專(zhuān)利名稱(chēng)：：制備抗糖抗原的特異性抗體的方法制備抗糖抗原的特異性抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明用途于免疫診斷和免疫治療領(lǐng)域，且更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于制備抗胂瘤相關(guān)糖類(lèi)抗原的抗體的化合物。背景已知糖類(lèi)在幾個(gè)生物和生理通路中起重要作用。事實(shí)上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們促成蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或?qū)到獾目剐?，促成胞?nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)和將糖蛋白靶向至膜或細(xì)胞器，并且涉及免疫識(shí)別[作為一般參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Varki,A.;67，6/'o7柳1993,3，97130，Bertozzi,C丄，Kiessling,L丄；5We"ce2001，291，2357-64，Angeloni，S.;67,co6/o7柳2005，15(1)，31-41〗。除此之外，幾項(xiàng)研究和研究計(jì)劃發(fā)現(xiàn)糖類(lèi)及其衍生物，例如聚糖也參與某些細(xì)胞的腫瘤性修飾。事實(shí)上[如以下文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的Hakomori，S.;Chapter4//7Montreuil，J.，VIiegenthart,J.F.G.，Schachter，H.(editors)Glycoproteinsanddisease.Elsevier,Amsterdam,1996或者KobataA.;Cancercellsandmetastasis.Chapter3/"Montreuil,J.，VIiegenthart,J.F.G.,Schachter,H.(editors)67ycoprofe//sa/7f/d/sease.Elsevier,Amsterdam,1996或Kumamoto等A/oc力e邊/ca/"/opA/s/ca/AesearcACo邁/Bii刀/ca^.o/JS1998,247，514—7或Hakomori,S.;PA^S2002，"(l6)，10231-33],已經(jīng)觀察到已知存在于細(xì)胞膜上的聚糖通常表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)修飾，例如在癌細(xì)胞膜中比在正常細(xì)胞膜中高度支化。同樣，除任何結(jié)構(gòu)修飾外，就正常細(xì)胞而言還觀察到在膜糖類(lèi)中組成上的改變。作為在腫瘤形成過(guò)程中起作用的糖部分的額外實(shí)例，例如唾液酸(參見(jiàn)TheMerckIndex;XIIIEd.;No.8558),即作為神經(jīng)氨酸相5關(guān)化合物成員的9-碳原子氨基糖。事實(shí)上已經(jīng)觀察到某些腫瘤形式的高度轉(zhuǎn)移活性可能與細(xì)胞膜中唾液酸的濃度增加十分相關(guān)，由此產(chǎn)生了轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中胞外基質(zhì)細(xì)胞的粘附能力下降(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Varki,A.等細(xì)e/〃a/so/"^/coWo/og/.Co/d〃flr6wZa6or"or/,ress，Co/d5^r//7g〃ar6or,/arir1999)。另外，例如如Sames，D.等在胞&re1997，389，587-91或Dwek，M.V.等("/'//caC//邊/'ca1998，271,191-202)或Burchel1等("7/co6/o/og/1999，9(12)，1307-ll)或Taylor-Papadimitriou等Woc嵐腸;一1999，1455,301-13)或Hanisch等(67/co6/o/o^r2000，10(5)，439-49)或Schuman,J.等(67ycoco/2乂i^"e/owvs/2000，17，835-48)所報(bào)導(dǎo)的，在復(fù)雜的糖化合物內(nèi)，高度糖基化的糖蛋白類(lèi)改變的MUC1似乎促成了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，所述MUC1顯示出大量O-糖殘基并且在上皮表面提供保護(hù)層且參與細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)移(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)ParryS，SilverraanHS等,Biochem.Biophys.Res.Commun.2001;11;283(3):715-20)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量分子改變與腫瘤的每單個(gè)發(fā)育或進(jìn)展期相關(guān)，但是它們之間的確切關(guān)系尚不完全了解。作為肺瘤的特征，在糖類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的表型改變一般稱(chēng)作腫瘤相關(guān)糖類(lèi)抗原(下文縮寫(xiě)為T(mén)ACAs)。在最廣泛已知的TACAs中，有分別常稱(chēng)作TF和Tn的表位Gal-P-1—3-GalNAc-ot-O.Ser/Thr和GalNAc-a-0.Ser/Thr(參見(jiàn)下文的化學(xué)結(jié)構(gòu))。TF抗原(Gal_P-l一3-GalNAc-a-0.Ser/Thr)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>Tn抗原(GalNAc-cc-O.Ser/Thr)由上文報(bào)導(dǎo)的式中，Tn免疫決定簇基團(tuán)是與絲氨酸或蘇氨酸羥基a連接的GalNAc殘基，它在糖蛋白的氨基-末端區(qū)中出現(xiàn)。由此通過(guò)酶P-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用形成Ga卜p-1—3-GalNAc-ot-0.Ser/Thr(TF抗原)，其中取自Gal-核苷酸的半乳糖殘基添加到Tn殘基上。