專利名稱：操作哺乳動(dòng)物中抗原特異性抗體的水平的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供增加哺乳動(dòng)物中自身抗原-特異性IgM抗體的水平，并因此減少哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原(circulating autoantigen)的水平的組合物和方法。通過使用這些自身抗原-特異性IgM抗體，本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供增加哺乳動(dòng)物中抗原-特異性IgG抗體的水平，并因此減少哺乳動(dòng)物中循環(huán)抗原的水平的組合物和方法。通過使用這些抗原-特異性IgG抗體，本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物疾病或狀況，例如癌癥或外來抗原諸如病原體的組合物和方法。
背景技術(shù)：
自身免疫性指免疫系統(tǒng)成分與正?；虍惓５淖晕业哪承┓磻?yīng)活性。免疫系統(tǒng)最重要的功能之一是去除由持續(xù)破損的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞殘骸。如果由持續(xù)破損的細(xì)胞產(chǎn)生的胞質(zhì)內(nèi)高分子量(MW)的物質(zhì)得以積聚在循環(huán)中，那么就可能產(chǎn)生針對自己的毒性和/或致病性自身抗體反應(yīng)。CD5+細(xì)胞的產(chǎn)物，自身抗原-特異性IgM，能夠幫助去除/代謝胞質(zhì)內(nèi)自身抗原，以幫助維持對自身的耐受性。天然發(fā)生的IgM抗體參與去除組織降解產(chǎn)物。特異性循環(huán)IgM抗-組織抗體已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于處于疾病狀態(tài)里的人中，在所述疾病狀態(tài)中發(fā)生有細(xì)胞降解現(xiàn)象，例如抗-心臟抗體發(fā)現(xiàn)于患有心急梗塞的患者中，發(fā)現(xiàn)于某些肝病中，以及灼傷損傷之后。因此，由對顆粒性亞細(xì)胞組分具有特異性的IgM抗體組成的限制型免疫應(yīng)答(restricted formof immune response)可以存在于正常個(gè)體中。
細(xì)胞死亡，例如因毒性損害、組織缺氧等引起的細(xì)胞死亡之后，隱蔽性自身抗原(cryptic autoantigens)會暴露于免疫系統(tǒng)。隱蔽性自身抗原可以被釋放到組織空間、血液、尿、內(nèi)臟等中，在其中，它們可以啟動(dòng)IgM抗體應(yīng)答，然后被去除和/或分解代謝掉。如果隱蔽性自身抗原因暴露于修飾劑(化學(xué)試劑、毒性試劑、感染性試劑等)而被修飾，那么這些修飾的自身抗原將作為外來物質(zhì)而被識別，并隨后發(fā)生致病性IgG應(yīng)答。這會對目標(biāo)器官產(chǎn)生直接的損害，或通過免疫復(fù)合物產(chǎn)生間接損害，免疫復(fù)合物例如由修飾/未修飾的抗原和停留在腎小球、其他血管、結(jié)締組織和類似物中的致病性IgG抗體組成。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物中自身抗原-特異性IgM抗體的水平的方法和組合物，包括下述步驟(a)提供包括未修飾的自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對于所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原-特異性IgM抗體的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物以組合物。本發(fā)明提供了減少哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平的方法和組合物，包括下述步驟(a)提供包括未修飾的自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的組合物，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原特異性IgM抗體的水平，進(jìn)而減少所述哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物以組合物。本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的方法和組合物，包括下述步驟(a)提供包括未修飾的自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的組合物，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(b)以足以減少所述哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平，進(jìn)而改善所述哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的量給予所述哺乳動(dòng)物以組合物。在可選擇的方面，通過改善所述方法能夠治療的自身免疫疾病，減輕自身免疫疾病的嚴(yán)重性，減緩或預(yù)防自身免疫疾病的發(fā)作，和/或減緩自身免疫疾病的進(jìn)展。在一個(gè)方面，哺乳動(dòng)物是人。
在可選擇的方面，用于本發(fā)明方法和組合物的多價(jià)抗體包括具有三價(jià)、四價(jià)、五價(jià)或更多的價(jià)的實(shí)體(entities)。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括IgM。在可選擇的方面，多價(jià)抗體包括多個(gè)抗原-結(jié)合部分，即多-抗原結(jié)合位點(diǎn)，包括多-片段，子序列(subsequences)、互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，它們保留了與抗原結(jié)合的能力，包括多-(i)Fab片斷，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片斷；(ii)F(ab’)2片斷，包括在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片斷的二價(jià)片斷；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片斷；(iv)由抗體的一個(gè)臂(a single arm)的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片斷；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片斷(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，和/或(vi)分離出的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括多-單鏈抗體。
在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法和組合物的多價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。多價(jià)抗體可以包括嵌合抗體，例如人源化的抗體。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的人抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠可以包括人免疫球蛋白基因座(locus)。用于本發(fā)明任何方法和組合物的多價(jià)抗體可以包括在能夠產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，諸如小鼠中產(chǎn)生的人抗體，例如如美國專利5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318所述。
在一個(gè)方面，在制備包括自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的組合物時(shí)，在給藥之前即刻將未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合；或在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)或更長時(shí)間之間，將未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合；或在給藥之前約5分鐘至1小時(shí)之間，將自身抗原與所述多價(jià)抗體所述混合；或在給藥之前約10分鐘至30分鐘之間，將自身抗原與所述多價(jià)抗體所述混合。
