專利名稱：通過發(fā)酵生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵工業(yè)技術(shù)，特別涉及一種通過使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)靶物質(zhì)如L-氨基酸的方法。
相關(guān)技術(shù)描述大腸桿菌(E.coli)的染色體DNA由兩個或更多的DNA結(jié)合蛋白折疊成一種所謂類核的核小體樣結(jié)構(gòu)。這些蛋白被稱為類核構(gòu)建蛋白(nucleoid-structuring proteins)。
FIS(倒位刺激因子)，是主要的類核構(gòu)建蛋白之一，由存在于大腸桿菌染色體73.4min位置的fis基因編碼。FIS表達(dá)在生長期被誘導(dǎo)而在穩(wěn)定期被抑制。已有報道稱，如果大腸桿菌野生型菌株的fis基因被斷裂，則其在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的生長率下降，更確切地說，在原本應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生高生長率的條件下，卻表現(xiàn)為當(dāng)最初生長率不高時其生長率沒有發(fā)生變化(非專利文獻(xiàn)1)。在細(xì)菌生產(chǎn)物質(zhì)的條件下，細(xì)菌的生長率符合后者的情形。進(jìn)一步而言，F(xiàn)IS是正負(fù)調(diào)節(jié)兩種或多種基因表達(dá)的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，已有報道稱FIS調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)2)，也調(diào)節(jié)包括代謝等方面基因的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)3)。
作為一種類核構(gòu)建蛋白，H-NS與FIS一樣，在生長期被誘導(dǎo)并且正負(fù)調(diào)節(jié)兩種或多種基因的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)4)。H-NS由存在于大腸桿菌染色體27.8min位置的hns基因編碼。
其它主要的類核構(gòu)建蛋白的實例包括，例如HU、DPS等。HU是一種由hupA和hupB基因分別編碼的Huα和Huβ組成的異源二聚體，hupA和hupB基因分別存在于大腸桿菌染色體的90.5min和9.7min(非專利文獻(xiàn)5)，HU在生長期和穩(wěn)定期都被表達(dá)。DPS由存在于大腸桿菌染色體18.3min的dps基因編碼，其表達(dá)在生長期被抑制而在穩(wěn)定期被誘導(dǎo)(非專利文獻(xiàn)6)。
迄今尚無關(guān)于通過調(diào)節(jié)編碼類核構(gòu)建蛋白的基因如fis、hns、hupAB和dps基因的表達(dá)來提高物質(zhì)生產(chǎn)的報道。
(非專利文獻(xiàn)1)Nilsson等，生物化學(xué)雜志(The Journal of Biololcal Chemistry)，269，9460-9465，1994(非專利文獻(xiàn)2)Nilsson等，EMBO雜志(The EMBO Journal)，9，727-734，1990(非專利文獻(xiàn)3)Xu等，細(xì)菌血雜志(Journal of Bacteriology)，177，938-947，1995(非專利文獻(xiàn)4)Hulton等，細(xì)胞(Cell)，63，631-642，1990(非專利文獻(xiàn)5)Wada等，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)，204，581-591，1988(非專利文獻(xiàn)6)Almion等，基因與發(fā)育(Genes and Development)，6，2646-2654，1992發(fā)明概述本發(fā)明的目的是通過使用屬于埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌的發(fā)酵來提高有用物質(zhì)生產(chǎn)的生產(chǎn)效率或生產(chǎn)率。
本發(fā)明的發(fā)明人為達(dá)到上述目的進(jìn)行了刻苦研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過修飾編碼普遍存在于大腸桿菌的類核構(gòu)建蛋白的基因能提高埃希氏菌屬細(xì)菌的物質(zhì)生產(chǎn)。特別是發(fā)現(xiàn)通過斷裂埃希氏菌屬細(xì)菌的fis基因能提高其生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力，從而實現(xiàn)本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供(1)一種通過使用屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，生產(chǎn)和積累培養(yǎng)基或細(xì)胞中的靶物質(zhì)，并收集靶物質(zhì)，其中的細(xì)菌具有生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力，且FIS蛋白在細(xì)胞中不能正常地起作用。
(2)按照(1)的方法，其中細(xì)菌染色體上的fis基因已被斷裂，致使FIS蛋白不能正常地起作用。
(3)按照(1)或(2)的方法，其中的屬于埃希氏菌屬細(xì)菌是大腸桿菌。
(4)按照(1)至(3)中的任何一種方法，其中的靶物質(zhì)是一種L-氨基酸或者一種蛋白。
(5)按照(4)的方法，其中的L-氨基酸是天冬氨酸家族的L-氨基酸。
(6)按照(5)的方法，其中天冬氨酸家族包括賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。
(7)按照(6)的方法，其中所述氨基酸是L-賴氨酸。
附圖簡述

圖1表示菌株sMG1655、MG1655Δfis、MG1655Δhns、MGΔdps和MGΔhupAB的生長圖。
圖2表示W(wǎng)C196和WC196Δfis的生長圖。
圖3表示菌株WC196和WC196Δfis的葡萄糖消耗圖。
圖4表示菌株WC196和WC196Δfis的賴氨酸積累圖。
圖5表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的生長圖。
圖6表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的葡萄糖消耗圖。
圖7表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的賴氨酸積累圖。
