專利名稱：：抗微生物肽的制作方法抗微生物肽本發(fā)明涉及具有抗微生物活性和內(nèi)毒素中和活性的多肽和脂多肽的新家族。這些新化合物還可與常規(guī)的抗生素或抗內(nèi)毒素劑一起在聯(lián)合療法中使用。另外，本發(fā)明公開了制備和使用這些新化合物的方法。能抵抗市售抗生素的致病細菌的日益出現(xiàn)，促使人們對開發(fā)作為抗細菌藥物的肽的興趣持續(xù)增長。的確，現(xiàn)今有很大一部分醫(yī)院感染(高達70%)是因抗生素抗性細菌所致。除了藥物抗性問題外，革蘭氏陰性細菌感染的抗生素治療還會造成內(nèi)毒素的釋放，？1起敗血性休克，這代表了抗微生物療法的又一個問題。感染性休克是重癥監(jiān)護病房中的死亡率的主要原因。革蘭氏陰性細菌特別地在其外膜中含有脂多糖(LPS),LPS已知是這一的應(yīng)答的最強引發(fā)物(elicitor)。此外，目前用于革蘭氏陰性感染的抗生素可殺滅細菌，但抗生素的給予并不能中和從垂死細菌的外膜釋放的LPS。LPS的這一釋放可實際上增加肺損傷，導(dǎo)致敗血綜合征。因此，具有抗微生物特性和能中和所釋放的內(nèi)毒素的藥劑，對于治療細菌感染會具有極高的價值。由于細菌已進化成能對大多數(shù)的現(xiàn)有抗生素呈現(xiàn)多重抗性，新的一類化合物更有可能使細菌抗性的快速出現(xiàn)減至最低。自然界告訴我們，哺乳動物先天免疫的效應(yīng)分子能提供抗擊大批病原微生物的第一道防線。具體的說，宿主防衛(wèi)肽被認為是多功能效應(yīng)分子，代表了據(jù)以克服抗微生物藥劑抗性的治療藥物的開發(fā)的新來源。許多常規(guī)的抗生素損害或殺滅細菌要一段時間，而大多數(shù)抗微生物肽幾乎是即刻殺滅，即在幾分鐘時間內(nèi)殺滅。有多種抗微生物肽還能阻斷LPS與其受體(如LBP、CD14和MD-2/TLR4)的相互作用，導(dǎo)致巨噬細胞的激活被抑制，這一特點可降低LPS毒性。乳鐵蛋白是具有抗微生物和LPS結(jié)合活性的鐵結(jié)合性內(nèi)源糖蛋白，見于哺乳動物的外分泌中和見于在炎癥反應(yīng)過程中的嗜中性粒細胞的顆粒中。乳鐵蛋白顯示多功能特性，包括抗細菌特性、抗真菌特性、抗病毒特性、抗腫瘤特性、抗炎特性和免疫調(diào)節(jié)特性。乳鐵蛋白及其衍生物已知具有中和細菌內(nèi)毒素(LPS)的能力，因此能保護生物體免于敗血癥的有害作用。因此，許多關(guān)于乳鐵蛋白的體外抗微生物和抗炎活性的報告，認為它在宿主抵御感染和過度炎癥中具有重要作用。人乳鐵蛋白的體外和體內(nèi)蛋白水解消化產(chǎn)生出被稱為乳鐵蛋白肽(lactoferricin)的肽片段，該片段相比于完整乳鐵蛋白具有增強的抗微生物活性。乳鐵蛋白肽的多種更短的合成衍生物顯示出抗革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的抗孩t生物活性，能特異性結(jié)合LPS(Str0metal.,丄Pe;^/e/仏57:127-139(2001))。雖然許多宿主防衛(wèi)肽作為新的候選抗微生物藥劑都很有潛力，但人乳鐵蛋白及其衍生物是獨特的，因為它們具有多功能活性，且它們由于來源于人，不太可能會引起不良生理效應(yīng)。富含肉豆蔻酰基化丙氨酸的C激酶底物(MARCKS)和MARCKS相關(guān)蛋白質(zhì)是許多細胞類型中的主要蛋白激酶C底物。發(fā)現(xiàn)MARCKS的轉(zhuǎn)錄受到響應(yīng)細菌LPS的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞激活的顯著上調(diào)。MARCKS上的LPS結(jié)合模體(LPS-bindingmotif)與用組合文庫方法鑒定到的強效抗微生物六肽(hex叩eptide)非常相似。由于MARCKS天然受到N末端肉豆蔻?；?myristoylation)修飾，可以預(yù)期的是，將親脂基團插入到較短的MARCKS衍生物中可導(dǎo)致產(chǎn)生強的抗^L生物活性和/或LPS結(jié)合。對于脂肽(lipopeptide，例如多粘菌素(polymyxin)、八肽菌素(octapeptin)和達托霉素(daptomycin))，已描述了其疏水性特別是烷基或酰基鏈的存在與其抗微生物活性的相關(guān)性。此外，多粘菌素對LPS分子的親和力高，能通過破壞帶負電荷的頭基團(headgroup)來使外膜透化，該破壞是通過將二價陽離子從它們在LPS上的結(jié)合位點置換下來而進行的。乳鐵蛋白肽B的九聚物核心肽的N末端的?；瑢?dǎo)致了抗微生物活性的提高。最近已從土壤樣本分離出長鏈N-?；被峥股?。月旨多胺(lipopolyamine)(DOSPER、DOSPA和DOGS,均含有C17烷基鏈)據(jù)報道也能顯示抗內(nèi)毒素活性，該活性是通過隔離LPS/人而阻斷會導(dǎo)致促炎介體(proinflammatorymediator)的產(chǎn)生的下游細胞激活事件而顯示的。這些脂多胺當(dāng)在患有綠膿桿菌CPsewJowow^flerag&osa)引起的入侵性革蘭氏陰性菌血癥的中性白細胞缺乏大鼠中單獨試驗時顯得無效，但當(dāng)與ceftazimidine這種抗生素組合給予時，這一組合與單獨的ceftazimidine相比顯著地提高了存活率。正在進行的新遞送系統(tǒng)的開發(fā)預(yù)期可提高肽在傳染病治療領(lǐng)域中抗感染疾病的潛力。例如，由于最近開發(fā)出嵌合肽策略，將肽遞送到大腦組織現(xiàn)在是可能做到的(Bickeletal.,Tev.46:247-279(2001))。一個成功案例-f亍全肺切除術(shù)后用多粘菌素B固定化的纖維處理和進行連續(xù)血液透析過濾一一據(jù)報道消除了肺結(jié)核患者中的敗血癥("敗血性休克，，)的致發(fā)因素(Takahashietal.,爿朋.TTzorac.O^^omsc.9:319-322(2003))。類似地，為增強肽藥物口服給予后的生物利用度，正在開發(fā)多種策略。這些策略包括微粒藥物遞送如納米顆粒、微膠嚢、脂質(zhì)體或乳液，黏膜黏附遞送和滲透促進劑的使用(Kompellaetal.，爿c/v.i>wg￡>Wv.iev.46:211-245(2001))。JapdjB.等(JBiolChem.280(17)(2005):16955-61)報道了衍自乳鐵蛋白的包含氨基酸序列FQWQRNIRKVR-NH2的內(nèi)毒素中和肽(LFll)。在這些研究的過程中，測定了負責(zé)LPS結(jié)合的LFll的氨基酸殘基。與JapeljB.等相似,在AndraJ.等(BiochemJ.385(2005):135-43)也分析了與C12烷基鏈偶聯(lián)的乳鐵蛋白衍生肽LF11與LPS的相互作用。在FamaudS.等(FEMSMicrobiolLett.238(1)(2004):221-6)中，公開了衍自牛和人乳鐵蛋白的抗微生物肽。這篇科學(xué)文章的作者研究了這些肽與LPS的結(jié)合。US2003/0022821Al涉及包含7-25個氨基酸殘基的修飾乳鐵蛋白肽，其中所述氨基酸殘基有三個或更多個是陽離子型殘基。US2003/0022821Al所述的肽還包含大體積和親脂性氨基酸殘基。ChenPW等(AmJVetRes.64(9)(2003):1088-92)報道了具有高含量的親脂性和陽離子型氨基酸殘基的乳鐵蛋白類似物。本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供顯示抗微生物特性和內(nèi)毒素中和特性的肽。因此，本發(fā)明涉及下式所示的具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa0M-(Xaa2)。-Xaa3-(Xaa4)p-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R-(Xaa8)s，其中Xaat為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選選自精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)，Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp),Xaa4選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，Xaa5選自異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr),Xaa6選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，Xaa為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(T卬)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)，和Xaas選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)和絲氨酸(Ser)，且其中O為0，M為l或2，P為2或3，Q和R為1，和S為1、2、3或4。本發(fā)明涉及顯示抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的分離肽、多肽和脂肽。這些分子顯示出抗各種病原體(包括細菌、病毒、真菌等)的生物物理學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)方面的實驗。