專利名稱：：作為syk-激酶抑制劑的吡咯并吡嗪的制作方法作為SYK-激酶抑制劑的吡咯并吡溱交叉參考發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及取代的氮雜吲咮、它們的制備方法、含有這些化合物的藥物組合物以及它們?cè)谥委熌芡ㄟ^(guò)抑制蛋白激酶被調(diào)控的疾病狀態(tài)中的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：蛋白激酶參與控制由細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子和環(huán)境變化所引起的細(xì)胞的活化、生長(zhǎng)和分化的發(fā)信號(hào)事件。一般而言，這些激酶分為幾類；一些優(yōu)先磷酸化絲氨酸和/或蘇氨酸殘基，一些優(yōu)先磷酸化酪氨酸殘基[S.K.Hanks和T.Hunter，F(xiàn)ASEB.J.，1995，9，576-596頁(yè)。絲氨^/蘇氨酸激酶包括例如蛋白激酶C同工型[A.C.Newton,J.Biol.Chem.，1995，270，28495-28498頁(yè)j和一組細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，例如cdc2[J.Pines，TrendsinBiochemicalSciences,1995，18，195-197頁(yè)I。酪氨酸激酶包括跨膜生長(zhǎng)因子受體例如表皮生長(zhǎng)因子受體[S.Iwashita和M.Kobayashi,CellularSignalling,1992，4，123-132頁(yè)j和胞質(zhì)非受體激酶例如p56tck、p59fYn、ZAP-70和csk激酶[C.Chan等人，Ann.Rev.Immunol.,1994，12，555-592頁(yè)l。已經(jīng)顯示許多由異常細(xì)胞功能所引起的疾病中牽涉過(guò)高的激酶活性。這可能是直接或間接地由于正常的激酶控制機(jī)制障礙(其例如與酶的突變、過(guò)表達(dá)或不適當(dāng)活化有關(guān))或由于同樣參與該激酶上游或下游信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的生成過(guò)量或不足所引起的。在所有這些情況下，預(yù)計(jì)選擇性抑制該激酶的作用可能會(huì)產(chǎn)生有益的作用。Syk是在多種造血細(xì)胞中表達(dá)的72kDa的胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，它是偶聯(lián)抗原受體與細(xì)胞應(yīng)答的多個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必需成分。因此，Syk在高親和力IgE受體(FcsRl)的發(fā)信號(hào)中、在肥大細(xì)胞中和在T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的受體抗原發(fā)信號(hào)中起著關(guān)鍵的作用。肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有共同的特點(diǎn)。受體的配體結(jié)合域缺少內(nèi)在的酪氨酸激酶活性。但是，它們與含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)的轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基相互作用[M.Reth，Nature,1989，338，383-384頁(yè)。這些基序位于FcsRl的P和y亞基、T細(xì)胞受體(TCR)的《-亞基以及B細(xì)胞受體(BCR)的IgGoc和IgGP亞基中[N.S.vanOers和A.Wdss,SeminarsinImmunology,1995，7，227-236頁(yè)j。一旦結(jié)合抗原和多聚化后，ITAM殘基被Src家族的蛋白酪氨酸激酶磷酸化。Syk屬于一類獨(dú)特的酪氨酸激酶，該類激酶具有兩個(gè)串聯(lián)的Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端催化域。這些SH2結(jié)構(gòu)域以高親和力與ITAM結(jié)合，這種SH2介導(dǎo)的Syk與活化受體的聯(lián)合刺激Syk激酶活性并將Syk定位至質(zhì)膜上。在Syk缺陷型小鼠中，肥大細(xì)胞脫粒受到抑制，提示這是開(kāi)發(fā)肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑的重要靶點(diǎn)[P.S.Costello，Oncogene,1996，13，2595-2605頁(yè)l。類似的研究已證實(shí)Syk在BCR和TCR發(fā)信號(hào)中的關(guān)鍵作用[A.M.Cheng,Nature,1995，378，303-306頁(yè)(1995)和D.H.Chu等人，ImmunologicalReviews,1998，165，167-180頁(yè)]。Syk似乎還與響應(yīng)于IL-5和GM-CSF的嗜酸性粒細(xì)胞生存有關(guān)S.Yousefi等人，J.Exp.Med"1996，183，1407-1414頁(yè)l。盡管Syk在肥大細(xì)胞、BCR和T細(xì)胞發(fā)信號(hào)中起著關(guān)鍵作用，但對(duì)于Syk通過(guò)何種機(jī)制傳遞下游效應(yīng)子仍知之甚少。已經(jīng)表明兩個(gè)銜接蛋白BLNK(B細(xì)胞連接蛋白，SLP-65)和SLP-76分別是Syk在B細(xì)胞和肥大細(xì)胞中的底物，推測(cè)它們將Syk與下游效應(yīng)子連接起來(lái)[M.Ishiai等人，Immunity,1999，10，117-125頁(yè)和L.R.Hendricks-Taylor等人，J.Biol.Chem1997,272,1363-1367頁(yè)]。此外，Syk似乎在CD40發(fā)信號(hào)途徑中起著重要作用，該途徑對(duì)B細(xì)胞的增殖起著重要作用[M.Faris等人，J.Exp.Med.，1994,179,1923-1931頁(yè)。4Syk還參與通過(guò)低親和力IgG受體(Fc，RIIA)刺激的或由膠原刺激的血小板活化[F.Yanaga等人，Biochem.J.，1995，311，(Pt,2)471-478頁(yè)。粘著斑激酶(FAK)是一種參與整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的非受體酪氨酸激酶。FAK與整聯(lián)蛋白共同定位于粘著斑位點(diǎn)，已經(jīng)表明FAK活化及其酪氨酸磷酸化在許多細(xì)胞類型中均依賴于整聯(lián)蛋白與其細(xì)胞外配體的結(jié)合。多項(xiàng)研究的結(jié)果支持這一假設(shè)，即，F(xiàn)AK抑制劑能用于癌癥治療。例如，在對(duì)趨化信號(hào)響應(yīng)時(shí)，F(xiàn)AK缺陷型細(xì)胞很少遷移，而且FAK的C端結(jié)構(gòu)域的過(guò)表達(dá)阻斷細(xì)胞擴(kuò)展以及趨化遷移(Sieg等人，J.CellScience,1999，112，2677-2691;RichardsonA.和ParsonsT.，Cell，1997，97，221-231);此外，F(xiàn)AK反義寡核苷酸處理的腫瘤細(xì)胞失去其附著物，發(fā)生凋亡(Xu等人，CellGrowthDiffer,1996，4，413-418)。據(jù)報(bào)道FAK在前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中均發(fā)生過(guò)表達(dá)。FAK的表達(dá)水平與表現(xiàn)出最大攻擊性的表型的腫瘤直接相關(guān)。血管生成或通過(guò)從原有血管系統(tǒng)萌發(fā)而導(dǎo)致的新血管形成在胚胎發(fā)育和器官形成中起著核心作用。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病以及腫瘤發(fā)生過(guò)程中均觀察到新血管形成的異常增加(Folkman，Nat.Med.