已經(jīng)研究了在正常組織中出現(xiàn)的這些抗原以便驗(yàn)證它們對(duì)病理性組織的特異性(例如，參見(jiàn)Cao，Histochem.CellBiol.1996，106，197-207)。此外，發(fā)現(xiàn)TF和Tn抗原以免疫反應(yīng)形式在約90°/。癌組織中過(guò)表達(dá)至顯著程度(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Springer,G.F.;&/e/7ce1984，224,1198-206)并且其在人癌中的相對(duì)比例經(jīng)常與癌本身的攻擊性相關(guān)。幾項(xiàng)研究的結(jié)果也提示在轉(zhuǎn)移過(guò)程的早期，TF和Tn抗原在腫瘤細(xì)胞與相鄰正常細(xì)胞之間的粘附現(xiàn)象中起關(guān)鍵作用(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Kischikawa等在Jpn.J.CancerRes.1999，90，326-32中所述)。在癌細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)的糖類(lèi)抗原的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，且由此TF和Tn的分離和結(jié)構(gòu)鑒定代表了研發(fā)肺瘤性疾病的治療和診斷策略的第一步基于糖類(lèi)的免疫治療和免疫診斷(例如，參見(jiàn)Allen在J.Am.Chem.Soc.，2001，123,1890-7中所述)。本領(lǐng)域中眾所周知免疫治療涉及刺激抗有害物的天然身體防御，即免疫系統(tǒng)，所述的有害物諸如微生物、污染物質(zhì)、化學(xué)制品、食品等。因此，設(shè)想特征在于在其膜上的TACAs表達(dá)改變的癌細(xì)胞可以代表人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)的靶標(biāo)。發(fā)現(xiàn)通過(guò)合適的腫瘤抗原，諸如，例如Tn或TF抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激可以成為抗腫瘤的富有希望的治療工具。Toyokuni等(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Bioorg.Med.Chem.1994,2，119-32)描述了通過(guò)使用進(jìn)一步與綿羊血清白蛋白，Starbust⑧樹(shù)狀聚體和三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰基絲氨酸(P3CS)綴合的一聚化、二聚化和三聚化Tn抗原制備完全合成的糖類(lèi)疫苗。Lo-Man等(例如，參見(jiàn)J.Immunol.2001，166，2849-54)披露了開(kāi)發(fā)完全合成的免疫原，它稱(chēng)作多抗原糖肽并且基于具有四個(gè)臂的樹(shù)狀聚體賴(lài)氨酸核。Kuduk等(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)J.Am.Chem.Soc.1998，120,12474-12485)描述了KLH、BSA和脂肽(pam)在Tn和TF抗原群集化中的用途，而Dziadek等(Angew.Cem.Int.Ed.2005，44,7624-7630)披露了制備包含TACAs和BSA和MUC1肽的化合物的類(lèi)似方法。Kagan等(作為參考文獻(xiàn)參見(jiàn)CancerImmunol.I咖unother.2005，54，424-430)描述了對(duì)幾種Tn綴合物的試驗(yàn)Tn單糖，在三元蘇氨酸骨架上制備的Tn(c)和在部分或完全糖基化MUCl骨架上制備的Tn。然而，上述報(bào)導(dǎo)的綴合的化合物的主要局限在于當(dāng)作為疫苗使用時(shí)，它們導(dǎo)致產(chǎn)生的所需抗體量極少，此外，最終回收了其非特異性混合物(例如,參見(jiàn)Grigalevicius等，BioconjugateChemistry,2005，16,1149-1159)。我們目前發(fā)現(xiàn)了TF和Tn抗原的新的綴合的化合物，其可以用作抗腫瘤治療中的疫苗。此外，本發(fā)明的綴合的化合物能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中TACAs綴合的化合物的上述缺陷。本發(fā)明的描述因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于包含直接或通過(guò)任意合適的連接體綴合至多聚體支架的多個(gè)Tn或TF抗原的化合物，所述的多聚體支架選自陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸鹽或葡聚糖。在本說(shuō)明書(shū)中，并且除非另作陳述，否則我們將術(shù)語(yǔ)多聚體支架指定為任意上述支架，如具有多聚體結(jié)構(gòu)的cBSA、藻酸鹽或葡聚糖。在本發(fā)明范圍內(nèi)的多聚體支架中，有牛血清白蛋白(BSA),即高度免疫原性的蛋白質(zhì)，它可以通過(guò)在天冬氨酸或谷氨酸殘基上引入烷氨基而進(jìn)一步被修飾，由此獲得陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)。根據(jù)8本發(fā)明，cBSA的分子量約包括約65-約77Kda。有關(guān)cBSA及其制備的一般參考文獻(xiàn)例如參見(jiàn)Domen等，J,Immunol.1987，139，(10)，3195-8。藻酸鹽是不同分子量的多糖鏈混合物(作為實(shí)例，參見(jiàn)TheMerckIndex,XIIIEd.，No.239)。一般而言，根據(jù)本發(fā)明，藻酸鹽的分子量是約130，000-約170,000，且更優(yōu)選約140，000-約160，000。最終，就有關(guān)葡聚糖的一般參考文獻(xiàn)例如參見(jiàn)TheMerckIndex,XIIIEd.，No.2965。本發(fā)明優(yōu)選的綴合的化合物包含cBSA和藻酸鹽，且甚至更優(yōu)選它們包含cBSA。如上所述，上述多聚體支架直接(通過(guò)共價(jià)鍵)或通過(guò)合適的連接體與多個(gè)Tn或TF抗原綴合。