本發(fā)明提供具有抗微生物活性和/或抗內(nèi)毒素活性的肽和脂肽。本文所用的術(shù)語"氨基酸"指天然的氨基酸和它們的衍生物。另外，也可使用一種或多種氨基酸的模擬物，它們又稱肽模擬物或模擬肽。本文所用的術(shù)語"模擬物"指具有某氨基酸的相同或類似功能特性的氨基酸或氨基酸類似物。肽模擬物或模擬肽是這樣的有機分子，它保持著與相應(yīng)的肽中存在的肽鏈藥效團(pharmacophoregroup)類似的肽鏈藥效團。如上所述的非天然氨基酸或者模擬肽對氨基酸的置換，基于對側(cè)鏈官能性的修飾，能增強單個肽的總體活性或其他特性。例如，對所例示的肽的這些類型的修飾，能增強肽對酶降解的穩(wěn)定性或者提高生物活性或降低免疫原性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地合成出本發(fā)明的肽和脂肽。制備合成的肽的標(biāo)準程序是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明的肽可通過諸如a-氨基基團的t-BOC或FMOC保護之類的常用方法進行合成。該兩種方法都涉及逐步合成，即從肽的羧基末端開始在每一步驟加入單個氨基酸(See,Coliganetal.，CurrentProtocolsinImmunology,WileyInterscience,1991，Unit9)。本發(fā)明的肽還可通過本領(lǐng)域公知的固相肽合成方法進行合成。(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149,1963),及Stewart和Young,SolidPhaseP印tidesSynthesis,Pierce,Rockford,111.(1984))。肽可用含有0.1-1.0mMol胺/g聚合物的(苯乙烯-二乙烯基苯)共聚物進行合成?；瘜W(xué)合成完成時，可用液體HF-10。/。茴香醚在0。C下處理約0.25-l小時，使肽脫保護和從聚合物上切割下來。蒸發(fā)掉試劑后，用1%乙酸溶液從聚合物萃取出肽，然后進行凍干得到粗物質(zhì)。這一粗物質(zhì)通?？赏ㄟ^諸如用5%乙酸作為溶劑進行的SephadexG-15凝膠過濾、高壓液相色譜等的技術(shù)來進行純化。柱子的適當(dāng)流分的凍干會產(chǎn)生出均一的肽或肽衍生物，它們?nèi)缓罂赏ㄟ^諸如以下的標(biāo)準技術(shù)進行鑒定氨基酸分析、薄層層析、高效液相色譜、紫外吸收胱譜、摩爾旋光度、溶解度，并通過固相Edman降解進行評估(參見例如ProteinPurification,M.P.Deutscher,ed.MethodsinEnzymology,Vol182,AcademicPress,1990)。使用FMOC固相合成方法進行的自動合成可用自動肽合成儀來完成(Model432A,AppliedBiosystems,Inc.)。本發(fā)明的肽/多肽還可用融合蛋白微生物方法來合成，其中陰離子型載體肽與陽離子型肽融合。用以進行具有抗微生物活性的陽離子型肽的這種微生物生產(chǎn)(suchmicrobialproduction)的方法在US5,593,866中提供。由此產(chǎn)生的本發(fā)明肽可通過蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域公知的蛋白質(zhì)分離/純化方法進行純化。更具體的說，可以一提的方法例如有萃取，重結(jié)晶，用硫酸銨、硫酸鈉等進行的鹽析，離心，透析，超濾，吸附層析，離子交換層析，疏水層析，正相層析，反相層析，凝膠過濾方法，凝膠滲透層析，親和層析，電泳，逆流分配等以及這些方法的組合。最有效的是反相高效液相色譜方法。本發(fā)明的肽可通過加入酸而形成鹽。酸的實例包括無機酸(如三氟乙酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸和硫酸)或有機羧酸(如乙酸、丙酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸和水楊酸)，酸性糖類如葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、抗壞血酸等，酸性多糖如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、海藻酸，或者有機磺酸(如甲磺酸和對曱苯磺酸)等等。這些鹽中，優(yōu)選的是藥物可接受的鹽。本發(fā)明的肽可與^威性物質(zhì)形成鹽。這種鹽的實例包括例如選自以下的藥物可接受鹽與無枳^成所成的鹽如i咸金屬鹽(鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽、銨鹽等，或者與有機堿所成的鹽如二乙醇胺鹽、環(huán)己胺鹽等。本文所用的術(shù)語"氨基酸"意指L-氨基酸。但是，D-氨基酸也可用來制備本發(fā)明的肽。本文所用的"肽"包含2-50個氨基酸殘基。"多肽"和"蛋白質(zhì)，，包含超過50個氨基酸殘基。本文所用的"抗微生物(的)"指本發(fā)明的肽和多肽的生物活性，意指該肽/多肽具有殺滅微生物、破壞微生物繁殖或另外使微生物不能生長的能力，其最小抑制濃度("MIC"，按照美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會(Clinical和LaboratoryStandardsInstitute,CLSI,以前稱NCCLS)小于32|iM，優(yōu)選小于16^M。根據(jù)本發(fā)明要抑制的微生物包括細菌、真菌、酵母等。測定抗微生物多肽的MIC的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在例如以下文獻中有描述Powell等(MolecularPlant-MicrobeInteractions,8:792-794(1995))，Wu和Hancock(J.BiolChem.274:29-35(1999))及LorianV.("AntimicrobialsinlaboratoryMedicine",19964thed.pp.330-396,WilliamsandWilkins,Baltimore,Md)。MIC測定可以確定出肽的抑制微生物繁殖和生長的最低濃度。出于本發(fā)明目的，認為某多肽如果具有針對本文所用某微生物的前述MIC,則它是抗微生物多肽。本發(fā)明的肽的"內(nèi)毒素中和，，活性和/或結(jié)合活性，可用例如巨噬細胞系在體外測定中進行試驗(Goughetal.(1996)Infect.Immun.64:4922-4927)。本發(fā)明的肽還顯示抗真菌活性。對幾種真菌顯示出這一活性，例^口只于襟斤型隱J求菌(CV7j!tococCT^weo/o廠ma"》。上述的式優(yōu)選包含選自以下的氨基酸序列FWQRIRKVR(SEQIDNo.1)、FWQRRIRKVRR(SEQIDNo.2)、FWQRKIRKVRK(SEQIDNo.3)、FWQRNIRIRR(SEQIDNo.4)、FWQRNIRKVR(SEQIDNo.5)、FWQRNIRVR(SEQIDNo.6)、FWQ畫RKVRR(SEQIDNo.7)、FWQRNIRKVKK(SEQIDNo.8)、FWQRNIRKVRRR(SEQIDNo.9)、踏4(di工)魂貨^、(3U)，，營廿與，^PA'凍賃實萄'味駛《化BX'(s")^貨練^(Sjv)壤貨鞋《9bbx'(di工)擲賓3貨OlI)瑰賓奢者《SCTX擲貨^i玄4(3II)魂貨安昔、(usv)魂難irY、(XlO)^貨縣tf化BX'(da丄)瑰,^fF^'凍賃，科味徵^化BX'(s人l)^，姊、(&V)，，辨tl^^W'，@節(jié),^化嘆'OlI)，實攀廿40iId)，,W玄與，^i'，賃，科，夢《貨'S(8BBX)"^(峋eX)-W(9BeX)力(SBeX)-d(葉BX)-化BX-0(^EX)-W(BBX):鄰^科劣4+專會MV莉劣^帀^^單首^^^Y土Y翁頃卑々一《^的》味。(備^^Y)添^H土W添^-G《賃努逸賃貨W,if承？針寧備去^:、r49+Mi^S,貨'+的》卞夢°(9￡'omaib3S)^AxaiNrab叢Ad.。maiD3S)^八:sraiN^DAvid、("。naib3S)HAXJiiJsrabAvvd、(^.omen^八:s入ibrabAVd、(1￡.onaiD3S)WA:MM^iD叢d[、(0￡'。NdlD3S)"HAXHIKraAA^、(6乙.onaiD3S)"aAMLh^nAuKsz'。naib3S)^八xaiN"aiAVd、("'。MGtl^)3S)HASWIiSraVAU、(9乙'onai^tA2WIJsracIAVd、(s乙onlaibas)^碰^ranrabAVd、(w.omaib3S)^w:s^mra。AVd:、(￡乙onaibas)HA別icrabAVd、(乙乙.。naibas)a^raDrabAVd、(iz。nai。3S)SAMINrabAVd、(0乙'。NaiD3S)WAXaAN^b叢d、(61.onaib3S)"aAMihrabAVd、(8I.omaib3S)MAX3AVNraD叢d、("'。naib3S)hav:shin^bAVd[、(91'。maibas)^rcraLNrabAVd、(si'。naib3S)MDraiNHb叢d、(w'onait)3S)ddci八XaiNMbAVd[、(n.onaiDas):sxxxA:^i腦DAVd、(n。nai5as)rara^oraiNH^wd力ionaiDas)OTaraAxaiNMbA^、(oi.。