，1995,1,27-31)。血管生成是一種復(fù)雜的多階段過(guò)程，它包括內(nèi)皮細(xì)胞的活化、遷移、增殖和存活。過(guò)去20年來(lái)腫瘤血管生成領(lǐng)域的大量研究已鑒定出許多治療靶點(diǎn)，包括激酶、蛋白酶和整聯(lián)蛋白，從而促成許多新的抗血管生成藥的發(fā)現(xiàn)，包括KDR抑制劑，其中的一些目前正在進(jìn)行臨床評(píng)估(Jekunen等人，CancerTreatmentRev.1997，23，263-286)。血管生成抑制劑可用于惡性腫瘤發(fā)生或再生的一線治療、輔助治療和甚至預(yù)防治療。已在酵母和果蠅中鑒定出多種參與染色體分離和紡錘體組裝的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的破壞導(dǎo)致染色體分離異常以及單極或受損的紡錘體。在這些激酶中有分別來(lái)自釀酒酵母(S.cerevisiae)和果蠅的Ipll和酶，二者均是中心體分離和染色體分離所不可缺少的。近來(lái)不同實(shí)驗(yàn)室克隆和表征了酵母Ipll的一種人類同源物。該激酶被命名為Aurora2、STK15或BTAK，屬于絲氨^/蘇氨酸激酶家族。Bischoff等人證明Aurora2有致癌性，它在人的結(jié)腸直腸癌中發(fā)生擴(kuò)增(EMBOJ，1998，17，3052-3065)。它在涉及上皮腫瘤的癌癥如乳腺癌中也發(fā)生擴(kuò)增。如今我們發(fā)現(xiàn)了一種新的帶取代基的氮雜吲味，它具有頗有價(jià)值的藥學(xué)性質(zhì)，特別是抑制蛋白激酶的能力，更特別是選擇性抑制Syk激酶的能力。這種氮雜吲哚化合物與美國(guó)第6,770,643號(hào)專利所披露的那些化合物相關(guān)，但在該專利中未被具體公開(kāi)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及式I化合物(I)其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，或該類化合物、其鹽或其前體藥物的溶劑合物。本發(fā)明還涉及包含式I化合物的藥物組合物以及使用式I化合物治療或預(yù)防患者的與Syk相關(guān)的生理狀況的方法或者治療或預(yù)防患者的與Syk相關(guān)的生理狀況的方法。本發(fā)明還涉及制備用于制備式I化合物的中間體化合物的方法。在另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含通式(I)化合物H,C(I)其相應(yīng)的N-氧化物和前體藥物；和該類化合物以及所述N-氧化物和前體，NH、/\\6藥物的藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物(如水合物)；以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1:制備式I化合物的反應(yīng)流程圖。圖2:注射了在弗氏不完全佐劑中的來(lái)自牛鼻的II型膠原并從第6天直至第21天用式I化合物A003397769(3.0、10或30mg/kg,b.i.d.)處理的大鼠的平均踝關(guān)節(jié)直徑。通過(guò)在第0天和第7天皮內(nèi)注射在弗氏不完全佐劑中的膠原(400ng/400fil/大鼠)被致敏的雌性LEW大鼠的平均踝關(guān)節(jié)直徑。從第6天至第21天對(duì)大鼠給藥。圖3:用A003397769(3.0、10或30mg/kg)處理的CIA大鼠跟骨的骨侵蝕分析(骨表面積與骨體積的比值)。圖4:注射了在弗氏不完全佐劑中的來(lái)自牛鼻的II型膠原并從第6天直至第20或21天單獨(dú)用A003397769(3.0mg/kg)或組合使用甲氨蝶呤(O.l或0.2mg/kg)處理的和與溶媒給藥動(dòng)物相比較的大鼠的平均踝關(guān)節(jié)直徑。SYK抑制劑A003397769(3.0mg/kg，b丄d.)單獨(dú)4吏用或與甲氨蝶呤組合4吏用對(duì)大鼠CIA的作用。圖5:注射了在弗氏不完全佐劑中的來(lái)自牛鼻的II型膠原并從第6天直至第20或21天單獨(dú)用A003397769(10mg/kg)或組合使用曱氨蝶呤(O.l或0.2mg/kg)處理的和與溶媒給藥動(dòng)物相比較的大鼠的平均踝關(guān)節(jié)直徑。SYK抑制劑A003397769(10mg/kg，b丄d.)單獨(dú)使用或與甲氨蝶呤組合使用對(duì)大鼠CIA的作用。圖6:單獨(dú)用A003397769(3.0或10mg/kg)或組合使用甲氨蝶呤(O.l或0.2mg/kg)處理的CIA大鼠跟骨的骨侵蝕分析(骨表面積與骨體積的比值)。圖7:注射了在弗氏不完全佐劑中的來(lái)自牛鼻的II型膠原并從第12天直至第21天用A003397769A(10和30mg/kg，b.i.d.)治療性處理的大鼠的平均踝關(guān)節(jié)直徑。通過(guò)在第O天和第7天皮內(nèi)注射在弗氏不完全佐劑中的膠原(400ng/400nl/大鼠)被致敏的雌性Lewis大鼠的平均踝關(guān)節(jié)直徑。雙爪的平均值。圖8:用A003397769A(10或30mg/kg，b丄d.)治療性處理的CIA大鼠跟骨的骨侵蝕分析(骨表面積與骨體積的比值)。圖9:式I化合物對(duì)大鼠體重的作用。圖10:式I化合物對(duì)血紅蛋白濃度的作用。發(fā)明詳述因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含通式(I)化合物H3C、其也可被稱為2-[4-(7-乙基-5H-吡咯并[2,3-b吡溱-6-基)-苯基I-丙-2-醇。在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的化合物"及與其相當(dāng)?shù)谋硎鲋荚诎ㄇ笆龅耐ㄊ?I)化合物，在上下文允許的情況下，該表述包括前體藥物、藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物，如水合物。類似地，在上下文允許的情況下，無(wú)論其本身是否包舍在權(quán)利要求書中，本文所述的中間體旨在包括它們的鹽和溶劑合物。為清楚起見(jiàn)，在上下文允許的情況下，本文有時(shí)會(huì)給出具體的實(shí)例，但這些實(shí)例純粹是舉例說(shuō)明性的，并非旨在排除上下文允許的其它實(shí)例。本文使用的縮略語(yǔ)ATP三磷酸腺苷DTT二硫蘇糖醇PBS磷酸鹽緩沖的鹽水如上文所用的以及貫穿本發(fā)明的整個(gè)說(shuō)明書，除非另有說(shuō)明，否則下列術(shù)語(yǔ)應(yīng)^^皮理解為具有以下含義"患者，，包括人和其它哺乳動(dòng)物。"前體藥物"意指通過(guò)代謝方式(如水解)在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為式(I)化合物(包括其N-氧化物)的化合物。例如含有羥基的式(I)化合物的酯在體內(nèi)通過(guò)水解可轉(zhuǎn)化為母體分子。或者，含有羧基的式(I)化合物的酯在體內(nèi)通過(guò)水解可轉(zhuǎn)化為母體分子。含有羥基的式(I)化合物的適宜的酯有例如乙酸酯、檸檬酸酯、乳酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水楊酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、富馬酸酯、馬來(lái)酸酯、亞甲基-雙-卩-羥基萘甲酸酯(methylene畫bis-p勿droxynaphthoate)、龍膽酸酯、羥乙基磺酸酯、二對(duì)甲苯?；剖狨ァ⒓谆撬狨?、乙磺酸酯、苯磺酸酯、對(duì)曱苯磺酸酯、環(huán)己基氨基磺酸酯和奎尼酸酯。含有羥基的式(I)化合物的一類特別有用的酯可由選自Bundgaard等人，J.Med.Chem.，1989，32，2503-2507頁(yè)所述的那些的酸部分形成，并且包括帶取代基的(氨甲基)-苯甲酸酯，例如二烷基氨基-甲基苯甲酸酯，其中兩個(gè)烷基可連接在一起和/或被氧原子或被任意帶取代基的氮原子如烷基化的氮原子所間隔，更尤其是(嗎啉代-曱基)苯甲酸酯，例如3-或4-(嗎啉代曱基)-苯甲酸酯，以及(4-烷基哌溱-l-基)苯甲酸酯，例如3-或4-(4-烷基哌溱-l-基)苯曱酸酯。