在一個(gè)方面，在制備包括自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的組合物時(shí)，未修飾的自身抗原與多價(jià)抗體混合，并將所述混合物冷凍-干燥。在給藥時(shí)，冷凍干燥的混合物可以重構(gòu)成制劑，用于給藥。冷凍干燥的混合物可以保存在約-20℃和4℃之間的溫度中。冷凍干燥的混合物重構(gòu)在水制劑中，諸如無菌蒸餾水，或緩沖鹽水，例如PBS、林格氏溶液(Ringer’s)和類似物中。
在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法和組合物的自身抗原包括純化的自身抗原。自身抗原可以包括重組的和合成的多肽。自身抗原可以包括可溶性抗原或顆粒性抗原。自身抗原可以包括小分子量的抗原，例如具有約0.1至10kd或約0.5至5kd之間的分子量；或自身抗原可以包括大分子量的抗原，例如具有在約5至50kd或約10至25kd之間的分子量。
在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法和組合物的自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的自身抗原。自身抗原可以包括腎小管致腎炎抗原(kidney tubular nephritogenicantigen)、腎小球致腎炎抗原(glomerular nephritogenic antigen)、子宮內(nèi)膜repro-EN-1.0抗原(endometrial repro-EN-1.0 antigen)、子宮內(nèi)膜IB1抗原(endometrial IB1 antigen)、谷氨酸脫羧酶、核仁ASE-1抗原(nucleolar ASE-1antigen)、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、轉(zhuǎn)醛縮酶(transaldolase)、髓鞘堿性蛋白、70kD線粒體膽汁自身抗原(70kD mitochondrial biliary autoantigen)、人軟骨糖蛋白39、人Sp17蛋白或人胎盤Hp-8。用于本發(fā)明方法和組合物的自身抗原還可以包括參與自身免疫應(yīng)答的多種自身抗原。
在一個(gè)方面，自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的亞細(xì)胞組分(subcellularfraction)、細(xì)胞、組織或器官。細(xì)胞或組織可以包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞或組織勻漿或細(xì)胞、組織或器官提取物。在一個(gè)方面，亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官包括腎近端小管(renal proximal tubule)或腎近端曲小管(renal proximal convolutedtubule)或其亞細(xì)胞組分。自身免疫應(yīng)答可以包括對腎小球基膜(kidney glomerularbasement membrane)自身抗原或腎近端曲小管抗原的自身免疫應(yīng)答。
在一個(gè)方面，自身免疫疾病包括自身免疫腎病，諸如被動(dòng)海曼氏腎炎(passive Heymann nephritis)、狼瘡性腎炎或膜性腎病(membranous nephropathy)。在可選擇的方面，自身免疫疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(Sjogren′s syndrome)、自身免疫甲狀旁腺功能減退癥、多發(fā)性硬化癥(MS)、原發(fā)性膽汁性肝硬變癥(PBC)、自身免疫溶血性貧血癥、接觸敏感性皮炎(contactsensitivity dermatitis)、自身免疫發(fā)泡性紊亂(autoimmune blistering disorders)(例如尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、大皰性類天皰瘡(bolus pemphigoid))、自身免疫不孕癥、自身免疫性阿狄森病、重癥肌無力、自身免疫性甲狀腺炎或硬皮病。
在一個(gè)方面，以摩爾為基礎(chǔ)，存在于組合物中的自身抗原比所述多價(jià)抗體多約1％至1000％。例如，在可選擇的方面，以摩爾為基礎(chǔ)，存在于所述組合物中的自身抗原比多價(jià)抗體多約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。在一個(gè)方面，包括等摩爾量的多價(jià)抗體和抗原的可供選擇的制劑可以用于實(shí)施本發(fā)明。在一些方面，制劑的維持劑量只需等摩爾的多價(jià)抗體和抗原制劑。
在可選擇的方面，本發(fā)明的藥物組合物和用于本發(fā)明方法的組合物可以包括約1μgm至500mg或更多數(shù)量之間的抗原和合適數(shù)量的抗體(二價(jià)或多價(jià)抗體)，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。在其他方面，本發(fā)明的藥物組合物和用于本發(fā)明方法的組合物可以包括約0.1mg至10mg之間或0.1mg至1.0mg之間的抗原和合適數(shù)量的抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。在一個(gè)方面，組合物包括約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合適數(shù)量的抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法或組合物的抗體(二價(jià)或多價(jià)抗體)具有已知的滴度(titer)(對抗原來說)。
在可選擇的方面，本發(fā)明的藥物組合物和用于本發(fā)明方法的組合物可以通過任何途徑，例如腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。在一個(gè)方面，組合物一天一次、一天兩次、或一天三次給藥。組合物可以一周約一次至兩次給藥。組合物可以最初一周兩次給藥，給藥約3周，然后每周一次給藥，給藥約5個(gè)月，然后每月一次給藥。在一個(gè)方面，一旦免疫系統(tǒng)被調(diào)整(tuned)為對注射的本發(fā)明復(fù)合物產(chǎn)生應(yīng)答，那么僅僅注射自身抗原也能維持特異性免疫應(yīng)答(盡管在較低的免疫應(yīng)答水平)。
本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括(i)未修飾的自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體天然來自所述哺乳動(dòng)物或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾量存在于組合物中；和(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可選擇的方面，用于本發(fā)明的藥物組合物和方法的多價(jià)抗體包括具有三價(jià)、四價(jià)、五價(jià)或更多價(jià)的實(shí)體。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括IgM。在可選擇的方面，多價(jià)抗體包括多-抗原結(jié)合部分，即多抗原結(jié)合位點(diǎn)，包括多-片段、子序列、互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其保留了與抗原結(jié)合的能力，包括多-(i)Fab片斷，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片斷；(ii)F(ab’)2片斷，包括在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片斷的二價(jià)片斷；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片斷；(iv)由抗體的一個(gè)臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片斷；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片斷(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，和/或(vi)分離出的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括多-單鏈抗體。