連接體的合適的實(shí)例包括直鏈或支鏈的、合成或天然的氨基酸及其衍生物，包括，例如合適的肽或糖類(lèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)的其它類(lèi)似的連接體。更優(yōu)選所述的氨基酸或肽包含2-約10個(gè)碳原子。然而，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述綴合的化合物包含直接與選擇的支架連接的上述抗原。只要涉及Tn和TF抗原，其結(jié)構(gòu)式已經(jīng)在上文中報(bào)導(dǎo)，那么它們就通過(guò)曱酰氨基鍵(carboxamidobond)，即任意的其氨基或羧基與剩余部分(例如支架)連接。除非另作陳述，否則我們將術(shù)語(yǔ)"多個(gè)Tn或TF抗原"指定為超過(guò)一個(gè)所述抗原直接或通過(guò)合適的連接體與多聚體支架連接。一般而言，在本發(fā)明的綴合的化合物中，與多聚體支持物連接的抗原數(shù)量可以根據(jù)構(gòu)成多聚體支架自身并且具有合適的反應(yīng)功能基團(tuán)(例如氨基，羧基)的單體單元的數(shù)量，以及適合于合成所述綴合的化合物的操作實(shí)驗(yàn)條件而變化很大。特別地，就包含cBSA的本發(fā)明的綴合的化合物的情況，Tn或TF抗原的約5-約30個(gè)部分，例如Tn或TF抗原的約10-約20個(gè)部分可以與每一cBSA分子連接。同樣，就包含藻酸鹽的本發(fā)明的綴合的化合物的情況，Tn或TF抗原的約200-約250個(gè)部分，例如Tn或TF抗原的約220-約230個(gè)部分可以與每一藻酸鹽分子連接。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包含與多個(gè)Tn抗原直接連接的cBSA的綴合的化合物。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包含與多個(gè)Tn抗原直接連接的藻酸鹽的綴合的化合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的提供了制備上述報(bào)導(dǎo)的綴合的化合物的方法，該方法包括下列步驟1)將多聚體支架中的任意一種溶于合適的緩沖水溶液；2)向步驟(l)的溶液中加入縮合試劑和適量的選擇的Tn或TF抗原，其各自在有縮合試劑存在下任選地連接至合適的連接體；和3)混合并且攪拌由步驟(2)得到的溶液以合適的時(shí)間段，并且回收獲得的產(chǎn)物。上述方法及其任意的變化形式如每個(gè)步驟(1)中所述在合適的緩沖水溶液中進(jìn)行，諸如2-嗎啉-乙磺酸(MES);合適的濃度為，例如25mM，而合適的pH包括約4.5-約7，優(yōu)選6.5。只要涉及步驟(2)，選擇的抗原的量為能夠使所述抗原和所述的支架按照預(yù)定摩爾比反應(yīng)的量，從而獲得本發(fā)明的目的綴合的化合物。上述反應(yīng)在有任意合適的通常適合于形成甲酰氨基鍵的縮合試劑存在下進(jìn)行。優(yōu)選所述的縮合試劑為單獨(dú)或與l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的組合的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。上述縮合試劑優(yōu)選以輕微化學(xué)計(jì)算過(guò)量的量使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員從上文中可以清楚地看到，連接體無(wú)論何時(shí)存在，在與支架進(jìn)行偶聯(lián)前均已經(jīng)與選擇的抗原鍵合(例如連接)，或備選地，它可以首先與支架鍵合(例如連接)，使得產(chǎn)生的中間體化合物隨后與選擇的抗原偶聯(lián)。在這方面，這些可選擇的變化形式均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，因?yàn)榭乖椭Ъ鼙旧砘蛲ㄟ^(guò)任意合適的連接體偶聯(lián)，其中通過(guò)形成曱酰氨基鍵，例如-CONH-或-NHCO-,所以本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚任選存在于抗原、支架乃至連接體自身中任一上并且易于在上述操作條件下反應(yīng)生成不需要的副產(chǎn)物的任意其它反應(yīng)基團(tuán)需要按照眾所周知的方法適當(dāng)保護(hù)/脫保護(hù)。根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)中終產(chǎn)物的回收通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行，包括，例如透析和凍干。在該方法和其任意變化形式中，反應(yīng)劑以及任意的起始原料，包括各自任選與連接體偶聯(lián)的選擇的抗原和支架，并且所述連接體自身均為公知的化合物或可以按照本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備它們。按照公知方法測(cè)定本發(fā)明化合物的取代程度，即與每一支架連接的Tn或TF抗原殘基的數(shù)量。作為實(shí)例，通過(guò)4吏用來(lái)自支頂孢屬(Jcre邁o//"iZ7s/7.)的酶oc-N-乙?；肴樘擒彰?，按照該酶制造商[Seikagaku(Tokyo,Japan)]提示的實(shí)驗(yàn)條件，通過(guò)酶促反應(yīng)測(cè)定包含cBSA的本發(fā)明化合物的取代程度。更具體地說(shuō)，例如，就Tn抗原而言，通過(guò)在pH4.5和37°C下，將0.25ml含Tn抗原與0.05ml酶(具有約13U/ml的活性)的底物混合物在檸檬酸鹽緩沖液中孵育2小時(shí)進(jìn)行水解。然后通過(guò)添加pH9.8的0.2M硼酸鹽緩沖液使反應(yīng)猝滅。通過(guò)如材料和方法部分中進(jìn)一步描述的毛細(xì)管電泳法對(duì)來(lái)自Tn抗原的所得糖殘基，即N-乙酰半乳糖胺(GalNac)進(jìn)行定量。由此通過(guò)對(duì)綴合的化合物的凍干樣品進(jìn)行的自動(dòng)化元素分析測(cè)定包含藻酸鹽或葡聚糖的本發(fā)明化合物的取代程度。然后將取代程度的測(cè)定結(jié)果(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分的實(shí)施例3和4)，即與每一支架連接的Tn或TF抗原殘基的數(shù)量表示為部分百分比。