專利名稱：腫瘤相關(guān)抗原sm5－1的特異性抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性存在于黑色素瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌的抗原、其特異性的單克隆抗體，以及該單克隆抗體應(yīng)用于其特異抗原相關(guān)的腫瘤診斷和/或治療的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，其中，黑色素瘤、肝細(xì)胞癌和乳腺癌均是惡性腫瘤中較為常見(jiàn)的。
惡性黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，發(fā)生在頭頸者約占全身的20％，主要發(fā)生于皮膚與腔、竇粘膜。人惡性黑色素瘤通常始于有害的黑痣，這些黑痣在輻射刺激后生長(zhǎng)，形成破壞性的轉(zhuǎn)移黑色素瘤。黑色素瘤極易向全身擴(kuò)散，在臨床上難以控制。化學(xué)治療和放射性治療通常對(duì)黑色素瘤不起作用。
目前，黑色素瘤免疫組織化學(xué)檢測(cè)通常使用的抗體是HMB-45、抗S-100和NKI/C3(參見(jiàn)Smoller BR，PATHOLOGYState of the Art Reviews，2371-383，1994)。這些抗體還存在著一些缺陷，HMB-45敏感性較低(其敏感性介于67％-93％之間)，會(huì)有一定量的黑色素瘤漏診(參見(jiàn)Wick MR et al.，J CutanPathol 1988；15201-207；Ordonez NG et al.，Am.J.Clin.Pathol.1988；90385-390)。S-100蛋白的抗體比HMB-45具有更高的敏感性(參見(jiàn)Nakajima Tet al.，Cancer 1982；50912-918；Kindblom LG et al.Acta.Pathol.Macrobial.Immunol.Scand.1984；92219-230)，但是它的特異性很差。NKI/C3抗體能作用于許多良性的或惡性的腫瘤，這種非特異性活性使NKI/C3抗體在黑色素瘤診斷上的使用受到了很大的限制。
乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有120余萬(wàn)婦女患乳腺癌，50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。其中北美洲、西歐、北歐等發(fā)達(dá)國(guó)家乳腺癌發(fā)病率最高，非洲發(fā)病率最低。乳腺癌的發(fā)病在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，無(wú)論在高發(fā)區(qū)還是低發(fā)區(qū)，乳腺癌發(fā)病率均以5-20％的速度上升。
肝癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其與肝炎有關(guān)。目前已經(jīng)進(jìn)行了較深入研究的肝癌抗原主要有PHC，F(xiàn)062，25T和Hab18等(Preparat ion ofmonoclonal antibody against apoptosis-associated antigens of hepatomacells by subtractive immunization Lian-Jun Yang，Wen-Liang Wang WorldJ Gastroenterol 2002；8(5)808-814)。研究發(fā)現(xiàn)，甲胎蛋白(AFP)在肝癌患者的血液中表達(dá)，在卵巢癌、睪丸癌等癌細(xì)胞也有表達(dá)。肝癌特異性Hab18單抗已經(jīng)進(jìn)行了部分研究，但該抗體的靶抗原未能成為治療肝癌的有效靶點(diǎn)。
目前，雖已制備了許多惡性腫瘤免疫治療的單克隆抗體，但是這些單克隆抗體的特異性及中和能力均不夠理想。因此，需要開(kāi)發(fā)新的針對(duì)惡性腫瘤的高特異性和中和力的單克隆抗體(包括人源化抗體)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種能與表達(dá)于黑色素瘤、乳腺癌及肝細(xì)胞癌表面的SM5-1抗原特異結(jié)合的抗體(如單克隆抗體)、多克隆抗體以及多肽。這種抗原的分子量為230kD及180kD。這種抗原可用本發(fā)明的抗體自黑色素瘤、乳腺癌和/或肝細(xì)胞癌細(xì)胞中分離獲得。
一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人源SM5-1特異性單克隆抗體(huSM5-1)。人源SM5-1特異性單克隆抗體(huSM5-1)重鏈及輕鏈可變區(qū)如表1所示。
在某些具體的情況下，該發(fā)明為一種抗體或包含huSM5-1片段或區(qū)域的多肽。一種具體的情況是片段為huSM5-1表1所示的重鏈；另一具體的情況是片段為表1所示的輕鏈；第三種具體的情況是片段為包含huSM5-1中SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的輕鏈和/或重鏈一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的氨基酸序列；第四種具體的情況是片段為包含表1所示的huSM5-1重鏈和/或輕鏈的互補(bǔ)決定簇區(qū)(CDR)。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可競(jìng)爭(zhēng)抑制huSM5-1與SM5-1靶抗原特異結(jié)合的抗體。在某些具體的情況下，抗體重鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO9中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，抗體輕鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。另一具體的情況是抗體重鏈的可變區(qū)包含SEQ IDNO9的氨基酸序列。第三種具體的情況是抗體輕鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。第四種具體的情況是抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9的氨基酸序列，抗體輕鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。在某些具體的情況下，抗體為人源抗體。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鼠源性SM5-1特異性的單抗(mSM5-1)(其重鏈及輕鏈可變區(qū)序列如表2)。mSM5-1重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO3的氨基酸序列， 輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO4的序列。
在某些具體的情況下，本發(fā)明是一種抗體或包含mSM5-1一個(gè)片段或區(qū)域的多肽。另一具體的情況是片段為包含mSM5-1中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的輕鏈和/或重鏈一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的氨基酸序列。第三種具體的情況是片段為包含SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的mSM5-1重鏈和/或輕鏈的互補(bǔ)決定簇區(qū)(CDR)。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可競(jìng)爭(zhēng)抑制mSM5-1與SM5-1靶抗原特異結(jié)合的抗體。在某些具體的情況下，抗體重鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO3中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，抗體輕鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO4中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。另一具體的情況是抗體重鏈的可變區(qū)包含SEQ IDNO9的氨基酸序列。第三種具體的情況是抗體輕鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。第四種具體的情況是抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9的氨基酸序列，抗體輕鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。在某些具體的情況下，抗體人源化抗體。
另一個(gè)方面，SM5-1抗原特異性的抗體為嵌合抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO3的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO4的氨基酸序列另一方面，本發(fā)明的抗體是人源化抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列和/或輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。另一具體的情況是本發(fā)明是一種抗體或包含該人源化抗體一個(gè)片段或區(qū)域的多肽。第三種具體的情況是片段為包含人源化抗體的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的輕鏈和/或重鏈一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的氨基酸序列。第四種具體的情況是片段為包含人源化抗體的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的輕鏈和/或重鏈一個(gè)或多個(gè)CDR。該發(fā)明還提供了可以抑制人源化抗體結(jié)合SM5-1抗原的抗體。
這里描述的某些具體情況下，本發(fā)明的抗體是多克隆抗體，單克隆抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab′片段，F(xiàn)(ab′)2片段，F(xiàn)v片段，雙體，單鏈抗體，或這些片段形成的多特異性抗體。
另一方面，本發(fā)明還提供了包括編碼上述抗體重鏈和/或輕鏈或其片段核酸序列的分離的核酸分子。在某些具體的情況下，核酸分子包含了編碼SEQ IDNO9和/或SEQ ID NO10氨基酸序列的核酸序列。另一具體的情況是核酸分子包含了SEQ ID NO11和/或SEQ ID NO12的核酸序列。第三種具體的情況是核酸分子包含了編碼SEQ ID NO3和/或SEQ ID NO4氨基酸序列的核酸序列。第四種具體的情況是核酸分子包含了SEQ ID NO7和/或SEQ ID NO8的核酸序列。第五種具體的情況是核酸分子包含了編碼SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸序列。第六種具體的情況是核酸分子包含了SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6的核酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了與上述所有核酸序列互補(bǔ)的分離的核酸分子。
另一方面，本發(fā)明提供了含有上述任何核酸分子的載體。所述載體可能包含與上述編碼抗體的核酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
另一方面，本發(fā)明還提供了含有上述核酸分子的重組細(xì)胞。在某些具體的情況下，重組細(xì)胞為真核細(xì)胞。另一具體的情況是重組細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了制備上述任何抗體或其片段的方法，包括培養(yǎng)含有編碼抗體或其片段的核酸分子并由其表達(dá)的重組細(xì)胞；還包括抗體或其片段的表達(dá)。在某些具體的情況下，該方法還包括了抗體或其片段的分離和/或純化方法。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包含有效劑量的上述任何抗體以及藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑。在某些具體的情況下，該藥學(xué)組合物為包括有效劑量的人源SM5-1特異性的單克隆抗體及藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑，該人源SM5-1特異性單克隆抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9中的31-35，50-66和99-108氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10中的24-40，56-62和95-102氨基酸序列。在另一具體的情況下，該藥學(xué)組合物為包括有效劑量的人源化SM5-1特異性的單克隆抗體及藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑，該人源化SM5-1特異性單克隆抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中的31-35，50-66和99-108氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2中的24-40，56-62和95-102氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了包含有效劑量上述抗體的試劑盒以及應(yīng)用抗體的方法說(shuō)明。
另一方面，本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，該方法包括應(yīng)用有效劑量的上述抗體于需要該種處理的哺乳動(dòng)物。在某些具體的情況下，哺乳動(dòng)物為人類。在某些具體的情況下，腫瘤為黑色素瘤，乳腺癌或肝細(xì)胞癌。另一具體的情況是，抗體通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作(CDC)用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。另一具體的情況是抗體為人源抗體。還有另外的具體情況是抗體為人源化抗體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括a)有效劑量的上述抗體；b)有效劑量的抗腫瘤制劑。在某些具體的情況下，抗腫瘤制劑為治療黑色素瘤，乳腺癌或肝細(xì)胞癌的制劑。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，該方法包括將有效劑量的上述組合物施用于需要該種處理的哺乳動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)caspase-10介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括包括應(yīng)用有效劑量的上述抗體于需要該種誘導(dǎo)的細(xì)胞。在某些具體的情況下，細(xì)胞為黑色素瘤細(xì)胞。在某些具體情況下，細(xì)胞位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含結(jié)合毒素和/或放射性同位素的上述抗體。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種分析樣本中SM5-1(如人源SM5-1靶抗原)靶抗原的方法，該方法包括a)從受試者獲取樣本；b)在適當(dāng)?shù)臈l件下，上述抗體與可能存在于樣本中的SM5-1靶抗原的結(jié)合；c)分析抗體與SM5-1靶抗原的結(jié)合，從而判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。在某些具體的情況下，該方法用于腫瘤的診斷及預(yù)后。在某些具體情況下，腫瘤為黑色素瘤，乳腺癌或肝細(xì)胞癌。
該發(fā)明還提供了一種分析樣本中SM5-1(如人源SM5-1靶抗原)靶抗原的試劑盒，該試劑盒包括a)上述的任何抗體；b)通過(guò)分析抗體與SM5-1靶抗原的結(jié)合，從而判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。


圖1顯示了本發(fā)明所用表達(dá)載體pMG18-3K，標(biāo)明了其中的元件及酶切位點(diǎn)。HCMV pro，人巨細(xì)胞病毒Major Immediate早期啟動(dòng)子；Ck，人κ鏈恒定區(qū)基因；CH，人γ1鏈恒定區(qū)基因；pA，多聚腺苷化信號(hào)；DHFR，二氫葉酸還原酶基因；pUC origin，質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)；Amp為氨芐青霉素抗性基因。
圖2顯示了人源化SM5-1抗體(ReSM5-1)重鏈及輕鏈的可變區(qū)。選擇人抗體KOL重鏈可變區(qū)作為人源化抗體重鏈的框架區(qū)，人本-周蛋白R(shí)EI輕鏈可變區(qū)作為人源化抗體輕鏈的框架區(qū)?！啊北硎九c人抗體KOL或REI相應(yīng)序列相同的氨基酸。括號(hào)中為CDR區(qū)。氨基酸順序根據(jù)Kabat(Kabat et al.，″Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th ed.，US Department of Heal thand Human Services，National Institute of Health，Bethesda.1991)標(biāo)記。
圖3顯示了使用流式細(xì)胞儀測(cè)定huSM5-1抗體結(jié)合到各乳腺癌細(xì)胞系、黑色素瘤細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系的FACS圖譜。
圖4顯示了SM5-1抗原的免疫印跡反應(yīng)圖譜。
圖5顯示了用huSM5-1處理的QYC和XJC細(xì)胞中caspase-10活性的變化。
圖6顯示了chSM5-1、reSM5-1單抗對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系QYC的體外抑制增殖曲線；其中A為chSM5-1單抗對(duì)QYC的體外抑制增殖曲線，B為reSM5-1單抗對(duì)QYC的體外抑制增殖曲線。
圖7顯示了(A)chSM5-1和(B)reSM5-1單抗對(duì)QYC的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。
圖8顯示了(A)chSM5-1和(B)reSM5-1單抗對(duì)QYC的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用。
圖9顯示了chSM5-1及reSM5-1對(duì)QYC荷瘤裸鼠的治療作用。
圖10顯示了125I標(biāo)記的chSM5-1及reSM5-1尾靜脈注射QYC荷瘤裸鼠后組織分布。
具體實(shí)施例方式
該研究建立在新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新抗原SM5-1基礎(chǔ)之上，該抗原過(guò)量表達(dá)于黑色素瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌。其存在糖基化和非糖基化兩種形式。Western blot研究顯示，本發(fā)明抗體與分子量分別為230kD(命名為A230)和180kD(命名為A180)的兩種分子結(jié)合。
本發(fā)明還提供了抗SM5-1的特異性人源(huSM5-1，其可變區(qū)見(jiàn)表1)、人源化(ReSM5-1，其可變區(qū)見(jiàn)表3)及嵌合抗體(chSM5-1，其可變區(qū)見(jiàn)表2)。這些抗體可以和黑色素瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌表面的抗原結(jié)合，并且可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖，誘導(dǎo)這些細(xì)胞進(jìn)入caspase-10介導(dǎo)的凋亡。由此可見(jiàn)，SM5-1提供了此類惡性腫瘤治療的靶點(diǎn)。
為了清楚闡明本發(fā)明，本發(fā)明進(jìn)一步具體描述如下，這些描述不用于限定本發(fā)明A.通用技術(shù)除非特別指明，本發(fā)明所用技術(shù)均為分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，一般技術(shù)人員均可實(shí)施。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中均有詳細(xì)闡述，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版(Sambrook et al.，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；《分子生物學(xué)方法》Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，and D.G.Newell，eds.，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987)；PCRThe Polymerase ChainReaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodiesa practical approach(P.Shepherd and C.Dean，eds.，Oxford University Press，2000)；Usingantibodiesa laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995)；and CancerPrinciples and Practice ofOncology(V.T.DeVita et al.，eds.，J.B.Lippincott Company，1993).