一些本發(fā)明的化合物呈堿性，可以以游離堿的形式或以其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的形式使用該類化合物。酸加成鹽是一種更便于使用的形式；實(shí)際上，使用鹽形式在本質(zhì)上即等于使用游離堿形式。可用于制備酸加成鹽的酸優(yōu)選包括當(dāng)與游離堿結(jié)合時(shí)生成藥學(xué)上可接受的鹽(即，在鹽的藥物劑量下其陰離子對(duì)患者無(wú)毒性、從而使得游離堿固有的有益抑制作用不因陰離子所產(chǎn)生的副作用而受損的鹽)的那些酸。雖然優(yōu)選所述堿性化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，但所有酸加成鹽均可用作游離堿形式的來(lái)源，即使特定的鹽本身只是作為中間產(chǎn)物，例如當(dāng)形成鹽僅僅是為了純化和鑒定目的時(shí)，或者當(dāng)形成鹽僅僅是為了通過(guò)離子交換操作制備藥學(xué)上可接受的鹽時(shí)。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的藥學(xué)上可接受的鹽包括衍生自無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的那些鹽，并且包括氫囟酸鹽如鹽酸9鹽和氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、氨基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、亞甲基-雙-P-羥基萘甲酸酯、龍膽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、二對(duì)甲苯酰基酒石酸鹽、曱磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)曱苯磺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽和奎尼酸鹽。本發(fā)明的化合物的鹽不僅自身可用作活性化合物，它們還可用于化合物的純化，例如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)利用鹽與母體化合物、副產(chǎn)物和/或起始原料的溶解度差異進(jìn)行純化。本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出有用的藥理學(xué)活性，因此被摻入藥物組合物中，用于治療患有某些醫(yī)學(xué)障礙的患者。因此，按照本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了用于治療的本發(fā)明的化合物和含有本發(fā)明的化合物的組合物。根據(jù)文獻(xiàn)記載和下文的體外操作中所述的試驗(yàn),本發(fā)明范圍內(nèi)的化合物抑制或阻斷激酶的催化活性，據(jù)信所述試-驗(yàn)的結(jié)果與在人和其它哺乳動(dòng)物中的藥理學(xué)活性相關(guān)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療患有或易患有能通過(guò)施用蛋白激酶抑制劑(如Syk、FAK、KDR或物的組合物。例如，本發(fā)明的化合物可用于治療炎性疾病，如哞喘炎性皮膚病(如銀屑病、皰滲樣皮炎、濕滲、壞死性血管炎和皮膚血管炎、大皰性疾病)；變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性結(jié)膜炎；關(guān)節(jié)炎癥，包括關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它關(guān)節(jié)炎性病癥例如類風(fēng)濕性脊推炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)滲性關(guān)節(jié)炎(rubellaarthritis)、銀屑病關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。所述化合物還可用于治療慢性阻塞性肺病(COPD)、急性滑膜炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性腦脊髓炎、結(jié)腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化、外周血管病、心血管疾病、多發(fā)性硬化、再狹窄、心肌炎、B細(xì)胞淋巴瘤、系統(tǒng)性紅斑狼掩、移植物抗宿主病和其它移植相關(guān)的排斥事件、癌癥和肺瘤(例如結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌和肺癌)以及炎性腸病。此外，所述化合物還可用作腫瘤抗血管生成劑。而且，本發(fā)明的化合物可用作控制腫瘤細(xì)胞的藥物。本發(fā)明的治療方法的一個(gè)具體實(shí)施方案是治療關(guān)節(jié)炎癥。本發(fā)明的治療方法的另一個(gè)具體實(shí)施方案是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的治療方法的一個(gè)具體實(shí)施方案是治療癌癥、腫瘤和其它增殖性障礙。本發(fā)明的治療方法的另一個(gè)具體實(shí)施方案是治療涉及液體腫瘤的癌癥。本發(fā)明的治療方法的另一個(gè)具體實(shí)施方案是治療套細(xì)胞淋巴瘤。本發(fā)明的治療方法的又一個(gè)具體實(shí)施方案是通過(guò)抑制血管生成來(lái)治療障礙。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)，本發(fā)明提供了治療人或動(dòng)物患者的方法，所述患者患有或易患有能通過(guò)施用蛋白激酶抑制劑(如Syk、FAK、KDR或Aurora2)而得到緩解的病癥，例如前面所述的病癥，該方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的化合物或含有本發(fā)明的化合物的藥物組合物。"有效量"意指本發(fā)明的化合物有效抑制但并激酶例如Syk、FAK、KDR或Aurora2的催化活性并因此產(chǎn)生所需的治療作用的量。本發(fā)明所提及的治療應(yīng)理解為包括預(yù)防性治療以及已形成的病癥的治療。本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括包含本發(fā)明的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的化合物可通過(guò)任何適宜的方法施用。在實(shí)踐中，本發(fā)明的化合物一般可胃腸外、局部、直腸、口服或吸入施用；尤其是通過(guò)口服途徑或通過(guò)吸入方式施用。本發(fā)明的組合物可按照常規(guī)方法使用一種或多種藥學(xué)上可接受的輔劑或賦形劑制備。所述輔劑尤其包括稀釋劑、無(wú)菌水性介質(zhì)和各種無(wú)毒的有機(jī)溶劑。所述組合物可以是片劑、丸劑、顆粒劑、散劑、水性溶液或混懸劑、注射液、酏劑或糖漿劑的形式，并且可含有一種或多種選自甜味劑、矯味劑、著色劑或穩(wěn)定劑的物質(zhì)，以獲得藥學(xué)上可接受的制劑。賦形物的選擇和賦形物中活性物質(zhì)的含量一般是依據(jù)活性化合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、具體施用方式和制藥實(shí)踐中須遵循的規(guī)定而確定的。例如，賦形劑例如乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和崩解劑例如淀粉、海藻酸以及某些與潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石粉結(jié)合的復(fù)合硅酸鹽可用于制備片劑。為了制備膠嚢劑，使用乳糖和高分子量聚乙二醇是有利的。