發(fā)明詳述下面將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明使用的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌沒有特殊限制，只要它是屬于埃希氏菌屬的微生物且具有生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力。特別是可以使用那些在Neidhardt等人的文章中提到的(Neidhardt，F(xiàn).C.等，大腸桿菌和傷寒沙門氏菌(Escherichia coliand Salmonella Typhimurium)，美國微生物學(xué)切會，華盛頓特區(qū)，1208，表1)。更特別提到的是大腸桿菌。
“生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力”是指當(dāng)本發(fā)明使用的埃希氏菌屬細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，在細(xì)胞或培養(yǎng)基中生產(chǎn)具有可收集量的靶物質(zhì)的能力。更確切的是指比野生型或未修飾的埃希氏菌屬細(xì)菌菌株生產(chǎn)量更大的靶物質(zhì)的能力。
靶物質(zhì)沒有特殊限制，只要可由屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)的物質(zhì)。該靶物質(zhì)的實例包括各種L-氨基酸如L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸，蛋白質(zhì)(包括肽)，核酸如鳥嘌呤、次黃苷、鳥苷酸和次黃苷酸，維生素，抗生素，生長因子，生理活性物質(zhì)等，它們通常通過使用埃希氏菌屬細(xì)菌能生產(chǎn)出。進(jìn)一步而言，本發(fā)明甚至可應(yīng)用于那些迄今尚未通過使用屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)的物質(zhì)。
靶物質(zhì)可以是天冬氨酸家族的L-氨基酸。所述家族包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸。
至于產(chǎn)L-賴氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，可以用具有L-賴氨酸類似物抗性的突變體為例。賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長，但是當(dāng)培養(yǎng)基中同時存在L-賴氨酸時，這種抑制變得完全或部分地不敏感。L-賴氨酸類似物的實例包括溶菌素、賴氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、α-甲基賴氨酸、α-氯己內(nèi)酰胺等。對這些賴氨酸類似物具有抗性的突變體可以通過常規(guī)的人為誘變處理屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌而得到。用來生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌菌株的特例包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；參見日本專利公開(Kokai)第56-18596號和美國專利第4,346,170號)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，由L-賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制是不敏感的。
除上述以外，需要提到的是，例如后面描述的產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌，在產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌中，由L-賴氨酸對天冬氨酸激酶的抑制通常也是不敏感的。
在后面描述的實例中，WC196菌株用作大腸桿菌的產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌。該細(xì)菌菌株是通過賦予源自大腸桿菌K-12的W3110菌株以AEC抗性而培育得到。該菌株被命名為大腸桿菌AJ13069菌株，且在國家生物科學(xué)和人體技術(shù)研究所(現(xiàn)為國家高等工業(yè)科學(xué)和技術(shù)協(xié)會，國際專利生物體保藏組織，TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)于1994年12月6日進(jìn)行了保藏，得到的保藏號為FERM P-14690。然后，該菌株于1995年9月29日被轉(zhuǎn)移到布達(dá)佩斯條約規(guī)定的國際保藏單位，得到的保藏號為FERM BP-5252(參見國際專利公開WO96/17930)。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌的實例包括大腸桿菌VKPM B-3996(RIA1867)(參見美國專利第5,175,107號)、MG442菌株(參見Gusyatiner等，Genetika(in Russian)，14，pp.947-956，1978)等。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-高絲氨酸細(xì)菌的實例包括菌株NZ10，它是菌株C600的Leu+回復(fù)突變型(參見Appleyard R.K.，遺傳學(xué)(Genetics)，39，pp.440-452，1954)。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌的實例包括AJ12624菌株(FERM BP-3853，參見法國專利公開第2,680,178號)和L-纈氨酸抗性菌株如大腸桿菌B11、大腸桿菌K-12(ATCC10798)、大腸桿菌B(ATCC11303)和大腸桿菌W(ATCC9637)。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-亮氨酸細(xì)菌的實例包括具有β-2-噻吩丙氨酸抗性的細(xì)菌菌株、具有β-2-噻吩丙氨酸抗性和β-羥基亮氨酸抗性的細(xì)菌菌株(參見日本專利公開(Kokoku)第62-34397號)和具有4-氮亮氨酸抗性或5，5，5-三氟亮氨酸抗性的細(xì)菌菌株(日本專利公開(Kokai)第8-70879號)。特別需要提到的菌株是AJ11478(FERMP-5274，參見日本專利公開(Kokoku)第62-34397號)。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-異亮氨酸細(xì)菌的實例包括大腸桿菌KX141(VKPMB-4781，參見歐洲專利公開第519,113號)。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-纈氨酸細(xì)菌的實例包括大腸桿菌VL1970(VKPMB-4411，參見歐洲專利公開第519,113號)。
屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-苯丙氨酸細(xì)菌的實例包括大腸桿菌AJ12604(FERMBP-3579，參見歐洲專利公開第488,424號)。
進(jìn)一步而言，屬于埃希氏菌屬的具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，也可以通過導(dǎo)入具有L-氨基酸生物合成遺傳信息的DNA和利用基因重組技術(shù)提高這種生產(chǎn)能力來培育。例如，至于產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌，可以導(dǎo)入的基因的實例包括，例如，編碼L-賴氨酸生物合成途徑的酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、二氧吡啶二羧酸合酶、二氧吡啶二羧酸還原酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶的基因。假設(shè)一種基因編碼受L-天冬氨酸或L-賴氨酸反饋抑制的酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或天冬氨酸激酶和二氧吡啶二羧酸合酶，期望使用編碼該酶的突變基因，使該抑制不敏感。
進(jìn)一步而言，至于產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌，可以導(dǎo)入的基因的實例包括編碼谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶等的基因。
至于產(chǎn)L-纈氨酸細(xì)菌，可以導(dǎo)入的基因的實例包括，例如，ilvGMEDA操縱子，優(yōu)選為不表達(dá)蘇氨酸脫氨酶活性和消除弱化作用的ilvGMEDA操縱子(參見日本專利公開(Kokai)第8-47397號)。
進(jìn)一步而言，酶從L-氨基酸生物合成途徑脫離來催化生產(chǎn)非靶L-氨基酸的化合物的活性可能下降或減少。例如，從L-賴氨酸生物合成途徑脫離來催化生產(chǎn)非靶L-賴氨酸的化合物的酶的實例包括高絲氨酸脫氫酶(參見國際專利公開WO95/23864)。進(jìn)一步而言，從L-谷氨酸生物合成途徑脫離來催化生產(chǎn)非靶L-谷氨酸的化合物的酶的實例包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙?；D(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。
進(jìn)一步而言，屬于埃希氏菌屬的具有生產(chǎn)核酸能力的細(xì)菌在例如國際專利公開WO99/03988中作了詳細(xì)描述。更特別的，需要提到的是在那篇申請中描述的大腸桿菌FADRaddG-8-3KQ菌株(purFKQ，purA-，deoD-，purR-，add-，gsk-)。該菌株具有生產(chǎn)次黃苷和鳥嘌呤核苷的能力。該菌株具有突變的編碼PRPP氨基轉(zhuǎn)移酶的purF基因，其中326位上的賴氨酸殘基被谷氨酸殘基取代，且AMP和GMP的反饋抑制不敏感。在該菌株中，琥珀酰AMP合酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)、嘌呤阻遏基因(purR)、腺苷脫氨酶基因(add)和次黃苷-鳥嘌呤核苷激酶基因(gsk)被斷裂了。該菌株的專有號為AJ13334，在國家生物科學(xué)和人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理機構(gòu)、國際貿(mào)易和工業(yè)部門(現(xiàn)為國家高等工業(yè)科學(xué)和技術(shù)協(xié)會，國際專利生物體保藏組織，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)于1997年6月24日作為布達(dá)佩斯條約規(guī)定的國際保藏進(jìn)行了保藏，得到的保藏號為FERM BP-5993。
進(jìn)一步而言，本發(fā)明適用的蛋白沒有特殊的限制，只要它們能通過基因工程方法生產(chǎn)出，而特別需要提到的是酸性磷酸酶和GFP(綠色熒光蛋白)或其類似物。
此外，屬于埃希氏菌屬的具有生產(chǎn)有用物質(zhì)如其它L-氨基酸、蛋白質(zhì)(包括多肽)、核酸、維生素、抗生素、生長因子和生理活性物質(zhì)能力的細(xì)菌，也可以為本發(fā)明所使用。
培育屬于埃希氏菌屬的具有上述生產(chǎn)靶物質(zhì)能力的細(xì)菌，向埃希氏菌屬細(xì)菌中導(dǎo)入基因來提高它們的能力，可以使用將屬于埃希氏菌屬細(xì)菌細(xì)胞中的自主復(fù)制載體與基因連接構(gòu)建重組DNA，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法。此外，也可能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，生物技術(shù)，1，p.417，1983)、Mu噬菌體公開(日本專利(Kokai)第2-109985號)或同源重組(分子遺傳學(xué)實驗，冷泉港實驗室，1972)的方法將靶基因結(jié)合到染色體上。
本發(fā)明使用的埃希氏菌屬細(xì)菌是具有上述生產(chǎn)靶物質(zhì)能力的細(xì)菌，其中的FIS蛋白在細(xì)胞中不能正常地起作用。“FIS蛋白不能正常地起作用”的表述可以指fis基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平降低，從而該基因的產(chǎn)物FIS蛋白不生產(chǎn)或生產(chǎn)量下降，或者指生產(chǎn)的FIS蛋白發(fā)生突變，從而FIS蛋白原先的功能退化或消失。FIS蛋白不能正常地起作用的埃希氏菌屬細(xì)菌的典型的實例包括基因斷裂的菌株，其染色體上的fis基因通過基因重組技術(shù)被斷裂，和突變的菌株，其中由于染色體的表達(dá)調(diào)節(jié)序列或fis基因編碼區(qū)發(fā)生突變，不再生產(chǎn)功能性FIS蛋白。
大腸桿菌fis基因的核苷酸序列(GenBank登記號為AE000405的核苷酸序列中1067至1363位的核苷酸序列)和FIS蛋白的氨基酸序列的實例，如SEQ IDNOS21和22所示。