B.定義除非特別指明，本發(fā)明中提到的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)同本領(lǐng)域研究人員一般理解的含義。本專利書(shū)中提到的所有專利、專利申請(qǐng)、出版的專利申請(qǐng)和其他出版物均全部納入本文作為參考。如果該專利書(shū)中提到的定義與其他文書(shū)中提到的不同或者相反，以本專利書(shū)為準(zhǔn)。
在本文中，一個(gè)(“a”或“an”)表示至少有一個(gè)(“at least one”)或者一個(gè)或者更多(“one or more”)。
所謂“抗體”就是能夠通過(guò)至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，和靶分子(包括糖、多聚核酸、脂類、多肽等)特異性結(jié)合的免疫球蛋白。在本文中，該定義不但包括完整的多克隆或者單克隆抗體，也包括各種抗體片段(如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v)、單鏈抗體(Scfv)，二體，由抗體片段形成的多特異性抗體，及其突變體含有抗體片段的融合蛋白，以及任何經(jīng)過(guò)改造但包含所需特異性識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子?？贵w包括各種類別，如IgG，IgA，或IgM(或由此而來(lái)的各種亞型)，不屬于上述任一類別的抗體。依據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為多個(gè)類別，主要有5種IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM。其中某些又可以分為多個(gè)亞型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1以及IgA2。不同類別免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別稱為alpha，delta，epsilon，gamma，及mu。有關(guān)不同類別免疫球蛋白亞單位結(jié)構(gòu)、三維構(gòu)象等知識(shí)均為本領(lǐng)域研究人員所熟知。
所謂“單克隆抗體”是指包含參與選擇性結(jié)合某一抗原氨基酸結(jié)構(gòu)(自然或者經(jīng)改建)的同一抗體群。單克隆抗體具有高度特異性，針對(duì)某一單一抗原位點(diǎn)。該定義不但包括完整的單克隆抗體和全長(zhǎng)的單克隆抗體，也包括各種抗體片段(如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v)、單鏈抗體(ScFv)，二體，由抗體片段形成的多特異性抗體，及其突變體含有抗體片段的融合蛋白，以及任何經(jīng)過(guò)改造但包含所需特異性識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子?？贵w的來(lái)源或者其制備方法并不受限制，例如通過(guò)雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。
所謂抗體的“可變區(qū)”是指抗體輕鏈的可變區(qū)、或者重鏈的可變區(qū)、或者二者共同形成的可變區(qū)。無(wú)論重鏈還是輕鏈的可變區(qū)均由通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining regions，CDRs，又稱為高變區(qū))及將其聯(lián)結(jié)起來(lái)的四個(gè)框架區(qū)(framework regions，F(xiàn)R)組成。每條鏈的CDRs被FRs拉近，并且和來(lái)自另外一條鏈的CDRs一起，形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。目前至少有兩種技術(shù)手段可以確定CDRs一種是基于跨種屬的序列可變性(i.e.，Kabat et al.Sequencesof Proteins of Immunological Interest，(5th ed.，1991，Nat ional Institutesof Health，Bethesda MD))；另外一種基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究(Chothia et al.(1989)Nature 342877；Al-lazikani et al.(1997)J.Molec.Biol.273927-948)。我們這里提到的CDRs可以是通過(guò)二者任一技術(shù)獲得的CDRs。
所謂抗體的“恒定區(qū)”是指抗體輕鏈的恒定區(qū)、或者重鏈的恒定區(qū)、或者二者共同形成的恒定區(qū)。
所謂“人源化”是指一個(gè)分子的抗原結(jié)合部分來(lái)自非人源的免疫球蛋白，而其余部分則基于人免疫球蛋白分子和/或序列構(gòu)建?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以由完整的可變區(qū)融合到恒定區(qū)構(gòu)成，也可以只是互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)移植到可變區(qū)適當(dāng)?shù)目蚣芙Y(jié)構(gòu)上?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以是野生型的，也可以通過(guò)替換一個(gè)或者多個(gè)氨基酸加以改造(譬如，可以通過(guò)改造使其更象人自身的免疫球蛋白)。某些形式的人源化抗體保留所有的CDRs序列，如(含有鼠抗體的所有6個(gè)CDR區(qū)的人源化鼠抗體。也有一些人源化抗體只保留一個(gè)或者幾個(gè)CDRs(一、二、三、四、五、六個(gè))，這些CDRs根據(jù)原來(lái)的抗體改造，也稱為來(lái)自原來(lái)源抗體CDRs的CDRs。
所謂“嵌合抗體”是指一個(gè)抗體的輕鏈和重鏈中一部分氨基酸序列來(lái)自一個(gè)種屬或者屬于一個(gè)類別，而其余部分來(lái)自另外一個(gè)種屬或者為另外一個(gè)類別。典型的嵌合抗體中，其輕鏈和重鏈的可變區(qū)來(lái)自某種哺乳動(dòng)物種屬，而恒定區(qū)來(lái)自另外一個(gè)種屬。這樣一個(gè)顯而易見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn)是，其可變區(qū)可以來(lái)自已有的或者容易獲得的非人雜交瘤或者B細(xì)胞，而恒定區(qū)來(lái)自人的細(xì)胞，二者聯(lián)合即可獲得。其可變區(qū)容易獲得，特異性不受來(lái)源影響；而恒定區(qū)為人源，注射于人體后不易引起免疫反應(yīng)。但是需要指出的是，該定義不僅局限于此例。
本文中“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”用來(lái)描述不同長(zhǎng)度的氨基酸序列。這些多聚分子可以是線性的，也可能具有分支結(jié)構(gòu)；可能含有經(jīng)過(guò)改造的氨基酸，也可能含有其他非氨基酸分子。該定義還包括自然或者通過(guò)干預(yù)修飾的氨基酸多聚分子，如二硫鍵的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者其他任何修飾改造，如與某種標(biāo)記分子偶連。該定義還包括其中含有氨基酸類似物的多肽(如非自然狀態(tài)下存在的氨基酸)以及其他任何本領(lǐng)域研究人員所熟知的修飾手段。應(yīng)該可以理解的是，因?yàn)榇祟惗嚯木鶃?lái)自抗體，因而它們可以是單鏈分子也可以是由幾條鏈構(gòu)成。
在本文中，“核酸”是指各種形式的脫氧核糖核酸(DNA)和/或者核糖核酸(RNA)，包括單鏈、雙鏈、三鏈、線形、環(huán)狀等各種形式。另外還包括多聚核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸嵌合物以及由此而來(lái)的各種類似物。該文描述的核苷酸是本領(lǐng)域研究人員所熟知的由四種鹼基(胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤)或者其衍生物構(gòu)成的DNA或者RNA。另外，各種形式的帶有稀有的磷酸二酯骨架的寡聚核苷酸衍生物也包括在內(nèi)，如磷酸三酯，多聚肽核酸(PNA)，甲基磷酸酯(methylphosphonate)，硫代磷酸酯(phosphorothioate)，多聚核苷酸引物，鎖核酸(LNA)等。
所謂“宿主細(xì)胞”是指能夠或者已經(jīng)作為載體接受細(xì)胞的某個(gè)細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)體系，這些載體用來(lái)整合多聚核苷酸。宿主細(xì)胞包括一個(gè)宿主細(xì)胞的子細(xì)胞，但是由于自然、偶然或者特意突變等原因它們并不一定與其來(lái)源細(xì)胞完全一樣(無(wú)論是形態(tài)學(xué)或者DNA序列)。宿主細(xì)胞包括體內(nèi)轉(zhuǎn)入本發(fā)明中寡聚核苷酸的細(xì)胞。
所謂“處理”是指為了獲得某種有益目的，特別是為了增強(qiáng)臨床效果所采用的方法。本文中所指的有益目的和臨床效果包括但是不局限于以下內(nèi)容抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或者殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、減小腫瘤瘤塊體積、減輕疾病癥狀、提高病人的生存質(zhì)量、減少其他藥物用藥劑量、延緩疾病進(jìn)程和/或延長(zhǎng)病人生存期。
所謂抗體、藥物或者任何藥物成分的“有效量”是指足以取得有益目的和臨床效果的量；所謂有益目的和臨床效果包括抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或者殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、減小腫瘤瘤塊體積、減輕疾病癥狀、提高病人的生存質(zhì)量、減少其他藥物用藥劑量、通過(guò)增加靶向性提高其他藥物治療效果、延緩疾病進(jìn)程和/或延長(zhǎng)病人生存期。有效量可以通過(guò)一次或者幾次給藥獲得。本發(fā)明中，所謂“有效量”是指通過(guò)直接或者間接機(jī)制足以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或者殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的量。在腫瘤臨床實(shí)踐中，由于一種藥物的有效量可能受到其他藥物的影響，因此，如癌癥臨床領(lǐng)域人員所知道的那樣，有效量的藥物、化合物或藥物組合物可以與其他藥物、化合物或藥物組合物聯(lián)用。因此，“有效量”可應(yīng)用于施用一種或多種治療劑的場(chǎng)合。單一治療劑可以以有效量給予，而且如果可以實(shí)現(xiàn)有利的結(jié)果，還可以與一種或多種其他治療劑聯(lián)用。
所謂“生物學(xué)樣品”包括來(lái)自某一個(gè)體、用于診斷或監(jiān)測(cè)的各種樣品。該定義包含血樣、生物來(lái)源的其他液體樣品、固體組織樣品(包括活檢標(biāo)本以及由此得來(lái)的組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng))。該定義還包括了經(jīng)過(guò)各種處理的樣品，如經(jīng)過(guò)各種試劑處理、溶解、蛋白質(zhì)、多聚核酸富集或者包埋于半固體或固體基質(zhì)。該定義既包括來(lái)自臨床的樣品，也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物液體和組織樣品。
C、組合物及制備方法該發(fā)明提供了能夠和SM5-1抗原特異性結(jié)合的抗體或多肽。在某些具體情況下，該抗體是單克隆抗體；該抗體可以是人來(lái)源的、人源化的、或者嵌合性的抗體。
在某些具體情況下，該發(fā)明系能夠和SM5-1抗原特異性結(jié)合的抗體或者多肽。抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO9中的氨基酸序列(31-35，50-66和99-108)，輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO10中的氨基酸序列(24-40，56-62和95-102)，或者二者同時(shí)存在。在某些情況下，抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO9中的氨基酸序列。在某些情況下，抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO10中的氨基酸序列。在某些情況下，抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO9中的氨基酸序列，而輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO10中的氨基酸序列。在某些情況下，抗體如表一所示為huSM5-1。
某些具體情況下，該發(fā)明系能夠和SM5-1抗原特異性結(jié)合的抗體或者多肽?？贵w的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列(31-35，50-66和99-108)，輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列(24-40，56-62和95-102)，或者二者同時(shí)存在。在某些情況下，抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列。在某些情況下，抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。在某些情況下，抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列，而輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。在某些情況下，抗體為人源化抗體。在某些具體情況下，人源化抗體重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO1中的氨基酸序列，而輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
在某些具體情況下，該發(fā)明為嵌合性抗體，抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列。在另外一些情況下，該發(fā)明為嵌合性抗體，其輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。在某些情況下，該發(fā)明中的嵌合性抗體，重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列，而輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。
該發(fā)明也提供了能夠競(jìng)爭(zhēng)抑制本文提到的任何特異性結(jié)合SM5-1抗體的抗體(如單克隆抗體)和多肽。一般情況下，抗原固定于多孔板，從而檢測(cè)未標(biāo)記抗體阻斷標(biāo)記抗體的情況。一般抗體標(biāo)記通過(guò)標(biāo)記放射性活性物質(zhì)或者酶標(biāo)物。
本發(fā)明還涵蓋了上述抗體的各種不同組成、等價(jià)物或者多肽片段(如，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v，F(xiàn)c等)、單鏈、二體，由抗體片段形成的多特異性抗體，及其突變體、含有抗體片段的融合蛋白，以及任何經(jīng)過(guò)改造修飾后仍保持SM5-1抗原特異性識(shí)別位點(diǎn)的抗體。
人來(lái)源SM5-1抗體(huSM5-1)的可變區(qū)序列如表1所示。人源化SM5-1抗體(ReSM5-1)可變區(qū)序列如表3所示。因而，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段以及由此而來(lái)的多肽，而抗體可以由宿主細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了下列分子或者由下列分子組成的組合物。(a)抗體huSM5-1(可變區(qū)見(jiàn)表1)；(b)抗體huSM5-1的片段或者一個(gè)區(qū)域；(c)抗體huSM5-1的一條重鏈；(d)抗體huSM5-1的一條輕鏈；(e)來(lái)自抗體huSM5-1的重鏈或者輕鏈或者二者同時(shí)來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)；(f)來(lái)自抗體huSM5-1的一個(gè)或者多個(gè)CDR(s)(一、二、三、四、五、六個(gè))；(g)來(lái)自抗體huSM5-1輕鏈三個(gè)CDR；(h)來(lái)自抗體huSM5-1重鏈的三個(gè)CDR；(i)來(lái)自抗體huSM5-1的重鏈的三個(gè)CDR和來(lái)自其輕鏈的三個(gè)CDR；(j)帶有b到i的任何成分的抗體。
本發(fā)明還提供了下列分子或者由下列分子組成的組合物。(a)抗體mSM5-1(可變區(qū)見(jiàn)表2，由ATCC Designation No.HB-12588宿主細(xì)胞或者其來(lái)源細(xì)胞產(chǎn)生)；(b)抗體mSM5-1的片段或者一個(gè)區(qū)域；(c)來(lái)自抗體mSM5-1的重鏈或者輕鏈或者二者同時(shí)來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)；(d)來(lái)自抗體mSM5-1的一個(gè)或者多個(gè)CDR(s)(一、二、三、四、五、六個(gè))；(e)來(lái)自抗體mSM5-1輕鏈三個(gè)CDR；(f)來(lái)自抗體mSM5-1重鏈的三個(gè)CDR；(g)來(lái)自抗體mSM5-1的重鏈的三個(gè)CDR和來(lái)自其輕鏈的三個(gè)CDR；(h)帶有b到g的任何成分的抗體。
本發(fā)明還提供了下列分子或者由下列分子組成的復(fù)合物。(a)抗體ReSM5-1(可變區(qū)見(jiàn)表3)；(b)抗體ReSM5-1的片段或者一個(gè)區(qū)域；(c)來(lái)自抗體ReSM5-1的重鏈或者輕鏈或者二者同時(shí)來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)；(d)來(lái)自抗體ReSM5-1的一個(gè)或者多個(gè)CDR(s)(一、二、三、四、五、六個(gè))；(e)來(lái)自抗體ReSM5-1輕鏈三個(gè)CDR；(f)來(lái)自抗體ReSM5-1重鏈的三個(gè)CDR；(g)來(lái)自抗體ReSM5-1的重鏈的三個(gè)CDR和來(lái)自其輕鏈的三個(gè)CDR；(h)帶有b到g的任何成分的抗體。
在某些情況下，CDR可以是Kabat CDR，也可以是Chothia CDR或者是二者兼而有之；如何確定CDR區(qū)為本領(lǐng)域研究人員所熟知。
根據(jù)具體情況，本發(fā)明提供了至少存在一個(gè)和至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)與huSM5-1，mSM5-1，or ReSM5-1基本同源CDR的抗體(某些情況下6個(gè)CDRs同源)；某些情況下為至少2個(gè)CDRs與huSM5-1，mSM5-1，or ReSM5-1至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)CDRs基本同源，或者來(lái)源于這些抗體?？梢岳斫獾氖牵祟惏l(fā)明的特異性結(jié)合能力和/或整體活性(如治療黑色素瘤、乳腺癌、肝癌等腫瘤的效果)均得以保留，雖然它們的活性水平可能多多少少有所差異。