因此，例如藻酸鹽的15%取代程度表示100個(gè)重復(fù)單糖單元中有15個(gè)與Tn或TF抗原的一個(gè)分子連接。如上所述，本發(fā)明的綴合的化合物可以應(yīng)用于治療和預(yù)防，且更具體地說(shuō)，它們可以用作抗腫瘤的疫苗。ii因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于藥物組合物，其包含綴合的化合物，其中多個(gè)Tn或TF抗原直接或通過(guò)任意合適的連接體與選自陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸鹽或葡聚糖的多聚體支架連接；和就一般制藥實(shí)施而言藥學(xué)上可接受的賦形劑，包括溶劑、栽體、緩沖劑、穩(wěn)定劑等。一般而言，在本發(fā)明的藥物組合物中可以適當(dāng)包括任意合適的賦形劑，其制備可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的一般方法進(jìn)行。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于包含直接或通過(guò)合適的連接體與選自陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸鹽或葡聚糖的多聚體支架綴合的多個(gè)Tn或TF抗原的化合物，其用于治療或預(yù)防。另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療或預(yù)防腫瘤的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予適量的本發(fā)明的綴合的化合物，其中多個(gè)TF或Tn抗原直接或通過(guò)任意合適的連接體與選自陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸鹽或葡聚糖的多聚體支架連接，或其任意的藥物組合物。就想要目的而言，適量的本發(fā)明的綴合的化合物是一般用于包括給予抗原及其衍生物的治療或預(yù)防目的的那些，并且可以按照選擇的合適的治療方案確定。另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于包含直接或通過(guò)合適的連接體與選自陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸鹽或葡聚糖的多聚體支架綴合的多個(gè)Tn或TF抗原的化合物在制備用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物或疫苗中的用途。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的綴合的化合物還可以用于制備抗Tn或TF抗原的特異性抗體。一般而言，可以通過(guò)在生產(chǎn)單克隆抗體中應(yīng)用的眾所周知的方法制備上述抗體(下文稱(chēng)作mAbs)。為了本發(fā)明的目的，使用動(dòng)物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)包括僅用于產(chǎn)生mAbs的正常小鼠。按照國(guó)家管理?xiàng)l例建立的動(dòng)物管理標(biāo)準(zhǔn)將它們圏養(yǎng)在動(dòng)物設(shè)施中，并且按照個(gè)別研究所的指南按照批準(zhǔn)的認(rèn)可方案飼養(yǎng)。他們也由獸醫(yī)定期檢查并且在認(rèn)可的動(dòng)物設(shè)施中由合格的動(dòng)物管理員處理。就有關(guān)單克隆抗體制備的一般參考文獻(xiàn)而言，例如，參見(jiàn)K6hler,G.，Milstein,C.;/Va&i*e1975,256,495-7。作為實(shí)例，請(qǐng)求保護(hù)的制備指定抗體的方法由此可以包括下列步驟1)BALB/c小鼠免疫接種；2)處死動(dòng)物并且切除脾；3)通過(guò)體細(xì)胞雜交(融合)使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞永生化；4)在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交細(xì)胞；5)通過(guò)ELISA測(cè)定進(jìn)行篩選以便獲得最具特異性的克??；和6)亞克隆。步驟(1)的免疫接種通過(guò)注射本發(fā)明的綴合的化合物進(jìn)行。優(yōu)選該綴合的化合物為其中多個(gè)Tn抗原直接與cBSA連接的化合物。按照公知方法進(jìn)行步驟2)，3)，4)和6)。具體而言，根據(jù)本發(fā)明，只要步驟涉及(5)，那么酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(更好地稱(chēng)作ELISA)包括在固定相上使用選擇的Tn或TF抗原，相當(dāng)于用于免疫接種的Tn或TF抗原在與本發(fā)明的支架綴合時(shí)，被適當(dāng)固定。更具體地說(shuō)，所述多聚體支架為生物素化的多聚體支架，使得它可以通過(guò)鏈霉抗生物素蛋白/生物素鍵連接/固定在固相支持物上。ELISA為用于檢測(cè)和定量物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、抗體和激素的測(cè)定法。ELISA的第一步需要將特異性抗原固定在ELISA平板上；然后將含本發(fā)明的待選擇的抗體的樣品加入到固相中，并且進(jìn)行孵育使得固定化抗原與互補(bǔ)抗體之間可以形成復(fù)合物。然后進(jìn)行洗滌以便除去未結(jié)合的物質(zhì)。另一個(gè)步驟包括加入針對(duì)已形成的復(fù)合物并且與合適的酶連接的第二抗體[最常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)]。最終，作為一個(gè)實(shí)例，隨后添加合適的色原導(dǎo)致顏色強(qiáng)度變化，這由與固定化抗原結(jié)合的抗體的數(shù)量來(lái)決定，并且只要后者變化，那么就可以對(duì)存在于樣品中的抗體量進(jìn)行評(píng)估。就本發(fā)明ELISA技術(shù)的一般參考，參見(jiàn)下文的實(shí)驗(yàn)部分。我們特別觀察到，為了ELISA,將所選擇的抗原固定在固相上可以通過(guò)固定本發(fā)明生物素化的綴合的化合物來(lái)便利地進(jìn)行。