在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法和組合物的多價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。多價(jià)抗體可以包括嵌合抗體，例如人源化的抗體。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的人抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠可以包括人免疫球蛋白基因座。用于本發(fā)明的任何藥物組合物和方法的多價(jià)抗體可以包括由能夠產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，諸如小鼠產(chǎn)生的人抗體，例如如美國專利5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318所述。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括IgM。在一個(gè)方面，多價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。在一個(gè)方面，用于本發(fā)明藥物組合物的多價(jià)抗體包括人源化的抗體。
本發(fā)明提供藥物組合物和制備它們的方法，所述的制備包括在給藥之前即刻混合未修飾的自身抗原和多價(jià)抗體。在一個(gè)方面，在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)之間，將未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合，或在給藥之前約5分鐘至1小時(shí)之間，將自身抗原與多價(jià)抗體混合；或在給藥之前約10分鐘至30分鐘之間，將自身抗原與多價(jià)抗體混合。
本發(fā)明提供藥物組合物和制備它們的方法，所述的制備包括冷凍干燥或凍干自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的混合物?；旌衔锟梢允切迈r的混合物，或如上所論述，在未修飾的自身抗原和多價(jià)抗體混合物被冷凍干燥或凍干之間可以經(jīng)歷一段時(shí)間(延遲)。給藥時(shí)，冷凍-干燥的混合物可以重構(gòu)成制劑，用于給藥。冷凍-干燥的混合物可以保存在約-20℃和4℃之間的溫度中。冷凍-干燥的混合物可以重構(gòu)在水制劑中，例如無菌蒸餾水或緩沖鹽水或類似物中。
本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含純化或分離出的自身抗原、或包括重組或合成的多肽的自身抗原。自身抗原包括可溶性抗原或顆粒性抗原，或小分子量抗原，例如具有約0.1至10kd或約0.5至5kd之間的分子量(MW)；或自身抗原可以包括大分子量抗原，例如具有約5至50kd或約10至25kd之間的MW。
本發(fā)明提供了包括參與自身免疫應(yīng)答的自身抗原的藥物組合物。自身抗原可以是任何已知的自身抗原，或新的自身抗原，其用常規(guī)的篩選方法確定。在可選擇的方面，自身抗原包括腎小球基膜抗原、腎小管致腎炎抗原、腎小球致腎炎抗原、子宮內(nèi)膜repro-EN-1.0抗原、子宮內(nèi)膜IB1抗原、谷氨酸脫羧酶、核仁ASE-1抗原、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、轉(zhuǎn)醛縮酶、髓鞘堿性蛋白、70kD線粒體膽汁自身抗原、人軟骨糖蛋白39、人Sp17蛋白、人胎盤Hp-8。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物還可以包括參與一種或多種自身免疫應(yīng)答的的單一自身抗原(single autoantigen)或許多不同的自身抗原。在一個(gè)方面，自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的亞細(xì)胞部分、細(xì)胞、組織或器官。在一個(gè)方面，所述細(xì)胞或組織包括亞細(xì)胞部分、細(xì)胞或組織勻漿或細(xì)胞、組織或器官提取物。所述亞細(xì)胞部分、細(xì)胞、組織或器官可以包括腎近端小管或腎近曲小管或其亞細(xì)胞部分。自身免疫應(yīng)答可以包括針對腎小球基膜自身抗原或腎近曲小管抗原的自身免疫應(yīng)答。自身免疫應(yīng)答包括自身免疫腎病，諸如被動(dòng)海曼腎炎、狼瘡性腎炎或膜性腎病。自身免疫應(yīng)答可以包括任何自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征、自身免疫甲狀旁腺功能減退癥、多發(fā)性硬化癥(MS)、原發(fā)性膽汁性肝硬變癥(PBC)、自身免疫溶血性貧血癥、接觸性敏感性皮炎、自身免疫發(fā)泡性紊亂(例如尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、團(tuán)塊狀類天皰瘡)、自身免疫不孕癥、自身免疫性阿狄森病、重癥肌無力、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病。
在本發(fā)明的藥物組合物的一個(gè)方面，以摩爾為基礎(chǔ)，存在于組合物中的自身抗原比所述多價(jià)抗體多約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。本發(fā)明的藥物組合物可以包括約1μgm至500mg或更多數(shù)量之間的抗原和合適數(shù)量的抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物和用于本發(fā)明方法的組合物可以包括約0.1mg至10mg之間，或0.1mg至1.0mg之間的抗原和合適數(shù)量的抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。在一個(gè)方面，組合物包括約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合適數(shù)量的抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物可以配制成通過任何途徑給藥，例如通過腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物一天一次、一天兩次、或一天三次給藥。在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物一周約一次至兩次給藥。在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物可以最初一周兩次給藥，給藥約3周，然后每周一次給藥，給藥約5個(gè)月，然后每月一次給藥。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物作為無菌液體制劑進(jìn)行配制，例如無菌鹽水、PBS、林格氏溶液和類似物，用于例如注射、灌輸、噴霧和類似給藥方式。