本發(fā)明還提供了包含下列任何氨基酸序列的多肽(可以是抗體也可以不是抗體)本發(fā)明所描述抗體(huSM5-1，mSM5-1，和ReSM5-1)的可變區(qū)中相鄰的至少5、10、20、25、30個(gè)氨基酸序列。
該發(fā)明還提供了制備這些抗體或者多肽的方法。該發(fā)明提到的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)制備，某些具體技術(shù)在舉例中已有說(shuō)明。在某些具體情況下，制備方法包括如何培養(yǎng)攜帶編碼這些抗體或片段核酸序列(如表1所示huSM5-1序列；表3示ReSM5-1序列)的宿主細(xì)胞，以及如何對(duì)這些表達(dá)的抗體或者片段進(jìn)行復(fù)性。某些情況下還描述了如何分離和/或純化這些抗體或者片段。
多肽可以通過(guò)蛋白水解或其他抗體降解方法獲得，也可以通過(guò)上述重組技術(shù)或者化學(xué)合成的方法獲得。抗體多肽，特別是50個(gè)氨基酸左右的短肽可以通過(guò)化學(xué)方法方便的合成。化學(xué)合成的方法為本領(lǐng)域人員所熟知，而且可通過(guò)商業(yè)途徑獲取。
單克隆抗體可以通過(guò)制備雜交瘤的方法獲得，如Kohler and Milstein在1975，Nature 256495中所描述的方法。制備雜交瘤時(shí)，采用抗原免疫小鼠、倉(cāng)鼠或者其他宿主動(dòng)物使其產(chǎn)生能夠分泌和抗原特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，淋巴細(xì)胞也可以通過(guò)體外方法加以免疫。
抗體或者抗體片段也可以通過(guò)重組技術(shù)獲得，如美國(guó)專利No.4,816,567描述的那樣。采用常規(guī)方法分離編碼抗體或者抗體片段的DNA，采用能夠特異性結(jié)合抗體重鏈和輕鏈的寡核苷酸探針予以測(cè)序。分離后的DNA(如SEQ ID NO5和SEQID NO6)裝入表達(dá)載體，后者再轉(zhuǎn)染本不表達(dá)免疫球蛋白的宿主細(xì)胞(如E.coli cells，simian COS cells，Chinese hamster ovary(CHO)cells，or myeloma cells)。對(duì)載體(包括表達(dá)載體)和宿主細(xì)胞，本文將進(jìn)一步予以闡釋。
該發(fā)明還描述了對(duì)于抗體進(jìn)行改造修飾的方法，包括制備對(duì)其功能無(wú)明顯影響的等價(jià)物和可能增強(qiáng)或者降低了其活性的變異體。修飾多肽技術(shù)為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，無(wú)須詳細(xì)描述。經(jīng)過(guò)修飾改造的多肽包括對(duì)其保守序列進(jìn)行氨基酸替代、在不顯著影響活性情況下刪除或者增加氨基酸，采用化學(xué)類似物等等?？梢员蝗〈陌被岚ǖ⒉痪窒抻诟拾彼?丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸.這些多肽包括糖基化、非糖基化、以及其他翻譯后修飾形式，如不同形式的糖基化、乙酰化、和磷酸化。這些替代的氨基酸最好是保守性很強(qiáng)的氨基酸，換句話說(shuō)，替代氨基酸應(yīng)該具有原來(lái)氨基酸相似的化學(xué)性質(zhì)。這些保守性氨基酸的取代為該研究領(lǐng)域人員所熟知，并且在上面已有舉例說(shuō)明。加以修飾的氨基酸可以是一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸，甚至可以是對(duì)于某個(gè)區(qū)(如可變區(qū))的整個(gè)重新改建?？勺儏^(qū)的變化有可能導(dǎo)致結(jié)合能力和/或特異性的改變。其他修飾方法還包括采用本領(lǐng)域常規(guī)的耦鏈技術(shù)，包括但不局限于酶手段、氧基取代和螯合作用。修飾可達(dá)到多種目的，如用來(lái)制備免疫檢測(cè)用的標(biāo)記試劑。
該發(fā)明還包括含有本發(fā)明中的抗體一個(gè)或幾個(gè)片段或區(qū)域的融合蛋白。在某些情況下，融合的多肽包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)和/或一個(gè)重鏈可變區(qū)(序列如SEQ IDNO2和/或SEQ ID NO1)。在另外一些情況下，融合的多肽包含來(lái)自SEQ ID NO10和/或SEQ ID NO9的一個(gè)輕鏈可變區(qū)和/或一個(gè)重鏈可變區(qū)。具體在本發(fā)明中，融合蛋白包含一個(gè)或者多個(gè)抗體及一個(gè)本來(lái)不具有的氨基酸序列，如來(lái)自其他分子或者其他區(qū)的序列。來(lái)自其他分子的此類例子如FLAG tag或6His tag中的″標(biāo)志(tag)″，這些都是本領(lǐng)域人員所熟知。
融合多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域人員所熟知的技術(shù)制備，如合成或重組技術(shù)。在本發(fā)明中，一般采用重組技術(shù)制備表達(dá)融合多肽的多聚核苷酸，當(dāng)然也可以采用本領(lǐng)域其他的常規(guī)技術(shù)如化學(xué)合成的方法制備。
在一種具體情況下，該發(fā)明中的嵌合性抗體其重鏈和/或輕鏈為融合蛋白。在某些情況下，其恒定區(qū)來(lái)自一種種屬和/或亞型，而可變區(qū)來(lái)自另外一種種屬和/或亞型。舉例說(shuō)明，某一嵌合抗體其恒定區(qū)為人源，而可變區(qū)卻與小鼠抗體同源或者來(lái)自小鼠抗體(如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。本發(fā)明中還涉及一種抗體，其可變區(qū)經(jīng)過(guò)人源化改造，其CDR區(qū)含有小鼠的氨基酸序列，而框架區(qū)來(lái)自人的序列。還有領(lǐng)域人員所熟知的其他形式的人源化抗體，本發(fā)明中也都有闡述。本發(fā)明中還包括嵌合抗體的功能片段，如人源化的Fab片段，其含有一個(gè)人源的鉸鏈區(qū)，人源的第一個(gè)恒定區(qū)，一個(gè)人源的kappa輕鏈或重鏈恒定區(qū)，以及來(lái)自小鼠輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)(如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。人源化的Fab片段又可以制備成二聚體。一般說(shuō)來(lái)，該發(fā)明中的融合蛋白和嵌合體通過(guò)重組技術(shù)制備，雖然其也可以通過(guò)本領(lǐng)域中其他常規(guī)技術(shù)如化學(xué)合成的方法制備(舉例見(jiàn)U.S.Pat.Nos.5,807,715；4,816,567；and 6,331,415.)。
該發(fā)明中還包括人源化抗體。通過(guò)基因技術(shù)對(duì)于抗體(如SEQ ID NO7 andSEQ ID NO8)或其他抗體類似物的多聚核苷酸進(jìn)行操作，以制備人源化抗體，或者提高其親和力及其他特點(diǎn)。人源化過(guò)程的原則是保留抗體結(jié)合抗原的基本序列，同時(shí)用人源抗體序列更換其其余非人抗體序列。人源化過(guò)程基本分為四個(gè)步驟(1)確定原來(lái)抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸序列并預(yù)測(cè)其氨基酸序列；(2)設(shè)計(jì)人源化抗體，也就是說(shuō)，確定在人源化過(guò)程中采用哪一個(gè)框架區(qū)；(3)具體的人源化方法和技術(shù)；(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。如恒定區(qū)被改造成更加類似人恒定區(qū)，從而避免臨床試驗(yàn)或用于人體試驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生免疫反應(yīng)(如美國(guó)專利Nos.5,997,867 and5,866,692.)。
已有多種來(lái)源于非人免疫球蛋白攜帶抗原結(jié)合位點(diǎn)的“人源化”抗體被加以描述，包括攜帶嚙齒類V區(qū)(改造或不加改造)的抗體，它們的CDRs與人的恒定區(qū)融合。具體例子可參考Winter et al.Nature 349293-299(1991)，Lobuglio et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)，Shaw et al.J Immunol.1384534-4538(1987)，and Brown et al.Cancer Res.473577-3583(1987).。其他亦有文獻(xiàn)描述在與人恒定區(qū)融合之前，嚙齒類CDRs被移植到人的框架區(qū)(FR)?？蓞⒖糝iechmann et al.Nature 332323-327(1 988)，Verhoeyen et al.Science 2391534-1536(1988)，and Joneset al.Nature 321522-525(1986).也有文獻(xiàn)描述了采用改造的嚙齒類FR為嚙齒類CDRs提供支架，如European Patent Publication No.519,596.通過(guò)上述處理，這些人源化分子最大限度的降低了用于人體時(shí)可能引起的免疫反應(yīng)，延長(zhǎng)了作用時(shí)間，提高了治療效果。其他如Daugherty等在Nucl.Acids Res.，192471-2476(1991)中，以及美國(guó)專利Nos.6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；6,350,861和PCT WO 01/27160等描述的方法也可以制備人源化抗體。
另一可供選擇的方法是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)制備重組抗體。參見(jiàn)美國(guó)專利5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；及Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)，和實(shí)施例2。另外，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature 348552-553(1990))還可用于從非免疫的供者免疫球蛋白可變區(qū)基因庫(kù)體外生產(chǎn)人源抗體或抗體片段根據(jù)該技術(shù)，將可變區(qū)基因按表達(dá)框克隆至絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白，如M13或fd，并且功能性抗體片段表達(dá)于噬菌體顆粒表面。因?yàn)榻z狀噬菌體包含一個(gè)單鏈的基因組DNA拷貝，因此抗體功能的篩選與編碼抗體的基因的篩選聯(lián)系到一起。這樣，噬菌體有些類似于B細(xì)胞。.噬菌體展示技術(shù)可以多種形式應(yīng)用，參見(jiàn)Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opnion如Structural Biology3，564-571(1993)。幾種來(lái)源的可變區(qū)基因片段可用于噬菌體展示。Clacksonet al.，Nature 352624-628(1991)從免疫小鼠的脾臟構(gòu)建的可變區(qū)基因的小的隨機(jī)組合文庫(kù)分離到了多種抗唑酮的抗體?？梢詷?gòu)建非免疫的人的抗體可變區(qū)基因庫(kù)，并可以分離到抗多種抗原(包括自身抗原)的抗體，使用的技術(shù)參見(jiàn)Mark et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，or Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)。在天然的免疫反應(yīng)中，抗體基因積累高頻突變(體細(xì)胞突變)。其中的某些變化使抗體具有更高的親和力，具有高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞再次接觸抗原時(shí)選擇性的復(fù)制分化。這一天然過(guò)程可通過(guò)鏈替換技術(shù)模擬，參見(jiàn)Marks，et al.，Bio/Technol.10779-783(1992))。在該方法中通過(guò)噬菌體展示獲得的原始的人源抗體的親和力可以通過(guò)自未免疫的供者獲得的天然可變區(qū)基因庫(kù)中的重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的序列替換得到提高。利用這種技術(shù)可以生產(chǎn)親和力為pM-nM抗體及抗體片段。1993年，Waterhouse等在Nucl.Acids Res.212265-2266中描述了大規(guī)模噬菌體抗體庫(kù)(也稱為“諸庫(kù)之母”)的制備策略。基因拖曳技術(shù)也被用于從嚙齒類抗體制備人源抗體，制備的人源抗體與原來(lái)的嚙齒類抗體具有相似的親和力和特異性。根據(jù)這種也被稱作“表位印記”的技術(shù)，通過(guò)噬菌體文庫(kù)技術(shù)獲得的嚙齒類抗體的重鏈或輕鏈V區(qū)基因被人V區(qū)所取代，得到嚙齒類-人嵌合體。采用抗原選擇可分離出能夠重建功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)，也就是說(shuō)，表位決定(印記)了伙伴的選擇。通過(guò)重復(fù)該過(guò)程替代殘存的嚙齒類V區(qū)獲得人源抗體(具體例子參考PCT patent application PCT WO 9306213，published April 1，1993)。與傳統(tǒng)的移植CDR制備人源化抗體不同，該項(xiàng)技術(shù)可制備出不含嚙齒類框架區(qū)或者CDR殘基的完全人源抗體。顯然，盡管上述討論的是人源化抗體的制備過(guò)程，該技術(shù)原則也適用于制備狗、貓、靈長(zhǎng)類等動(dòng)物適用的抗體。
本發(fā)明還提供了上述抗體或多肽偶聯(lián)(如連接)于治療性的制劑，如放射性同位素，毒素(如calicheamicin)，化療分子，可以將藥物前體轉(zhuǎn)化為活性抗腫瘤藥物的藥物前體轉(zhuǎn)化酶或含有化療復(fù)合物(或包含這些抗體或多肽的組合物)的脂質(zhì)體或其他載體。這些組成應(yīng)用于個(gè)體，可以通過(guò)抗體或多肽識(shí)別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的SM5-1抗原而將制劑導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞從而可以消除腫瘤細(xì)胞(或減少數(shù)量)和/或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。這些結(jié)合物通常指如上所述連接這些成分于抗體。連接(通常指至少為應(yīng)用的目的，固定這些成分，使之與抗體為最近的相關(guān)關(guān)系)可以通過(guò)下述的方法達(dá)到。
本發(fā)明的放射性同位素包括能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞的放射性同位素。例如但并不限于鈷-60，131I及X-射線。另外，天然生成的放射性同位素如鈾、鐳和釷常為多種放射性的混合形式，同樣也是合適的放射性分子的例證。
本發(fā)明的毒素包括但并不限于紫杉酚，細(xì)胞松弛素B，短桿菌肽D，溴化乙啶，吐根堿，絲裂霉素，依托泊甙，tenoposide，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，秋水仙素，阿霉素，紅比霉素，dihydroxy anthracin dione，米托蒽醌，光神霉素，放線菌素D，1-去氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，嘌呤霉素及其同源或類似物。
本發(fā)明的抗體或多肽可以結(jié)合(連接)放射性同位素或分子，毒素，或其他治療制劑，可以將藥物前體轉(zhuǎn)化為活性抗腫瘤藥物的前體藥物轉(zhuǎn)化酶，脂質(zhì)體或包含直接或間接、共價(jià)或非共價(jià)連接的其他載體?？贵w可以連接放射性分子，毒素，治療性分子或前體藥物轉(zhuǎn)化酶于其任何位點(diǎn)，只要其保留結(jié)合靶抗原的能力。
毒素與治療制劑可以直接或間接(如通過(guò)連接基團(tuán)或通過(guò)具有連接位點(diǎn)的連接分子(如美國(guó)專利5,552,391描述的分子))偶聯(lián)(如共價(jià)結(jié)合)。本發(fā)明中的毒素和治療性制劑可直接通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法直接連接于靶蛋白。例如當(dāng)抗體與制劑之一具有可以與對(duì)方反應(yīng)的取代基時(shí)，二者可直接反應(yīng)。例如一方的親核基團(tuán)如氨基，巰基可與含羰基的基團(tuán)如酸酐或鹵酸或具有容易脫離基團(tuán)(如鹵素)的烴基的另一方反應(yīng)。
本發(fā)明中抗體或多肽連接物還包括了雙功能連接分子，其既包含可與毒素制劑或治療制劑偶聯(lián)的基團(tuán)，又有能與抗體偶聯(lián)的基團(tuán)。連接分子可以使抗體及所連接的制劑適當(dāng)分離從而避免影響抗體的結(jié)合能力。連接分子可以是可分或不可分的。連接分子的作用還可以是提高制劑或抗體取代基的化學(xué)反應(yīng)性，從而增加偶聯(lián)的效率。化學(xué)反應(yīng)性的提高可以使得制劑的使用更加容易，或使制劑中的基團(tuán)具有功能，否則不可能達(dá)此目的。雙功能連接分子可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法與抗體偶聯(lián)。例如，含有活性酯基團(tuán)如N-羥磺胺吡啶酯的連接分子，可通過(guò)氨基與抗體中的賴氨酸相連。另一個(gè)實(shí)例為含有親核基團(tuán)胺或肼殘基的連接分子可以與抗體糖基中糖的氧化分解過(guò)程產(chǎn)生的的醛基相偶聯(lián)。除了這些直接的偶聯(lián)方法外；連接分子還可通過(guò)中間載體如氨基右旋糖苷與抗體間接偶聯(lián)。在這些具體情況中，修飾的連接是通過(guò)賴氨酸、糖類或中間載體形成。在另一具體的情況下，連接分子與抗體分子中的自由硫醇?xì)埢稽c(diǎn)選擇性相偶聯(lián)。在本領(lǐng)域中，選擇性與蛋白中硫醇?xì)埢嗯悸?lián)的合適的連接分子為大家熟知。包括二硫化合物，α-鹵代羧基及α-鹵代羧基化合物，馬來(lái)酰亞胺。親核的胺與出現(xiàn)于同一分子內(nèi)部的α-鹵代羧基或羧基，可能通過(guò)分子內(nèi)部的胺的烴化而有環(huán)化存在的可能。避免這一問(wèn)題的方法為本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)方法，例如制備胺與α-鹵代基團(tuán)被不可折疊的基團(tuán)(如芳基，反式烯烴基)分隔的連接分子，使得不期望的環(huán)化反應(yīng)在空間化學(xué)上變得不可能。對(duì)于通過(guò)二硫鍵連接的maytansinoids與抗體的偶聯(lián)物的制法，可參見(jiàn)美國(guó)專利6,441,163。
本發(fā)明的抗體(或多肽)可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法連接上放射性同位素或分子。有關(guān)放射性標(biāo)記抗體的討論參見(jiàn)″Cancer Therapy with MonoclonalAntibodiesT″，D.M.Goldenberg ed.(CRC Press，Boca Raton，1995).