在這方面，已證實(shí)抗原-生物素化的藻酸鹽綴合物的固定在檢測(cè)來(lái)源于本發(fā)明任意綴合的化合物自身接種的抗體中特別具有選擇性。換句話說(shuō)，當(dāng)免疫接種和抗體制備遵循對(duì)小鼠適當(dāng)接種本發(fā)明的選擇的綴合的化合物時(shí)，例如在Tn與cBSA之間綴合，ELISA試驗(yàn)可以通過(guò)將含由此產(chǎn)生的抗體的樣品添加到含本發(fā)明的生物素化的綴合的化合物,優(yōu)選與相同TACA，即Tn抗原的生物素化的藻酸鹽綴合物的固相中來(lái)便利地進(jìn)行。從上文中，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚當(dāng)涉及TF抗原及其綴合的化合物時(shí)可以應(yīng)用類(lèi)似的考慮。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于包含直接或通過(guò)任意合適的連接體與生物素化的多聚體支架綴合的多個(gè)Tn或TF抗原的化合物，所述的生物素化的多聚體支架選自生物素化的藻酸鹽、生物素化的陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(生物素化的cBSA)或生物素化的葡聚糖。優(yōu)選生物素化的多聚體支架為生物素化的藻酸鹽。在這方面，如上所述定義cBSA、藻酸鹽和葡聚糖。同樣，與本發(fā)明的生物素化的支架連接的Tn或TF抗原數(shù)量如上所述。生物素(參見(jiàn)TheMerckIndex,XIIIEd.,No.1231)為已知在與蛋白質(zhì)或多肽的羧化反應(yīng)中起作用的天然的生長(zhǎng)因子。當(dāng)生物素選擇性結(jié)合尤其是用于體外制備固體床的鏈霉抗生物素蛋白時(shí)，在分離和純化技術(shù)中生物素可以與待固定在所述固相上的分子有用地連接。在生物素衍生物中，N-(+)-生物素基-L-賴(lài)氨酸酰肼可以有用地用于使多聚體支架生物素化。具體地，其為具有如下所示化學(xué)式的商購(gòu)化合物14N-s-(+)-生物素基-L-賴(lài)氨酸酰肼生物素與多聚體，即cBSA、藻酸鹽或葡聚糖的連接通過(guò)這些多聚體化合物的任意羧基隨機(jī)進(jìn)行。就本發(fā)明的綴合的化合物的制備而言，其中所述多聚體支架為生物素化的多聚體支架，所述方法包括下列步驟1)將所述多聚體支架中的任意一種溶于合適的緩沖水溶液；2)在有適當(dāng)縮合試劑存在下向步驟(l)的溶液中加入適量的生物素或生物素化試劑；3)向由步驟(2)得到的溶液中加入適當(dāng)?shù)目s合試劑和適量的選擇的Tn或TF抗原，其各自任選與合適的連接體連接；和4)混合并且攪拌來(lái)自步驟(3)的所得溶液以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，并且回收獲得的產(chǎn)物。就上述方法而言，適量的生物素和生物素化試劑屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍以便得到所需的生物素化的多聚體。然而，就具體涉及的用于本發(fā)明方法的操作條件及其細(xì)節(jié)而言，參見(jiàn)下述實(shí)驗(yàn)部分。優(yōu)選的縮合試劑為，例如單獨(dú)使用或與EDC組合的NHS。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于包含與適當(dāng)固定在固相上的生物素化的藻酸鹽、生物素化的cBSA或生物素化的葡聚糖連接的Tn或TF抗原的綴合的化合物在用于檢測(cè)通過(guò)固定化技術(shù)產(chǎn)生的抗體的ELISA試驗(yàn)中的用途，其中Tn或TF是那些分別與cBSA、藻酸鹽或葡聚糖綴合的相同Tn或TF抗原。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，特別優(yōu)選包含與適當(dāng)固定在固相上的生物素化的藻酸鹽連接的Tn或TF抗原的綴合的化合物在通過(guò)ELISA試驗(yàn)對(duì)通過(guò)固定化技術(shù)產(chǎn)生的抗體的檢測(cè)中的用途，并且該化合物包括那些與cBSA、藻酸鹽或葡聚糖綴合的相同Tn或TF抗原。一般而言，除非另作陳述，將與生物素化的多聚體綴合的Tn或TF抗原適當(dāng)固定在固相上包括用鏈霉抗生物素蛋白包被微量滴定ELISA平板孔，用生物素化的多聚體與Tn或TF之間的選擇的綴合物填充孔并且孵育以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段。上述操作條件為本領(lǐng)域眾所周知并且其細(xì)節(jié)報(bào)導(dǎo)在實(shí)驗(yàn)部分中。由此本發(fā)明產(chǎn)生和選擇的抗體還可以用于治療目的。另外，因?yàn)樗鼈冞x擇性靶向特異性腫瘤部位或組織，所以可以按照公知方法，使用診斷或治療活性化合物使它們適當(dāng)功能化。事實(shí)上，因?yàn)樗鼈冞x擇性攻擊和結(jié)合在其表面上表達(dá)Tn和/或TF抗原的腫瘤細(xì)胞，所以它們還可以作為栽體起作用，從而將治療活性部分帶到腫瘤部位或組織，或者將診斷性部分帶到那些部位或組織以能夠顯影。一般而言，使用治療或診斷活性化合物的功能化可以包括使所述抗體與給定的抗腫瘤藥或本領(lǐng)域中公知的可檢測(cè)標(biāo)記反應(yīng)。從上文中，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚抗體和治療或診斷活性部分可以直接或可備選地通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任意合適的連接體或間隔體彼此連接。這些連接體可以包括，但不限于本領(lǐng)域中通常公知的取代或未被取代的烷基鏈、聚乙二醇衍生物、氨基酸間隔體、糖或脂肪族或芳族間隔體。本發(fā)明的診斷性部分的合適的實(shí)例包括，例如適合于磁共振成像(MRI)的順磁金屬螯合物、適合于X-射線成像的放射性標(biāo)記、適合于超聲檢測(cè)的超聲微球或脂質(zhì)體或光學(xué)成像染料。在順磁螯合物中，優(yōu)選的金屬元素是具有20-31、39、42、43、44、49和57-83的原子數(shù)的那些。