naiOas)xs^vx^iNubA^雖W/8^法能氨酸(Val)，和Xaas為精氨酸(Arg)，且其中O為0,M為1或2,R為0或1,P為1、2或3，Q為1,和S為0、1或2。上述的式優(yōu)選包含選自以下的氨基酸序歹'j:FWRIRKWR(SEQIDNo.37)、FWRIRKVR(SEQIDNo.38)、F豐WRR(SEQIDNo.39)、FWRRWRR(SEQIDNo.40)、FWRRWIRR(SEQIDNo.41)、FWRGWR腿(SEQIDNo.42)、FWRRFWRR(SEQIDNo.43)、F戰(zhàn)豐戰(zhàn)(SEQIDNo.44)、FWRI豐WR(SEQIDNo.45)、FWRIWRIWR(SEQIDNo.46)、FWRNIRKWR(SEQIDNo.47)和FWRRRIR腺(SEQIDNo.48)。本發(fā)明的另一個方面涉及下式所示的具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa,)M-(Xaa2)。-Xaa3-(Xaa4)p-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R-(Xaa8)s,其中Xaai為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe),Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選選自精氨酸(Arg),賴氨酸(Lys),Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp)，Xaa4選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)和異亮氨酸(Ile),Xaa5選自異亮氨酸(Ile)和色氨S殳(Trp),Xaae選自精氨酸(Arg)和天冬氨酸(Asp),Xaa7為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu),和Xaas選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)和天冬氨酸(Asp),且其中0和Q為0,M為0、1、2或3,R為1或2,P為1、2或3,和S為1、2或3。上述的式優(yōu)選包含選自以下的氨基S臾序列PFWRWRIWR(SEQIDNo.50)、PFWRIR腿(SEQIDNo.51)、PF豐QRIRR(SEQIDNo.52)、PFWRARIRR(SEQIDNo.53)、PFWRKRIRR(SEQIDNo,54)、PFWRKRLRR(SEQIDNo.55)、PFWRKRWRR(SEQIDNo.56)、PFWRRRIRR(SEQIDNo.57)、PFWRRRWRR(SEQIDNo.58)、PFWRIRIRRD(SEQIDNo,59)、PFFWRIRIRR(SEQIDNo.60)、PWRIR跳(SEQIDNo.61)、PFWRRQIRR(SEQIDNo.81)、PFWRKKLKR(SEQIDNo.82)、PWRRIRR(SEQIDNo.83)、PWRRKIRR(SEQIDNo.84)和PFWRRIR腿(SEQIDNo.85)。本發(fā)明的又一個方面涉及下式所示的具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa!)M-(Xaa2)o-Xaa3-(Xaa4)p-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R匿(Xaa8)s,其中Xaa,為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe),Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選精氨酸(Arg),Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp),Xaa4選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)和賴氨酸(Lys),Xaa5選自異亮氨酸(Ile)、笨丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)，Xaa6選自谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)和天冬酰胺(Asn),Xaa7為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe),和Xaas為精氨酸(Arg),且其中M為0、1、2或3，O為0或1，P為1、2或3,Q為1或2，和R和S為0、1或2。上述的式優(yōu)選包含選自以下的氨基酸序列FWRNIRIRR(SEQIDNo.72)、FWQRIR腿(SEQIDNo.73)、FWRWRI職(SEQIDNo.74)、FWRIRIRR(SEQIDNo.75)、FWRNIRIWRR(SEQIDNo.76)和Fw麵RIRR(SEQIDNo.77)。內(nèi)毒素中和活性的肽，該式包含選自以下的氨基酸序列RFWQRNIRKVRR(SEQIDNo.62)、RFWQRNIRKYR(SEQIDNo.63)、PFWQRNIRKWR(SEQIDNo,64)、RFRWQRNIRKYRR(SEQIDNo.65)、RWKR服QWF(SEQIDNo.66)、KRFCFKK(SEQIDNo.67)、KRFSFKKC(SEQIDNo.68)、KRWSWKK(SEQIDNo.69)、FRFSFKK(SEQIDNo.70)、RRFWFRR(SEQIDNo.71)、RFWQRNIR腿(SEQIDNo.78)、RWQRNIRIRR(SEQIDNo.79)和RRWFWRR(SEQIDNo.86)。本發(fā)明的另一個方面涉及式FIWQRNIRKVR(SEQIDNo.34)、FIWRWRWR(SEQIDNo.49)和RRIRINRQWF(SEQIDNo.80)所示的具有抗孩i生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽。本發(fā)明的肽的N末端和/或C末端可具有修飾，如?；?乙酰化)、酰胺化、酯化、還原、氧化、(共價)接頭結(jié)合(linkerbinding)、肽鍵、二硫鍵等。肽還可例如通過碳水化合物、接頭分子、脂質(zhì)等作進一步修飾。本發(fā)明的肽的C末端優(yōu)選包含(consistspreferablyof)選自羧基、酰胺基的基團，特別是包含(consistingof)N-曱基酰胺基、酯、醚或酮，優(yōu)選包含1-20個碳原子，更優(yōu)選1-10個碳原子。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，使?；c肽的N末端或C末端結(jié)合。為了增加本發(fā)明的肽的疏水性，從而增加肽與例如細胞的疏水部分(例如細胞膜)的相互作用，肽優(yōu)選用酰基基團進行修飾。要與本發(fā)明的肽結(jié)合的?；鶊F，優(yōu)選是選自C2-C2o的飽和和不飽和的直鏈和支鏈?；?、千基衍生物和F-moc的疏水鏈。?；鶊F優(yōu)選選自十二碳?；鶊F、癸?；鶊F、辛?；鶊F、己?；鶊F、2-曱基己?；鶊F、2-乙基己?；鶊F、2-丙基戊?；鶊F、2-丁基辛酰基基團、2,2-二曱基丁酰基基團、2-曱基戊?；鶊F、3-甲基戊?；鶊F、4-甲基戊?；鶊F、6-曱基辛?；鶊F、節(jié)基基團和二環(huán)己基乙?；鶊F。本發(fā)明的特別優(yōu)選的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的肽可參見表1。表l:本發(fā)明的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>本發(fā)明的另一個方面涉及包含本發(fā)明的肽的多肽。本發(fā)明的肽還可以是多肽的一部分，條件是包含所述肽的(非天然)多肽顯示相同的抗微生物活性和/或內(nèi)毒素中和活性。但是，該融合多肽可顯示出比該肽更低或甚至更高的活性。樣，可將本發(fā)明的肽用作重復(fù)單元，以獲得具有2、3、4、5、10或20個重復(fù)單元的肽或多肽。本發(fā)明的另一個方面涉及包含本發(fā)明的肽或多肽的藥物組合物。這種組合物可用來治療和/或預(yù)防例如^t生物感染或敗血性^f木克。最后，本發(fā)明涉及將本發(fā)明的多肽或脂肽與其他抗微生物藥劑或抗敗血癥藥劑在藥物可接受載體或惰性物質(zhì)中一起共給予，以改進所述其他抗孩i生物藥劑或抗敗血癥藥劑的功效的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，組合物還包含至少一種另外的抗微生物藥劑或抗敗血癥藥劑。為了獲得具有更好的抗微生物作用和/或內(nèi)毒素中和作用的藥物組合物，加入了顯示與本發(fā)明的肽類似的特性的另外藥物。當(dāng)然還可以加入其活性不同于本發(fā)明的肽的藥物。這些物質(zhì)可幫助^提高生物利用度，例如提高肽的穩(wěn)定性或增強肽的遞送。可與本發(fā)明的肽進行組合的具體的藥物的實例包括氨基糖苷(例如托普霉素)、青霉素(例如哌拉西林)、頭孢菌素(例如頭孢他咬)、氟喹諾酮(例如環(huán)丙沙星)、碳青霉烯類(例如亞胺培南)、四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯(例如紅霉素和克拉霉素)。組合物還可加入抗生素供進行組合療法或協(xié)同療法。