本發(fā)明的抗體(或多肽)可以連接上述制劑(包括可以將前體藥物轉(zhuǎn)化為活性抗腫瘤藥物的前體藥物轉(zhuǎn)化酶)。例如本發(fā)明的抗體或多肽可以通過(guò)連接轉(zhuǎn)化前體藥物的前體藥物轉(zhuǎn)化酶從而用于抗體依賴的酶介導(dǎo)的前體藥物治療AntibodyDependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy(ADEPT)(如a peptidylchemotherapeutic agent，see WO81/01145)參見(jiàn)WO 88/07378及美國(guó)專利.4,975,278.
本發(fā)明的抗體(或多肽)可連接(或標(biāo)記)標(biāo)記試劑，如熒光分子，放射性分子或其他本領(lǐng)域熟知的標(biāo)記物。標(biāo)記物通?？梢蕴峁?直接或間接)信號(hào)。
本發(fā)明還涵蓋了組合，包括藥學(xué)上的組合，其中包括有效劑量的可與SM5-1抗原結(jié)合的抗體(包括抗體連接物)和多肽，以及包括編碼上述抗體、多肽序列的多聚核苷酸。如上所述，組合包括結(jié)合SM5-1抗原的一種或多種抗體，和/或一種或多種含有編碼一種或多種結(jié)合SM5-1抗體序列的多聚核苷酸。這種組合還包括合適的賦形劑，如本領(lǐng)域所熟知的包括緩沖液在內(nèi)的藥學(xué)上可接受的賦形劑。
本發(fā)明還涵蓋了包括有效劑量的上述抗體和有效劑量的抗腫瘤制劑的組合?？鼓[瘤制劑可以是治療黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌的制劑。
本發(fā)明還提供了分離的SM5-1的靶抗原，其包含與上述抗體特異結(jié)合的蛋白。在某些具體的情況下，分離的SM5-1是一種人的抗原。在某些具體的情況下，分離的SM5-1抗原是糖基化的蛋白。在另一些具體的情況下，分離的SM5-1抗原是一種非糖基化的蛋白。在某些具體的情況下，分離的SM5-1抗原是上述的A230或A180片段。在某些具體的情況下，分離的SM5-1抗原可自黑色素瘤、乳腺癌和/或肝細(xì)胞癌細(xì)胞中分離獲得。
D、多聚核苷酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供了編碼該發(fā)明中的抗體(如輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)包含SEQID NO2和SEQ ID NO1的多肽序列，輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10和SEQ ID NO9的多肽序列)的分離的核酸分子，以及包含該多聚核苷酸分子的載體和宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼上述多肽(包括抗體片段)的多聚核苷酸分子。
另一方面，本發(fā)明提供了組合(如藥學(xué)上的組合)，組合中包括本發(fā)明的多聚核苷酸分子。在某些具體的情況下，多聚核苷酸包含SEQ ID NO11或SEQ ID NO12中的核苷酸序列。另一具體的情況是多聚核苷酸包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6中的核苷酸序列。另一具體的情況是組合中包括含有編碼上述抗體的多聚核苷酸的表達(dá)載體。另一具體的情況是組合包括上述一種或兩種多聚核苷酸。表達(dá)載體及多聚核苷酸的應(yīng)用下文有詳細(xì)說(shuō)明。
另一方面，本發(fā)明提供了制備上述多聚核苷酸的方法。
與本發(fā)明所述序列互補(bǔ)的多聚核苷酸也包括其中。多聚核苷酸可以為單鏈(編碼鏈或反意義鏈)或雙鏈，也可以是DNA(基因組，cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其包含有內(nèi)含子，并與DNA分子呈一一對(duì)應(yīng)方式以及不包含內(nèi)含子的mRNA分子。另外編碼或非編碼序列可以但非必須出現(xiàn)于本發(fā)明的多聚核苷酸中，多聚核苷酸可以但非必須與支持物相連。
多聚核苷酸可以包括一個(gè)天然序列(如編碼抗體或其片段的內(nèi)源性序列)或包含這樣序列的一個(gè)可變區(qū)。多聚核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)可替代區(qū)域，而且刪除這些區(qū)域或插入片段，其編碼多肽的免疫反應(yīng)性與天然分子的免疫反應(yīng)性相比并不會(huì)減弱。對(duì)編碼多肽免疫反應(yīng)性的影響可以通過(guò)如下描述的方法評(píng)定。多聚核苷酸的變化形式較佳的至少含有70％，更佳的至少含有80％以及最佳的含有90％的與編碼天然抗體或其片段的多聚核苷酸序列等同的序列。
如果兩個(gè)序列的核苷酸或氨基酸序列如下所述排列比較時(shí)相同，則兩個(gè)多聚核苷酸或多肽序列視為等同。兩個(gè)序列的比較通常通過(guò)比較窗進(jìn)行，鑒定及比較區(qū)域序列的相似性。上述的比較窗指至少約20個(gè)臨近的位點(diǎn)，通常將兩個(gè)序列最佳的排列好之后，與參考序列比較30到約75，40到約50的相應(yīng)的臨近位點(diǎn)。
比較序列的最佳排列可以使用生物信息軟件-Lasergene套裝軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign，應(yīng)用缺省參數(shù)。這一程序具體為下述文獻(xiàn)中描述的幾種排列技術(shù)Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods inEnzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.andSharp，P.M.，1989，CABIOS 5151-153；Myers，E.W.and Muller W.，1988，CABIOS411-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.and Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
序列一致性百分比通過(guò)如下的方法確定比較兩個(gè)最佳排列序列的比較窗中至少20個(gè)位點(diǎn)，比較窗中的多聚核苷酸或多肽序列與參考序列(不含插入或缺失)相比可能含有20％或更少如5-15％或10-12％的插入或缺失。確定兩個(gè)序列中相一致的核苷酸或氨基酸相同的位點(diǎn)獲得相匹配的位點(diǎn)數(shù)，相匹配的位點(diǎn)數(shù)除以參考序列的總的為位點(diǎn)數(shù)(如窗口的大小)，乘以100而獲得序列一致性百分比。
變化形式還包括其部分序列選擇性的被天然基因的同源序列取代的情況。這種多聚核苷酸的變化形式在中等強(qiáng)度的條件下可與編碼天然抗體的序列(或其互補(bǔ)序列)發(fā)生雜交反應(yīng)。
適合的中等強(qiáng)度的條件包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)中預(yù)雜交；50℃-65℃，5X SSC雜交過(guò)夜；以及含0.1％SDS的2X，0.5X及0.2XSSC于65℃洗滌20分鐘，各兩次。
如上所述，高強(qiáng)度的條件為(1)使用低離子強(qiáng)度及高的溫度洗滌，如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，50℃；(2)雜交過(guò)程使用變性劑，如福爾馬林，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)的福爾馬林/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5含750mM氯化鈉及75mM檸檬酸鈉，42℃；(3)或使用50％的福爾馬林，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M sodium citrate)，50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)，0.1％的焦磷酸鈉，5x Denhardt’s溶液，超聲降解的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，及10％的硫酸右旋糖苷，42℃，0.2 x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)42℃及50％的福爾馬林55℃洗滌，以及隨后的高強(qiáng)度的含EDTA的0.1 x SSC于55℃洗滌。熟練的技術(shù)工作人員知道如何根據(jù)提供的條件如檢測(cè)長(zhǎng)度等調(diào)整溫度，離子強(qiáng)度等條件。
通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，依據(jù)基因密碼子的簡(jiǎn)并性，可得到編碼上述抗體的許多核酸序列。某些這樣的多聚核苷酸與天然基因的核苷酸序列具有最低的同源性。本發(fā)明已預(yù)期了由于使用不同密碼子而產(chǎn)生的多聚核苷酸的變化形式。而且包含這里提供多聚核苷酸序列的等位基因也在本發(fā)明的范圍。等位基因是發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)突變的內(nèi)源性基因，如核苷酸的刪除、添加或取代。其相應(yīng)的mRNA及蛋白質(zhì)可以但是并非必須發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能的改變。等位基因可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)(如雜交，擴(kuò)增和/或序列數(shù)據(jù)庫(kù)的比較)進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的多聚核苷酸可以通過(guò)化學(xué)合成的方法、重組方法或PCR獲得?；瘜W(xué)合成多聚核苷酸的方法已為本領(lǐng)域所熟知，這里沒(méi)有詳細(xì)描述。可使用本領(lǐng)域中的技術(shù)根據(jù)上述的序列通過(guò)商業(yè)化的DNA合成儀合成預(yù)期的DNA序列。
利用重組的方法制備多聚核苷酸，可將包含預(yù)期序列的多聚核苷酸可以插入合適的載體，而后載體轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。多聚核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法插入宿主細(xì)胞。細(xì)胞通過(guò)直接攝取，胞吞，轉(zhuǎn)染，F(xiàn)-雜交或電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)化外源的多聚核苷酸分子。外源多聚核苷酸一旦轉(zhuǎn)入細(xì)胞，就可以以非整合的載體(如質(zhì)粒)或整合入宿主細(xì)胞基因組而在細(xì)胞內(nèi)維持。因此多聚核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增，分離。參見(jiàn)Sambrook et al.(1989)。
PCR也可以完成DNA序列的復(fù)制。PCR技術(shù)已為本領(lǐng)域所熟知，可參見(jiàn)美國(guó)專利4,683,195，4,800,159，4,754,065及PCRThe Polymerase Chain Reaction，Mullis et al.eds.，Birkauswer Press，Boston(1994)。
RNA可以通過(guò)分離位于合適載體中的DNA并插入到合適的宿主細(xì)胞獲得。細(xì)胞復(fù)制時(shí)，DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，RNA可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分離得到，參見(jiàn)Sambrook etal.，(1989)。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)構(gòu)建或從本領(lǐng)域可獲得的大量的克隆載體中選擇獲得合適的克隆載體?？寺≥d體要根據(jù)打算應(yīng)用的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，有用的克隆載體通常具有自主復(fù)制的能力，具有特定限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，和/或具有篩選含有載體的陽(yáng)性克隆的標(biāo)志基因。適當(dāng)?shù)膶?shí)例包括質(zhì)粒、細(xì)菌病毒，如pUC18，，pUC19，，pUC57，，pMG18-3K，Bluescript(e.g.，pBS SK+，pBS SK-)及其派生物，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌體DNA，以及穿梭載體如pSA3及pAT28。這些以及許多其他的克隆載體已商業(yè)化，可自BioRad，Strategene，及Invitrogen.等廠商購(gòu)得。
表達(dá)載體通?？梢詮?fù)制包含本發(fā)明多聚核苷酸序列的的多聚核苷酸結(jié)構(gòu)。因此表達(dá)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)必須以附加體或整合成為染色體DNA的一部分的方式進(jìn)行復(fù)制。合適的表達(dá)載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒載體，包括腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒及噬粒。載體的元件通常包括但并不限于一個(gè)或多個(gè)下列成分信號(hào)序列；復(fù)制起始位點(diǎn)；一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志基因；適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄控制元件(如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，終止子)。為了表達(dá)(即翻譯)，通常還需要一個(gè)或多個(gè)翻譯控制元件，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始位點(diǎn)以及終止密碼子。
含有插入的多聚核苷酸序列的載體可以通過(guò)多種適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入宿主細(xì)胞，包括電轉(zhuǎn)化，應(yīng)用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖苷或其他物質(zhì)轉(zhuǎn)染；微注射；脂質(zhì)體；感染(載體具有感染性如牛痘病毒)。導(dǎo)入載體或多聚核苷酸的方法的選擇通常取決于宿主細(xì)胞的特征。
本發(fā)明還提供了包含上述多聚核苷酸的宿主細(xì)胞。任何可以高表達(dá)異源DNA的宿主細(xì)胞都可用于編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白基因的分離。非限制性的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于COS，HeLa，及CHO細(xì)胞。合適的非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞(如大腸桿菌或B.subtillis)及酵母(如S.cerevisae，S.pombe或K.lactis)。宿主細(xì)胞cDNA的表達(dá)量較佳的要超過(guò)宿主細(xì)胞內(nèi)源性抗體或目的蛋白(如果存在的話)表達(dá)量的5倍以上，更佳的要超過(guò)10倍以上，最佳的要超過(guò)20倍以上。篩選表達(dá)與SM5-1靶抗原結(jié)合的特異抗體的宿主細(xì)胞可以通過(guò)免疫分析或流式細(xì)胞術(shù)完成。可以鑒定出高表達(dá)目的抗體或蛋白的細(xì)胞。
E、利用特異結(jié)合于SM5-1抗原的抗體進(jìn)行腫瘤診斷的方法一方面，本發(fā)明提供了樣本中人SM5-1靶抗原的方法，該方法包括a)自受試者獲得樣本；b)上述樣本與SM5-1靶抗原特異結(jié)合的抗體的結(jié)合。c)通過(guò)分析樣本中人SM5-1靶抗原與抗體的結(jié)合來(lái)判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。
上述的SM5-1靶抗原特異性的抗體可以用于鑒定腫瘤細(xì)胞的存在與否，包括但不限于黑色素瘤，乳腺癌，肝細(xì)胞癌的診斷。檢測(cè)通常包括了上述SM5-1靶抗原特異性抗體與細(xì)胞抗原的結(jié)合以及抗原抗體復(fù)合物的形成。這種復(fù)合物的形成可以在體外或是體內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種利用上述抗體或多肽幫助腫瘤診斷的方法。所述的幫助診斷的方法是指這些方法有助于判斷腫瘤的分類或特征，其可以或不可以作出最后的明確的診斷。幫助腫瘤診斷的方法可以包括檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的生物樣本的SM5-1靶抗原的水平以及樣本中SM5-1靶抗原的表達(dá)水平。
一種將抗體用于腫瘤的體內(nèi)影象學(xué)診斷是連接標(biāo)記試劑(如熒光試劑，放射性或放射非穿透性制劑)于抗體，該抗體應(yīng)用于個(gè)體后通過(guò)X-射線或其他影響學(xué)設(shè)備觀測(cè)標(biāo)記抗體在表面表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞的分布位置。所用抗體的濃度在生理?xiàng)l件下可以促進(jìn)與靶抗原的結(jié)合。標(biāo)記物為本領(lǐng)域所熟知。
另一方面，去除腫瘤細(xì)胞并利用本領(lǐng)域熟知的方法制備免疫組織化學(xué)檢測(cè)的組織(包埋入冰凍復(fù)合物，冰凍，切片，固定或不固定；固定或石蠟包埋，使用或不使用各種抗原修復(fù)及染色方法)?？贵w還可以用于鑒定不同進(jìn)展期的腫瘤細(xì)胞?？贵w還可以用于確定哪些患者腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)可確定水平的相應(yīng)抗原從而作為應(yīng)用針對(duì)所述抗原的抗體進(jìn)行免疫治療的候選者。
識(shí)別抗原的抗體(或多肽)可用于發(fā)明檢測(cè)腫瘤活細(xì)胞或死細(xì)胞釋放或分泌于體液，包括但不限于血液，唾液，尿液，肺部的積液或腹水中的抗原的免疫分析方法。利用本發(fā)明的抗體進(jìn)行診斷的方法在任何形式的抗腫瘤治療之前或之后都是十分有用的，如化療或放療，確定何種腫瘤對(duì)給予的治療反應(yīng)性更佳，腫瘤患者的預(yù)后，腫瘤的亞型分析，轉(zhuǎn)移性腫瘤的原發(fā)灶以及腫瘤的進(jìn)展及其對(duì)治療的反應(yīng)。
F、治療中應(yīng)用SM5-1抗原特異性抗體的方法。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，該方法包括應(yīng)用有效劑量的SM5-1抗原特異性的抗體(如huSM5-1及ReSM5-1)于需要該種處理的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明所述的抗體可以用于患有各種腫瘤個(gè)體的治療，包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌及肝細(xì)胞癌。在某些具體的情況下，抗體用于腫瘤患者的被動(dòng)免疫。在某些具體情況下，應(yīng)用的抗體通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。在某些具體情況下，抗體用于治療人類腫瘤患者。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，該方法包括應(yīng)用有效劑量的藥物組合，組合包括有效劑量的上述SM5-1抗原特異性的抗體以及有效劑量的抗腫瘤制劑于需要該種處理的哺乳動(dòng)物。在某些具體的情況下，抗腫瘤制劑為治療黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌的制劑。