更優(yōu)選選自如下的順磁金屬離子Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Ni(2+)、Rh(2+)、Co(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Tb(3+)、Pm(3+)、Nd(3+)、Tm(3+)、Ce(3+)、Y(3+)、Ho(3+)、Er(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(3+)、Mn(2+)，其中Gd(3+)為最優(yōu)選的。有機(jī)螯合物是具有一個(gè)或多個(gè)極性基團(tuán)的分子，所述的極性基團(tuán)作為順磁金屬的配體起作用并且與之絡(luò)合。合適的螯合物是本領(lǐng)域公知的并且包括含亞甲基膦酸基團(tuán)、亞甲基羰基羥胺酸(methylenecarbohydroxamine)基團(tuán)、羧基亞乙基基團(tuán)或羧基亞甲基基團(tuán)。螯合物的實(shí)例包括，但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，lO-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7,10-四乙酸(D0TA)、乙二胺四乙酸(EDTA)和1，4，8,11-四氮雜環(huán)十四烷-l，4，8，ll-四乙酸(TETA)。其他的螯合配體是亞乙基雙-(2-羥基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5Br-EHPG、5-Me-EHPG、5t-Bu-EHPG和5sec-Bu-EHPG;苯并二乙烯三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、千基-DTPA和二節(jié)基DTPA;雙-2(羥基千基)-乙二胺二乙酸(HBED)及其衍生物，含至少3個(gè)碳原子，更優(yōu)選至少6個(gè)碳原子和至少2個(gè)雜原子(0和/或N)的大環(huán)化合物類(lèi)，這些大環(huán)化合物可以由一個(gè)環(huán)或兩個(gè)或三個(gè)彼此在雜環(huán)元素上連接的環(huán)組成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA,其中NOTA為1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷N,N、N"-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA為1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)和苯并-TETMA,其中TETMA為1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-丙二胺四乙酸的(PDTA)和三乙烯四胺六乙酸(TTHA)衍生物；1，5，IO-N，N'，N"-三(2，3-二羥基苯甲酰基)-三兒茶酸(LICAM)和1，3，5-N，r，N"-三(2，3-二羥基苯甲?；?氨甲基苯(MECAM)的衍生物，(4S)-4-(4-乙氧基千基)-3，6，9-三羧酸酯基曱基)-3，6，9-三氮雜十一烷二酸-二鈉(EOB-DTPA)，N，N-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-L-谷氨酸(DTPA-GLU),N，N-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-L-賴(lài)氨酸(DTPA-LYS)，DTPA單-或雙-酰胺衍生物，諸如N，N-雙[2-[羧甲基[(甲基氨基曱?；?曱基]-氨基]乙基]甘氨酸(DTPA-BMA),1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(D03A)，10-(2-羥丙基)-1，4，7，IO-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(HPD03A),4-羧基-5，8，11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧雜-5，8，ll-三氮雜十三烷-13-酸(B0PTA)，2-甲基-l，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-l，4，7，10-四乙酸(MCTA)，(，，，"，，，，)-四甲基-l，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-l，4，7，10-四乙酸(DOTMA)，3，6，9，15-四氮雜雙環(huán)〖9.3.l]十五-l(15)，11，13-三烯-3，6，9-三乙酸(PCTA)和6-[雙(羧甲基)氨基]-四氫-6-甲基-lH-l，4-二吖庚因-1，4(5H)-二乙酸(AAZTA)及其衍生物，通常參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W003/008390，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。本發(fā)明包括的有代表性的螯合物和螯合基團(tuán)的實(shí)例描述在W098/18496、W086/06605、W091/03200、W095/28179、W096/23526、W097/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182和U.S.4,899,755中，將所用這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。上述化合物，特別是指定用于診斷用途的那些，且甚至更具體地說(shuō)是用于MRI的那些均可以按照本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備。圖1例證了單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)。圖2表示在生物素化的藻酸鹽-Tn綴合的化合物(Alg-Tn)測(cè)試的，Tn-cBSA免疫接種后小鼠"#1"和小鼠"#2"血清的ELISA結(jié)果;藻酸鹽(Alg)和Tn抗原(Tn)是使用的參照物。圖3表示抗Tn雜交瘤選擇的實(shí)例。在圖中，報(bào)導(dǎo)了在生物素化的藻酸鹽-Tn綴合的化合物上測(cè)試的克隆上清液的吸收度值。下列實(shí)施例更詳細(xì)披露了本發(fā)明；盡管未明確包括，但是認(rèn)為其它類(lèi)似的用途在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)部分封并和才法N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-乙酰半乳糖胺、2-氨苯曱酸(2-AA)、氰基硼氫化鈉和生物素來(lái)自SigmaChemicalCo.