所給予的適當(dāng)抗生素通常要取決于微生物的易感性(susceptibility),例如細菌是革蘭氏陰性細菌還是革蘭氏陽性細菌，對此本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易分清的。除了以上所列抗生素外，典型的抗生素包括氨基糖苷(阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、托普霉素、鏈霉素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素(依托紅霉素/琥乙紅霉素/葡庚糖酸紅霉素/乳糖酸紅霉素/硬脂酸紅霉素)、(3-內(nèi)酰胺如青霉素(例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、二氯唑西林、氨芐青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐西林、美洛西林、阿洛西林和哌拉西林)或者頭孢菌素(例如頭孢噻吩、頭孢唑林、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢呋辛、頭孢尼西、cefmetazole、頭孢替坦、頭孢丙烯、氯碳頭孢、頭孢他美、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢唑月虧、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢泊肟和頭孢磺啶)。其他類別的抗生素例如包括碳青霉烯類(例如亞胺培南)、單環(huán)-內(nèi)酰胺類(例如氨曲南)、喹諾酮類(例如氟羅沙星、萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星和西諾沙星)、四環(huán)素類(例如多西環(huán)素、米諾環(huán)素、四環(huán)素)和糖肽類(例如萬古霉素、替考拉寧)。其他的抗生素包括氯霉素、克林霉素、曱氧節(jié)啶、磺胺甲噁唑、硝基呋喃、利福平和莫匹羅星。本發(fā)明的組合物可優(yōu)選還包含藥物可接受賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可單獨由本發(fā)明的肽組成，或者可以為包含本發(fā)明的肽和藥物可接受載體的組合物的形式?？墒褂玫乃幬锟山邮茌d體沒有特別限制，包括可用于醫(yī)療領(lǐng)域的賦形劑、粘合劑、潤滑劑、著色劑、崩解劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、麻醉劑等。而且，它可以與另一抗微生物藥品如溶菌酶、抗生素等組合使用。本發(fā)明的組合物可用于治療例如身體外部的受微生物感染的部分，或者用于治療身體內(nèi)部的微生物感染，因此根據(jù)治療目的，適當(dāng)?shù)慕o藥方法可選自注射(皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)等)、滴眼、滴注、經(jīng)皮給予、口服給予、吸入等。同樣，可根據(jù)給藥方法適當(dāng)選擇劑型，如可注射制劑(溶液劑、混懸劑、乳劑、使用時進行溶解的固體劑等)、片劑、膠嚢劑、顆粒劑、散劑、液體劑、脂質(zhì)體包埋劑(liposomeinclusion),軟膏劑、凝膠劑、外用散劑、噴霧劑、吸入散劑、滴眼劑、眼用軟膏劑、栓劑、陰道栓劑(pessary)等，因此可配制本發(fā)明的抗微生物藥品。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明的肽或多肽作為抗微生物藥劑或作為內(nèi)毒素中和藥物的用途。本文所公開的肽顯示出抗微生物活性和/或內(nèi)毒素中和活性。因此，這些肽可適合作為抗微生物藥劑或作為內(nèi)毒素中和藥物應(yīng)用。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明的肽或多肽用于制備用以治療或預(yù)防由微生物優(yōu)選由細菌引起的感染或優(yōu)選由內(nèi)毒素引起的敗血癥或敗血性休克的藥物的用途。由于其生物特性，本發(fā)明的肽適合在藥物中應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，該藥物可優(yōu)選還包含至少一種另外的抗微生物藥劑或抗敗血癥藥劑。該藥物此外還優(yōu)選包含藥物可接受賦形劑。本發(fā)明的另一個方面涉及抑制至少一種微生物的生長的方法，所述方法包括使所述微生物與有效量的本發(fā)明的肽或多肽接觸的步驟。本發(fā)明的肽和多肽可用來抑制微生物的生長。這個作用可通過使所述分子與要抑制的微生物接觸來實現(xiàn)。本文所用的術(shù)語抑制微生物的生長的"治療有效量，，或"有效量"，指足以降低受試者對LPS的應(yīng)答和減少敗血癥的癥狀的肽量。術(shù)語"治療有效(的)"因此包括這樣的肽量，該量足以使臨床上顯著的TNF血漿水平升高得到防止，優(yōu)選得到降低達至少50%，更優(yōu)選達90%。肽的給予的劑量范圍是大得足夠產(chǎn)生所需的作用的劑量范圍。一般來說，劑量要隨患者的年齡、身體狀況、性別和感染如上所述的細菌或其他微生物的程度而變，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進行確定。在任何禁忌征候情形中，劑量可由醫(yī)師個體進行調(diào)整。在任何情形中，治療的有效性可通過檢測患者中的LPS和TNF的水平來確定。血清LPS和TNF水平的下降應(yīng)與患者的康復(fù)相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，所述微生物是革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。本文所公開的肽和多肽對細菌特別有效。因此，優(yōu)選的要進行接觸的微生物，優(yōu)選是腸桿菌科，特別是大腸桿菌(5^/^n'c/z/aco/0、沙門氏菌屬中的細菌(5"a/mo"e〃aj;;.)、鼠疫耶爾森氏菌(Jera/w'a;asfc)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(7era纟m'aewteraco/"/ca)或克雷伯氏菌屬中的細菌(幻e/^'e〃a^d.);優(yōu)選是假單胞菌科，特別是綠膿桿菌(fteMctowowwaerag&asfl);優(yōu)選是產(chǎn)堿菌科，特別是支氣管敗血波氏桿菌(5oWete〃aZrawc/^eprica)或百日咳波氏桿菌(5on/efe〃apeW"M");優(yōu)選是布魯氏菌科，特別是流產(chǎn)布魯氏菌(&""http://00^^1);優(yōu)選是莫拉氏菌科，特別是鮑曼不動桿菌G4cZ"eto6acfer^Mwam'Z);優(yōu)選是黃單胞菌科，特別是嗜麥芽窄食單胞菌(5Vewo^o^/owo"(^wa/top/n7Za);巴斯德氏菌科，特別是流感嗜血桿菌Cf/aemop/n7ws/w/7Mew加e);優(yōu)選是奈瑟氏菌科，特別是腦膜炎奈瑟氏菌(A^^en'awem'"g"W》；優(yōu)選是葡萄球菌科，特別是金黃色葡萄球菌(iSta;/^/ococctw做re"力或表皮葡萄球菌0SVap/^/ococa^ep/cfemn'^fe);優(yōu)選是腸球菌科，特別是糞腸球菌(五w/eracocc^/flecafe);優(yōu)選是鏈球菌科，特別是無乳鏈球菌0SV^^ococct^agfl/acrtae);和優(yōu)選是衣原體科，特別是肺炎衣原體如果所述微生物顯示多藥耐藥性的話，尤其適合使用本發(fā)明的肽。多藥耐藥性(即微生物對多種藥物特別是抗生素的抗性)是臨床實踐中的主要問題之一。因此，提供出新的可影響微生物的生長的藥劑是重要的。本發(fā)明的另一個方面涉及通過給予有效量的本發(fā)明肽或多肽或藥物組合物，來中和微生物的細菌成分、優(yōu)選細胞壁成分、更優(yōu)選脂多糖的生物活性的方法。本發(fā)明的肽和多肽顯示內(nèi)毒素中和活性。因此，這些物質(zhì)可應(yīng)用來結(jié)合細菌成分，特別是細胞壁成分，從而結(jié)合其生物活性。本發(fā)明的又一個方面涉及通過給予有效量的本發(fā)明肽或多肽或藥物組合物，來中和微生物的細菌成分、優(yōu)選細胞壁成分、更優(yōu)選脂多糖的生物活性，或者治療遭受微生物感染或敗血性休克的哺乳動物特別是人個體的方法。治療和預(yù)防有效量優(yōu)選為約0.5mg/kg至約100mg/kg體重，更優(yōu)選約1mg/kg至約20mg/kg，最優(yōu)選約2mg/kg至約10mg/kg。對于皮膚應(yīng)用，所述化合物可以以高得足夠快速殺滅目標(biāo)微生物的濃度(至少是MIC的10-100倍或者是100-1000g/ml)給予。對于腹膜內(nèi)應(yīng)用，治療范圍優(yōu)選為約7.5mg/kg至約75mg/kg。在與常規(guī)抗生素共給予的情況中，治療有效量減少10-100倍。本發(fā)明的另一個方面涉及制備具有N末端脯氨酸殘基的本發(fā)明肽的方法，所述方法包括以下步驟-提供包含編碼這樣的融合多肽或蛋白質(zhì)的核酸分子的宿主細胞，該融合多肽或蛋白質(zhì)包含具有N末端脯氨酸殘基的本發(fā)明肽，其中所述肽C末端融合于具有C末端天冬氨酸的所述多肽或蛋白質(zhì)，-表達和分離所述融合多肽或蛋白質(zhì)，陽使分離的融合多肽或蛋白質(zhì)經(jīng)受0.5-4之間的pH值(SkribanekZ.etal.,,尸eW.6W.8:398-406(2002))。