本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)caspase-10介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括包括應(yīng)用有效劑量的上述SM5-1抗原特異性的抗體于需要該種誘導(dǎo)的細(xì)胞。在某些具體的情況下，細(xì)胞為黑色素瘤細(xì)胞。在某些具體情況下，細(xì)胞位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
可以應(yīng)用多種形式的上述抗SM5-1抗體以及抗體或抗體片段(如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v，F(xiàn)c等)的等價(jià)物，如嵌合抗體單鏈抗體(ScFv)，以及它們的突變體，包含抗體片段的融合蛋白，人源化抗體，連接毒素或放射性同位素的抗體及其他包含所需特異性的改形抗體。在另外一些具體的情況下，抗體或其多種形式(包括上述的具體組成)以及藥學(xué)上可以接受的賦形劑可以多種形式應(yīng)用。藥學(xué)上可接受的賦形劑在本領(lǐng)域是眾所周知的，其為相對(duì)惰性的物質(zhì)，可以使藥學(xué)上有效的物質(zhì)應(yīng)用更加容易。例如賦形劑可賦予藥物堅(jiān)固的外形，或作為溶劑。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括但不限于穩(wěn)定劑，濕化及乳化劑，提供不同滲透壓的鹽類，膠囊劑，緩沖液及透皮劑。用于腸胃外和非腸胃外的給藥的賦形劑以及劑型，在Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)中有描述。
通常這些制劑構(gòu)成供注射使用的形式(如腹腔注射，靜脈注射，皮下注射，肌肉注射)，但其他應(yīng)用的形式(如口服，粘摸等)也可使用?？贵w及其等價(jià)物最好與藥學(xué)上可接受的載體如鹽水，林格氏液，右旋糖苷等聯(lián)合應(yīng)用。確切的投藥方法如劑量，時(shí)間，重復(fù)給藥取決于具體的個(gè)體以及該個(gè)體的就醫(yī)史。通常，應(yīng)用劑量至少為100ug/kg體重，250ug/kg體重，750ug/kg體重，3mg/kg體重，5mg/kg體重及10mg/kg體重。如每天應(yīng)用1-200mg的劑量?？贵w可以注入腫瘤局部(Irieet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838694-8698(1986))或全身應(yīng)用(特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤)。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，藥物的半衰期通常會(huì)決定使用的劑量。與人體免疫系統(tǒng)相容的抗體如人源化抗體及全人源抗體，可以延長(zhǎng)抗體的半衰期并防止宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。給藥頻率可在治療期間確定和調(diào)整，基于減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，維持腫瘤細(xì)胞的減少，降低腫瘤細(xì)胞的增殖或是延遲腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。腫瘤細(xì)胞的存在可由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法或這里討論的方法(如免疫組化，活檢或生物樣品的流式細(xì)胞檢測(cè))鑒定。也可選擇持續(xù)釋放抗體的長(zhǎng)效形式。獲得長(zhǎng)效釋放的形式及工具為本領(lǐng)域所熟知。
在一種具體的情況下，抗體劑量可以根據(jù)給藥一次或多次的個(gè)體依經(jīng)驗(yàn)確定。一些個(gè)體給予逐漸增加劑量的抗體。為評(píng)價(jià)抗體的療效，可以隨訪腫瘤狀態(tài)特異性的標(biāo)志分子。這包括觀察或用卡尺直接測(cè)量腫瘤的大小，通過(guò)X射線或其他成像技術(shù)間接測(cè)量腫瘤大?。煌ㄟ^(guò)直接的腫瘤活檢及腫瘤樣本的顯微鏡檢判斷其有否改善；腫瘤間接標(biāo)志的檢測(cè)，疼痛或麻痹的減輕，語(yǔ)言、視力、呼吸以及其他腫瘤相關(guān)的能力降低的改善；食欲改善；或通過(guò)可接受的測(cè)定方法檢測(cè)的生活質(zhì)量的提高及生存期的延長(zhǎng)。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，投藥劑量要依據(jù)不同的個(gè)體、腫瘤的不同類型、腫瘤的分期、腫瘤有否轉(zhuǎn)移、個(gè)體的其他狀態(tài)以及過(guò)去及當(dāng)前應(yīng)用的處理而有所不同。
其他的形式包括本領(lǐng)域熟知的轉(zhuǎn)運(yùn)形式包括但不限于載體，如脂質(zhì)體。參見(jiàn)Mahato et al.(1997)Pharm.Res.14853-859。脂質(zhì)體包括但不限于cytofectins，多層載體及單層載體。
在某些具體的情況下，可以出現(xiàn)一種以上的抗體或其他制劑?？贵w可以為單克隆抗體或多克隆抗體。這種組合包括至少一種，至少兩種，至少三種，至少四種，至少五種不同的抗癌、腺癌、肉瘤或腺肉瘤的抗體。如本領(lǐng)域時(shí)常指出的那樣，抗體混合物可用于治療很寬范圍的個(gè)體。
G、包含本發(fā)明抗體的試劑盒本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)和/或治療的包含抗體的試劑盒。在某些具體的情況下，試劑盒包含上述抗體。本發(fā)明的試劑盒有合適的包裝，并且有選擇的提供附加試劑，如緩沖液及上述方法中抗體的使用說(shuō)明。
一個(gè)方面，試劑盒可以用于上述的任何方法，包括治療患腫瘤的個(gè)體。在某些具體的情況下，試劑盒包括有效劑量的上述抗體以及所述抗體的使用說(shuō)明。
另一方面，本發(fā)明提供了分析樣本中人源SM5-1靶抗原的試劑盒，試劑盒中包含上述的抗體以及通過(guò)分析抗體與SM5-1靶抗原的結(jié)合，從而判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。在某些具體情況下，試劑盒包括分析方法的說(shuō)明。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的人源化單克隆抗體/嵌合抗體不僅保留了鼠源SM5-1單克隆抗體的高敏感性、特異性等生物活性，而且在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)高表達(dá)，更適合應(yīng)用于人用藥物和臨床治療。
(2)本發(fā)明的單克隆抗體可作用于多種腫瘤細(xì)胞系，包括但不限于黑色素瘤、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌等的細(xì)胞系。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1huSM5-1抗原的篩選和鑒定一.構(gòu)建肝細(xì)胞癌細(xì)胞株QYC的cDNA文庫(kù)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞QYC(購(gòu)自上海國(guó)際合作腫瘤研究所)用Trizol試劑提取總RNA。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法分離mRNA并合成cDNA(Marken JS.PNAS，1992，893503-3507)，補(bǔ)平后與BstXI酶切位點(diǎn)的接頭相連，經(jīng)BstXI酶切后克隆到哺乳動(dòng)物瞬時(shí)表達(dá)載體pCDM8(購(gòu)自Invitrogen公司)中，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3(購(gòu)自Invitrogen公司)，構(gòu)成cDNA文庫(kù)。
二.文庫(kù)的表達(dá)和篩選用以上構(gòu)建的cDNA文庫(kù)按lipofectin法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(Invitrogen)。12小時(shí)后胰酶消化細(xì)胞后鋪于新的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收集細(xì)胞，重懸于含鼠源單抗SM5-1(ATCC HB-12588)的PBS/10mM EDTA/5％FBS液中，冰浴1小時(shí)，細(xì)胞經(jīng)洗滌后重懸于PBS/EDTA/0.5％FBS液中，將細(xì)胞分別鋪到10個(gè)用羊抗鼠IgG抗體包被的分篩皿中，室溫靜置2小時(shí)后用PBS/EDTA/5％FBS液輕輕洗滌，去掉未與抗體結(jié)合的細(xì)胞，然后收集吸附在分篩皿上的細(xì)胞，采用Hirt法(薩姆布魯克J，弗里齊E，曼尼阿提斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版)回收細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/p3進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)成一個(gè)新的cDNA文庫(kù)。
如上所述，經(jīng)過(guò)4輪轉(zhuǎn)染、表達(dá)、分篩和質(zhì)粒回收，將最后一次用Hirt法回收的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3后鋪板，隨機(jī)挑取多個(gè)單克隆擴(kuò)增、抽提質(zhì)粒，并分別用Lipofectin法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12小時(shí)后，胰酶消化細(xì)胞并鋪于新的培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后加入單抗SM5-1，并用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗染色，最后在熒光顯微鏡下觀察，鑒定出陽(yáng)性克隆。
自篩選到的陽(yáng)性克隆分離質(zhì)粒，并對(duì)編碼SM5-1的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序分析。SM5-1的胞外區(qū)克隆入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。SM5-1抗原的胞外區(qū)自無(wú)血清培養(yǎng)上清經(jīng)親和層析(交聯(lián)鼠SM5-1單抗的Sepharose-4B)純化獲得。
實(shí)施例2從人抗體庫(kù)中篩選huSM5-1可變區(qū)基因按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法構(gòu)建人源抗體庫(kù)。
將復(fù)蘇的抗體庫(kù)菌株1毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培養(yǎng)16小時(shí)。
菌液12000rpm高速離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)無(wú)菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆?。其滴度?yīng)在2×1011以上。以實(shí)施例1純化的抗原A230(SM5-1)包被25毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在包被后的細(xì)胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體顆粒，37℃溫育1小時(shí)。然后，倒掉瓶中的液體，用10毫升含1％Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。洗脫緩沖液洗下粘附的噬菌體顆粒并加入1毫升對(duì)數(shù)期的TG1細(xì)胞，37℃溫育震蕩培養(yǎng)16小時(shí)。
重復(fù)上段所述步驟共4次。
將上述獲得的細(xì)胞稀釋至105/毫升，然后在含0.1％氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得單克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上培養(yǎng)，每孔一個(gè)克隆，共作960個(gè)克隆(10塊96孔板)。將上述深孔板在96孔板離心機(jī)上5000RPM離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的無(wú)菌深孔板，封口后保藏于4℃?zhèn)溆谩?br> 取10塊96孔板，每孔中加入A230抗原(10微克/毫升)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37℃溫育1小時(shí)后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。加入1微升HRP標(biāo)記的羊抗M13單抗，37℃溫育30分鐘后用含1％Tween-20的PBS洗滌10次。
加入100微升TMB顯色底物溶液，96孔板室溫避光顯色5-20分鐘，加入50微升終止緩沖液后，酶標(biāo)儀讀取450納米處的光吸收值。
通過(guò)上述過(guò)程共篩選出415個(gè)陽(yáng)性克隆。顯色反應(yīng)強(qiáng)的孔，其相對(duì)應(yīng)的克隆即為包含較強(qiáng)親和力的抗體可變區(qū)的克隆。依據(jù)光吸收值，篩選得到5個(gè)親和力強(qiáng)的克隆。取親和力最強(qiáng)克隆，即含有本發(fā)明單抗huSM5-1可變區(qū)的克隆，用于后續(xù)的研究。HuSM5-1重鏈氨基酸及核苷序列(SEQ ID NOs9和11)及輕鏈氨基酸及核苷酸序列(SEQ ID NOs10及12)列于下表1中。
表1. huSM5-1重鏈及輕鏈可變區(qū)氨基酸及核苷酸序列

實(shí)施例3huSM5-1單克隆抗體的制備一.huSM5-1表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR將XbaI酶切位點(diǎn)及單抗OKT3的信號(hào)肽加至huSM5-1重鏈可變區(qū)基因的5’端，NheI酶切位點(diǎn)加至3’端。單抗OKT3的信號(hào)肽氨基酸序列為MDFQVQIFSFLLISASVIISRG(SEQ ID NO13)，其核苷酸序列為ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGAG(SEQ ID NO14)。將上述PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體進(jìn)行測(cè)序確證。重鏈可變區(qū)經(jīng)XbaI和NheI酶切后插入圖1所示的pMG18-3K表達(dá)載體(from Development oftools for environmental monitoring based on incp-9 plasmid sequences.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas school of biologicalsciences，university of Bermingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UKand Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)。
利用PCR將HindIII酶切位點(diǎn)及單抗OKT3的信號(hào)肽加至huSM5-1輕鏈可變區(qū)基因的5’端，BsiWI酶切位點(diǎn)加至3’端。將上述PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體進(jìn)行測(cè)序確證。輕鏈可變區(qū)經(jīng)HindIII和BsiWI酶切后插入pMG18-3K表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)。
二、人源SM5-1的表達(dá)及純化轉(zhuǎn)染之前，CHOdhfr-細(xì)胞培養(yǎng)于含有甘氨酸、次黃嘌呤及胸腺嘧啶(GHT)的完全DMEM培養(yǎng)基。上述表達(dá)載體用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen，Garlsbad，CA)按廠商說(shuō)明操作，轉(zhuǎn)入CHOdhfr-細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無(wú)GHT的DMEM中選擇培養(yǎng)，逐漸提高M(jìn)TX的濃度至1.0mM。挑出抗性克隆擴(kuò)增后進(jìn)行后續(xù)的分析。挑出的克隆培養(yǎng)上清用夾心ELISA法分析抗體的表達(dá)量，羊抗人IgG(Fc)(KPL)為包被抗體，羊抗人κ-HRP(KPL)為檢測(cè)抗體，純化的人IgG1/Kappa(Sigma)作為標(biāo)準(zhǔn)品。挑選出抗體表達(dá)量最高的克隆進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)的適應(yīng)。重組抗體的無(wú)血清培養(yǎng)上清通過(guò)ProteinA親和層析純化。
實(shí)施例4SM5-1嵌合(chSM5-1)及人源化(reSM5-1)單克隆抗體的構(gòu)建1.鼠源SM5-1單抗重鏈及輕鏈克變區(qū)基因的克隆。用Trizol試劑(GibcoBRL，Grand Island，NY)提取SM5-1雜交瘤細(xì)胞(ATCC Designation No.HB-12588)的RNA。按照廠商的說(shuō)明操作，用5’RACE系統(tǒng)克隆雜交瘤細(xì)胞的mSM5-1重鏈及輕鏈克變區(qū)基因。最終的PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體(Promega，Madison，WI)測(cè)序確正。重鏈克變區(qū)(mSM5-1VH)及輕鏈可變區(qū)(mSM5-1VL)的核苷酸序列及推定的氨基酸序列如下表2。
表2.mSM5-1可變區(qū)的核苷酸及氨基酸序列


2.嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建上述mSM5-1重鏈及輕鏈可變區(qū)用于構(gòu)建人鼠嵌合抗體。嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建采取與實(shí)施例3中huSM5-1相同的方法。
轉(zhuǎn)染之前，CHOdhfr-細(xì)胞培養(yǎng)于含有甘氨酸、次黃嘌呤及胸腺嘧啶(GHT)的完全DMEM培養(yǎng)基。含有chSM5-1重鏈及輕鏈的表達(dá)載體pMG18-3K用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen，Garlsbad，CA)按廠商說(shuō)明操作，轉(zhuǎn)入CHOdhfr-細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無(wú)GHT的DMEM中選擇培養(yǎng)，逐漸提高M(jìn)TX的濃度至1.0mM。挑出抗性克隆擴(kuò)增后進(jìn)行后續(xù)的分析。挑出的克隆培養(yǎng)上清用夾心ELISA法分析抗體的表達(dá)量，羊抗人IgG(Fc)(KPL)為包被抗體，羊抗人κ-HRP(KPL)為檢測(cè)抗體，純化的人IgG1/Kappa(Sigma)作為標(biāo)準(zhǔn)品。挑選出抗體表達(dá)量最高的克隆進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)的適應(yīng)。重組抗體的無(wú)血清培養(yǎng)上清通過(guò)ProteinA親和層析純化。