本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物中抗原-特異性IgG抗體的水平的方法，包括下述步驟(a)提供包括修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體的組合物，其中所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原-特異性IgG抗體的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物組合物。本發(fā)明提供了減少哺乳動(dòng)物中循環(huán)抗原的水平的方法，包括下述步驟(a)提供包括修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體的組合物，其中所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原-特異性IgG抗體的水平，進(jìn)而減少所述哺乳動(dòng)物中循環(huán)抗原的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物組合物。本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物疾病或狀態(tài)的方法，包括下述步驟(a)提供包括修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體的組合物，其中所述抗原與疾病或狀態(tài)有關(guān)，所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(b)以足以增加哺乳動(dòng)物中抗原-特異性二價(jià)抗體的水平，進(jìn)而改善所述哺乳動(dòng)物疾病或狀態(tài)的量給予所述哺乳動(dòng)物組合物。本發(fā)明提供了藥物組合物，包括(i)修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體，其中所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾量存在于組合物中；和(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一個(gè)方面，哺乳動(dòng)物是人。
在可選擇的方面，用于本發(fā)明方法和組合物的二價(jià)抗體包括IgG或IgA。在可選擇的方面，二價(jià)抗體包括兩個(gè)抗原結(jié)合部分，即二價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)，包括二價(jià)片段、子序列、互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其保留了結(jié)合抗原的能力，包括二價(jià)(i)Fab片斷，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片斷；(ii)F(ab’)2片斷，包括在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片斷的二價(jià)片斷；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片斷；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片斷；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片斷(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，和/或(vi)分離出的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在一個(gè)方面，抗體包括二價(jià)單鏈抗體。
在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法和組合物的二價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。二價(jià)抗體可以包括嵌合抗體，例如人源化的抗體。在一個(gè)方面，二價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因鼠中產(chǎn)生的人抗體。轉(zhuǎn)基因鼠可以包括人免疫球蛋白基因座。用于本發(fā)明任何藥物組合物和方法的二價(jià)抗體可以包括由能夠產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，諸如鼠產(chǎn)生的人抗體，例如如美國專利5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318所述。在一個(gè)方面，二價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。
在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法和組合物的二價(jià)抗體通過包括在給藥之前即刻混合修飾的抗原和二價(jià)抗體的方法而制備。在可選擇的方面，用于本方法的組合物(例如，藥物組合物)或本發(fā)明的組合物通過這樣的方法制備，該方法包括在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)之間，將修飾的抗原與抗體(例如二價(jià)抗體或多價(jià)抗體)混合，或在給藥之前約10分鐘至1小時(shí)之間，混合修飾的抗原與二價(jià)抗體；或在給藥之前約30分鐘至1小時(shí)之間，混合修飾的抗原與二價(jià)抗體； 在一個(gè)方面，用于本方法的組合物(例如，藥物組合物)或本發(fā)明的組合物通過包括冷凍干燥或凍干修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體的方法而制備。在給藥時(shí)，冷凍干燥的混合物可以重構(gòu)成制劑，用于給藥。冷凍干燥的混合物可以保存在約-20℃和4℃之間的溫度中。冷凍干燥的混合物可以重構(gòu)在水制劑中，諸如無菌蒸餾水，或緩沖鹽水，例如PBS、林格氏溶液和類似物中。
在用于本方法的組合物(例如藥物組合物)或本發(fā)明組合物的一個(gè)方面，抗原包括純化或分離的抗原；或抗原包括重組和合成的多肽；或抗原包括可溶性抗原或顆粒性抗原；或自身抗原包括小分子量抗原，例如具有約0.1至10kd或約0.5至5kd之間的MW；或自身抗原包括大分子量抗原，例如具有約5至50kd或約10至25kd之間的MW。
在用于本方法的組合物(例如藥物組合物)或本發(fā)明組合物的一個(gè)方面，抗原包括癌癥-特異性抗原或?qū)υ錾?xì)胞或組織具有特異性的抗原。抗原可以包括外來抗原(foreign antigen)，例如細(xì)菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、酵母抗原或原生動(dòng)物抗原。抗原可以包括亞細(xì)胞部分、細(xì)胞、組織或器官。細(xì)胞或組織可以包括亞細(xì)胞部分、細(xì)胞或組織勻漿或細(xì)胞、組織或器官提取物。癌癥可以是黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肝癌、乳癌、肺癌或胃癌。外來抗原可以包括來自病原體或感染性疾病媒介物(infectious disease agent)的抗原。所述來自病原體或感染性疾病媒介物的抗原可以包括細(xì)菌抗原、病毒抗原或來自原生動(dòng)物的抗原，例如來自葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、大腸桿菌(E.coli)、流感病毒、甲型、乙型或丙型肝炎或瘧疾的抗原。
在用于本方法的組合物(例如藥物組合物)或本發(fā)明組合物的一個(gè)方面，以摩爾計(jì)算，存在于組合物中的修飾的抗原比二價(jià)抗體多約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。在一個(gè)方面，組合物包括約0.1mg至10mg之間的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，以保持抗原的摩爾數(shù)超過二價(jià)抗體；或組合物包括約0.1mg至1.0mg之間的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過二價(jià)抗體；或組合物包括約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，以維持抗原的摩爾數(shù)超過抗體。