當(dāng)使用水性混懸劑時(shí)，它們可含有乳化劑或促進(jìn)混懸的物質(zhì)。還可使用稀釋劑例如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或其混合物。對(duì)于胃腸外施用，使用在植物油(如芝麻油、花生油或橄欖油)或水性-有機(jī)溶液(如水和丙二醇)、可注射有機(jī)酯(如油酸乙酯)中的本發(fā)明的產(chǎn)品的乳劑、混懸劑或溶液以及所述藥學(xué)上可接受的鹽的無(wú)菌水溶液。本發(fā)明的產(chǎn)品的鹽溶液尤其可用于通過(guò)肌內(nèi)注射或皮下注射施用。水性溶液(也包括所述鹽在純蒸餾水中的溶液)可用于靜脈內(nèi)施用，只要其pH值調(diào)節(jié)適宜、緩沖適當(dāng)、含有足量的葡萄糖或氯化鈉使其達(dá)到等張并且通過(guò)加熱、輻射或微濾被滅菌即可。對(duì)于局部施用，可使用含有本發(fā)明的化合物的凝膠劑(以水或乙醇為基礎(chǔ))、乳膏劑或軟膏劑。還可將本發(fā)明的化合物摻入凝膠或基質(zhì)中用于以貼劑形式應(yīng)用，其將使得能通過(guò)透皮屏障控制釋放化合物。對(duì)于吸入施用，可將本發(fā)明的化合物溶解或混懸在適宜的載體中用于在噴霧器中使用或以混懸型或溶液型氣霧劑的形式使用，或者可被吸收或吸附到適宜的固體載體上用于在干粉吸入器中使用。用于直腸施用的固體組合物包括按照已知方法配制并含有至少一種本發(fā)明的化合物的栓劑。本發(fā)明的組合物中活性成分的百分?jǐn)?shù)可以變動(dòng)，但需構(gòu)成一定比例以便獲得適宜的劑量。顯然，可幾乎同時(shí)施用多個(gè)單位劑型。使用的劑量將由醫(yī)師決定，并取決于所需的治療作用、施用途徑、治療持續(xù)時(shí)間以及患者的狀況。就成人而言，每日吸入劑量一般為約0.001至約50mg/kg體重，優(yōu)選約0.001至約5mg/kg體重；每日口服劑量為約0.01至約100mg/kg，優(yōu)選O.l至70mg/kg,更尤其是0.5至10mg/kg體重；每日靜脈內(nèi)給藥劑量為約0.001至約10mg/kg，優(yōu)選0.01至1mg/kg體重。在每種具體情況下，將依據(jù)待治療患者的具體因素如年齡、體重、整體健康狀況和其它能影響該醫(yī)藥產(chǎn)品功效的特點(diǎn)來(lái)確定劑量。為了獲得所需的治療作用，本發(fā)明的化合物可按照需要的頻度被施用。一些患者可能對(duì)較高或較低的劑量迅速響應(yīng)，且可能發(fā)現(xiàn)低得多的維持劑量就足夠了。對(duì)于其它患者，按照每個(gè)特定患者的生理需求，可能有必要以每日1至4個(gè)劑量的頻度進(jìn)行長(zhǎng)期治療。一般而言，可每日口服1至4次地施用活性產(chǎn)品。當(dāng)然，對(duì)于一些患者，將有必要開(kāi)具每日不超過(guò)l或2個(gè)劑量。本發(fā)明的化合物可通過(guò)應(yīng)用或修改已知方法來(lái)制備，所述已知方法是指前人用過(guò)的或在文獻(xiàn)中描述的方法，例如R.C丄arock在ComprehensiveOrganicTransformations,VCH出版公司，1989中描述的那些方法。在下文所述的反應(yīng)中，可能有必要保護(hù)在最終產(chǎn)品中所需的反應(yīng)性官能團(tuán)例如羥基、氨基、亞氨基、巰基(thio)或羧基，以免它們不希望地參與反應(yīng)。可按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用常規(guī)的保護(hù)基，例如參見(jiàn)T.W.Greene和P.G.M.Wuts"ProtectiveGroupsinOrganicChemistry"JohnWileyandSons,1991。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的化合物可含有不對(duì)稱中心。這些不對(duì)稱中心可獨(dú)立地是R或S構(gòu)型。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明的某些化合物還可呈現(xiàn)出幾何異構(gòu)現(xiàn)象。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明包括上述式(I)化合物的單獨(dú)的幾何異構(gòu)體和立體異構(gòu)體以及其混合物，包括外消旋混合物。通過(guò)應(yīng)用或修改已知方法如色諳技術(shù)和重結(jié)晶技術(shù)可從其混合物中分離出這類異構(gòu)體，或可從其中間體的適宜異構(gòu)體分別制備這類異構(gòu)體。依據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)特點(diǎn)，應(yīng)用或修改已知方法通過(guò)游離堿與適宜的酸發(fā)生反應(yīng)可制備本發(fā)明的化合物的酸加成鹽。例如，本發(fā)明的化合物的酸加成鹽可通過(guò)以下方法制備將游離堿溶于含有適宜的酸的水或乙醇水溶液或其它適宜溶劑中，通過(guò)蒸發(fā)溶液分離出鹽；或者使游離堿與酸在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，在這種情況下，直接分離出鹽或能通過(guò)濃縮溶液得到鹽。通過(guò)應(yīng)用或修改已知方法能由鹽再生本發(fā)明的化合物的酸加成鹽。例如，通過(guò)用堿如碳酸氫鈉水溶液或氨水溶液處理能由酸加成鹽再生本發(fā)明的母體化合物。通過(guò)應(yīng)用或修改已知方法能從其堿加成鹽再生本發(fā)明的化合物。例如，通過(guò)用酸如鹽酸處理其堿加成鹽能再生本發(fā)明的母體化合物。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的化合物可方便地被制備成或形成溶劑合物(如水合物)。使用有機(jī)溶劑如二悉烷、四氫呋喃或曱醇通過(guò)用水/有機(jī)溶劑混合物重結(jié)晶可方便地制備本發(fā)明的化合物的水合物。按照本發(fā)明的又一個(gè)特點(diǎn)，應(yīng)用或修改已知方法使游離酸與適宜的堿反應(yīng)可制備本發(fā)明的化合物的堿加成鹽。例如，本發(fā)明的化合物的堿加成鹽可通過(guò)以下方法制備將游離酸溶解于含有適宜堿的水或乙醇水溶液或其它適宜溶劑中，通過(guò)蒸發(fā)溶液分離出鹽；或使游離酸與堿在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，在這種情況下，直接分離出鹽或能通過(guò)濃縮溶液得到鹽。通過(guò)應(yīng)用或修改已知方法、例如在實(shí)施例中所述的方法或其明顯的化學(xué)等效方法可制備起始原料和中間體。下列舉例說(shuō)明性實(shí)例進(jìn)一步闡明了本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。300MHzlH核磁共振譜(NMR)是在VarianMercury儀器上記錄的。在該核磁共振語(yǔ)(NMR)中，化學(xué)位移(5)以相對(duì)于四曱基硅烷的ppm來(lái)表示?？s寫符號(hào)具有下列含義s=單峰；d=雙峰；t=三重峰；m=多重峰；q=四重峰；dd=雙二重峰；ddd=雙二倍二重峰(duobletofdoubledoublets)。用于測(cè)定保留時(shí)間(Rt)和相關(guān)的質(zhì)量離子的高壓液相色譜-質(zhì)譜(LCMS)實(shí)驗(yàn)是采用下列方法進(jìn)行的。質(zhì)鐠(MS)是用MicromassLCT飛行時(shí)間質(zhì)譜儀記錄的。方法為正離子電噴霧電離，掃描質(zhì)荷比m/z為IOO至1000。液相色譜分析是在AgilentTM1100SeriesBinaryPump&Degasser上進(jìn)行的；固定相PhenomenexSynergiTM2|uHydro-RP20X4.0mm色語(yǔ)柱；流動(dòng)相A-0.1。/。曱酸(FA)的水溶液，B=0.1%FA的乙腈溶液。使用CTC分析PAL系統(tǒng)(CTCAnalyticalPALSystem)進(jìn)樣5|iL。.