3.人源化SM5-1(reSM5-1)表達(dá)載體的構(gòu)建人抗體KOL重鏈可變區(qū)用作人源化抗體重鏈的框架區(qū)，人Bence-Jones蛋白R(shí)EI用作輕鏈的框架區(qū)。輕鏈及重鏈的三個(gè)CDR區(qū)移植入人抗體輕鏈及重鏈的框架區(qū)產(chǎn)生人源化抗體的基因。人源化抗體的輕鏈及重鏈可變區(qū)基因用overlapping PCR的方法合成。人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建與上述嵌合抗體的方法相同。
如圖2所示，輕鏈或重鏈的三個(gè)CDR區(qū)直接移植入人抗體輕鏈或重鏈的框架區(qū)產(chǎn)生人源化抗體的基因。人源化抗體的輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)基因克隆至表達(dá)載體pMG18-3K并在COS細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，產(chǎn)生人源化的SM5-1。COS細(xì)胞培養(yǎng)上清的reSM5-1表達(dá)量通過(guò)ELISA鑒定，其與肝細(xì)胞癌細(xì)胞QYC的結(jié)合能力通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)確定。抗原結(jié)合活性分析表明該抗體與人黑色素瘤細(xì)胞的結(jié)合能力很差。這提示某些框架區(qū)的氨基酸必須改變以回復(fù)抗體的結(jié)合活性。通過(guò)分析確定可能影響抗體結(jié)合活性的重要的框架區(qū)氨基酸并進(jìn)行回復(fù)突變。最終我們獲得了與chSM5-1具有相同抗原結(jié)合活性的人源化抗體。人源化SM5-1命名為ReSM5-1，其輕鏈及重鏈可變區(qū)的氨基酸及核苷酸序列如下表3。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，ReSM5-1顯示了與mSM5-1及chSM5-1具有相同的親和力。
表3.ReSM5-1可變區(qū)的氨基酸及核苷酸序列

4.人源化抗體的純化轉(zhuǎn)染之前，CHOdhfr-細(xì)胞培養(yǎng)于含有甘氨酸、次黃嘌呤及胸腺嘧啶(GHT)的完全DMEM培養(yǎng)基。合適的表達(dá)載體pMG18-3K用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen，Garlsbad，CA)按廠商說(shuō)明操作，轉(zhuǎn)入CHOdhfr-細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無(wú)GHT的DMEM中選擇培養(yǎng)，逐漸提高M(jìn)TX的濃度至1.0mM。挑出抗性克隆擴(kuò)增后進(jìn)行后續(xù)的分析。挑出的克隆培養(yǎng)上清用夾心ELISA法分析抗體的表達(dá)量，羊抗人IgG(Fc)(KPL)為包被抗體，羊抗人κ-HRP(KPL)為檢測(cè)抗體，純化的人IgG1/Kappa(Sigma)作為標(biāo)準(zhǔn)品。挑選出抗體表達(dá)量最高的克隆進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)的適應(yīng)。重組抗體的無(wú)血清培養(yǎng)上清通過(guò)ProteinA親和層析純化。
實(shí)施例5huSM5-1的生物學(xué)活性1.huSM5-1對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的作用在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑色素瘤A2058細(xì)胞株至106/毫升。96孔板每孔加入20ul上述細(xì)胞懸浮液和不同量的單抗huSM5-1(0，1，5，10，20，50，100ul；單抗溶于含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，濃度為1μg/ul)，每孔加入含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基至500ul。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后顯微鏡檢或MTT染色后確定活細(xì)胞數(shù)。
(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)。從上述樣品中取出0.2毫升進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果以檢測(cè)孔存活細(xì)胞占對(duì)照孔(不加huSM5-1)存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示，具體數(shù)據(jù)如下huSM5-1加入量(ul) 01 5 102050100細(xì)胞存活數(shù)(％) 100.087.8 68.8 53.2 42.6 32.6 22.6上述結(jié)果說(shuō)明，huSM5-1單抗具有明顯的殺傷人黑色素瘤細(xì)胞的作用。
(2)MTT檢測(cè)取經(jīng)過(guò)huSM5-1單抗處理的細(xì)胞0.2毫升，加入1/10體積濃度為5mg/ml的MTT溶液，37℃培養(yǎng)30分鐘后在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的光吸收值。結(jié)果如下表，經(jīng)過(guò)huSM5-1單抗處理的細(xì)胞比未經(jīng)處理的對(duì)照光吸收明顯降低。
huSM5-1加入量(ul)0 1 5 102050100光吸收(％) 100.0 96.384.9 66.2 47.7 33.6 20.1從上述兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果可以看出，huSM5-1單抗在體外可以明顯抑制人黑色素瘤細(xì)胞的增殖，因此可能在臨床上用于黑色素瘤的治療。
2.流式細(xì)胞分析SM5-1特異性抗原的表達(dá)利用huSM5-1對(duì)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了分析，使用的細(xì)胞系有乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3，MDA-MB-231，BT-20-T，MDA-MB-468和MCF-7；黑色素瘤細(xì)胞系CRL-1872，U10；肝細(xì)胞癌細(xì)胞系QYC，LYX，XJC。
研究發(fā)現(xiàn)，SM5-1特異性抗原不僅表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞，還表達(dá)于乳腺癌及肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
取上述細(xì)胞系細(xì)胞，與適當(dāng)稀釋的huSM5-1溫育1小時(shí)，然后用PBS洗滌細(xì)胞5次，再與FITC標(biāo)記的羊抗人IgG(2mg/ml，Jackson ImmuinoresearchLaboratories，West Grove，PA)溫育40分鐘，含1％福爾馬林的PBS固定后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
結(jié)果見(jiàn)圖3。乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3，MDA-MB-231，MCF-7；黑色素瘤細(xì)胞系CRL-1872；肝細(xì)胞癌細(xì)胞系QYC，LYX，表達(dá)高水平或中等水平的SM5-1特異性抗原；SM5-1特異性抗原在乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3，BT-20-T，肝細(xì)胞癌細(xì)胞XJC以及黑色素瘤細(xì)胞系U10中表達(dá)較低。
這些結(jié)果證實(shí)SM5-1特異性抗原表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞，乳腺癌及肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
為了確定huSM5-1識(shí)別的抗原決定簇，抽提的肝細(xì)胞癌細(xì)胞QYC的膜蛋白用huSM5-1抗體進(jìn)行免疫沉淀，鼠抗人CD4作為陰性對(duì)照，然后進(jìn)行Western印跡測(cè)定。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量為230kD和180kD的兩種蛋白具有huSM5-1特異性的抗原決定簇(圖4)。
3.huSM5-1誘導(dǎo)caspase-10相關(guān)的細(xì)胞凋亡為了測(cè)定caspase是否在huSM5-1誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮作用，檢測(cè)了多種不同的caspase抑制劑對(duì)凋亡抑制率的影響。Caspase抑制劑包括普通caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)，caspase-1抑制劑(Z-WEHD-FMK)，caspase-2抑制劑(Z-VDVAD-FMK)，caspase-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)，caspase-4抑制劑(Z-YVAD-FMK)，caspase-6抑制劑(Z-VE ID-FMK)，caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)，caspase-9抑制劑(Z-LEHD-FMK)，caspase-10抑制劑(Z-AVED-FMK)，caspase-13抑制劑(Z-LEED-FMK)。在50uM/L濃度下，caspase抑制劑與QYC細(xì)胞共同溫育2小時(shí)，之后細(xì)胞用50ng/ml huSM5-1抗體處理。這些caspase抑制劑的抑制率分別為pan-caspase(72％)，caspase-10抑制劑(52％)，caspase-6抑制劑(28％)，caspase-1抑制劑(27％)，caspase-8抑制劑(17％)，caspase-13抑制劑(15％)，caspase-4抑制劑(14％)，caspase-9抑制劑(5％)，caspase-2抑制劑(1％)，caspase-3抑制劑(1％)。依據(jù)上述結(jié)果，pan-caspase能夠最大抑制huSM5-1誘導(dǎo)的凋亡，caspase-10也可有效的抑制這種凋亡，比其他的caspase抑制劑具有高的抑制效率，這表明huSM5-1誘導(dǎo)的凋亡是caspase依賴性的，caspase-10是對(duì)huSM5-1誘導(dǎo)凋亡影響最大的一種caspase。
為了進(jìn)一步證明huSM5-1誘導(dǎo)的凋亡是caspase-10相關(guān)的，使用caspase-10比色分析試劑盒測(cè)定了QYC和JXC中caspase-10酶活性的升高。Caspase-10的活性通過(guò)caspase-10分析試劑盒(美國(guó)R&D公司)來(lái)測(cè)定，按照廠家的說(shuō)明書(shū)操作。將細(xì)胞與50ng/ml huSM5-1抗體孵育一定時(shí)間，離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移棄去上清，加入溶解緩沖液(25ul/1×106細(xì)胞)溶解，在冰上放置10分鐘，離心，轉(zhuǎn)移上清至新的管中，置于冰上保存。Caspase活性的酶反應(yīng)在96孔微量滴定板上進(jìn)行。每一反應(yīng)需要50ul細(xì)胞溶解液上清，50ul 2X反應(yīng)緩沖液，10ul新鮮DTT貯存液。加入5ul caspase-10比色底物(AEVD-pNA)，在37℃溫育1-2小時(shí)。酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm。Caspase-10相關(guān)的活性的增加通過(guò)下式計(jì)算Caspase-10活性(％)＝(B-C)/(A-C)×100％其中，A表示未用huSM5-1抗體處理的細(xì)胞的OD值；B表示用huSM5-1抗體處理的細(xì)胞的OD值；C表示陰性對(duì)照的OD值。每種處理設(shè)置3復(fù)孔。
結(jié)果如圖5。用huSM5-1處理的QYC細(xì)胞，caspase-10活性增加從13％(48h)至51％(96h)，huSM5-1處理的XJC細(xì)胞，caspase-10活性增加從17％(48h)至38％(72h)，后又降至28％(96h)。與上述試驗(yàn)相結(jié)合，可以得出結(jié)論，huSM5-1抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是caspase-10相關(guān)的。
4.huSM5-1對(duì)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的作用huSM5-1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的測(cè)定使用MTT進(jìn)行分析。該反應(yīng)的原理為活細(xì)胞能夠?qū)⒌S色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶。1×103待測(cè)細(xì)胞與不同濃度的抗體共孵育，一定時(shí)間后，加入20ul MTT(0.5mg/ml，2h)，溫育后用DMSO(150ul)溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。MTT還原產(chǎn)物用Benchmark吸光值讀取機(jī)(Bio-RadLaboratories)在490nm處測(cè)定吸收值，進(jìn)行定量。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率如下式計(jì)算抑制率(％)＝(A-B)/(A-C)×100其中，A表示huSM5-1未作用的細(xì)胞的OD值；B表示huSM5-1作用的細(xì)胞的OD值；C表示陰性對(duì)照的OD值。每種處理設(shè)置3復(fù)孔。
發(fā)明人用MTT法測(cè)定了huSM5-1對(duì)4種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用，使用的細(xì)胞分別是肝細(xì)胞瘤細(xì)胞QYC，XJC；乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231；黑色素瘤細(xì)胞系CRL-1872。將細(xì)胞分別用不同濃度(50ng/ml，10ng/ml，1ng/ml)的huSM5-1抗體處理一定時(shí)間(24h，48h，72h，96h)。最大抑制出現(xiàn)在細(xì)胞用50ng/ml的huSM5-1處理后72小時(shí)。如50ng/ml、10ng/ml和1ng/ml的huSM5-1處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞QYC 24小時(shí)后，增長(zhǎng)抑制率為29％、11％和7％；48小時(shí)后，增長(zhǎng)抑制率為28％、17％和5％；72小時(shí)后，增長(zhǎng)抑制率為43％、19％和10％；96小時(shí)后，增長(zhǎng)抑制率為36％、11％和2.5％。其他的3種細(xì)胞處理后出現(xiàn)類似的結(jié)果。對(duì)照使用無(wú)關(guān)人IgG1抗體，對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。
上述結(jié)果證明，huSM5-1抗體能夠顯著的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且這種抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)與劑量及時(shí)間相關(guān)。這種抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用是由于huSM5-1單抗具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生Caspase-10相關(guān)的凋亡，其凋亡的機(jī)制可能與DNA的斷裂有關(guān)。
實(shí)施例6chSM5-1和ReSM5-1的對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外作用本例中使用人肝癌細(xì)胞系QYC，購(gòu)自上海國(guó)際合作腫瘤研究所。細(xì)胞均傳代培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中，使用含10％胎牛血清(GIBCO公司)的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培養(yǎng)基(GIBCO公司)。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為6×104/ml，重懸于10％FCS 1640/DMEM培養(yǎng)液中備用。
用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM培養(yǎng)基稀釋chSM5-1及huSM5-1。
chSM5-1與huSM5-1的濃度為20mg/ml，用10％FCS 1640/DMEM逐級(jí)稀釋，直至濃度為8ug/ml，每步稀釋不得超過(guò)10倍。然后以8ug/ml為起始濃度，在96孔板中2倍比序列稀釋，共14個(gè)濃度梯度，100ul/孔，只加10％FCS 1640/DMEM的孔為空白對(duì)照。
將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液分別加入含兩種抗體的96孔板中，100ul/孔。為防止多孔板的邊緣效應(yīng)，不使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板邊緣的孔，但須加入200ul/孔的PBS。37℃，7％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天后顯色讀數(shù)。
顯色96孔板加入PMS∶MTS＝1∶20的顯色劑，20ul/孔。96孔板蓋打開(kāi)后細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。
酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板OD490nm，將吸光度值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品濃度作四參數(shù)回歸。
Y＝(A-B)/[1+(X/C)D]+B根據(jù)該方程，X＝+∞時(shí)，Y＝B，即最高限；當(dāng)X＝0時(shí)，Y＝A，即最低限；而當(dāng)X＝C時(shí)，Y＝(A+B)/2，即達(dá)到最大效應(yīng)的一半。因此C值為半數(shù)有效濃度(ED50)。chSM5-1及reSM5-1對(duì)細(xì)胞QYC的體外增殖抑制結(jié)果參見(jiàn)圖6。
試驗(yàn)結(jié)果表明，在離體條件下，chSM5-1及reSM5-1均可明顯抑制受試細(xì)胞系的增殖。
實(shí)施例7chSM5-1及reSM5-1對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用1.外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的分離無(wú)菌采集靜脈血，注入含有肝素20U/ml的無(wú)菌15ml離心管中，輕輕混勻。加入等體積PBS溶液，稀釋血液以提高分離效果。
取15ml離心管，每管加入6ml室溫浴溫后的淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物所，上海，中國(guó))。傾斜離心管，沿管壁緩慢加入稀釋后的抗凝外周血，6ml/管。動(dòng)作輕柔，以防破壞界面。