本發(fā)明中，“FIS蛋白”可以是除了具有如SEQ ID NO22所示氨基酸序列的大腸桿菌FIS蛋白外，還可以是該蛋白的同源物。進(jìn)一步而言，被斷裂的fis基因可以是除了具有如SEQ ID NO21所示核苷酸序列的大腸桿菌fis基因外，還可以是該基因的同源物。例如，fis基因同源物的實例包括可以與具有SEQID NO21所示核苷酸序列或其部分的探針，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交和編碼具有FIS蛋白功能的蛋白的基因。這里提到的“嚴(yán)格條件”，是指在該條件下產(chǎn)生所謂的特異性雜交，而不產(chǎn)生非特異性雜交。盡管很難通過使用一些數(shù)值來清楚地表述該條件，例如，該嚴(yán)格條件包括DNA具有高度同源性，例如DNA具有50％或以上，優(yōu)選70％或以上，更優(yōu)選90％或以上，甚至更優(yōu)選95％或能相互雜交，而具有低于上述同源性的DNA之間不能相互雜交?？晒┻x擇地，作為實例的嚴(yán)格條件是在該條件下，當(dāng)鹽濃度符合Southern雜交洗脫條件時，即1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS，60℃，DNA相互雜交。
作為探針，也可以使用SEQ ID NO21所示核苷酸序列的部分。這樣的探針可以通過PCR生產(chǎn)，用根據(jù)SEQ ID NO21所示核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物，用包含SEQ ID NO21所示核苷酸序列的DNA片段作為模板。當(dāng)長度約300bp的DNA片段作為探針時，2×SSC，0.1％SDS，50℃可作為雜交的洗脫條件。
作為在下面描述的基因破壞中使用的fis基因，優(yōu)選使用與目標(biāo)埃希氏菌屬細(xì)菌染色體上的fis基因相同的基因。然而，具有一定程度同源性的基因，以至于細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)生同源重組，也可被使用。
下面將描述通過基因重組技術(shù)斷裂染色體上fis基因的方法的一個實例?？梢杂镁哂斜恍揎椀膄is基因的DNA轉(zhuǎn)化埃希氏菌屬細(xì)菌來斷裂染色體上的fis基因，致使不生產(chǎn)FIS。這一般是通過缺失fis基因的一部分(缺失型fis基因)以及使缺失型fis基因和染色體上的fis基因發(fā)生重組來實現(xiàn)的。通過同源重組來斷裂基因方法已經(jīng)建立，有使用線性DNA的方法、使用具有溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒的方法等?？紤]到可靠性，優(yōu)選使用具有溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒的方法。
宿主染色體的fis基因可以用缺失型fis基因代替如下。例如，可以通過將溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)、突變型fis基因和顯示藥物如氨芐青霉素抗性的標(biāo)記基因連接而制備重組DNA，用該重組DNA轉(zhuǎn)化屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，將轉(zhuǎn)化體菌株在溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)不起作用的溫度下培養(yǎng)，然后在含有藥物的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)，以獲得轉(zhuǎn)化體菌株，其中重組DNA結(jié)合到染色體DNA中。
如上所述，菌株中的重組DNA結(jié)合到染色體DNA上，與原先存在于染色體上的fis基因序列發(fā)生重組，兩個融合基因染色體fis基因和缺失型fis基因插入到染色體中，位于重組DNA的其它部分(載體部分、溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)和藥物抗性標(biāo)記)的兩端。因此，由于正常fis基因在該狀態(tài)下為顯性，轉(zhuǎn)化體菌株表達(dá)正常的FIS蛋白。
隨后，為了在染色體DNA上僅保留缺失型fis基因，通過兩種fis基因的重組，從染色體DNA上除去fis基因的一個拷貝以及載體區(qū)(包括溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)和藥物抗性標(biāo)記)。此時，染色體DNA上保留了正常fis基因而除去了缺失型fis基因，或者相反地，染色體DNA上保留了缺失型fis基因而除去了正常fis基因。在任何一種情況下，當(dāng)菌株在溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)起作用的溫度中培養(yǎng)時，被除去的DNA以質(zhì)粒形式停留在細(xì)胞中。另一方面，如果菌株在溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)不起作用的溫度中培養(yǎng)，染色體DNA上保留了缺失型fis基因的細(xì)胞中會除去包含正常fis基因的質(zhì)粒。因此，通過PCR克隆或類似方法確定細(xì)胞中fis基因的結(jié)構(gòu)，可以獲得染色體DNA上包含缺失型fis基因的菌株，而該細(xì)胞中正常fis基因被除去。
溫度敏感性復(fù)制控制區(qū)在屬于埃希氏菌屬細(xì)菌的細(xì)胞中起作用，作為具有該控制區(qū)的質(zhì)粒，需要提到的是pMAN997(國際專利公開WO99/03988)，其在后面描述的實例中被使用。
常規(guī)基因重組技術(shù)如DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化、從轉(zhuǎn)化體菌株提取重組DNA和PCR，在參考文獻(xiàn)中詳細(xì)描述，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的，例如，Sambrook，J.，F(xiàn)itsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室，1989等。
進(jìn)一步而言，通過用紫外線照射或使用常規(guī)突變處理用的誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，可以獲得不再生產(chǎn)功能性FIS蛋白的突變菌株。
生產(chǎn)靶物質(zhì)，可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述獲得的具有生產(chǎn)靶物質(zhì)能力和細(xì)胞中FIS蛋白不能正常地起作用的埃希氏菌屬細(xì)菌，在培養(yǎng)基或細(xì)胞中生產(chǎn)和積累靶物質(zhì)，并收集靶物質(zhì)。本發(fā)明中，使用具上述特性的埃希氏菌屬細(xì)菌，能提高靶物質(zhì)的生產(chǎn)率或者生產(chǎn)效率。據(jù)信這是因為具有fis基因的野生型埃希氏菌屬細(xì)菌在培養(yǎng)過程中表達(dá)fis基因，促進(jìn)或抑制一組轉(zhuǎn)錄受FIS蛋白調(diào)節(jié)的基因(包括已知和未知的基因)的表達(dá)，然而，在FIS蛋白不能正常地起作用的菌株中，上述這組基因的表達(dá)則不被調(diào)節(jié)。