流速為1mL/分鐘。梯度在3分鐘內(nèi)從5%B到90%B，在2分鐘內(nèi)從90%B至14100%B。輔助檢測(cè)器為Agilent1100系列紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220nm;SedereSEDEXtm75蒸發(fā)光散射(EvaporativeLightScattering)檢測(cè)器，溫度=46°C，氮?dú)鈮毫?4巴。薄層色譜法(tlc)Rf值是使用MerckTM硅膠板測(cè)定的。A)實(shí)施例12-[4-(7-乙基-5H-吡咯并[2，3-bj吡溱-6-基)-苯基卜丙-2-醇從正丙基吡溱(化合物2)和4-乙酰千腈(化合物3)開(kāi)始經(jīng)兩個(gè)步驟制得共計(jì)6.0g2-[4_(7-乙基-511-吡咯并[2,3-1)]吡喚-6-基)苯基丙-2-醇(化合物1)。如下進(jìn)行化合物1的合成。正丙基吡溱(化合物2)和4-乙酰千腈(化合物3)與雙(三甲基硅烷基)氨基鈉在四氫呋喃中于40°C偶聯(lián)，生成中間體化合物4，產(chǎn)率為30%?；衔?與甲基氯化鎂在四氫呋喃中于0。C反應(yīng)，用2-丙醇重結(jié)晶后得到所需的化合物1,產(chǎn)率為74%。合成如圖1所示。實(shí)驗(yàn)2-[4-(7-乙基-5H-吡咯并[2，3-bl吡噪-6-基)苯基l乙酮(化合物4)。于20°C歷經(jīng)7分鐘的時(shí)間向雙(三曱基硅烷基)氨基鈉(2M的THF溶液；13mL，26mmo1,3.5當(dāng)量)中逐滴加入正丙基吡喚(化合物2,912mg,7.46mmol)在四氫呋喃(5mL)中的溶液。得到一種深紫-紅色溶液，溫度下降至16.4°C。于13.3°C歷經(jīng)18分鐘的時(shí)間加入4-乙酰節(jié)腈(化合物3，1.08g,7.4mmol)在四氫呋喃(5mL)中的溶液。溫度下降至12.6。C，形成一種棕色溶液。將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，加熱至約35°C達(dá)6小時(shí)，隨后在室溫下攪拌約60小時(shí)。將該混合物倒入飽和碳酸氫鈉水溶液(200mL)中，用乙酸乙酯萃取(2xl50mL)。用水(100mL)洗滌乙酸乙酯，在40°C浴溫和80-10托下在Buchi上濃縮，得到深黃色固體。將該固體用乙醚(25mL)研磨，過(guò)濾并用乙醚(25mL)洗滌。將該固體風(fēng)干，得到600mg(30.3。/。)黃色固體形式的化合物4。^NMR(300MHz，CDC13，圖1)58.5(1H,d，J=2Hz),158.15(2H，d，J=8Hz),8.1(1H，d，J=3Hz)，7.9(2H，d，J=8Hz)，3.1(2H，q，J=9Hz)，2.7(3H，s)，1.4(3H，t，J=9Hz)。l一[4-(7-乙基-5H-吡咯并[2，3-b吡溱-6-基)苯基]丙-2-醇(化合物1)。歷經(jīng)90分鐘的時(shí)間向冷卻的(5。C)曱基氯化鎂(3M的THF溶液；81.3mL,244mmol,10當(dāng)量)在四氬呋喃(116mL)中的溶液中逐滴加入化合物4(6.5g，24.4mmol)在四氫呋喃(348mL)中的溶液，控制滴加速度使溫度保持在約0°C。伴隨滴加可觀察到亮黃色溶液形成。1小時(shí)后，TLC(乙酸乙S旨/正庚烷1/1)表明已無(wú)起始原料存在，在較低Rf處出現(xiàn)一個(gè)新點(diǎn)。通過(guò)小心地加入飽和碳酸氬鈉水溶液(約660mL)終止該反應(yīng)。形成濃稠物料，隨后向該混合物中加入乙酸乙酯(250mL)和水(250mL)。取出水相，用乙酸乙酯反萃取(2x250mL)。合并乙酸乙酯級(jí)分，用水(2x200mL)洗滌，在40°C浴溫和80-10托下在Buchi上濃縮，得到7.5g(109%)淡米黃色固體形式的1。'HNMR(DMSO-d6，圖2)512.0(1H，s)，8.35(1H,d，J=3.5Hz)，8.2(1H，d，J=3.5Hz),7.6(4H，s)，5.1(1H,s)，2.9(2H，q，J=8Hz),1.5(6H,s)，1.3(3H，t，J=8Hz)。將該材料與前一實(shí)驗(yàn)所得材料合并。將合并的材料(8.5g)與2-丙醇(150mL)—起回流，得到一種澄清的淡棕色溶液，將其在布氏漏斗上進(jìn)行真空熱過(guò)濾。在濾瓶中形成沉淀，將混合物加熱至沸騰，得到一種澄清溶液。在攪拌下使該物質(zhì)冷卻至室溫，生成淡黃色固體，將其過(guò)濾，用冷的2-丙醇洗滌，在50°(:真空干燥，生成6.0g(71。/。)淡黃色固體形式的化合物1。LCMS:RT=2.55分鐘，MS:282(M+H);'H醒R(DMSO-d6，圖3)S12.0(1H，s),8.35(1H，d，J=3Hz)，8.2(1H，d，J=3Hz)，7.6(4H，s)，5.1(1H，s)，2.9(2H，q，J=9Hz),1.5(6H，s)，1.3(3H，t，J=9Hz)?；衔?的元素分析如表1中所示。各元素的理論百分?jǐn)?shù)C72.57%,H6.81%，N14.93%，05.69%實(shí)驗(yàn)l:C72.46%,H7.05%,N15.07%表lSYK的體外試驗(yàn)操作測(cè)定格式:檢測(cè)格式:調(diào)控測(cè)定法名稱縮寫脾酪氨酸(Y)激酶Syk底物磷酸化鏈霉抗生物素Flashplate抑制來(lái)自PerkinElmerLifeSciencesTM的鏈霉抗生物素FlashPlatePlus微孔板設(shè)計(jì)用于板內(nèi)放射性測(cè)定法。每個(gè)孔內(nèi)部都永久性圖覆有一薄層以聚苯乙烯為基礎(chǔ)的閃爍劑，然后與鏈霉抗生物素共價(jià)結(jié)合。這些板適合于許多采用生物素化的俘獲分子的測(cè)定應(yīng)用。Poly(Glu，Tyr)4:l(PGT)是一種能用作酪氨酸特異性蛋白激酶底物的無(wú)規(guī)共聚物。該測(cè)定法測(cè)量Syk對(duì)PGT-生物素底物的磷酸化。該酶將[Y"P-磷酸基從h^Pl-ATP上轉(zhuǎn)移至聚合物底物上。該測(cè)定法在非結(jié)合性384孔板上在溶液中進(jìn)行。使用磷酸終止反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至一塊384孔鏈霉抗生物素Flashplate板上。生物素化的底物被俘獲至該板上，洗去包括熱ATP在內(nèi)的其它試劑。然后對(duì)每個(gè)孔的放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。酶反應(yīng)在384孔非結(jié)合性板上進(jìn)行。試劑終濃度/孔為7.77nMSyk，15.5nMPGT-生物素底物，0.1fiCi33P-ATP,50mMTris(pH7.5)，10mMMgCl2，3mMMnCl2，lmMDTT，0.1mg/mly-球蛋白。反應(yīng)體積為22fU。反應(yīng)時(shí)間120分鐘。溫度室溫。通過(guò)加入20fil9%磷酸終止反應(yīng)，將30nl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到一塊384孔鏈霉抗生物素Flashplate板上。在室溫下孵育90分鐘后，以0.02%Tween-20在50mMTris，pH7.5中的溶液洗涂該板。在TopCountTM閃爍計(jì)數(shù)器上對(duì)放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。制備酶稀釋液，將其保存在冰上備用。使用前，向測(cè)定緩沖液中加入新配制的MnCl2和DTT。該測(cè)定法使用的材料如表2中所示。