在一個(gè)方面，組合物(例如藥物組合物)通過腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。組合物可以一天一次、一天兩次、或一天三次或更多次給藥。組合物可以一周約一次至兩次給藥。組合物可以最初一周兩次給藥，給藥約3周，然后每周一次給藥，給藥約5個(gè)月，然后每月一次給藥。在一個(gè)方面，一旦通過注射本發(fā)明的復(fù)合物，免疫系統(tǒng)被調(diào)整為對修飾的抗原適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生應(yīng)答，那么僅僅注射修飾的抗原也能維持特異性免疫應(yīng)答(盡管免疫應(yīng)答水平較低)。在一個(gè)方面，為了維持高水平的特異性循環(huán)IgG抗體，通過依照微微過量的抗原，持續(xù)注射本發(fā)明的合適的復(fù)合物，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞受到比平時(shí)更多的刺激。例如，當(dāng)癌細(xì)胞被消除或在數(shù)量上減少時(shí)，或?qū)嶓w腫瘤退化或轉(zhuǎn)移性癌癥位點(diǎn)消失或減少時(shí)，和/或感染終止時(shí)，或自身免疫疾病或狀態(tài)被改善時(shí)，本發(fā)明合適的復(fù)合物的給藥頻率可以減少，和/或可以給予較少劑量的本發(fā)明合適的復(fù)合物。癌癥是否成功得到改善可以通過常規(guī)的程序測定，例如實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，包括活組織檢查、特異性血清分析、成像方法(例如X-射線、超聲波掃描圖、MRI)和類似方法。病原體或感染性病是否成功得到改善可以通過常規(guī)的程序測定，例如征兆、癥狀的存在與否、實(shí)驗(yàn)室檢查和類似方法。
在一個(gè)方面，用于本方法的組合物(例如藥物)或本發(fā)明組合物，包括無菌水制劑，諸如無菌蒸餾水或緩沖鹽水，例如PBS、林格氏溶液和類似物。
在一個(gè)方面，用于本方法的組合物(例如藥物)或本發(fā)明組合物包括佐劑。在一個(gè)方面，組合物與佐劑一起給藥。佐劑可以包括明礬或弗氏佐劑。
在一個(gè)方面，用于本方法的組合物(例如藥物)或本發(fā)明組合物是修飾的抗原，例如來自病原體、疾病源和類似物的修飾抗原。在一個(gè)方面，用于本發(fā)明方法或組合物的修飾的抗原與“耐受的”或“天然的”蛋白質(zhì)有足夠的不同以致于被識別為外來物，然而也足夠地相似以致于它能夠與耐受的蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。然而，本發(fā)明不受限于任何特定的作用機(jī)制，為了讓給藥的(例如注射的)抗原(例如蛋白質(zhì))激發(fā)免疫應(yīng)答，并從而終止無應(yīng)答性狀態(tài)(unresponsive state)(耐受)，抗原必須與“耐受的”蛋白質(zhì)足夠不同以致于被識別為外來物。在一個(gè)方面，抗原也足夠相似，以致于它能夠與耐受的蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。
抗原可以用半抗原修飾?？乖梢栽隗w外用各種小MW物質(zhì)半抗原化，以獲得半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，諸如對氨基苯基砷酸(arsanil)-蛋白質(zhì)、對氨基苯磺胺(sulfanil)-蛋白質(zhì)、對氨基苯基砷酸-對氨基苯磺胺蛋白質(zhì)和類似物。在一個(gè)方面，免疫-復(fù)合物制備成抗原的摩爾數(shù)微微超過特異性高滴度的二價(jià)抗體(例如IgG、IgA、融合的單鏈Abs或CDRs)，所述二價(jià)抗體是針對所述抗原。
半抗原-修飾的抗原可以包括半抗原-蛋白質(zhì)結(jié)合體。半抗原-蛋白質(zhì)結(jié)合體可以包括對氨基苯基砷酸-蛋白質(zhì)結(jié)合體、對氨基苯磺胺-蛋白質(zhì)結(jié)合體或?qū)Π被交樗?對氨基苯磺胺蛋白質(zhì)結(jié)合體。
本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)方面的細(xì)節(jié)闡述在下面的附圖和說明書中。通過閱讀說明書和附圖和權(quán)利要求書后，本發(fā)明其他的特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將會顯而易見。
在此引用的所有出版物、專利、專利申請、GenBank序列和ATCC保藏物均在此明確引入，可用作所有目的的參考。
附圖描述

圖1以圖示出了實(shí)驗(yàn)和對照動(dòng)物中的蛋白尿(proteinuria)，如在下面實(shí)施例1中詳細(xì)描述。
在不同附圖中同樣的標(biāo)記符號表示同樣的元素。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了控制哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的新型方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物中自身抗原-特異性IgM抗體的水平的組合物和方法。通過增加哺乳動(dòng)物中自身抗原-特異性IgM抗體的水平，減少自身抗原的水平，包括減少可溶性或循環(huán)形式的自身抗原。利用這些自身抗原-特異性IgM抗體，本發(fā)明提供了改善——包括預(yù)防或治療——自身免疫疾病的組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明的組合物和方法可以用于改善——包括預(yù)防或治療——同種異體移植物排斥，例如組織、器官或細(xì)胞(例如骨髓)移植排斥。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物抗原-特異性IgG抗體的水平的組合物和方法。增加哺乳動(dòng)物中抗原-特異性IgG抗體的水平可減少自身抗原的水平，包括減少哺乳動(dòng)物中可溶的，或循環(huán)形式的抗原。使用這些抗原-特異性IgG抗體，本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物疾病或狀態(tài)，例如癌癥或外來抗原諸如病原體的組合物和方法。所述組合物和方法可以用于治療或預(yù)防疾病或狀態(tài)。
盡管本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，本發(fā)明的方法部分地基于這樣的新發(fā)現(xiàn)當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)抗原被釋放時(shí)(例如細(xì)胞破壞之后)，那么將會立即產(chǎn)生特異性IgM抗體，并在清除細(xì)胞殘骸中發(fā)揮生理作用。哺乳動(dòng)物，包括人，對胞質(zhì)內(nèi)顆粒性抗原無耐受性。自身免疫系統(tǒng)的這種武器是生理性的，并因此對個(gè)體是有利的，其通過提供最有效的清除機(jī)制來去除不想要的、被破壞的細(xì)胞成份，而不想要的、破壞的細(xì)胞成份在因損傷、感染、創(chuàng)傷、組織缺氧引起的細(xì)胞死亡后產(chǎn)生，或細(xì)胞生命周期結(jié)束之后產(chǎn)生。
通用技術(shù) 本發(fā)明提供了包括分離的、重組的或合成的自身抗原、抗體和抗原的組合物?？梢员挥脕韺?shí)施本發(fā)明的核酸，例如基因組DNA、質(zhì)粒、病毒或它們的雜交子，可以分離自各種來源，遺傳工程化的、擴(kuò)增的、和/或表達(dá)的/重組產(chǎn)生的。由這些核酸產(chǎn)生的重組多肽(例如自身抗原、抗體、抗原)可以單獨(dú)分離或克隆并測試需要的活性。可以使用任何重組表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲或植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
可替代地，用于實(shí)施本發(fā)明的核酸和多肽可以用已知的化學(xué)合成技術(shù)體外合成，諸如描述于下述文獻(xiàn)中Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美國專利4,458,066。
操作核酸的技術(shù)，諸如亞克隆、標(biāo)記探針(使用Klenow聚合酶的隨機(jī)引物標(biāo)記、切口平移、擴(kuò)增)、測序、雜交和類似技術(shù)已在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中充分描述，參見例如Sambrook，ed.，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL(2ND ED.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGYHYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
本發(fā)明提供了包括用于實(shí)施本發(fā)明的自身抗原、抗體、抗原的融合蛋白質(zhì)，和編碼它們的核酸。本發(fā)明的多肽可以融合到異源肽或多肽，諸如N-末端識別肽(N-terminal identification peptides)，其賦予想要的特征，諸如增加的穩(wěn)定性或簡化的純化。本發(fā)明的肽和多肽也可以作為在其上連接有一個(gè)或多個(gè)額外的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)而被合成和表達(dá)，用于例如產(chǎn)生更具免疫原性的肽、制備修飾的抗原、更容易地分離重組合成的肽(例如抗原)、鑒定和分離抗體和表達(dá)抗體的B細(xì)胞和類似用途。