作為培養(yǎng)本發(fā)明中屬于埃希氏菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)基，根據(jù)使用的細(xì)菌菌株種類或靶物質(zhì)，可以使用常規(guī)熟知的培養(yǎng)基。也就是說，可以使用包含碳源、氮源、無機離子和作為需要的其它有機成分的常規(guī)培養(yǎng)基。實施本發(fā)明不需要特殊的培養(yǎng)基。
作為碳源，可以使用糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解產(chǎn)物，醇類如甘油和山梨醇，有機酸如反丁烯二酸、檸檬酸和琥珀酸等。
作為氮源，可以使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨，有機氮如大豆水解產(chǎn)物，氨氣，氨水等。
至于有機微量營養(yǎng)素，根據(jù)埃希氏菌屬細(xì)菌的特性，優(yōu)選添加適量的所需物質(zhì)如維生素B1、L-高絲氨酸和L-酪氨酸、酵母提取物等。除這些物質(zhì)外，按需可添加少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養(yǎng)可根據(jù)使用的細(xì)菌菌株，在熟知的常規(guī)使用的條件下進(jìn)行。例如，優(yōu)選地，在有氧條件下培養(yǎng)16-120小時。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度控制在25-45℃，pH控制在5-8?？梢允褂脽o機或有機酸或堿物質(zhì)以及氨氣等來調(diào)節(jié)pH。
培養(yǎng)完成后，本發(fā)明不需要特殊的方法來收集培養(yǎng)基或細(xì)胞中的靶物質(zhì)。也就是說，收集靶物質(zhì)可以根據(jù)靶物質(zhì)的種類，通過結(jié)合熟知的方法如那些使用離子交換樹脂、沉淀法和其它方法達(dá)到。進(jìn)一步而言，積累在細(xì)胞中的靶物質(zhì)，可以在經(jīng)物理地或酶促破碎細(xì)胞之后，根據(jù)靶物質(zhì)從細(xì)胞提取物或膜級分(membrane fraction)中收集。根據(jù)靶物質(zhì)，當(dāng)其存在于細(xì)胞中時，該靶物質(zhì)可以作為微生物催化劑或類似物利用。
按照本發(fā)明，通過使用埃希氏菌屬細(xì)菌，能提高有用物質(zhì)如L-氨基酸生產(chǎn)的生產(chǎn)率或者生產(chǎn)效率。
實施例下面將通過實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實施例1編碼大腸桿菌MG1655的類核構(gòu)建蛋白基因的斷裂及其對生長的作用通過交換PCR斷裂編碼大腸桿菌類核構(gòu)建蛋白的基因(參見Link，A.J.，Phillips，D.，Church，G.M.，細(xì)菌血雜志(J.Bacteriol.)，Vol.179，6228-6237，1997)。
(1)fis基因的斷裂合成SEQ ID NOS1和2所示的寡核苷酸(引物1和2)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括fis基因編碼區(qū)的N-末端約20bp和其上游區(qū)。合成SEQ ID NOS3和4所示的寡核苷酸(引物3和4)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括fis基因編碼區(qū)的C-末端約20bp和其下游區(qū)。引物2和3包括部分互補的共同序列，設(shè)計引物使得當(dāng)擴增產(chǎn)物被連接到那些部分時，fis基因的ORF的一部分將被除去。
進(jìn)行第一個PCR，使用引物1和2結(jié)合、引物3和4結(jié)合以及以通過常規(guī)方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。在該PCR中，引物1和2與引物4和3的摩爾比為10∶1。進(jìn)行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產(chǎn)物作為模板和引物1和4。將由第二個PCR構(gòu)建的具有缺失型fis基因的DNA片段克隆到pGEMT-Easy，一種由Promega生產(chǎn)的克隆載體試劑盒中，按照操作步驟獲得重組載體pGEM-fis。
用EcoR I消化pGEM-fis以獲得包括缺失型fis基因的DNA片段。將該消化片段連接到溫度敏感性質(zhì)粒pMAN997(參見國際專利公開WO99/03988)中，用相同的酶消化后，再用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)純化。上述pMAN997可以通過將pMAN031的Vsp I-HindIII片段(細(xì)菌血雜志(J.Bacteriol.)，162，1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)交換而獲得。
大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(Takara Shuzo)用上述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化，接種到含有25μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上(Meiji Seika)(LB+氨芐青霉素)，在30℃中培養(yǎng)，以篩選氨芐青霉素抗性的克隆。將這些克隆在含有25μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的試管中30℃培養(yǎng)，用Wizard Plus Miniprep(Promega)從細(xì)胞中提取質(zhì)粒。用EcoR I消化這些質(zhì)粒，篩選出含有目標(biāo)長度片段的質(zhì)粒作為fis斷裂的質(zhì)粒pMANΔfis。
用pMANΔfis轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655。
該轉(zhuǎn)化菌株在LB+氨芐青霉素平板上30℃培養(yǎng)，并篩選氨芐青霉素抗性克隆。篩選的克隆在30℃下液體培養(yǎng)過夜，稀釋103倍后接種到LB+氨芐青霉素平板上，在42℃下篩選氨芐青霉素抗性克隆。在這一階段，pMANΔfis結(jié)合到染色體DNA中。