材料供應(yīng)商目錄號(hào)分子量功能lMTris，pH7.5FisherBP1757-500緩沖液1MMgCl2SigmaM-102895.2酶輔因子1MnCl2SigmaM-1787125.8酶輔因子DTTSigmaD-5545154.2抗氧化劑Y-球蛋白SigmaG-5009蛋白穩(wěn)定劑DMSOSigma-Aldrich15,493-9溶劑星孢素SigmaS-4400466.5參比抑制劑磷酸(85%)SigmaP-656098.0終止液1mCi;33P-ATPPerkinElmerNEG6xx底物10xPBS，pH7.4FisherBP399-1洗滌緩沖液Tween20FisherBP337-5001227.54洗滌劑384孔聚丙烯板Coming3657復(fù)板非結(jié)合性384孔板Corning3652反應(yīng)板384孔鏈霉抗生物PerkinElmerSMP-410俘獲板素Flashplate板(A)TopSealA密封膜Packard6005185板密封物Elx405自動(dòng)洗滌才幾Bio-Tek洗板機(jī)TopCountPackard計(jì)數(shù)器FXStationBeckman液體處理器Beckman2000Beckman液體處理器表2酶采用本領(lǐng)域已知方法制備和純化Flag標(biāo)記的Syk(0.184mg/ml，MW=35,531.81Da)。底物生物素輒合的(Glu，Tyr)4:l購(gòu)自CisbiointernationalTM(目錄號(hào)61GT0BLB,批號(hào)16)。18所用的測(cè)定法溶液如表3中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>B)表3化合物稀釋1.向96孔U型底聚丙烯板每孔加入10nl10mM的化合物在100。/。DMSO中的溶液，其中板的H行留空。每孔加入90nl100%DMSO,得到100nllmM化合物，重新密封，將板于室溫下暗處保存。2.制備化合物目的板在384孔圓形底聚丙烯板(Corning儲(chǔ)存板)中，向第3和13列每孔加入23ftl水，向笫4列直至第12列以及第14列直至第22列每孔加入20pi30%DMSO(O行和P行留空)。3.使用激酶檢測(cè)(KinaseProfiling)程序在Biomek2000頂上制備化合物稀釋液(10種稀釋液300jiM、100fiM、30pM，以此類推)使用20jU吸頭，除第8個(gè)孔夕卜(即H行)，從源板第l列每孔轉(zhuǎn)移l(HillmM化合物至目的板笫3列，得到首個(gè)300jiM稀釋液。之后，在目的板中，混合并將第3列每孔的300nM稀釋液轉(zhuǎn)移lOfil至第4列，得到IOOnM稀釋液?；旌喜⒌?列每孔100nM稀釋液轉(zhuǎn)移10jil至第5列，得到30nM稀釋液，以此類推。對(duì)于每一種化合物都配制雙份稀釋液，例如，從源板的Al每孔轉(zhuǎn)移lOjil化合物至目的板的A3和B3。重復(fù)混合和轉(zhuǎn)移。然后，將源板第2列每孔1mM化合物轉(zhuǎn)移10nl至目的板第13列，得到300fiM稀釋液。之后，在目的板中，混合并將第13列每孔300jiM稀釋液轉(zhuǎn)移lOjil至第14列，得到IOOjiM稀釋液，以此類推。一塊完整的H行留空的96孔源板可產(chǎn)生6塊化合物目的板。4.制備標(biāo)準(zhǔn)化合物母板向96孔U形底聚丙烯板的H1和H2每孔加入5pl10mMRoscovitine在100。/。DMSO中的溶液，然后每孔加入45fil100%DMSO稀釋為lmM溶液。5.制備標(biāo)準(zhǔn)化合物目的板在384孔圓形底聚丙烯板(CorningTM儲(chǔ)存板)上，向第3和13列每孔加入23fil水，向第4列直至第12列以及第14列直至第22列每孔加入20pi30%DMSO(O行和P行留空)。6.使用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)程序在Biomek200(FM上制備標(biāo)準(zhǔn)化合物稀釋液(10種稀釋液300nM、100nM、30nM，以此類推)使用單個(gè)20jil吸頭，從母板Hl沒(méi)孔轉(zhuǎn)移lOjil1mM標(biāo)準(zhǔn)化合物至目的板的Ol，得到首個(gè)300稀釋液。之后，在目的板中，混合并從03每孔轉(zhuǎn)移10ftl300nM稀釋液至04，得到100jiM稀釋液。混合并從O4每孔轉(zhuǎn)移10nll00jiM稀釋液至O5，得到30pM稀釋液，以此類推。每一標(biāo)準(zhǔn)化合物均制備雙份稀釋液，例如，從母板的Hl每孔轉(zhuǎn)移lOpl化合物至目的板的03和P3。重復(fù)混合和轉(zhuǎn)移。然后，從母板的H2每孔轉(zhuǎn)移10nl1inM化合物至目的板的013,得到300nM稀釋液。之后，在目的板中，混合并從O13每孔轉(zhuǎn)移10pl300nM稀釋液至014，得到100jiM稀釋液，以次類推。7.在標(biāo)準(zhǔn)化合物目的板中，向第23列的A直至H中每孔加入20jtl30%DMSO(高對(duì)照)，向第23列的I至J中每孔加入20jil45%H;jP04(低對(duì)照)。測(cè)定法操作1.向測(cè)定板(CorningTM非結(jié)合性384孔板)中加入10jtl酶&底物溶液和2nl供試化合物，在室溫下孵育30分鐘(酶/化合物預(yù)孵育步驟)。2.通過(guò)加入10jilATP/33p-ATP溶液開(kāi)始反應(yīng)。3.在室溫下孵育120分鐘。4.通過(guò)加入20nl終止緩沖液終止反應(yīng)。5.將30pl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至384孔鏈霉抗生物素Flashplate板上。8.在室溫下孵育卯分鐘。9.使用Elx405自動(dòng)洗滌機(jī)用每孔100nl洗滌緩沖液對(duì)鏈霉抗生物素Flashplate板洗滌兩次。10.密封，在TopCountTM閃爍計(jì)數(shù)器上對(duì)板進(jìn)行讀數(shù)(40秒/孔)。*使用BiomekTMFX操作臺(tái)進(jìn)行步驟1至步驟5的測(cè)定。IC5。測(cè)定中用于曲線擬合的方程Y=底+(頂-底)/(l+10A((LoglC5。-X"斜率(HillSlope)))X表示濃度的對(duì)數(shù)。Y表示響應(yīng)。Y從底開(kāi)始直至頂，呈S型。這與"四參數(shù)邏輯，，方程相同。該測(cè)定測(cè)得式I化合物的ICso為1.7納摩爾。使用MTS試劑進(jìn)行的血液惡性腫瘤細(xì)胞系的生存力測(cè)定法1，目的該方法用于測(cè)定在用供試化合物處理后液體腫瘤細(xì)胞系的生存力。在混懸液中將腫瘤細(xì)胞維持在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。使用的當(dāng)天，將細(xì)胞重新混懸至0.05至0.1百萬(wàn)/ml的密度，將細(xì)胞與供試化合物一起在96孔板中孵育96小時(shí)。通過(guò)將細(xì)胞與PromegaMTS試劑一起孵育來(lái)測(cè)量細(xì)胞的生存力。細(xì)胞的生存力與490mn處的吸光度變化成比例。通過(guò)比較對(duì)照和化合物處理的細(xì)胞的吸光度，測(cè)定供試化合物對(duì)細(xì)胞生存力的影響，將其表示為對(duì)照細(xì)胞生存力的百分?jǐn)?shù)。2.操作A.材料211.細(xì)胞液體腫瘤細(xì)胞系獲自美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTissueCultureCollection)或DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZdlkulturenGmbH)。2.培養(yǎng)基完全RPMI:具有25mMHEPES(4-(2-羥基乙基)-l-哌溱乙磺酸)和L-谷氨酰胺(Gibco/InvitrogenTM，目錄號(hào)22400-089)的RPMI-1640培養(yǎng)基十100/。熱滅活的胎牛血清(FBS)(Gibco/InvitrogenTM，目錄號(hào)16140-071)+lx青霉素/鏈霉素(Gibco/Invitrogen，目錄號(hào)15070-063)+50ug/mlPlasmocin(InvivogenTM，目錄號(hào)ant-mpt)無(wú)酚紅cRPMI:無(wú)酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基L-谷氨酰胺(Gibco/InvitrogenTM，目錄號(hào)Gibco/Invitrogen,11835-030)+10%熱滅活的胎牛血清(FBS)(Gibco/Invitrogen，目錄號(hào)16140-071)+lx青霉素/鏈霉素(Gibco/InvitrogenTM，目錄號(hào)15070-063)3.