在降低pH值的過程中，優(yōu)選地使該多肽或蛋白質(zhì)在例如90mMHC1中85°C下溫育1小時。所得的肽優(yōu)選通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，并任選通過質(zhì)譜分析進行鑒定和表征。本發(fā)明的另一個方面涉及從樣品吸附和除去或滅活細菌或細菌成分的方法，所述方法包括使所述樣品與固定化的本發(fā)明肽接觸的步驟?？蓪⒈景l(fā)明的抗微生物藥劑和內(nèi)毒素中和/結(jié)合藥劑應(yīng)用到合適材料的表面或者與合適材料混合，以產(chǎn)生抗微生物材料。這種抗微生物材料可以以珠粒、薄膜、板材、單纖絲、非織造織物、海綿狀物、布料、針織物、短纖維、管子、中空纖維等的各種形式使用。更具體的說，它可用于人工器官、導(dǎo)管、外科手術(shù)用縫合線(連接纖維)、透析膜等以及衛(wèi)生用品、抗微生物濾器等。所述裝置或植入物可用作包含固定化到不溶性載體的本發(fā)明肽的內(nèi)毒素清除劑。本發(fā)明的內(nèi)毒素清除劑是基于本發(fā)明肽的高內(nèi)毒素可結(jié)合性在吸附和除去內(nèi)毒素方面的應(yīng)用。出多種形式，例如膜(濾器型、中空型、管子型、平板膜型等)、顆粒、乳膠、芯片、粉末和微量培養(yǎng)板等形式。對不溶性載體的材料也沒有特別限制，可以舉出多種材料，例如聚苯乙烯材料、聚丙烯材料、聚酰胺材料、纖維素材料、瓊脂糖材料、聚丙烯酰胺材料、葡聚糖材料和乙烯基聚合物材料。對將本發(fā)明肽固定化到不溶性載體上的方法也沒有特別限制，本發(fā)明肽的固定化可通過采用被用作固定化酶的制備方法的一般方法來實現(xiàn)，如物理吸附方法、離子4建方法、共價鍵方法和包埋方法。將本發(fā)明肽進行物理固定化。又例如，由聚酰胺材料、纖維素材料、瓊脂糖材料、聚丙烯酰胺材料、葡聚糖材料或乙烯基聚合物材料制成的不溶性載體，可將本發(fā)明肽進行化學(xué)固定化。對于化學(xué)固定化(結(jié)合)方法，可以舉出例如重氮化方法，其中重氮偶聯(lián)是利用不溶性載體中的芳族氨基基團來進行；CNBr方法，其中肽鍵是通過用CNBr活化不溶性載體中的羥基基團來形成；?；B氮方法，其中肽鍵是用不溶性載體的肼衍生物來形成；烷基化方法，其中肽用不溶性載體中的反應(yīng)性官能團如鹵素進行烷基化；交聯(lián)方法，其中能與游離氨基基團反應(yīng)的交聯(lián)劑如戊二醛將不溶性載體和肽中的游離氨基基團交聯(lián)在一起；碳二亞胺方法；環(huán)氧活化方法；和其中鍵是采用上述方法之一通過間隔基(spacer)來形成的方法。根據(jù)用來鍵合本發(fā)明肽的不溶性載體的類型，可從這些已知方法中選擇出適當(dāng)?shù)姆椒?。使固定化有本發(fā)明肽的不溶性載體與需要從中除去內(nèi)毒素的溶液進行接觸，以形成溶液中的內(nèi)毒素與固定化有本發(fā)明肽的不溶性載體的復(fù)合物，然后將這樣形成的復(fù)合物除去，從而可將溶液中的內(nèi)毒素除去。對使固定化有本發(fā)明肽的不溶性載體與需要從中除去內(nèi)毒素的溶液進行接觸的方法沒有特別限制，可使用已知的固-液接觸方法。例如，可使用以下方法來獲得去除了內(nèi)毒素或類似物質(zhì)的溶液使溶液在濾器形狀的或中空纖維形狀的不溶性載體中通過或者從平板膜形狀的不溶性載體上通過的方法，使溶液從裝有粒狀不溶性載體的柱子中通過的方法，將溶液裝入^L量培養(yǎng)^1形狀的孔中并讓溶液靜止一定時間后將溶液分離的方法，將溶液加到任何形狀的不溶性載體上并振動或靜止一定時間后進行常規(guī)固-液分離(過濾、離心、抽吸、傾析等)的方法。對需要從中除去內(nèi)毒素的溶液沒有特別限制，其實例包括在藥物生產(chǎn)車間、醫(yī)療設(shè)備等中使用的溶液、更具體的說透析液、胃腸外注射液(parenteralfluid)、血液、藥品、超純水等，但不限于這些。本發(fā)明的一個方面是抗微生物化合物，即能抑制、防止或破壞微生物如細菌、真菌等的生長或增殖的化合物。這些化合物是本文給出的通式所示的肽或脂肽。肽，將細菌成分(優(yōu)選來自細胞壁，如內(nèi)毒素)的生物活性中和掉，來治療內(nèi)毒素血癥的方法。以下實施例和附圖是給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員作為指導(dǎo)來提供，并不意在以任何方式限制所提出權(quán)利要求的本發(fā)明的范圍。圖1顯示所選的肽(見肽代號)和多粘菌素(PMB)對圖中所示兩個大腸桿菌(E0/0株和宋內(nèi)氏志賀菌(57'^/&^朋d)的最小抑制濃度(MIC)和最小殺細菌濃度(MBC)。圖2顯示在加入確定量的所選肽時，新生霉素的最小抑制濃度的降低。圖3顯示所選的肽、多粘菌素B九肽(PMBN)和非透化肽(P3)的透化作用，該透化作用是通過由于N-苯基萘胺(NPN)分配入大腸桿菌細胞外膜中所致的熒光強度增加來測量的。圖右側(cè)的圖例所列的物質(zhì)的順序?qū)?yīng)于圖中各曲線在其終點的順序。圖4顯示在所選的肽的存在下，對LPS刺激的單核細胞TNF-a分泌的中和作用。圖5顯示在不同抗生素、多粘菌素B(PMB)和所選的肽(見肽代號)存在下，TNF-a的釋放情況。圖6顯示含有N-?；湹碾牡娜苎钚?。圖中標(biāo)出了加到2.5%人紅細胞的肽量。圖7顯示重組肽的切割產(chǎn)物的HPLC分離的色譜圖。保留時間為8.175分鐘的流分含有該肽。實施例實滋辨7,尉口/緣合A肽是按照標(biāo)準的Fmoc合成方案通過同步多重肽合成來進行合成的(Houghten，A/a,/.jcac/.Sc/.82:5131-5135(1985))。每種肽所用的樹脂分裝在聚丙烯網(wǎng)狀袋(meshpacket)中，這使得可以在共同的反應(yīng)容器中進行所有的共同合成步驟(即洗滌、脫保護和中和步驟)，而所需的偶聯(lián)步驟通過用單獨的適當(dāng)氨基酸溶液處理每個袋來進行。親脂性酸以與偶聯(lián)受保護的氨基酸時所用的策略類似的策略與N末端發(fā)生結(jié)合。賴氨酸和色氨酸的側(cè)鏈用tBoc基團保護，精氨酸的側(cè)鏈用五曱基苯并呋喃-5-磺?；鶊F保護，半胱氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的側(cè)鏈用三苯曱基保護，天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的側(cè)鏈用叔丁基保護。最終切割是通過用三氟乙酸處理來進行(Fiddsetal.,加.J.尸—t/e尸成L35:161-214(1990))。各肽的身份(identity)和純度通過與液相色譜系統(tǒng)(FinniganLCQ)聯(lián)用的質(zhì)譜分析和使用BeckmanSystemGoldHPLC的分析型反相高效液相色譜(RP-HPLC)來測定。肽和脂肽用帶有Foxy流分收集器的WatersMilliprep300制備型HPLC,通過制備型RP-HPLC進行純化。用乙酸(達95%)或乙腈(達50%)溶液使脂肽增溶以進行純化。試驗了每種肽和脂肽對以下一系列細菌的最小抑制濃度(MIC):大腸桿菌C&cAm'c/^aco/0ATCC25922、大腸桿菌DC2、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(《/^^6//o砂toca)ATCC8724、鮑曼不動桿菌(^c/w"oZflc^"6a謂aw'0CUN10817—01、綠脈軒菌(7^ew/麵owcwaen^'wwa)CUN4158—02、嗜麥芽窄食單胞菌OStewWra/^owomwwato;/7!'fl)CUN3998-00、流產(chǎn)布魯氏菌C^wce〃cr9.49per-、鼠疫耶爾森氏菌(Jera'm'a;Mto)KIMpYV-、大腸桿菌CUN2709-04、大腸桿菌CUN1786-04、宋內(nèi)氏志賀菌057^￡/^朋^)八丁(^25931、明尼蘇達沙門氏菌0Sa/wo"e〃am!'朋esota)HL63(S)、明尼蘇達沙門氏菌R60HL100(Ra)、明尼蘇達沙門氏菌R7HL44(Rdl)、明尼蘇達沙門氏菌R595HL111(Re)、5o油&〃fl6謂—邵ricc!CUN11844—99、萬on^函6ra"拜'，"'caRB50、流感嗜血桿菌(i/aewo/9/n7us/"y7we"加e)CUN6277-04、月畝月莫炎奈瑟氏菌(A^&en-amem7zg"zVfo)CUN6395-04、糞腸球菌CE""teracocc^/aecafo)ATCC29212、金黃色葡萄球菌(5"鄉(xiāng)/^。cocctwwrew力ATCC25923、無乳鏈球菌0SV一ococci^flgfl/Gcriae)CUN4783-03、糞腸球菌ATCC51299、金黃色葡萄球菌CUN3792-99、表皮葡萄球菌(6Va/7A;//ococciATCC12228、表皮葡萄球菌CUN5-93、肺炎鏈球菌CS"^^ococcw5p"eMmow^e)ATCC49619。將新近生長的細菌培養(yǎng)物接種和稀釋在MuellerHinton(MH)肉湯中，達l-5xl05CFU/ml的近似最終測定濃度。細菌懸浮液的活菌計數(shù)，是通過將培養(yǎng)物用MH肉湯稀釋并將100iil的適當(dāng)IO倍稀釋液接種到MH瓊脂平板上來測定。