隨后，篩選的克隆涂布在LB+氨芐青霉素平板上，30℃培養(yǎng)。然后，將適量細(xì)胞加到2mlLB培養(yǎng)基中，42℃搖床培養(yǎng)4至5小時。將培養(yǎng)液稀釋105倍后接種到LB平板上。在獲得的克隆中，將幾百個克隆接種到LB平板和LB+氨芐青霉素平板上，并檢測它們的生長，以確定氨芐青霉素敏感性和抗性。氨芐青霉素敏感性菌株的染色體DNA缺少pMANΔfis載體部分和原先存在于染色體DNA上的正常fis基因，或者缺失型fis基因。幾個氨芐青霉素敏感性菌株經(jīng)過了克隆PCR，以篩選預(yù)期用期望的缺失型基因取代fis基因的菌株。因此，由大腸桿菌MG1655制備得到fis基因斷裂的菌株即MG1655Δfis。
(2)hns基因的斷裂和(1)中的方法一樣，由MG1655制備得到hns基因斷裂的菌株。合成SEQID NOS5和6所示的寡核苷酸(引物5和6)作為引物，用來擴增一段約600bp的區(qū)域包括hns基因編碼區(qū)的N-末端約40bp和其上游區(qū)，合成SEQ ID NOS7和8所示的寡核苷酸(引物7和8)作為引物，用來擴增一段約600bp的區(qū)域包括hns基因編碼區(qū)的C-末端約40bp和其下游區(qū)。
進(jìn)行第一個PCR，使用引物5和6結(jié)合、引物7和8結(jié)合以及用通過常規(guī)方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進(jìn)行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產(chǎn)物作為模板和引物5和8。獲得由第二個PCR構(gòu)建的具有缺失型hns基因的DNA片段。后面進(jìn)行的程序與(1)中的方法相同，以獲得hns基因斷裂的菌株MG1655Δhns。
(3)dps基因的斷裂和(1)中的方法一樣，由MG1655制備得到dps基因斷裂的菌株。合成SEQID NOS9和10所示的寡核苷酸(引物9和10)作為引物，用來擴增一段約400bp的區(qū)域包括dps基因編碼區(qū)的N-末端約20bp和其上游區(qū)，合成SEQ ID NOS11和12所示的寡核苷酸(引物11和12)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括dps基因編碼區(qū)的C-末端約20bp和其下游區(qū)。
進(jìn)行第一個PCR，使用引物9和10結(jié)合、引物11和12結(jié)合以及用通過常規(guī)方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進(jìn)行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產(chǎn)物作為模板和引物9和12。獲得包括由第二個PCR構(gòu)建的缺失型dps基因的DNA片段。后面進(jìn)行的程序與(1)中的方法相同，以獲得dps基因斷裂的菌株MG1655Δdps。
(4)hupAB基因的斷裂由于hupA和hupB在基因組中是不相鄰的，因此這些基因需分別進(jìn)行斷裂。首先，斷裂hupA基因。合成SEQ ID NOS13和14所示的寡核苷酸(引物13和14)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括hupA基因編碼區(qū)的N-末端約20bp和其上游區(qū)，合成SEQ ID NOS15和16所示的寡核苷酸(引物15和16)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括hupA基因編碼區(qū)的C-末端約20bp和其下游區(qū)。
進(jìn)行第一個PCR，使用引物13和14結(jié)合、引物15和16結(jié)合以及以通過常規(guī)方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進(jìn)行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產(chǎn)物作為模板和引物13和16。獲得由第二個PCR構(gòu)建的具有缺失型hupA基因的DNA片段。后面進(jìn)行的程序與(1)中的方法相同，以獲得hupA基因斷裂的菌株MG1655ΔhupA。
隨后，在hupA基因斷裂的菌株MG1655ΔhupA中斷裂hupB基因。合成SEQID NOS17和18所示的寡核苷酸(引物17和18)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括hupB基因編碼區(qū)的N-末端約20bp和其上游區(qū)，合成SEQ IDNOS19和20所示的寡核苷酸(引物19和20)作為引物，用來擴增一段約300bp的區(qū)域包括hupB基因編碼區(qū)的C-末端約20bp和其下游區(qū)。
進(jìn)行第一個PCR，使用引物17和18結(jié)合、引物19和20結(jié)合以及用通過常規(guī)方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進(jìn)行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產(chǎn)物作為模板和引物17和20。獲得由第二個PCR構(gòu)建的具有缺失型hupB基因的DNA片段。后面進(jìn)行的程序與(1)中的方法相同，以獲得hupA基因和hupB基因斷裂的菌株MG1655ΔhupAB。
(5)基因斷裂菌株的培養(yǎng)用容量10ml的L-管，將fis基因斷裂的菌株MG1655Δfis、hns基因斷裂的菌株MG1655Δhns、hupAB基因斷裂的菌株MG1655ΔhupAB、dps基因斷裂的菌株MG1655Δdps和它們的親本菌株MG1655，培養(yǎng)在含有20mMNH4Cl、2mM MgSO4、40mM NaHPO4、30mM KH2PO4、0.01mM CaCl2、0.01mMFeSO4、0.01mM MnSO4、5mM檸檬酸、10mM葡萄糖、2mM鹽酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培養(yǎng)基中。開始培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)基的量為5ml。在37℃下以70rpm的旋轉(zhuǎn)率進(jìn)行旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)。培養(yǎng)基、容器等在使用前都經(jīng)過高壓滅菌。
持續(xù)測定液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度。細(xì)胞濃度是通過使用生物光檢測器(biophotodetector)(Advantech)測量660nm處的混濁度來測定的。結(jié)果如圖1所示。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dps基因斷裂的菌株顯示出與對照菌株相似的生長水平，而hns基因斷裂的菌株和hupAB基因斷裂的菌株顯示出生長水平下降。另一方面發(fā)現(xiàn)，與對照菌株相比，fis基因斷裂的菌株顯示出生長水平提高。因此，證實了fis基因斷裂在發(fā)酵生產(chǎn)上的作用。