(St.Louis.，M0)，Ns-(+)-生物素基-L-賴(lài)氨酸酰肼、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和2-嗎啉乙磺酸(MES)—水化物來(lái)自Fluka(Buchs，Switzerland)，來(lái)自支頂孢屬的ot-N-乙酰氨基半乳糖苷酶來(lái)自Seikagaku(Tokyo,Japan),PBS(磷酸鹽緩沖鹽水；CambrexBioScience,Verviers，Belgium)，Tween20(Sigma-Aldrieh，St.Louis;MO)，卵白蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0)ABTS過(guò)氧化物酶底物(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0)，綴合的抗小鼠IgG-過(guò)氧化物酶(AmershamBiosciences,Freiburg,Germany),鏈霉生物素蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0)。毛勿f在豕高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)來(lái)自Hewlett-Packard(Agilent，Waldbrorm,Germany),ModelHP3DCE，其帶有HPChemstation軟件。通過(guò)將糖的水溶液與^f生溶液(0.25M2-AA,在99%甲醇和1%乙酸中的0.159M氰基硼氫化鈉)混合，使用2-AA對(duì)GalNAc(標(biāo)準(zhǔn)品或因BSA-Tn水解產(chǎn)生)進(jìn)行衍生。將該溶液在60。C下加熱5小時(shí)。在毛細(xì)管電泳分析前，用水將樣品稀釋5次。分析條件報(bào)導(dǎo)在表A中。在每次試驗(yàn)前，使用氫氧化鈉(2min，985mbar)和操作緩沖液(4min,985mbar)對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行洗滌。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1-HPLC-UV實(shí)驗(yàn)條件議器安裝了L-62Q0泵、AS-200A自動(dòng)采樣器和L-4500ADiode<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2-HPLC-MS實(shí)驗(yàn)條件議器安裝了MS泵，自動(dòng)采樣器和PDA檢測(cè)器的HPLCSURVEYORThe函Finnigan系統(tǒng)，與具有電噴射離子化(ESI)的LCQDECAXPPlusThermoFinnigan質(zhì)讀_儀結(jié)合。Xcalibur軟件用于成像系統(tǒng)和數(shù)據(jù)。實(shí)施例1cBSA-Tn綴合的化合物的制備將Tn抗原(1mg)和^M(2mg)溶于含MES緩沖液(O.2M)，pH6的溶液中；加入輕微化學(xué)計(jì)算過(guò)量的EDC和NHS，并且將該混合物攪拌2小時(shí)。然后透析該溶液并且凍千且由此回收標(biāo)題化合物。通過(guò)按照類(lèi)似方式操作并且通過(guò)使用本發(fā)明的任意合適的抗原和任意合適的多聚體支架，可以獲得下列化合物-藻酸鹽-Tn綴合的化合物；-葡聚糖-Tn綴合的化合物；-cBSA-TF綴合的化合物；-藻酸鹽-TF綴合的化合物；-葡聚糖-TF綴合的化合物。實(shí)施例2生物素化的藻酸鹽-Tn綴合的化合物的制備1)藻酸鹽的生物素化分離自Z腫/"ar/sAy/7er6oreai7的藻酸鹽由ProtanA/S(Norway)提供并且通過(guò)在異丙醇中沉淀而純化。將30mg(0.15mmol-重復(fù)單元)的藻酸鹽溶于10mLpH6的MES緩沖液(0.2M)。然后加入輕微化學(xué)計(jì)算過(guò)量的EDC和NHS;然后加入N-s-(+)-生物素基-L-賴(lài)氨酸酰肼(3.2mg)并且將該溶液攪拌6-8小時(shí)，然后透析并且凍干。通過(guò)按照類(lèi)似方式操作并且通過(guò)使用本發(fā)明的任意合適的多聚體支架和任意合適的生物素化的部分可以獲得生物素化的-cBSA和生物素化的-葡聚糖。2)使用Tn對(duì)生物素化的藻酸鹽的衍生將14mg(0.071mmol)生物素化的藻酸鹽溶于5.0mL的0.2MpH6.0的MES緩沖液中。溶解后，加入EDC(33.9mg)和NHS(4.7mg)并且在10min后，加入0,6mg(1.95X10-3mmol,0.027eq)P-GalNAc-oc-O-Ser。將該溶液攪拌8h，透析并且凍干且由此回收標(biāo)題化合物。通過(guò)按照類(lèi)似方式操作，在步驟(1)中以任意生物素化的支架為原料，也可以使用TF抗原衍生/綴合那些相同的生物素化的支架。實(shí)施例3實(shí)施例1的綴合的化合物的取代程度的測(cè)定所用實(shí)驗(yàn)條件為上述說(shuō)明書(shū)中所述酶的供應(yīng)商指示的那些。得到的上述實(shí)施例1的化合物的摩爾取代程度為3%。實(shí)施例4實(shí)施例2的綴合的化合物的取代程度的測(cè)定通過(guò)元素分析對(duì)包含藻酸鹽或葡聚糖作為多聚體支架的本發(fā)明的綴合的化合物的取代程度進(jìn)行測(cè)定。得到的上述實(shí)施例2的化合物的摩爾取代程度為15%。實(shí)施例5抗-Tn和抗-TF抗體的生產(chǎn)和選擇按照本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中披露的優(yōu)選方法生產(chǎn)抗-Tn和抗-TF抗體，并且在本文中報(bào)導(dǎo)如下1)通過(guò)3次腹膜內(nèi)注射在Ribi，s(MPL+TDMAdijuvantSystem;Sigma)中適當(dāng)乳化的200jagTn-cBSA，對(duì)2只8-周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種；以觀察免疫反應(yīng)。