在37°C下溫育過夜后的MIC,是按照美國臨床實驗室標(biāo)準化委員會(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandard,NCCLS)的指導(dǎo)方針，通過肉湯微稀釋方法在96孔組織培養(yǎng)板中進行測定。因此，將100(il細菌懸浮液與100以肽或脂肽溶液在96孔平底板中的MH肉湯中混合，37°C下溫育過夜。在溫育之前和之后，測量每個孔的620nm吸光度。所有的肽和脂肽都從250昭/ml開始作系列兩倍稀釋，各稀釋液進行兩次重復(fù)試驗。將肽的活性與MH肉湯中的細胞(0%抑制)和單獨MH肉湯(100%抑制)或脂肽最低濃度。在每個測定中使用市售的抗生素作為標(biāo)準對照。最小殺細菌濃度(MBC)定義為殺滅99.9%的起始接種物的抗微生物藥劑最低濃度，按CLSI/NCCLS的推薦進行測定。簡單的說，從沒有檢測到生長的那些孔獲取100jil懸浮液，接種在MH板上。將板在37。C下溫育24小時(圖1)。裝遂奔丄'與#;貌^^;#的分、/^活'勝革蘭氏陰性細菌的外膜起到阻擋疏水性化合物的透性障的作用。為測量肽的透化活性，使用了兩種方法。這兩種測定法都基于這一點被肽透化的膜能讓疏水性物質(zhì)(NPN)進入脂質(zhì)雙層，讓新生霉素到達其內(nèi)部革巴標(biāo)(DNA促旋酶)。由于綠膿桿菌(尸.aemg&oM)4158-02(CUN)固有的較低滲透性，這些試驗是在這種細菌上進行。肽的透化活性，是根據(jù)已公布的棋盤滴定方法(checkerboardtitrationmethod)(LorianV.AntimicrobialsinlaboratoryMedicine",19964thed.pp.330-396,Williams和Wilkins，Baltimore,Md),通過將每種肽-新生霉素組合的MIC與單獨新生霉素的MIC進行比較來測量。為比較各肽的透化活性，測定了以下兩個指標(biāo)(i)分數(shù)抑制濃度(fmctionalinhibitoryconcentration,FIC)指標(biāo)4安以下方程式計算FIC指標(biāo)=(組合中試驗的新生霉素的MIC)/(單獨新生霉素的MIC)+(組合中的肽的MIC)/(單獨肽的MIC)。如果FIC指標(biāo)50.5,則相互作用定義為有協(xié)同性；(b)MIC-Drop定義為新生霉素在給定的肽不存在下和存在下的MIC的比例。一個組合當(dāng)其MIC-Drop匕4時認為具有協(xié)同性(圖2)。熒光實驗是按Loh和他的合作者的描述(1984.Antimicrob.AgentsChemother.26:546-55l)進行，但有一些改動。簡單的說，使細菌在LB肉湯中生長至對數(shù)期，用5mMHEPES緩沖液(pH7.2)洗滌，用0.1%的葡萄糖重懸于相同緩沖液中，至最終的600nm波長處的吸光度為0.5。熒光是在熒光計(LS-50,Perkin-Elmer)中用350nm激發(fā)波長和420nm發(fā)射波長于37。C下測量。將NPN以10的最終濃度加到懸浮液中，隨后將肽以50嗎/ml的最終濃度加入(圖3)。乳鐵蛋白肽衍生的肽對LPS誘導(dǎo)的人單核細胞激活的抑制，是用來自腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的粗糙型突變抹R60(Serovarminnesota)的LPSRa進行測量。將該脂多糖與各個肽(空心柱條，0.1pg/ml;實心柱條，1lig/ml)在37。C下溫育30分鐘，加到來自健康供體的剛分離細胞(最終濃度lng/mlLPS)。將單獨LPS誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)物上清液中TNF-a量用作未處理對照(圖4)。實^辨5:#被殺義勿霧#身^紐應(yīng)的》義教的井和#^細菌能被不同的抗生素殺滅，這些不同的抗生素靶向細菌存活所必需的不同分子。當(dāng)革蘭氏陰性細菌被殺滅時，所釋放的LPS能刺激細胞因子如TNF-a或其他促炎介體的產(chǎn)生。按以下方式對已確立的的化合物進行比較使細菌(大腸桿菌抹0:111)在LB培養(yǎng)基中生長至600nm吸光度為0.4,在具添加葡萄糖RPMI培養(yǎng)基中稀釋2500倍。加入不同濃度的抗生素或本發(fā)明肽并溫育過夜。將80pl的細胞懸浮液加到含有1()5個MonoMac6細胞的100fil中，15小時后，用ELISA試驗測定TNF-a向培養(yǎng)基的釋放。結(jié)果清楚表明，殺滅細菌細胞的氯霉素、青霉素和利福平導(dǎo)致了單核細胞受到高度刺激，而肽VS1-22和VS1-53顯著地抑制了TNF-a的釋放，與毒性脂肽多粘菌素B相似(圖5)。藏定屋的我樣#/^^者i癥V、虞漠藝小鼠能顯著抵抗LPS介導(dǎo)的敗血性休克。但是，小鼠對內(nèi)毒素的敏感性可通過共注射LPS和半乳糖胺來加強。給各有16-18只20-25g重量的雌性ICR-CD1小鼠的幾個實驗組腹膜內(nèi)注射200^的含有0,3嗎大腸桿菌LPS和18mg半乳糖胺的無熱原鹽水。之前的實驗得以確定出，這一組合在注射后48小時對90。/。的小鼠致死(LD9Q)。小鼠在這個攻擊(challenge)后立即在腹部不同部位接受第二次腹膜內(nèi)注射，注射液是在150^的10。/。DMF無熱原鹽水中溶解有150pg的肽。在所有的實驗中，有一組小鼠不進行處理，而另一組則接受150嗎的多粘菌素B。每日監(jiān)測小鼠的死亡率，直到攻擊后168小時為止。在我們的實驗條件下，多粘菌素B沒有賦予顯著的針對內(nèi)毒素休克的保護作用。滅定炎^在沖W鬼^^f在兔子(在對LPS活性的敏感性方面與人類非常接近的動物模型)中試驗了脂質(zhì)A所誘導(dǎo)的導(dǎo)致出血性皮膚壞死(經(jīng)典的Shwartzmann反應(yīng))的促炎細胞因子活性的原理，并將它與對脂質(zhì)A所誘導(dǎo)的導(dǎo)致凝血的LAL酶促級聯(lián)激活的抑制進行比較。因此，在新西蘭白兔的削了毛的背部區(qū)域，單獨注射明尼蘇達沙門氏菌(S.Re595脂質(zhì)A或者將該脂質(zhì)A與肽1:100(w/w)(5嗎于0.2ml鹽水緩沖液中；途徑同上)一起注射。注射后72-96小時，觀察兔子皮膚是存在開放性壞死(叩ennecrosis)還是該壞死^皮抑制。多粘菌素B(PmB)用作對照。表4:來自不同權(quán)利要求的顯示"體夕卜，，與"體內(nèi)，，試驗分析之間的正相關(guān)性的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>「疊i^ir(凝H^)夏H0,12—5—EU/mi#^早10pgAnlfr^IPS&MZ""as。toRe595;結(jié)果是用在不同日期制備的儲備溶液，通過LAL測定法，進行最少6個試驗，每個試驗重復(fù)進行三次而獲得的。2結(jié)果是在不同時間的實驗中，將選定的肽在最少3只兔子中進行最少3次皮膚注射而獲得的。32,2-DMB…2,2-二曱基丁?；?滋辨7:才嘑/乙^試一發(fā)肽對獲自肝素化人血液的紅細胞的溶血活性，由37。C溫育1小時后血紅蛋白的釋放來測定。血紅蛋白的總釋放(在414nm處測量的吸光度)通過加入TritonX-100(0.5%最終濃度)來實現(xiàn)。圖6中顯示了?；碾脑诟哂谄銶IC的濃度下(5-50倍，取決于肽和細菌種類)的數(shù)據(jù)。此外，選出顯示最高膜透化活性的肽，通過臺盼藍染料排斥試驗評估它們對人Hela細胞的毒性(Mishell，B.B.,和S.M.Shiigi.1980Selectedmethodsincellularimmunology.Freeman和Co.,SanFrancisco.14-17)。當(dāng)在100嗎/ml下試驗時，所有的肽(n二16)沒有顯示出對細胞排斥染料的能力的作用或所顯示出的該作用微不足道。實滋辨&'^這^應(yīng)的^化為純化重組蛋白質(zhì)，將得自l升培養(yǎng)液的細菌細胞沉淀重懸于20ml裂解緩沖液(IOmMTrispH=8.0，lmMEDTA,0.1%DOC)中，通過超聲處理進行^tt。將所得混合物在4。C下12，000rpm離心15分鐘，分離。將含有KSI-P2-33融合蛋白的不溶性包涵體部分，用20ml的含有10mMTrispH=8.0,lmMEDTA和0.1%DOC的洗滌緩沖液洗滌兩次，用10mMTrispH=8.0,lmMEDTA和2M尿素洗滌兩次，用20mMTrispH=8.0洗滌三次。將不溶性包涵體溶于10ml的6M胍-HC1中并離心，將可溶性上清液對2升去離子水進行透析，導(dǎo)致KSI-P2-33的沉淀。將融合蛋白(10mg)溶于10ml的90mMHCl中，所得混合物在85°C下混合2小時，以使融合蛋白與肽之間的天冬氨酰-脯氨酰鍵裂解。將酸性裂解所釋放的肽通過HPLC進行純化將反應(yīng)混合物干燥，溶于去離子水中，注射到C5RP-HPLC柱(Sephasil)上，用5%乙腈、5mMHC1至95%乙腈、5mMHC1的梯度進行洗脫。肽峰(圖7)通過280nm處的紫外吸光度進行檢測。肽的身份通過質(zhì)譜進行確定。豸滋辨:9:^7^定^成遽/,^戎微##^/定使用磷酸緩沖鹽水pH=7.5，使肽P2-32(500嗎)與氰尿酰氯活化的磁性顆粒(10mg)(Chemicell,Productnumber1314)共價連接。將所得懸浮液在搖動器上室溫下混合2小時后，加入封閉緩沖液(PBSpH=7.5和2%乙醇胺)，將懸浮液在搖動器上室溫下混合30分鐘。將顆粒物用PBS洗滌兩次。