其它液體試劑PromegaTMMTS試劑(CellTiter96Aqueous目錄號(hào)G358B)二曱亞砜(DMSO)(SigmaTM,目錄號(hào)D2650)4.消耗品供應(yīng)帶蓋的無(wú)菌96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)處理的透明板(FalconTM，目錄號(hào)3072)5.儀器讀板儀，96孔(SpectraMAXGeminiEMTM，MolecularDevices,USA)B.方法第1天制備供試化合物用DMSO溶解并以lOOOx濃度連續(xù)稀釋供試化合物。在無(wú)菌96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中將供試化合物以1:100稀釋在無(wú)酚紅cRPMI中。使用12道移液器將10^稀釋的化合物溶液轉(zhuǎn)移到空的96孔板上以用于細(xì)胞孵育。加入100nl細(xì)胞培養(yǎng)物后，供試化合物的終濃度將為lx。第1天制備液體胂瘤細(xì)胞用于化合物處理從對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物中收集細(xì)胞在完全RPMI中，密度為約0.3-0.7百萬(wàn)/ml。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以無(wú)酚紅cRPMI中調(diào)整為0.1百萬(wàn)/ml(對(duì)于生長(zhǎng)快速的倍增時(shí)間等于或小于24小時(shí)的細(xì)胞，如K562，使用0.05百萬(wàn)/ml以避免過(guò)度生長(zhǎng))。將一式3份100fil細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔透明板上，共計(jì)10000細(xì)胞/孔。注意每個(gè)孔含有上文制備的10pi10x濃縮供試化合物。細(xì)胞孵育將細(xì)胞在含有5%C02的組織培養(yǎng)箱中于37°C孵育72-96小時(shí)。C.測(cè)量測(cè)定細(xì)胞生存力1.融化PromegaMTS試劑，使用重復(fù)移液器向每孔加入20jil。2.通過(guò)振搖板混合孔中的試劑，將板放置在37。C的C02組織培養(yǎng)箱中。3.通過(guò)向只含有100nl無(wú)酚紅cRPMI的一排孔中加入MTS試劑制備"無(wú)細(xì)胞"的空白對(duì)照。4.于37。C孵育，直至對(duì)照細(xì)胞在490nm的吸光度〉1.5。5.通過(guò)振搖混合細(xì)胞培養(yǎng)物，以確?？字蓄伾唬瑥亩_保沒(méi)有氣泡。若有氣泡，將板在臺(tái)式離心機(jī)上于1000xg離心以除去氣泡。6.在MolecularDevices96-孔讀板儀中讀取吸光度。D.結(jié)果分析1.將試驗(yàn)數(shù)據(jù)復(fù)制并粘貼到Excel文件中2.對(duì)"無(wú)細(xì)胞"空白數(shù)據(jù)求平均值，從含有細(xì)胞的每孔的吸光度中減去該平均值。3.對(duì)空白校正后的一式三份的孔數(shù)據(jù)求平均值，計(jì)算重復(fù)變型的標(biāo)準(zhǔn)偏差。4.對(duì)對(duì)照細(xì)胞數(shù)據(jù)求平均值。5.如下計(jì)算化合物處理的細(xì)胞平均數(shù)據(jù)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞平均數(shù)據(jù)的百分比(化合物處理的值/對(duì)照值)*100=%對(duì)照值結(jié)果我們測(cè)定了式I化合物的抗增殖活性。如表4中所示，式I化合物對(duì)Jeko-l和Granta-519兩個(gè)MCL細(xì)胞系均始終如一地具有活性。此外，式I化合物對(duì)相當(dāng)廣泛的血液惡性腫瘤細(xì)胞系(15個(gè)細(xì)胞系中的6個(gè))有抑制作用。IC50(uM)最大濃度(10uM)下的抑制。/。疾病細(xì)胞系A(chǔ)003397769N=4A003397769N=4AMLHL-603.7，8.1，>10,>1035AMLKG-11.991AMLML-2>1028B-AIXNalm-65.584B-CIXJVM畫23.5，3.6，7.7，>1060B-CULJVM畫26.8，7.0，8.4，>1059B-N肌DLCL-21.4,>10，>10，>100B-NHLDOHH-24.575CMLJurl-MKl1.2，>10，>10，>1028CMLK5623.9，>10，>10，>1021MCLJeko-l3.197MCLGranta-5193.467MML-3635.561MMRPMI8226>1036TALLJurkat6.8，>10，>10，>1043表4:Syk化合物對(duì)液體腫瘤細(xì)胞系的生存力的作用(MTS測(cè)定法)24大鼠的膠原^"導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制介紹膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)是一種已經(jīng)明確鑒定的人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型，使用在佐劑中的II型膠原(cII)免疫后可在遺傳易感的嚙齒類動(dòng)物中誘導(dǎo)CIA。CIA和RA均表現(xiàn)出嚴(yán)重的關(guān)節(jié)腫脹/炎癥、滑膜增生以及軟骨和骨侵蝕。通過(guò)cll免疫誘發(fā)的這種慢性炎性關(guān)節(jié)炎由T細(xì)胞組分(在缺乏T細(xì)胞的小鼠中CIA減弱證實(shí)了這一點(diǎn))和B細(xì)胞組分組成。缺乏B細(xì)胞的小鼠、xid小鼠或攜帶CXCR5無(wú)效突變的小鼠不發(fā)生CIA。方法免疫和激發(fā)雌性Lewis大鼠第0天接受免疫，第7天用與弗氏不完全佐劑混合的來(lái)自牛鼻的cll激發(fā)，膠原終濃度為1.0mg/ml。在大鼠尾基部注射400jigcll。預(yù)防性給藥方案從第6天起直至第21天每日兩次(b.i.d.)口服(p.o.)給予式I化合物(3.0、10和30mg/kg)。組合給藥方案從第6天起直至第21天給予大鼠單獨(dú)的式I化合物(3.0和10mg/kg，p.o.，b丄d.)或甲氨蝶呤(MTX，0.1和0.2mg/kg，p.o.，q.d.)，或者組合給予式I化合物的每個(gè)劑量和MTX的每個(gè)劑量。治療性給藥方案從第12天起直至第21天口服施用式I化合物(IO和30mg/kg,p.o.，b丄d.)。關(guān)節(jié)病理使用電子數(shù)字測(cè)徑器測(cè)量踝關(guān)節(jié)腫脹，精確到O.Olmm。從第6天開(kāi)始至第21天結(jié)束在整個(gè)研究期間記錄7次測(cè)量結(jié)果。在相同日期記錄體重。第21天時(shí)，在緊鄰踝關(guān)節(jié)上面的鼠毛邊緣處切除后爪，固定在10%中性緩沖的福爾馬林中。顯微CT分析使用錐束nCT掃描儀檢查踝關(guān)節(jié)。首先獲得探查性掃描圖像，用于選擇樣本的檢查體積，然后進(jìn)行定位、測(cè)量和計(jì)算機(jī)重建。分析踝關(guān)節(jié)的骨表面積與骨體積的比值，該值反應(yīng)了在一定體積中骨表面的復(fù)雜性。統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于關(guān)節(jié)腫脹/炎癥，采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析和Dunnett檢驗(yàn)在Everstatv.5軟件上分析數(shù)據(jù)。使用單因素方差分析和Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)在Everstat上分析顯微CT數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM,p值O.05被認(rèn)為數(shù)據(jù)有顯著差異。