有助于檢測和純化的結(jié)構(gòu)域包括例如金屬螯合肽(metal chelating peptides)諸如使得可以在固定化金屬上進(jìn)行純化的多組氨酸(polyhistidine tracts)和組氨酸-色氨酸模塊(histidine-tryptophan modules)、使得可以在固定化的免疫球蛋白上進(jìn)行純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，和用于FLAGS延展/親合純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域(ImmunexCorp，Seattle WA)。在純化結(jié)構(gòu)域和包含模體的(motif-comprising)的肽或多肽之間加入可切割的連接序列諸如Xa因子或腸激酶(Invitrogen，San Diego CA)，可幫助純化。例如，表達(dá)載體可以包括編碼表位的核酸序列，其連接到六個(gè)組氨酸殘基，隨后是硫氧還蛋白和腸激酶結(jié)合位點(diǎn)(參見例如Williams(1995)Biochemistry341787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12404-414)。腸激酶切割位點(diǎn)提供了將表位從融合蛋白的殘留部分純化出來的手段，組氨酸殘基則幫助檢測和純化。
轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以被用于產(chǎn)生核酸或多肽(例如自身抗原、抗體、抗原)，由此來實(shí)施本發(fā)明。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物例如可以是山羊、兔、綿羊、豬、牛、大鼠和小鼠。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以用本領(lǐng)域任何已知的方法設(shè)計(jì)和產(chǎn)生，參見例如美國專利6,211,428；6，187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，它們描述了制備和使用轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和卵細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬和牛。
轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞可以被用于產(chǎn)生核酸或多肽(例如自身抗原、抗體、抗原)，由此來實(shí)施本發(fā)明。轉(zhuǎn)基因植物可以被用于產(chǎn)生大量的多肽(例如自身抗原、抗體、抗原)。例如，參見Palmgren(1997)Trends Genet.13348；Chong(1997)Transgenic Res.6289-296(使用生長素誘導(dǎo)型的、雙向甘露氨酸合成酶(mas1′，2′)啟動(dòng)子和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化方法，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中轉(zhuǎn)產(chǎn)生人乳蛋白β-酪蛋白)。使用已知的方法，技術(shù)人員可以通過檢測轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因mRNA或蛋白質(zhì)的增加或減少來篩選表達(dá)本發(fā)明的自身抗原、抗體、抗原的植物。檢測和量化mRNA或蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。
用于實(shí)施本發(fā)明的多肽或肽(例如自身抗原、抗體、抗原)可以分離自自然來源，可以是合成或重組產(chǎn)生的多肽。肽和蛋白質(zhì)可以在體外或體內(nèi)重組表達(dá)。用于實(shí)施本發(fā)明的肽或多肽可以用本領(lǐng)域已知的任何方法來制備和分離。用于實(shí)施本發(fā)明的多肽或肽也可以用本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法整體或部分地合成。參見Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.225-232Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and Proteins，F(xiàn)ormulation，Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用各種固相技術(shù)進(jìn)行(參見例如Roberge(1995)Science 269202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.2893-13)，并可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成，例如依據(jù)制造商提供的說明書使用ABI 431A肽合成儀(Perkin Elmer)進(jìn)行。
用于實(shí)施本發(fā)明的肽或多肽也可以進(jìn)行糖基化。糖基化可以通過化學(xué)方法或通過細(xì)胞生物合成機(jī)制在翻譯后加入，其中后者結(jié)合使用已知的糖基化模體，其可以天然源自序列或可以作為肽加入，或加入到核酸編碼序列中。糖基化可以是O-連接或N-連接。
用于實(shí)施本發(fā)明的肽和多肽包括所有“模擬的”和“肽模擬的”形式。術(shù)語“模擬的(mimetic)”和“肽模擬的(peptidomimetic)”指具有與本發(fā)明的多肽實(shí)質(zhì)上相同的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的合成的化學(xué)化合物。該模擬物或者完全由合成的非天然的氨基酸類似物組成，或者是由部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸類似物構(gòu)成的嵌合分子。所述模擬物也可以包括任意數(shù)量的天然氨基酸保守取代，只要這樣的取代本質(zhì)上不改變該模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性。用于實(shí)施本發(fā)明的多肽模擬化合物可以含有非天然結(jié)構(gòu)組分的任何組合。在可供選擇的方面，本發(fā)明的模擬化合物包括以下三種結(jié)構(gòu)基團(tuán)中的一種或所有a)不是天然酰胺鍵(“肽鍵”)連接的殘基連接基團(tuán)；b)取代天然發(fā)生的氨基酸殘基的非天然殘基；或者c)誘導(dǎo)二級結(jié)構(gòu)擬態(tài)(mimicry)的殘基，即是，為了誘導(dǎo)或者穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，如β轉(zhuǎn)角、γ轉(zhuǎn)角、β折疊、α螺旋構(gòu)象，等等。各個(gè)肽模擬物殘基可以通過肽鍵、其它的化學(xué)鍵或者偶聯(lián)方式連接，如，通過戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或者N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)連接。可以替代傳統(tǒng)的酰胺鍵(“肽鍵”)連接的連接基團(tuán)包括，如，酮基亞甲基(如，-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亞甲基(CH2-NH)、次乙基、烯烴(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、retroamide、硫代酰胺或者酯(參見如，Spatola(1983)在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，267-357頁，“Peptide Backbone Modifications”MarcellDekker，NY)。