將固定化的肽對大腸桿菌(菌林0:111)進行試驗，該菌抹在LB培養(yǎng)基中生長至600nm吸光度達0.4,并在LB培養(yǎng)基中稀釋2500倍。加入不同濃度的固定化有肽的磁性顆粒，溫育過夜。結(jié)果是50、25和10mg/ml濃度的固定化磁性顆粒防止了細菌生長。表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>將新型隱球菌(C."eo/omw"力ATCC32045培養(yǎng)物在4°C下保持在酵母培養(yǎng)基(YM;DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)瓊脂平板上。在測定前，使培養(yǎng)物在瓊脂平板上生長并在26。C下溫育72小時。然后從這些新長出的真菌培養(yǎng)物中挑取兩個菌落接種在5ml的2XYM肉湯中，旋渦，在2XYM肉湯中稀釋10倍，達lxl05-5xl05CFU/ml的近似最終測定濃度。在96孔組織培養(yǎng)板中，將真菌2XYM肉湯懸浮液加到以1mg/ml至lpg/ml的濃度分配的肽，這些濃度是在無菌水中進行系列兩倍稀釋得到的。然后將板在26。C下溫育72小時。每個試驗樣品所觀察到的真菌相對生長百分數(shù)，是用TitertekMultiskanPlus儀器通過620nm光密度(OD620)進行測定。MIC定義為導(dǎo)致2%生長的試驗樣品最低濃度，IC50定義為導(dǎo)致50%生長抑制的試驗樣品濃度。IC50用S型曲線擬合軟件程序(Gr叩hpadPrism;ISISoftware,SanDiego,CA)來計算。所選的肽獲得的結(jié)果在表6中顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>權(quán)利要求1.下式所示的具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa1)M-(Xaa2)O-Xaa3-(Xaa4)P-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R-(Xaa8)S，其中Xaa1為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選選自精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)，Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp)，Xaa4選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，Xaa5選自異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，Xaa6選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，Xaa7為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)，和Xaa8選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)和絲氨酸(Ser)，且其中O為0，M為1或2，P為2或3，Q和R為1，和S為1、2、3或4。2.權(quán)利要求1的肽，其特征在于所述的式包含選自以下的氨基酸序列FWQRIRKVR(SEQIDNo.1)、FWQRRIRKVRR(SEQIDNo.2)、FWQRKIRKVRK(SEQIDNo,3)、FWQRNIR腿(SEQIDNo.4)、FWQ腿RKVR(SEQIDNo.5)、FWQRNIRVR(SEQIDNo.6)、FWQ腿RKVRR(SEQIDNo.7)、FWQ腿RKVKK(SEQIDNo.8)、FWQRNIRKVRRR(SEQIDNo.9)、FWQ腿RKVKKK(SEQIDNo.10)、FWQ謹RKVRRRR(SEQIDNo.11)、FWQRNIRKVRRRI(SEQIDNo.12)、FWQRNIRKVKKKK(SEQIDNo.13)、FWQRNIRKVKKKI(SEQIDNo.14)、FWQRNIRKIR(SEQIDNo.15)、FWQRNIRKLR(SEQIDNo.16)、FWQRNIRKWR(SEQIDNo.17)、FWQRNWRKVR(SEQIDNo.18)、FWQRNFRKVR(SEQIDNo.19)、FWQRNYRKVR(SEQIDNo.20)、FWQRNIRKVS(SEQIDNo.21)、FWQ腿RIRR(SEQIDNo.22)、FWQRPIRKVR(SEQIDNo.23)、FWQRRIRKWR(SEQIDNo.24)、FWQ固RRWRR(SEQIDNo.25)、FWPRNIRKVR(SEQIDNo.26)、FWARNIRKVR(SEQIDNo.27)、FWIRNIRKVR(SEQIDNo,28)、FWLRNIRKVR(SEQIDNo.29)、FWV腿RKVR(SEQIDNo.30)、FWQRNIFKVR(SEQIDNo.31)、FWQRMYKVR(SEQIDNo.32)、FAWQRNIRKVR(SEQIDNo.33)、FLWQRNIRKVR(SEQIDNo.35)和FVWQRNIRKVR(SEQIDNo.36)。3.下式所示的具有抗;微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa!)M-(Xaa2)。-Xaa3-(Xaa4)p-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R-(Xaa8)s，其中Xaa,為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自苯丙氨酸(Phe)和異亮氨酸(Ile),Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys),Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp),Xaa4選自甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)、異亮氨酸(Ile)和苯丙氨酸(Phe),Xaa5為異亮氨酸(Ile)或色氨酸(Trp),Xaa6為精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys)，Xaa為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)和纈氨酸(Val),和Xaas為精氨酸(Arg),且其中O為0，M為1或2,R為0或1，P為1、2或3，Q為1,和S為0、1或2。4.權(quán)利要求3的肽，其特征在于所述的式包含選自以下的氨基酸序列FWRIRKWR(SEQIDNo.37)、F戰(zhàn)IRKVR(SEQIDNo.38)、F皿WRR(SEQIDNo.39)、FWRR曹R(SEQIDNo.40)、FWRRW腿(SEQIDNo.41)、FWRG戰(zhàn)IRR(SEQIDNo.42)、F曹RFWRR(SEQIDNo.43)、FWRWR戰(zhàn)(SEQIDNo.44)、FWRI戰(zhàn)WR(SEQIDNo.45)、FWRI豐I曹(SEQIDNo.46)、FWRNIRKWR(SEQIDNo,47)和FWRRRIR腿(SEQIDNo.48)。5.下式所示的具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa!)M-(Xaa2)o-Xaa3-(Xaa4)p-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R-(Xaa8)s，其中Xaa,為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe),Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)，Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp),Xaa4選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)和異亮氨酸(Ile)，Xaa5選自異亮氨酸(Ile)和色氨酸(Trp),Xaa6選自精氨酸(Arg)和天冬氨酸(Asp)，Xaa為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)，和Xaas選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)和天冬氨酸(Asp)，且其中O和Q為0,M為0、1、2或3，R為1或2,P為1、2或3,和S為1、2或3。6.權(quán)利要求5的肽，其特征在于所述的式包含選自以下的氨基酸序列PFWRWRIWR(SEQIDNo.50)、PFWRIRIRR(SEQIDNo.51)、PF徵QR腿(SEQIDNo.52)、PFWRARIRR(SEQIDNo.53)、PFWRKRIRR(SEQIDNo.54)、PFWRKRLRR(SEQIDNo.55)、PF戰(zhàn)KRWRR(SEQIDNo.56)、PFWRRR職(SEQIDNo.57)、PFWRRR戰(zhàn)R(SEQIDNo.58)、PFWRIRIRRD(SEQIDNo.59)、PFFWRIRIRR(SEQIDNo.60)、P豐IRIRR(SEQIDNo.61)、PFWRRQ腿(SEQIDNo.81)、PFWRKKLKR(SEQIDNo.82)、PWRRIRR(SEQIDNo.83)、PWRRKIRR(SEQIDNo.84)和PF曹RIRIRR(SEQIDNo.85)。