20℃，800g離心30min，剎車關(guān)閉，自然降速。管內(nèi)液體分為三層，從上至下依次為血漿層、細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞及粒細(xì)胞層。血漿層與細(xì)胞分層液交界處毛玻璃樣的白色層即為淋巴及單核細(xì)胞層。
用吸管輕輕插入毛玻璃樣層，緩慢吸出外周血單個(gè)核細(xì)胞，放入另一15ml離心管中。加入PBS稀釋后離心，200g，5min，洗滌2遍。
用無(wú)酚紅1640/DMEM混合液(GIBCO公司)調(diào)整細(xì)胞密度為6×106/ml，懸于15ml離心管，置于37℃，7％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱備用。
2.靶細(xì)胞QYC的制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QYC細(xì)胞，用吸管將培養(yǎng)上清吸除，用PBS洗滌2遍。加入0.5ml含0.05％胰蛋白酶及0.02％EDTA的消化液，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓，吸管吸除消化液。用無(wú)酚紅的1640/DMEM重懸QYC細(xì)胞。計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml備用。
3.細(xì)胞與chSM5-1及reSM5-1的作用將chSM5-1及reSM5-1用無(wú)酚紅1640/DMEM混合液稀釋至濃度為40ug/ml，而后在1.5ml離心管中將抗體濃度2倍比序列稀釋，共14個(gè)濃度，300ul/管。加入調(diào)整好細(xì)胞密度的QYC細(xì)胞，300ul/管。4℃作用30min后，200g離心5min，用PBS洗滌2遍。懸于300ul無(wú)酚紅1640/DMEM混合液中。將與chSM5-1及reSM5-1作用后的細(xì)胞懸液加入96孔板中，100ul/孔。以20∶1效、靶比加入效應(yīng)細(xì)胞，100ul/孔，37℃，7％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱7h后顯色。
4.顯色和讀數(shù)使用羅氏公司非同位素細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。催化劑用1ml ddH2O溶解。以1∶45比例將催化劑與染料溶液混合。96孔板以200g離心5min后，每孔吸取50ul上清至另一96孔板中，加入混合好的顯色液50ul/孔，室溫，避光作用30min。酶標(biāo)儀讀數(shù)OD490。
結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果證明，chSM5-1及reSM5-1誘發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)理與ADCC有關(guān)。
實(shí)施例8補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用人肝癌細(xì)胞系QYC細(xì)胞表面高表達(dá)A230抗原分子，SM5-1單克隆抗體可與其結(jié)合。如果培養(yǎng)液中同時(shí)存在人的補(bǔ)體成分，則能使結(jié)合了抗體的靶細(xì)胞溶解，即補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)。在存在過(guò)量補(bǔ)體的前提下(由新鮮的正常人血清提供)，在一定范圍內(nèi)抗體的濃度與細(xì)胞溶解的程度呈量效關(guān)系。細(xì)胞溶解的程度可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞溶解后釋放的乳酸脫氫酶來(lái)檢測(cè)。
補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用檢測(cè)使用QYC細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)無(wú)支原體污染。用含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)于25-75cm2方瓶中。下述培養(yǎng)液過(guò)濾除菌后4℃保存A為含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培養(yǎng)液；B為不含血清的無(wú)酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液；C.為含有5％正常人血清的培養(yǎng)液B。人血清為新鮮分離的正常人血清。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2，飽和濕度。
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QYC細(xì)胞，計(jì)數(shù)，每次測(cè)定(1塊96孔板)需約2×106細(xì)胞，離心棄上清，加入培養(yǎng)液B調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，0.1ml/孔。注意不使用96孔板邊緣的孔，但在這些孔中加入無(wú)菌水(防止多孔板的邊緣效應(yīng))用培養(yǎng)液C將待測(cè)樣品逐步稀釋至濃度為4ug/mL。每次稀釋倍數(shù)不超過(guò)10倍。在1.5mL無(wú)菌離心管中用培養(yǎng)液C連續(xù)2倍比稀釋樣品。
以培養(yǎng)液C為陰性對(duì)照，在已接種過(guò)QYC細(xì)胞的培養(yǎng)板中，加入上述梯度稀的樣品或陰性對(duì)照的培養(yǎng)液，0.1mL/孔。每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。置于37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4小時(shí)。
從每個(gè)測(cè)量孔中吸出50μL上清至另一96孔板的對(duì)應(yīng)孔中，加入混合好的LDH檢測(cè)試劑盒試劑50uL，室溫避光孵育0.5h，用終止液1mol/L醋酸50uL/孔終止顯色。以490nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630為參比波長(zhǎng)于酶標(biāo)儀測(cè)量A450-A630值。結(jié)果參見(jiàn)圖8。
注該軟件給出的回歸方程為四參數(shù)方程Y＝(A-B)/[1+(X/C)D]+B根據(jù)該方程，X＝+∞時(shí)，Y＝B，即最高限；當(dāng)X＝0時(shí)，Y＝A，即最低限；而當(dāng)X＝C時(shí)，Y＝(A+B)/2，即半數(shù)有效。因此C值為半數(shù)有效濃度(ED50)。
上述結(jié)果表明，chSM5-1及reSM5-1誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)理與CDC有關(guān)(圖8)。
實(shí)施例9SM5-1抗體對(duì)QYC荷瘤裸鼠的治療作用檢測(cè)chSM5-1、reSM5-1、chCD3、reCD3對(duì)QYC荷瘤裸鼠的治療作用。
40只雌性裸鼠皮下接種QYC細(xì)胞，接種后7周瘤體直徑平均達(dá)0.5cm。荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組一組為PBS；一組為無(wú)關(guān)抗體chCD3 4mg/kg；一組為reCD34mg/kg；一組為chSM5-14mg/kg；一組為reSM5-14mg/kg；每組八只裸鼠。
結(jié)果參見(jiàn)圖9。結(jié)果顯示，chSM5-1、reSM5-1對(duì)QYC荷瘤裸鼠有明顯的治療作用。其作用的機(jī)理可能與ADCC或/和CDC有關(guān)。
實(shí)施例10125I標(biāo)記的chSM5-1及reSM5-1尾靜脈注射荷瘤裸鼠后的組織分布取8只荷瘤裸鼠(QYC)，腫瘤大小約0.7cm，隨機(jī)分為2組，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)及臨床應(yīng)用劑量顯示4mg/kg濃度即可抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)。故采用此單一劑量進(jìn)行體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)。
chSM5-1標(biāo)記效率為682823cpm/ul(0.52ug/ul)，reSM5-1標(biāo)記效率為681012cpm/u(0.52ug/ul)。
荷瘤裸鼠稱重，尾靜脈分別注射125I標(biāo)記的chSM5-1及reSM5-1，平均每只裸鼠尾靜注射約180ul左右。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用藥后24-72小時(shí)測(cè)量組織分布較為合適，因此選擇48小時(shí)作為測(cè)量時(shí)間。
準(zhǔn)備好γ-計(jì)數(shù)儀專用管并編號(hào)，用天平稱管重。
先用眼科鑷眼球取血，后依次取如下21種組織置于管中。操作過(guò)程應(yīng)最后取腫瘤組織并防止組織間交叉污染。

稱取含組織的管重，并得出凈重。用γ-計(jì)數(shù)儀讀出cpm值，并根據(jù)凈重計(jì)算出單位重量cpm值。
結(jié)果參見(jiàn)圖10，注射后chSM5-1及reSM5-1選擇性集中于腫瘤部位，可見(jiàn)采用chSM5-1及reSM5-1可用于腫瘤的放射性治療。
實(shí)施例11氯甘脲(Iodogen)法131I標(biāo)記單克隆抗體SM5-1及其治療性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)氯甘脲(Iodogen)的化學(xué)名稱為1，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基乙二醇脲，和氯胺T同屬于氯酰胺碘化反應(yīng)類型，是一種不溶于水的固相氧化劑，能將131I氧化成131I2，從而與蛋白質(zhì)或多肽分子中酪氨酸殘基上羥基鄰位的氫發(fā)生置換反應(yīng)。此法反應(yīng)溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)抗體損傷小，標(biāo)記率高。
1.涂布試管將含0.02％氯甘脲的二氯甲烷或氯仿溶液50ul，加至玻璃或塑料反應(yīng)管底部，用氮?dú)獯蹈苫驕p壓抽干，低溫干燥保存。用前以少量0.05mol/L，pH7.4 PBS洗滌數(shù)次，去除未粘附管壁的試劑。
2.標(biāo)記抗體在反應(yīng)試管中加入以下物質(zhì)氯甘脲(0.02％)50ul(涂布于反應(yīng)管)0.05mol/L，pH7.4PBS 50ulNa131I溶液11mCi/10ul抗體5-10ug/10ul混勻，室溫反應(yīng)5-15min加入0.05mol/L，pH7.4 PBS 200ul終止反應(yīng)。
3.標(biāo)記抗體的純化反應(yīng)混合物通過(guò)Sephades G-50凝膠過(guò)濾層析分離純化。
結(jié)果表明，所得標(biāo)記抗體的比放射活性為126MBq/mg，足以用于放射免疫治療。
4.131I標(biāo)記的chSM5-1及ReSM5-1對(duì)荷瘤裸鼠的療效用上述方法標(biāo)記5mg純化的chSM5-1及ReSM5-1。將32只荷瘤裸鼠(腫瘤細(xì)胞為QYC，腫瘤大小約為0.7cm)隨機(jī)分成4組，每組8只，尾靜脈注射標(biāo)記的抗體藥物。治療組劑量為5GBq/kg體重。8周后檢查腫瘤大小情況(此前死亡的，在死亡時(shí)檢查)和存活情況，結(jié)果如下表。
131I標(biāo)記的chSM5-1及ReSM5-1對(duì)荷瘤裸鼠(QYC)的療效

上述結(jié)果證明，I131標(biāo)記的chSM5-1及ReSM5-1對(duì)荷瘤小鼠有明顯的治療作用，可顯著降低腫瘤大小，提高生存率。
實(shí)施例12chSM5-1及ReSM5-1親和力比較用Pharmacia公司的BIAcore，參照Karlsson等(Karlsson，R.，Michaelsson，A.，and Mattsson，L.(1991)Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigeninteractions with a new biosensor based analytical system.J.Immunol.Methods 145，229-240)提供的方法測(cè)定chSM5-1及ReSM5-1的親和常數(shù)Kd(Kon/Koff)，發(fā)現(xiàn)chSM5-1與ReSM5-1親和力接近，分別為9.31×10-9M和3.78×10-9M。
上述結(jié)果說(shuō)明，本次對(duì)SM5-1的人源化設(shè)計(jì)改造是成功的，基本沒(méi)有降低親和力，達(dá)到了治療用單抗親和力的要求。
上述的實(shí)施實(shí)例只是為了說(shuō)明本發(fā)明，并非將本發(fā)明限定于上述范圍。上述實(shí)例可能作很多變動(dòng)，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>馬，菁<120>腫瘤相關(guān)抗原SM5-1的特異性抗體及其應(yīng)用<130>035759<150>CN 03129123.6<151>2003-06-06<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(119)<223>ReSM5-1重鏈可變區(qū)<400>1Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Pro Val Thr Val Ser Ser115<210>2<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(113)<223>ReSM5-1輕鏈可變區(qū)<400>2Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys35 40 45Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln85 90 95Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr100 105 110Arg<210>3<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(119)<223>mSM5-1重鏈可變區(qū)<400>3Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Val Tyr Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115<210>4<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(113)<223>mSM5-1輕鏈可變區(qū)<400>4Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser20 25 30Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln85 90 95Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>5<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(357)<223>ReSM5-1重鏈可變區(qū)<400>5caggtgcagc tggtgcagtc tggcggtgga gtggtccagc ccggccgcag cctgaggctg60tcctgcaagg catctggcta caccttcacc agctacgtga tgacatgggt gcgccaagcc120cccggaaagg gcctcgaatg gattggctac attgtgcctt ataatgacgg tactaagtac180aatgaaaagt tcaagggcag atttacaata tcaagtgaca agagcaagtc aaccgcattc240ctccaaatgg acagcttgcg tccagaggac accgccgtat actattgtgt gcgcggcagc300cgttacgact ggtacttgga ctactggggc caaggcactc cagtcaccgt ctcctct 357<210>6<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(339)<223>ReSM5-1輕鏈可變區(qū)<400>6aacatcatga tgactcagag cccatccagc ttgagcgcat cagtaggcga ccgcgtaacg60atcacttgca aatcctctca gtcagtattg tactccagca accagaagaa ctacctggcc120ggatatcagc agactcccgg caaagcccca aagttgctga tttattgggc ctccacgcgc180gagtctggcg tgccatcacg ctttagcggc agcgggtccg gtacagatta cacgtttacc240attagcagtc tgcagcctga ggacatagcc acctactact gtcaccagta ctttagttcc300tacacttttg gccagggaac taaactgcag attactcga 339<210>7<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(357)<223>mSM5-1重鏈可變區(qū)<400>7