芳香族氨基酸的模擬物可以通過用以下的取代來產(chǎn)生，如，D-或者L-萘基丙氨酸；D-或者L-苯基甘氨基，D-或L-2thieneyl丙氨酸；D-或者L-1，-2，3-或者4-芘基丙氨酸；D-或者L-3thieneyl丙氨酸；D-或者L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(2-吡嗪基)-丙氨酸，D-或者L-(4-異丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-p-氟-苯基丙氨酸；D-或者L-p-二苯基苯基丙氨酸；D-或者L-p-甲氧基-二苯基苯基丙氨酸；D-或者L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和，D-或者L-烷基丙氨酸，其中的烷基可以是取代的或者非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基，戊基、異丙基、異丁基、sec-isotyl、異戊基或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香環(huán)包括，如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香環(huán)。
酸性氨基酸的模擬物可以通過用以下的取代來產(chǎn)生，如，保持有負(fù)電荷的非羧酸氨基酸；(膦?；?丙氨酸；硫酸化的蘇氨酸。羧基側(cè)鏈(如，天冬氨?；蛘吖劝滨；?也可以通過與碳二亞胺(R′-N-C-N-R′)反應(yīng)進(jìn)行選擇性的修飾，所述碳二亞胺如1-環(huán)己基-3(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或者1-乙基-3(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。天冬氨?；蛘吖劝滨；部梢酝ㄟ^與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為天冬酰胺?；凸劝滨０孵；?。堿性氨基酸的模擬物可以通過用如，(除了賴氨酸和精氨酸外)鳥氨酸、瓜氨酸、或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)烷基-乙酸的取代產(chǎn)生，其中烷基如以上定義。腈衍生物(如，含有取代COOH的CN-部分)可以取代天冬酰胺或者谷氨酰胺。天冬酰胺?；凸劝滨０孵；梢悦摪被蔀橄鄳?yīng)的天冬氨?；蛘吖劝滨；?。精氨酸殘基模擬物可以通過精氨?；c例如一種或者多種常規(guī)試劑在優(yōu)選為堿性的條件下反應(yīng)而產(chǎn)生，所述的常規(guī)試劑包括如苯乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮或者茚三酮。酪氨酸殘基模擬物可以通過酪氨?；c例如芳香重氮化合物或者四硝基甲烷反應(yīng)而產(chǎn)生。N-acetylimidizol和四硝基甲烷可以分別用于形成O-乙酰基酪氨酰物質(zhì)和3-硝基衍生物。半胱氨酸殘基模擬物可以通過半胱氨酰殘基與例如α-鹵素乙酸例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相應(yīng)的胺反應(yīng)而產(chǎn)生；得到羧甲基或者羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸殘基模擬物也可以通過半胱氨酰殘基與例如溴代-三氟丙酮、α-溴-β-(5-imidozoyl)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；p-氯汞苯甲酸鹽；2-氯汞-4硝基苯酚，或者，氯-7-硝基苯并-氧雜-1，3-二唑反應(yīng)而產(chǎn)生。可以通過賴氨?；c例如琥珀酸或者其它的羧酸酸酐反應(yīng)而產(chǎn)生賴氨酸模擬物(和改變氨基末端殘基)。賴氨酸和其它的含有α-氨基的殘基模擬物也可以通過與亞氨酸酯例如methyl picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基-苯磺酸、O-甲基異脲、2，4，戊二酮的反應(yīng)，和與乙醛酸的轉(zhuǎn)酰胺基酶催化的反應(yīng)而產(chǎn)生。甲硫氨酸的模擬物可以通過與例如甲硫氨酸亞砜反應(yīng)而產(chǎn)生。脯氨酸的模擬物包括，例如，2-哌啶酸、四氫噻唑羧酸、3-或4-羥脯氨酸、脫氫脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸，或者3，3，-二甲基脯氨酸。組氨酸殘基模擬物可以通過組氨酰基與例如二乙基原碳酸酯或者對溴苯甲酰甲基溴化物反應(yīng)而產(chǎn)生。其它的模擬物包括，例如，由脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用產(chǎn)生的模擬物；由絲氨酰或者蘇氨酰的羥基的磷酸化作用產(chǎn)生的模擬物；由賴氨酸、精氨酸和組氨酸的α氨基基團(tuán)的甲基化作用產(chǎn)生的模擬物；由N-末端胺的乙酰化作用而產(chǎn)生的模擬物；由主鏈酰胺殘基的甲基化或用N-甲基氨基酸取代而產(chǎn)生的模擬物；或者，由C-末端羧基的酰胺化而產(chǎn)生的模擬物。
用于實(shí)施本發(fā)明的多肽可以通過天然過程改變，諸如翻譯后加工(例如磷酸化作用，?；饔玫?，或通過化學(xué)修飾技術(shù)改變，得到修飾的多肽。修飾可以發(fā)生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。修飾包括乙?；?、?；饔?、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共價(jià)連接核黃素、共價(jià)連接血紅素組分、共價(jià)連接核苷酸或者核苷酸衍生物、共價(jià)連接脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物、共價(jià)連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)的環(huán)化作用、形成二硫鍵、去甲基作用、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI錨、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻?；饔?、氧化作用、聚乙二醇化、蛋白水解過程、磷酸化作用、異戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸鹽化作用，和轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)氨基酸添加到蛋白質(zhì)中，如精氨?；?。參見，如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H.Freeman和Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，11-12頁(1983)。
固相化學(xué)肽合成方法也可以用于合成用于實(shí)施本發(fā)明的多肽或片段，參見例如Merrifield(1963)Am.Chem.Soc.852149-2154；Stewart，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill，pp.11-12；商業(yè)上可利用的實(shí)驗(yàn)室肽設(shè)計(jì)和合成試劑盒，例如Cambridge ResearchBiochemicals。此種商業(yè)上可利用的實(shí)驗(yàn)室試劑盒通常利用H.M.Geysen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，813998(1984)的教導(dǎo)，在多個(gè)“桿(rods)”或“針(pins)”的尖端(tips)上合成肽，所有的“桿”或“針”連接到單個(gè)板。
抗體和基于抗體的篩選方法 本發(fā)明提供了使用抗體的方法和組合物，抗體包括二價(jià)和多價(jià)抗體，其分別特異性地結(jié)合到癌癥或致病性抗原，或自身抗原。用于實(shí)施本發(fā)明的抗體可以是分離的、合成的或重組的抗體。
抗體也可以用于免疫沉淀、染色、免疫親合柱和類似物。如果需要，編碼特定抗原的核酸序列可以通過進(jìn)行免疫，然后分離多肽或核酸、擴(kuò)增或克隆和表達(dá)本發(fā)明的多肽而產(chǎn)生?？商娲?，這些方法可以用于修飾抗體的結(jié)構(gòu)，例如抗體與抗原(自身抗原、致病性抗原、癌癥抗原)的親和力可以被增加或減少。