7.下式所示的具有抗孩i生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa0M-(Xaa2)o-Xaa3-(Xaa4)p-(Xaa5)Q-(Xaa6)M-(Xaa7)R陽(Xaas)s,其中Xaa,為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe),Xaa2為堿性氨基酸，優(yōu)選精氨酸(Arg)，Xaa3為疏水性氨基酸，優(yōu)選色氨酸(Trp)，Xaa4選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)和賴氨酸(Lys),Xaa5選自異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp),Xaa6選自谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)和天冬酰胺(Asn),Xaa7為疏水性氨基酸，優(yōu)選選自異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe),和Xaas為精氨酸(Arg),且其中M為0、1、2或3,O為0或1,P為1、2或3，Q為1或2，和R和S為0、l或2。8.權(quán)利要求7的肽，其特征在于所述的式包含選自以下的氨基酸序列FWRNIRIRR(SEQIDNo.72)、FWQRIRIRR(SEQIDNo.73)、F曹WRI曹(SEQIDNo.74)、F曹IRIRR(SEQIDNo.75)、FWRNIRIWRR(SEQIDNo，76)和FwRNIRIRR(SEQIDNo.77)。9.一種具有抗^L生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽，所述肽的式中包含選自以下的氨基酸序列62)、RFWQRNIRKYR(SEQIDNo.63)、PFWQ腿RKWR(SEQIDNo.64)、RFRWQ腿RKYRR(SEQIDNo.65)、RWKRINRQWF(SEQIDNo.66)、KRFCFKK(SEQIDNo.67)、KRFSFKKC(SEQIDNo.68)、KRWSWKK(SEQIDNo,69)、FRFSFKK(SEQIDNo.70)、RRFWFRR(SEQIDNo.71)、RFWQRNIRIRR(SEQIDNo.78)、RWQRNIRIRR(SEQIDNo.79)和RRWFWRR(SEQIDNo.86)。10.—種具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽，所述肽具有以下所示的式FIWQRNIRKVR(SEQIDNo.34)、FIWRWRWR(SEQIDNo.49)和RRIR腿QWF(SEQIDNo.80)。11.權(quán)利要求1-10中任一項的肽，其特征在于其C末端優(yōu)選包含選自N-曱基酰胺基基團或羧基基團的基團，或者選自酰胺基團、酉旨、醚或酮的基團，優(yōu)選包含1-120個碳原子，更優(yōu)選1-10個碳原子，特別是包含N-曱基酰胺基基團。12.權(quán)利要求1-11中任一項的肽，其特征在于?；鶊F與肽的N末端或C末端結(jié)合。13.權(quán)利要求12的肽，其特征在于所述?；鶊F是選自C2-C20的飽和和不飽和的直鏈和支鏈?；?連、芐基》f生物和F-moc的疏水《連。14.權(quán)利要求12或13的肽，其特征在于所述?；鶊F選自十二碳?；鶊F、癸?；鶊F、辛?；鶊F、己?；鶊F、2-甲基己?；鶊F、2-乙基己?；鶊F、2-丙基戊?；鶊F、2-丁基辛?；鶊F、，2,2-二曱基丁?；鶊F、2-曱基戊?；鶊F、3-甲基戊?；鶊F、4-甲基戊?；鶊F、6-曱基辛?；鶊F、千基基團和二環(huán)己基乙?；鶊F。15.—種包含權(quán)利要求1-14中任一項的肽的多肽。16.—種包含權(quán)利要求1-15中任一項的肽或多肽的藥物組合物。17.權(quán)利要求16的組合物，所述組合物包含至少一種另外的抗微生物藥劑或抗敗血癥藥劑。18.權(quán)利要求16或17的組合物，所述組合物還包含藥物可接受的賦形劑。19.權(quán)利要求1-15中任一項的肽或多肽作為抗微生物藥劑、作為內(nèi)毒素中和藥劑或作為抗真菌藥劑的用途。20.權(quán)利要求1-15中任一項的肽或多肽用于制備用以治療或預(yù)防由微生物優(yōu)選由細菌和/或真菌引起的感染或優(yōu)選由內(nèi)毒素引起的敗血癥或敗血性休克的藥物的用途。21.權(quán)利要求20的用途，其特征在于所述藥物還包含至少一種另外的抗微生物藥劑或抗敗血癥藥劑。22.權(quán)利要求20或21的用途，其特征在于所述藥物還包含藥物可接受的賦形劑。23.—種抑制至少一種微生物的生長的方法，所述方法包括使所述微生物與有效量的權(quán)利要求1-15中任一項的肽或多肽接觸的步驟。24.權(quán)利要求23的方法，其特征在于所述微生物是革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。25.權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于所述要進行接觸的微生物，優(yōu)選是腸桿菌科，特別是大腸桿菌C&cAen'cWaco/0、沙門氏菌屬中的細菌(&z/wowe〃")、鼠疫耶爾森氏菌(Jera纟m'apesto)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Jerafm'aewteraco/Wca)或克雷伯氏菌屬中的細菌(7efo/e//a5;9p.);優(yōu)選是假單胞菌科，特別是綠膿桿菌CRyewdomo"ayflen^'"o犯)；優(yōu)選是產(chǎn)堿菌科，特別是支氣管敗血波氏桿菌(丑on^e〃aZ^owc/^e/rica)或百日咳波氏桿菌C5oniete〃ape廠似^&);優(yōu)選是布魯氏菌科，特別是流產(chǎn)布魯氏菌(5n/cetoak^w力；優(yōu)選是莫拉氏菌科，特別是鮑曼不動桿菌(J"'""oZ^cfe/^mwwm'/);優(yōu)選是黃單胞菌科，特別是嗜麥芽窄食單月包菌GSVe"WTO/^omowosma/top/n7z'a);巴斯德氏菌科，特別是流感嗜血桿菌(//<^附0/7/7^/"/^"^6);優(yōu)選是奈瑟氏菌科，特別是腦膜炎奈瑟氏菌(A^werz'amem'"g/"fifa);優(yōu)選是葡萄球菌科，特另'J是金黃色葡萄球菌(AS鄉(xiāng)/^/ococcMSflwre—或表皮葡萄球菌(5Va//^/ococcMSe;,c/er附/flfe1);4尤選是腸3求菌牙+，凈爭另'j是糞腸J求菌(五"teracocc船/aecflfc);優(yōu)選是鏈球菌科，特別是無乳鏈球菌(5V";tococc船aga/ac"ae);和優(yōu)選是衣原體科，特別是肺炎衣原體26.權(quán)利要求23-25中任一項的方法，其特征在于所述微生物顯示多藥耐藥性。27.—種通過給予有效量的權(quán)利要求1-15中任一項的肽或多肽或者權(quán)利要求16或18的藥物組合物，來中和微生物的細菌成分、優(yōu)選細胞壁成分、更優(yōu)選脂多糖的生物活性的方法。28.—種通過給予有效量的權(quán)利要求1-15中任一項的肽或多肽或者權(quán)利要求16或18的藥物組合物，來中和微生物的細菌成分、優(yōu)選細胞壁成分、更優(yōu)選脂多糖的生物活性，或者治療遭受微生物感染或敗血性休克的哺乳動物特別是人個體的方法。29.—種制備具有N末端脯氨酸殘基的權(quán)利要求1-14中任一項的肽的方法，所述方法包括以下步驟-提供包含編碼這樣的融合多肽或蛋白質(zhì)的核酸分子的宿主細胞，該融合多肽或蛋白質(zhì)包含具有N末端脯氨酸殘基的權(quán)利要求1-14中任一項的肽，其中所述肽C末端融合于具有C末端天冬氨酸的所述多肽或蛋白質(zhì)，-表達和分離所述融合多肽或蛋白質(zhì)，-使分離的融合多肽或蛋白質(zhì)經(jīng)受0.5-4之間的pH值。30.—種A^樣品吸附和除去或滅活細菌或細菌成分的方法，所述方法包括使所述樣品與固定化的權(quán)利要求1-14中任一項的肽接觸的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及以下通式所示的具有抗微生物活性或內(nèi)毒素中和活性的肽(Xaa<sub>1</sub>)<sub>M</sub>-(Xaa<sub>2</sub>)<sub>O</sub>-Xaa<sub>3</sub>-(Xaa<sub>4</sub>)<sub>P</sub>-(Xaa<sub>5</sub>)<sub>Q</sub>-(Xaa<sub>6</sub>)<sub>M</sub>-(Xaa<sub>7</sub>)<sub>R</sub>-(Xaa<sub>8</sub>)<sub>S</sub>。文檔編號A61K38/03GK101528248SQ200780033567公開日2009年9月9日申請日期2007年7月10日優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日發(fā)明者A·馬杰爾,B·賈佩爾,D·茲韋蒂克,G·多伊奇,G·馬蒂納茨德特賈達德,I·M·尤里亞,J·L·利昂,J·安德拉,K·布蘭登伯格,K·洛納,M·佐科,M·波羅,P·普里斯托夫塞克,R·杰拉拉,S·E·布朗德爾申請人:奧地利科學(xué)院