實施例2大腸桿菌fis基因的斷裂及其對L-賴氨酸生產(chǎn)的作用(1)fis基因的斷裂與實施例1中的方法相同，由大腸桿菌WC196菌株制備得到fis基因斷裂的菌株WC196Δfis。WC196菌株是一種源自AEC抗性大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌。該菌株的專有號為AJ13069，保藏在國家生物科學(xué)和人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理機構(gòu)(現(xiàn)為國家高等工業(yè)科學(xué)和技術(shù)協(xié)會，國際專利生物體保藏組織，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到的保藏號為FERM P-14690。然后，它于1995年9月29日被轉(zhuǎn)移到布達(dá)佩斯條約規(guī)定的國際保藏單位，得到的保藏號為FERM BP-5252(參見國際專利公開WO96/17930)。使用實施例1中獲得的fis基因斷裂的質(zhì)粒pMANΔfis來轉(zhuǎn)化產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌大腸桿菌WC196。隨后進(jìn)行的程序與實施例1中的方法相同，由L-賴氨酸細(xì)菌大腸桿菌產(chǎn)WC196制備得到fis基因斷裂的菌株WC196Δfis。
(2)fis基因斷裂菌株的培養(yǎng)用200ml錐形瓶，將fis基因斷裂的菌株WC196Δfis和其親本菌株WC196培養(yǎng)在含有20mM NH4Cl、2mM MgSO4、40mM NaHPO4、30mM KH2PO4、0.01mM CaCl2、0.01mM FeSO4、0.01mM MnSO4、5mM檸檬酸、50mM葡萄糖、2mM鹽酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培養(yǎng)基中。開始培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)基的量為20ml。在37℃下以144rpm的旋轉(zhuǎn)率進(jìn)行旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)。培養(yǎng)基、容器等在使用前都經(jīng)過高壓滅菌。
持續(xù)測定液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度、葡萄糖濃度和L-賴氨酸的積累。細(xì)胞濃度是通過使用分光光度計(Beckman)測量經(jīng)水稀釋至適當(dāng)濃度的液體培養(yǎng)基在562nm處的混濁度來測定的。離心除去細(xì)胞后，將培養(yǎng)上清液稀釋至適當(dāng)濃度，再用生物技術(shù)分析儀(biotech analyzer)(Sakura Seiki)測定葡萄糖濃度和L-賴氨酸的濃度。結(jié)果如圖2至4所示。進(jìn)一步而言，培養(yǎng)8小時后的L-賴氨酸的積累值和殘余葡萄糖濃度如下所示。
表1fis斷裂的菌株8小時后的L-賴氨酸積累和殘余葡萄糖濃度
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照菌株相比，fis基因斷裂的菌株顯示出其生長水平(圖2)、葡萄糖消耗率(圖3)和L-賴氨酸生產(chǎn)率(圖4)都提高了。
實施例3將產(chǎn)L-賴氨酸的質(zhì)粒導(dǎo)入fis基因斷裂的大腸桿菌菌株極其對L-賴氨酸生產(chǎn)的作用(1)將產(chǎn)L-賴氨酸的質(zhì)粒導(dǎo)入fis基因斷裂的菌株用含有突變的二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶基因、突變得源自埃希氏菌屬細(xì)菌的天冬氨酸激酶III基因和二氫吡啶二羧酸還原酶基因以及源自乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Lactofermentum)的二氨基庚二酸脫氫酶基因的質(zhì)粒pCABD2(WO95/16042)，轉(zhuǎn)化實施例2中獲得的fis基因斷裂的菌株WC196Δfis和其親本菌株WC196，以獲得WC196/pCABD2菌株和WC196Δfis/pCABD2菌株。上述突變的二氧吡啶二羧酸合成酶基因和突變的天冬氨酸激酶III基因，都具有對L-賴氨酸的反饋抑制不敏感的突變。
(2)fis基因斷裂菌株的培養(yǎng)用200ml錐形瓶，將fis基因斷裂的WC196Δfis/pCABD2菌株和具有fis基因的野生型菌株WC196/pCABD2培養(yǎng)在含有20mM NH4Cl、2mM MgSO4、40mM NaHPO4、30mM KH2PO4、0.01mM CaCl2、0.01mM FeSO4、0.01mMMnSO4、5mM檸檬酸、50mM葡萄糖、2mM鹽酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培養(yǎng)基中。開始培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)基的量為20ml。在37℃下以144rpm的旋轉(zhuǎn)率進(jìn)行旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)。培養(yǎng)基、容器等在使用前都經(jīng)過高壓滅菌。
持續(xù)測定液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度、葡萄糖濃度和L-賴氨酸的積累。細(xì)胞濃度是通過使用分光光度計(Beckman)測量經(jīng)水稀釋至適當(dāng)濃度的液體培養(yǎng)基在562nm處的混濁度來測定的。離心除去細(xì)胞后，將培養(yǎng)上清液稀釋至適當(dāng)濃度，再用生物技術(shù)分析儀(Sakura Seiki)測定葡萄糖濃度和L-賴氨酸的濃度。結(jié)果如圖5至7所示。進(jìn)一步而言，培養(yǎng)8小時后的L-賴氨酸的積累值和殘余葡萄糖濃度如下所示。
表2fis斷裂的菌株8小時后的L-賴氨酸積累和殘余葡萄糖濃度
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照菌株相比，導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸質(zhì)粒的fis基因斷裂的菌株的生長水平(圖5)、葡萄糖消耗率(圖6)和L-賴氨酸生產(chǎn)率(圖7)都提高了。
序列表<110>味之素株式會社<120>生產(chǎn)物質(zhì)的方法<130>OP1626<140>