結(jié)果預(yù)防性給藥關(guān)節(jié)胂脹/炎癥的數(shù)字測(cè)徑器測(cè)量結(jié)果(圖2)。-僅在第12天，與溶媒處理的大鼠相比，式I化合物(3.0mg/kg)顯著減輕踝關(guān)節(jié)的腫脹/炎癥。-從第12天直至第19天，與溶媒處理的大鼠相比，式I化合物(IOmg/kg)顯著減輕踝關(guān)節(jié)的肺脹/炎癥。-從第12天直至第21天，與溶媒處理的大鼠相比，式I化合物(30mg/kg)顯著減輕踝關(guān)節(jié)的腫脹/炎癥。顯微CT分析(圖3)。-與溶々某處理的大鼠相比，式I化合物(3、10或30mg/kg，b.i.d.)顯著減輕骨侵蝕(通過(guò)骨表面積與骨體積的比值衡量)。組合給藥關(guān)節(jié)腫脹/炎癥的數(shù)字測(cè)徑器測(cè)量結(jié)果(圖4、5)。畫從第15天直至第21天，與溶媒處理的大鼠相比，式I化合物(10mg/kg)顯著減輕踝關(guān)節(jié)的肺脹/炎癥。畫從第15天至第21天，與單獨(dú)給予式I化合物(10mg/kg)或MTX(0.2或0.1mg/kg)治療的大鼠相比，式I化合物(IOmg/kg)與MTX(0.2或0.1mg/kg)的組合治療顯著減輕踝關(guān)節(jié)的腫脹/炎癥。-通過(guò)踝關(guān)節(jié)的腫脹/炎癥來(lái)衡量，以單獨(dú)給予或與MTX(O.lmg/kg)組合給予式I化合物(3.0mg/kg)不能顯著影響疾病的嚴(yán)重程度。-第18天直至笫21天的測(cè)量結(jié)果顯示，與兩種藥物分別單獨(dú)給藥相比，與MTX(0.2mg/kg)組合給予式I化合物(3.0mg/kg)顯著減輕關(guān)節(jié)的腫脹/炎癥。顯微CT分析(圖6):26-三維圖像證實(shí)溶媒處理的大鼠關(guān)節(jié)發(fā)生顯著的骨侵蝕/破壞。-與溶媒處理的大鼠相比，給予大鼠式I化合物(IOmg/kg，po，bid)顯著減少骨侵蝕。給予3mg/kg式I化合物的大鼠未見(jiàn)有顯著減少。-單獨(dú)給予MTX(0.2mg/kg，po,qd)導(dǎo)致骨侵蝕顯著減少。給予O.lmg/kgMTX的大鼠未見(jiàn)有此作用。-與溶媒處理的大鼠相比，用式I化合物和MTX組合處理時(shí)，所有組的骨表面積與骨體積的比值均表現(xiàn)出顯著下降。-與接受單獨(dú)的式I化合物或MTX的大鼠相比，式l化合物(10mg/kg，bid，po)與MTX(0.2mg/kg，qd)的組合治療為避免發(fā)生骨侵蝕提供了更多保護(hù)。治療性給藥關(guān)節(jié)腫脹/炎癥的數(shù)字測(cè)徑器測(cè)量結(jié)果(圖7)。-即便是在治療性方案中給藥被延遲至已有明顯可見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎時(shí)，式I化合物(10和30mg/kg,p.o.,b.i.d.)在第15至第21天仍顯著減輕踝關(guān)節(jié)的腫脹/炎癥。顯微CT分析(圖8):-通過(guò)骨表面積與骨體積的比值衡量，與溶々某處理的CIA大鼠相比，治療性給予式I化合物(10mg/kg或30mg/kg)的CIA大鼠表現(xiàn)出骨侵蝕顯著減少?？偨Y(jié)這些研究證實(shí)用關(guān)節(jié)腫脹/炎癥和骨侵蝕的減少來(lái)衡量，式I化合物對(duì)syk激酶的抑制能顯著延遲大鼠CIA的發(fā)病和進(jìn)展。重要的是，在給藥被延遲至關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，仍觀察到顯著抑制疾病的進(jìn)展和嚴(yán)重程度。新的RA臨床治療一般組合給予MTX。來(lái)自嚙齒動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型的數(shù)據(jù)表明當(dāng)將式I化合物與MTX組合給藥時(shí)有相加作用，這提示式I化合物與MTX的組合治療能對(duì)RA患者產(chǎn)生協(xié)同性臨床作用。血管生成測(cè)定法使用曱苯噢噪(4mg/kg)和氯胺酮(80mg/kg)麻醉雌性Lewis大鼠(5周齡，150-175g)。然后將含有50|iilFGF-2(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)溶液(含400ngFGF-2)或溶媒(生理鹽水溶液，0.08%牛血清白蛋白)的纖維素海綿(直徑10mm，VivoxidLtd.TM，Turku,Finland)皮下植入到動(dòng)物背部。在隨后兩天期間，通過(guò)每日經(jīng)皮注射50piFGF-2溶液或溶媒(基本條件)到海綿中進(jìn)一步誘導(dǎo)血管生成。植入海綿一周后，使用過(guò)量戊巴比妥將動(dòng)物安樂(lè)死，取出海綿。然后切碎海綿，在Fastprep勻漿器(QbiogeneTM，Illkirch,法國(guó))中使用LysingMatrixD管(MPBiomedicalsTM，Illkirch，法國(guó))在裂解緩沖液(NaCl150mM，EDTA1mM，TritonXI001%，去氧膽酸鈉0.5%,NaF10mM，Tris/HCl30mMpH7.8，含有蛋白酶抑制劑合劑(P8340,Sigma-AldrichTM，StLouis,USA))中進(jìn)行勻化。使用Drabkin測(cè)定法(PierceBiotechnologyTM，Rockford，Illinois,USA)測(cè)定血紅蛋白濃度，它反映了血管體積?；衔镆栽?.6%甲基纖維素、0.5。/。Tween80水溶液中的混懸液形式通過(guò)口服管飼法施用。式I化合物對(duì)大鼠體重的作用如圖9中所示。式I化合物對(duì)血紅蛋白濃度(mg/ml)的作用如圖10中所示。權(quán)利要求1.式(I)化合物或其相應(yīng)的N-氧化物或前體藥物；或該類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；以及所述鹽和溶劑合物的N-氧化物和前體藥物。2.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的化合物以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。3.—種治療患者關(guān)節(jié)炎癥的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。4.一種治療患者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。5.—種治療患者關(guān)節(jié)炎癥的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物與甲氨蝶呤的組合。6.—種治療患者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物與曱氨蝶呤的組合。7.—種治療患者腫瘤的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。8.—種治療患者套細(xì)胞淋巴瘤的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。9.一種抑制患者血管生成的方法，其包括給需要其的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。全文摘要本發(fā)明涉及式I化合物和其前體藥物，以及該類化合物和它們的前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物。該類化合物具有頗有價(jià)值的藥學(xué)性質(zhì)，特別是抑制蛋白激酶的能力。文檔編號(hào)A61P19/02GK101511838SQ200780033660公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年9月11日優(yōu)先權(quán)日2006年9月11日發(fā)明者A·齊爾伯施泰因,E·M·阿倫,P·埃諾特,T·A·吉爾雷斯拜,余儉德申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬(wàn)特股份有限公司