隨后另外靜脈內(nèi)注射在PBS中適當(dāng)稀釋的20jug選擇的綴合的化合物；2)處死動(dòng)物并且切除脾；3)通過(guò)體細(xì)胞雜交(融合)使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞永生化；4)在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交細(xì)胞；5)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)以便獲得最具特異性的克??；和6)進(jìn)行亞克隆。按照公知方法進(jìn)行上述披露方法的步驟2)，3)，4)和6)(參見(jiàn)本發(fā)明上文說(shuō)明書(shū)中的參考文獻(xiàn))。按照下列實(shí)施例6中披露的方法進(jìn)行步驟5)。實(shí)施例6抗體的選擇22按照本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中披露的方法進(jìn)行的ELISA試驗(yàn)如下進(jìn)行-在4'C下用碳酸鹽緩沖液100mMpH9.6中的10jag/ml鏈霉抗生物素蛋白對(duì)微量滴定平板孔包被過(guò)夜；-在用PBS洗滌后，用100jig/oilofTn-生物素化的藻酸鹽綴合物填充孔，并且在37。C下孵育lh;-在室溫下使用PBS洗滌3次；-使用PBS卵白蛋白的1%溶液在37°C下封閉lh;-在室溫下使用PBS洗滌3次；-將小鼠血清雜交瘤上清液加入到孔中，并且在37。C下孵育lh;-4吏用PBSTween的0.02%溶液洗滌3次；-加入抗-小鼠IgG-HRP綴合的二次抗體并且在室溫下孵育lh;-在室溫下^f吏用PBSTween的0.02%溶液洗滌3次；-力口入0.5mg/mlABTS過(guò)氧化物酶底物；-在405nm處，對(duì)ELISA平板上的結(jié)合抗原進(jìn)行比色定量。權(quán)利要求1.一種包含直接或通過(guò)任意合適的連接體綴合至多聚體支架的多個(gè)Tn或TF抗原的化合物，所述的多聚體支架選自陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸鹽或葡聚糖。2.權(quán)利要求l的化合物，其中所述多聚體支架為cBSA。3.權(quán)利要求1的化合物，其中所述抗原直接與所述多聚體支架連接。4.權(quán)利要求1的化合物，其中所述抗原通過(guò)任意合適的連接體與所述多聚體支架綴合。5.權(quán)利要求4的化合物，其中所述連接體選自直鏈或支鏈的、合成或天然的氨基酸及其衍生物，合適的肽和糖類(lèi)。6.權(quán)利要求5的化合物，其中所述氨基酸或糖類(lèi)連接體包含2-10個(gè)碳原子。7.權(quán)利要求l的化合物，其中多個(gè)Tn抗原直接與cBSA連接。8.權(quán)利要求l-7中任意一項(xiàng)的化合物用作藥物的用途。9.權(quán)利要求8的用途，用于制備抗腫瘤的疫苗。10.—種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-7的化合物中任意一種與合適的溶劑和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。11.一種治療腫瘤的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求1-7的化合物或其任意的藥物組合物。12.—種用于制備權(quán)利要求l-7中任意一項(xiàng)的化合物的方法，該方法包括下列步驟1)將所述多聚體支架中的任意一種溶于合適的緩沖水溶液中；2)向步驟(l)的溶液中加入縮合試劑和適量的Tn或TF抗原，其各自在有縮合試劑存在下任選地連接至合適的連接體；和3)混合并且攪拌由步驟(2)得到的溶液以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，并且回收獲得的產(chǎn)物。13.—種用于制備抗-Tn抗體或of抗-TF抗的方法，其包括下列步驟1)BALB/c小鼠免疫接種；2)處死動(dòng)物并且切除脾；3)通過(guò)體細(xì)胞雜交(融合)使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞永生化；4)在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交細(xì)胞；5)通過(guò)ELISA測(cè)定進(jìn)行篩選以獲得最具特異性的克??；6)亞克??；其中步驟(l)包括注射權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的化合物，其中所述抗原分別為T(mén)n或TF。14.一種包含多個(gè)直接或通過(guò)任意合適的連接體綴合至生物素化的藻酸鹽的Tn或TF抗原的化合物。15.權(quán)利要求14的化合物，其中生物素化的藻酸鹽直接連接至Tn或TF抗原。16.—種用于制備權(quán)利要求14或15的綴合的化合物中任意一種的方法，其包括下列步驟1)將藻酸鹽溶于緩沖溶液；2)向上述獲得的溶液中加入適量的生物素或生物素化試劑；3)向由步驟(2)得到的溶液中加入適量的Tn或TF抗原，其各自任選地連接至合適的連接體，所述的連接體選自直鏈或支鏈的、合成或天然的氨基酸及其衍生物，合適的肽和糖類(lèi)；和4)混合并且攪拌所得溶液以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，并且回收獲得的產(chǎn)物。17.權(quán)利要求14或15的綴合的化合物在選擇抗-Tn或抗-TF抗原中的用途。18.—種用于選擇抗-Tn或抗-TF抗體的ELISA試驗(yàn)，其包括下列步驟1)用鏈霉抗生物素蛋白包被微量滴定孔平板；2)在由步驟1)獲得的固相上固定權(quán)利要求14或15中任意一項(xiàng)的綴合的化合物。19.權(quán)利要求13產(chǎn)生和/或權(quán)利要求18選擇的抗體。20.權(quán)利要求19的抗體，進(jìn)一步用治療性或診斷性部分功能化。全文摘要本發(fā)明涉及用于刺激抗體產(chǎn)生的新化合物。所述的化合物包含糖腫瘤抗原和多聚體支架。本發(fā)明還包括在用于選擇針對(duì)糖抗原的抗體的ELISA測(cè)定中使用的綴合的化合物。文檔編號(hào)A61K39/385GK101472609SQ200780022959公開(kāi)日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年6月19日優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日發(fā)明者A·科斯洛維,A·科羅巴蒂,C·坎帕,C·達(dá)努斯,F·尤格瑞,S·鮑利迪申請(qǐng)人:伯拉考成像股份公司