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg60tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag120cctgggcagg gccttgactg gattggatat attgttcctt acaatgatgg cactaagtac180aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac240atggagctca gcagactgac ctctgaggac tctgcggtct attattgtgt ctacggtagt300aggtacgact ggtatttaga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 357<210>8<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(339)<223>mSM5-1輕鏈可變區(qū)<400>8aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact60atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc120tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg180gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc240atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata tttctcctca300tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaagcgg 339<210>9<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(119)<223>huSM5-1重鏈可變區(qū)<400>9Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Cys1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Gly Lys Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Trp Arg Phe Ser Ile Ser Ser Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Ser Asp Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Pro Val Thr Val Ser Ser115<210>10<211>113<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(113)<223>huSM5-1輕鏈可變區(qū)<400>10Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Asp Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser20 25 30Ser Lys Asp Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Lys35 40 45Ala Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asp Arg Glu Ser Asp Val50 55 60Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Tyr Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln85 90 95Trp Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Asp Gln Gly Thr Lys Leu Asn Ile Thr100 105 110Arg<210>11<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(357)<223>huSM5-1重鏈可變區(qū)<400>11caggtgcagc tggtggagtc tggcggtgga gtggtccagc ccggctgcag cctgaggctg60tcctgcagta gctctggcta caccttcacc agctacacca tgacatgggt gcgccaagcc120cccggaaagg gcctcgaatg gattggctac attaatcctt ataatgacgg tgggaagtac180aatgaaaagt tcaagtggag attttcaata tcaagtgaca agagcaagaa caccctgttc240ctccaaagcg acagcttgac cccagaggac accggcgtat actattgtgt gcgcggcagc300cgttacgact ggtacgggga ctactggggc caaggcactc cagtcaccgt ctcctct 357<210>12<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(339)<223>huSM5-1輕鏈可變區(qū)<400>12gacatccaga tgactcagag cccatccagc ttgagcggct cagtaggcga ccgcgtaacg60atcacttgcg actcctctca gtcagtattg tactccagca aagacgacaa ctacctggcc120ggatatcagc aggggcccgg caaagcccca agcttgctga tttattatgc ctccgaccgc180gagtctgacg tgccatcacg ctttagcggc agcgggtccg gtgatgatta cacgctgacc240attagcagtc tgcagcctga ggacgccgcc acctactact gtcaccagtg gtttagttcc300tacacttttg accagggaac taaactgaac attactcga 339
<210>13<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>單抗OKT3的信號(hào)肽<400>13Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly20<210>14<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(67)<223>單抗OKT3的信號(hào)肽編碼序列<400>14atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc60agaggag 6權(quán)利要求
1.一種可競(jìng)爭(zhēng)抑制人源SM5-1單克隆抗體與SM5-1靶抗原特異結(jié)合的抗體，其中，所述的人源SM5-1單克隆抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，可選自多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、雙體片段、單鏈抗體以及多特異性抗體等抗體片段。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9中31-35，50-66及99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10中24-40，56-62及95-102的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的抗體，其輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。
6.一種人源SM5-1特異性單克隆抗體，其特征在于，重鏈可變區(qū)包含SEQ IDNO9的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。
7.一種可競(jìng)爭(zhēng)抑制SM5-1單克隆抗體與SM5-1靶抗原特異結(jié)合的抗體，其中，所述的SM5-1單克隆抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體，可選自多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、雙體片段、單鏈抗體以及多特異性抗體等抗體片段。
9.如權(quán)利要求7所述的抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66及99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2中24-40，56-62及95-102的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體，其為人源化抗體。
11.如權(quán)利要求7所述的抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO3的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。
12.一種人源化SM5-1特異性單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
13.一種分離的核酸分子，它編碼權(quán)利要求3所述抗體的重鏈和/或輕鏈或其片段。
14.一種分離的核酸分子，它編碼權(quán)利要求6所述人源SM5-1單克隆抗體的重鏈和/或輕鏈或其片段。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO11和/或SEQID NO12的核苷酸序列。
16.一種分離的核酸分子，它包含與權(quán)利要求13的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
17.一種載體，它含有權(quán)利要求13所述的核酸分子。
18.如權(quán)利要17求所述的載體，它含有與編碼抗體輕鏈和/或重鏈或其片段的核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
19.一種重組細(xì)胞，它含有權(quán)利要求13所述的核酸分子。
20.如權(quán)利要求19所述的重組細(xì)胞，其特征在于，它是真核細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求19所述的重組細(xì)胞，其特征在于，它是CHO細(xì)胞。
22.一種分離的核酸分子，它包含權(quán)利要求9中所述編碼重鏈和/或輕鏈或其片段的核苷酸序列。
23.一種分離的核酸分子，它包含權(quán)利要求12中所述編碼人源化抗體重鏈和/或輕鏈或其片段的核苷酸序列。
24.如權(quán)利要求23所述的核酸分子，它包含SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6的核苷酸序列。
25.一種分離的核酸分子，它包含與權(quán)利要求22核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
26.一種載體，它含有權(quán)利要求22所述的核酸分子。
27.如權(quán)利要26求所述的載體，它含有與編碼抗體輕鏈和/或重鏈或其片段的核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
28.一種重組細(xì)胞，它含有權(quán)利要求22所述的核酸分子。
29.如權(quán)利要求28所述的重組細(xì)胞，其特征在于，它是真核細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求28所述的重組細(xì)胞，其特征在于，它是CHO細(xì)胞。
31.一種制備抗體或抗體片段的方法，該方法包括含有權(quán)利要求13所述核酸分子的重組細(xì)胞的培養(yǎng)，核酸分子編碼抗體或抗體片段的表達(dá)，以及表達(dá)抗體或抗體片段的復(fù)性，所述抗體為人源抗體。
32.如權(quán)利要求31中所述的方法，還包括復(fù)性抗體和/或抗體片段的分離純化。
33.一種制備抗體或抗體片段的方法，該方法包括含有權(quán)利要求22所述核酸分子的重組細(xì)胞的培養(yǎng)，核酸分子編碼抗體或抗體片段的表達(dá)，以及表達(dá)抗體或抗體片段的復(fù)性，所述抗體為人源化抗體。
34.如權(quán)利要求33中所述的方法，還包括復(fù)性抗體和/或抗體片段的分離純化。
35.一種藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求3所述的單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其中，所述抗體為人源抗體。
36.一種藥物組合物，包含有效量的人源化SM5-1特異性單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其中，所述人源化SM5-1特異性單克隆抗體的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
37.一種試劑盒，包含有效量的權(quán)利要求3中所述抗體以及抗體的應(yīng)用方法說(shuō)明，其中，所述的抗體為人源抗體。
38.一種試劑盒，包含有效量的人源化SM5-1特異性單克隆抗體以及抗體的應(yīng)用方法說(shuō)明，其中，所述人源化SM5-1特異性單克隆抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ IDNO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
39.權(quán)利要求1中所述的抗體在制備治療哺乳動(dòng)物腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
40.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物為人。
41.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤為黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌。
42.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗體為人源SM5-1特異性單克隆抗體。
43.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，抗體通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
44.權(quán)利要求7中所述的抗體在制備治療哺乳動(dòng)物腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
45.如權(quán)利要求44所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗體為人源化抗體，人源化抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
46.如權(quán)利要求45的應(yīng)用，其特征在于，哺乳動(dòng)物為人。
47.如權(quán)利要求45的應(yīng)用，其特征在于，腫瘤為黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌。
48.如權(quán)利要求45的應(yīng)用，其特征在于，人源化抗體通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
49.一種組合物，這種組合物包括a)有效量的權(quán)利要求1所述的抗體；b)有效量的抗腫瘤制劑。
50.如權(quán)利要求49的組合物，其特征在于，抗腫瘤制劑為治療黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌的制劑。
51.權(quán)利要求49中所述的組合物在制備治療哺乳動(dòng)物腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
52.一種組合物，這種組合物包括a)有效量的權(quán)利要求7所述的抗體；b)有效量的抗腫瘤制劑。
53.如權(quán)利要求52的組合物，其特征在于，抗體為人源化抗體，人源化抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
54.如權(quán)利要求52的組合物，其特征在于，抗腫瘤制劑為對(duì)黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌的治療有效的制劑。
55.權(quán)利要求52中所述的組合物在制備治療哺乳動(dòng)物腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
56.權(quán)利要求1所述的抗體在制備誘導(dǎo)caspase-10介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
57.如權(quán)利要求56的應(yīng)用，其特征在于，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
58.如權(quán)利要求56的應(yīng)用，其特征在于，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞。
59.權(quán)利要求7所述的抗體在制備誘導(dǎo)caspase-10介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
60.如權(quán)利要求56的應(yīng)用，其特征在于，抗體為人源化抗體，人源化抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
61.如權(quán)利要求59的應(yīng)用，其特征在于，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
62.如權(quán)利要求59的應(yīng)用，其特征在于，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞。
63.一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包括連接毒素和/或放射性同位素于權(quán)利要求1中所述的抗體。
64.如權(quán)利要求63的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物中的抗體為人源抗體，人源抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO9中31-35，50-66及99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10中24-40，56-62及95-102的氨基酸序列。
65.一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包括連接毒素和/或放射性同位素于權(quán)利要求7中的抗體。
66.如權(quán)利要求65的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物中的抗體為人源化抗體，人源化抗體重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
67.一種分析樣本中人源SM5-1靶抗原的方法，該方法包括a)從受試者中獲取樣本；b)用權(quán)利要求1中的抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下與樣本結(jié)合，如樣本中存在人源SM5-1的靶抗原，就會(huì)與所述抗體結(jié)合；c)通過(guò)分析樣本中人源SM5-1靶抗原與抗體的結(jié)合來(lái)判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。
68.如權(quán)利要求67的方法，其特征在于，該方法用于腫瘤的鑒定及預(yù)后判斷。
69.如權(quán)利要求68的方法，其特征在于，所述的腫瘤為黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌。
70.一種分析樣本中人源SM5-1靶抗原的方法，該方法包括a)從受試者中獲取樣本；b)用權(quán)利要求7中的抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下與樣本結(jié)合，如樣本中存在人源SM5-1的靶抗原，就會(huì)與所述抗體結(jié)合；c)通過(guò)分析樣本中人源SM5-1靶抗原與抗體的結(jié)合來(lái)判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。
71.如權(quán)利要求70的方法，其特征在于，該方法用于腫瘤的鑒定及預(yù)后判斷。
72.如權(quán)利要求71的方法，其特征在于，腫瘤為黑色素瘤、乳腺癌或肝細(xì)胞癌。
73.一種分析樣本中人源SM5-1靶抗原的試劑盒，其中包含a)權(quán)利要求1中所述抗體；b)通過(guò)分析樣本中人源SM5-1靶抗原與抗體的結(jié)合來(lái)判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。
74.一種分析樣本中人源SM5-1靶抗原的試劑盒，其中包含a)權(quán)利要求7中所述抗體；b)通過(guò)分析樣本中人源SM5-1靶抗原與抗體的結(jié)合來(lái)判斷樣本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的黑色素瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌特異性的抗體(人源化單克隆抗體huSM5－1和人鼠嵌合的抗體SM5－1)，其相關(guān)的抗原，編碼該抗體的分離的核酸分子，以及所述抗體的制備方法。本發(fā)明還涉及所述的抗體和/或分離的核酸分子在制備診斷和治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1572800SQ20031011992
公開(kāi)日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者馬菁 申請(qǐng)人:馬菁