<141>2003-11-11<150>JP 2002-327205<151>2002-11-11<160>22<170> PatentIn version 3.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>1cctggatctt tcgggaaatc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>2tacgcgttgt tcgaacatag<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>3ctatgttcga acaacgcgta aaatacggca tgaactaatt<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>4cactctgcaa tcacttcaaa<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>7caatgagcga agcacttaaa ttcctgatca agcaataatc<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述PCR引物<400>10taatttagcg gtactcataa<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
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<223>人工序列的描述PCR引物<400>12cggcaaaaac gtgatgcacg<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>15ttatgaacaa gactcaactg aaagacgcag ttaagtaaga<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>16aacattgata ttgatgagcg<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>人工序列的描述PCR引物<400>20cgccaatcag gtaaccactc<210>21<211>497<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(101)..(397)<400>21cgcacattca acgccattga ggatgccagc gaacagctgg aggcgttgga ggcatacttc 60gaaaattttg cgtaaacaga aataaagagc tgacagaact atgttcgaac aacgcgtaaa 120ttctgacgta ctgaccgttt ctaccgttaa ctctcaggat caggtaaccc aaaaacccct 180gcgtgactcg gttaaacagg cactgaagaa ctattttgct caactgaatg gtcaggatgt 240gaatgacctc tatgagctgg tactggctga agtagaacag cccctgttgg acatggtgat 300gcaatacacc cgtggtaacc agacccgtgc tgcgctgatg atgggcatca accgtggtac 360gctgcgtaaa aaattgaaaa aatacggcat gaactaattc aggttagcta aatgcttgat 420taaaaaggcg ctactcggca tggggaagcg ccttttttat aggtgtcaca aagggagtga 480ccatgagaac aggatgt497<210>22<211>98<212>PRT<213>大腸桿菌<400>22
Met Phe Glu Gln Arg Val Asn Ser Asp Val Leu Thr Val Ser Thr Val1 5 10 15Asn Ser Gln Asp Gln Val Thr Gln Lys Pro Leu Arg Asp Ser Val Lys20 25 30Gln Ala Leu Lys Asn Tyr Phe Ala Gln Leu Asn Gly Gln Asp Val Asn35 40 45Asp Leu Tyr Glu Leu Val Leu Ala Glu Val Glu Gln Pro Leu Leu Asp50 55 60Met Val Met Gln Tyr Thr Arg Gly Asn Gln Thr Arg Ala Ala Leu Met65 70 75 80Met Gly Ile Asn Arg Gly Thr Leu Arg Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Gly85 90 95Met Asn
權(quán)利要求
1.一種通過使用屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌以在培養(yǎng)基或細(xì)胞中生產(chǎn)和積累靶物質(zhì)，并收集靶物質(zhì)，其中的細(xì)菌具有生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力，且FIS蛋白在細(xì)胞中不能正常地起作用。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)菌染色體上的fis基因已被斷裂，致使FIS蛋白不能正常地起作用。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌是大腸桿菌。
4.按照權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中靶物質(zhì)是L-氨基酸或蛋白。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中L-氨基酸是天冬氨酸家族的L-氨基酸。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中天冬氨酸家族包括賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述氨基酸是L-賴氨酸。
全文摘要
一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)埃希氏菌屬細(xì)菌以生產(chǎn)和積累培養(yǎng)基或細(xì)胞中的靶物質(zhì)，并收集靶物質(zhì)，例如，染色體上fis基因被斷裂的、致使FIS蛋白在細(xì)胞中不能正常地起作用的菌株，可被用作該細(xì)菌。
文檔編號C12P13/00GK1498969SQ20031011986
公開日2004年5月26日 申請日期2003年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月11日
發(fā)明者瀧川里繪, 今泉明, 松井和彥, 児島宏之, 之, 彥 申請人:味之素株式會社