分明 顯化合物BM-3對兩種腫瘤細(xì)胞系的抑制活性IC50，均在mM數(shù)量 級上；足見BM-3抑制腫瘤細(xì)胞的顯著活性?；衔顱M-3對一些腫 瘤細(xì)胞系的抑制活性也十分顯著，對HepG2、 K562細(xì)胞系的IC50分 別達(dá)0.89和4.44 mM，表明化合物BM-3對腫瘤細(xì)胞系的抑制活性十 分強(qiáng)，比陽性對照順鉑(Cisplatin)的活性要好。陽性對照順鉑 (Cisplatin)是目前仍然廣泛應(yīng)用的臨床抗腫瘤化療藥物，表明化合 物BM-3對腫瘤細(xì)胞系HepG2(肝癌細(xì)胞株)、K562(白血病細(xì)胞株) 的細(xì)胞毒生物活性(IC50 in MM)十分明顯，具有很好的抗白血病、肝 癌腫瘤的治療藥物的開發(fā)及其利用前景。實施例3:片劑實施例1所得化合物BM-3 10mg，乳糖180mg，淀粉 55mg，硬脂酸鎂5mg;制備方法將化合物、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤 后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片， 每片重250mg，化合物含量為10mg。實施例4:安瓿劑實施例1所得化合物BM-3 2mg，氯化鈉10mg; 制備方法將化合物和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。實施例5:膠囊劑實施例1所得化合物BM-3 10mg，乳糖187mg，硬脂 酸鎂3mg;制備方法將化合物與助劑混合，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。
權(quán)利要求
1、如結(jié)構(gòu)式所示的化合物小葉黃楊寧G
2、權(quán)利要求1化合物小葉黃楊寧G的制備方法，采集小葉黃楊 的地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3-4 次，每次l-2天，合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏； 所得浸膏加一定量的酸水稀釋并調(diào)pH值為2-3，用乙酸乙酯萃取2-3 次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pH為9-10，用氯仿萃取2-3 次得到總生物堿部分；氯仿部分在常壓硅膠柱上柱層析，用氯仿-甲 醇梯度洗脫進(jìn)行粗分，用TLC檢測，得到4-6個部分.氯仿-甲醇 (20:1)反復(fù)用硅膠柱層析分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，洗脫得到 BM-3化合物的粗品；在經(jīng)ODS柱層析分離純化，或用Sephadex LH-20進(jìn)一步純化，得到化合物BM-3化合物的純品。
3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于取小葉黃楊地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3次，每次2天；合并提取液，減壓 濃縮至無丙酮蒸出，得浸膏，加酸水稀釋調(diào)pH-2，分別用乙酸乙酯 萃取3次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pH-10，用氯仿萃取3 次得到生物堿部分；氯仿萃取拌硅膠在常壓硅膠柱上柱層析，氯仿-甲醇(100:0, 50:1, 20:1, 10:1, 2:1)梯度洗脫，用TLC檢測，得到 Fr.l-Fr.5 5個部分；將Fr.3部分上硅膠柱用氯仿-甲醇(20:l , 5:1)得到 Fr.3.1， Fr.3.2組分；Fr.3.1組分反復(fù)上硅膠柱用氯仿-甲醇(50:1 ,20: 1， 10:1)，得到的氯仿-甲醇(20:1)部分，經(jīng)SephadexLH-20迸一 步純化得到權(quán)利要求l化合物。
4、 抗腫瘤藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1化合 物小葉黃楊寧G和藥學(xué)上可接受的載體。
5、 權(quán)利要求1化合物小葉黃楊寧G在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6、 權(quán)利要求1化合物小葉黃楊寧G在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
7、 權(quán)利要求1化合物小葉黃楊寧G在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種如右結(jié)構(gòu)式所示的新的三萜生物堿化合物小葉黃楊寧G，其制備方法，以小葉黃楊寧G化合物為活性成分的藥物組合物，以及它在治療腫瘤疾病中的應(yīng)用。
文檔編號A61P1/16GK101328200SQ200810058448
公開日2008年12月24日 申請日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者晨 卿, 琳 周, 赟 孫, 張憲民, 張雁麗, 邱明華, 閆玉鑫 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所