免疫、產(chǎn)生和分離抗體(多克隆和單克隆抗體)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，并描述于科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，例如參見Coligan，CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASIC AND CLINICALIMMUNOLOGY(7th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，NewYork。除了使用動(dòng)物的傳統(tǒng)體內(nèi)方法外，抗體也可以例如使用表達(dá)重組抗體結(jié)合位點(diǎn)的噬菌體展示文庫體外產(chǎn)生。參見例如Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.1562-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2627-45。
抗體可以被用于免疫親合層析程序，以分離或純化被用于實(shí)施本發(fā)明的多肽，或測定多肽是否存在于生物樣品中。在免疫親合程序中，抗體被附著到固體支持物，諸如珠或其他柱基質(zhì)。在一定的條件下，放置蛋白質(zhì)使之與抗體接觸，在所述條件中，抗體特異性地結(jié)合到想要的多肽(例如抗原、其他抗體)。洗滌去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)之后，洗脫特異性結(jié)合的多肽。
在生物樣品中的蛋白質(zhì)(例如抗原)結(jié)合抗體的能力可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種方法中的任何一種來測定。例如，結(jié)合可以通過用可檢測標(biāo)記諸如熒光試劑、酶標(biāo)記或放射性同位素對抗體進(jìn)行標(biāo)記來測定?？商娲?，抗體與樣品的結(jié)合可以使用其上具有此種可檢測標(biāo)記的二抗來檢測。具體的測定方法包括ELISA測定、夾層測定(sandwich assays)、放射性免疫測定和Western印跡。
為了制備單克隆抗體，可以使用提供由持續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，Nature，256495-497，1975)、三體瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，Immunology Today 472，1983)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
已描述的用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(參見例如美國專利4,946,778)可以被調(diào)整用于產(chǎn)生單鏈抗體，以用于本發(fā)明的方法和組合物。
如上所述，轉(zhuǎn)基因鼠可以用于表達(dá)人或人源化的抗體，用于本發(fā)明的方法和組合物。
試劑盒 本發(fā)明提供了試劑盒，其包括組合物，例如本發(fā)明的免疫復(fù)合物和/或藥物。試劑盒可以含有說明性材料，其教導(dǎo)本發(fā)明的方法和工業(yè)用途，如本文中所述。
自身抗體和自身免疫疾病 本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物自身抗原-特異性IgM抗體水平、降低哺乳動(dòng)物自身抗原水平和改善自身免疫疾病的方法和組合物。用于本發(fā)明的組合物和方法的自身抗原以及它們的由本發(fā)明方法所靶向的相應(yīng)疾病包括，例如髓鞘堿性蛋白(MBP)和多發(fā)性硬化癥(MS)；少突細(xì)胞糖蛋白、髓鞘堿性蛋白(MBP)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(experimental autoimmune encephalitis)(EAE)；乙酰膽堿受體和重癥肌無力；胰島素、IA-2抗原、谷氨酸脫羧酶(GAD)和I型糖尿病；甲狀腺球蛋白(thyrogobulin)和自身免疫性甲狀腺炎；膠原蛋白IV型α3-鏈(collagen type IVα3-chain)和Goodpasture綜合癥；核仁纖維蛋白和硬皮病。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的組合物和方法使用修飾或未修飾的隱性自身抗原，包括隱性自身抗原，和/或顯性自身抗原(暴露于免疫細(xì)胞，例如循環(huán)中的、組織內(nèi)的血細(xì)胞的表面上的自身抗原)。給藥之后，修飾的自身抗原被識別為外來物，并啟動(dòng)免疫應(yīng)答，例如病原性免疫應(yīng)答，其可以包括體液(IgG)和/或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
胰島素依賴型糖尿病(IDDM) 本發(fā)明提供了用于改善自身免疫胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的方法和組合物，IDDM為與胰腺的分泌胰島素的β細(xì)胞有關(guān)的自身免疫反應(yīng)。參見例如美國專利6,214,985。本發(fā)明的方法和組合物使用與IDDM相關(guān)的抗原，包括谷氨酸脫羧酶同工型、胰島素、羧肽酶H、ICA516和64kD整合膜蛋白、hsp65、若干分泌型粒蛋白(例如胰島素分泌型?？乖?、鼠胰島素分泌型?？乖?imogen 38)。
胰島素依賴型糖尿病(IDDM)是自身免疫疾病，其因胰腺分泌胰島素的β-細(xì)胞受到破壞而引起?；加蠭DDM的患者具有胰島炎，蘭格罕氏小島的淋巴細(xì)胞浸潤，胰島特異性Th1淋巴細(xì)胞，以及針對胰島細(xì)胞的成份的抗體。
可以在IDDM動(dòng)物模型中，使用和測試用于改善IDDM的本發(fā)明方法和組合物。動(dòng)物模型中的IDDM是T細(xì)胞介導(dǎo)的，并需要CD8+，I類MHC限制性T細(xì)胞和CD4+，II類MHC限制性T細(xì)胞的參與。已經(jīng)證明了MHC II類DR4多態(tài)性等位基因和疾病敏感性之間的相關(guān)性，這表明應(yīng)答是由抗原驅(qū)動(dòng)的。
本發(fā)明的方法和組合物使用若干β-細(xì)胞蛋白質(zhì)，它們已被鑒定為IDDM中的抗原，包括兩種谷氨酸脫羧酶同工型、胰島素、羧肽酶H、ICA 516和64kD整合膜蛋白、hsp65、若干分泌型粒蛋白(例如胰島素分泌型?？乖?、鼠胰島素分泌型粒抗原(imogen 38)。這些抗原中的一些已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于糖尿病和糖尿病前期個(gè)體的血清中。參見例如美國專利6,211,352；6,025,176；5,792,620。
與GABA能神經(jīng)元內(nèi)的谷氨酸脫羧酶GAD具有反應(yīng)活性的自身抗體存在于大多數(shù)患有罕見的神經(jīng)疾病Stiff Man綜合征的患者的血清中。GAD自身抗體陽性的患者具有多內(nèi)分泌腺自身免疫性(polyendocrine autoimmunity)例如IDDM的頻率會增加。在IDDM臨床前階段期間以及在臨床IDDM有最近發(fā)作的患者中，頻頻檢測到針對胰島細(xì)胞MW 64,000蛋白，或某一種形式的GAD的自身抗體。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) 本發(fā)明提供了用于改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的抗原，包括核仁蛋白ASE-1、纖連蛋白、心磷脂、組蛋白H2A-H2B-DNA、KU-DNA蛋白激酶、高爾基體蛋白(golgin)和/或膠原蛋白、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、HP-8。參見例如美國專利6,177,254；6,111,088；5,807,993。
使用針對核仁蛋白ASE-1的克隆區(qū)域產(chǎn)生的抗體的間接免疫熒光分析(indirect immunofluorescence analysis)表明，該蛋白質(zhì)出現(xiàn)在推斷的rDNA轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)中的核仁的纖維中心處。在細(xì)胞分化期間，ASE-1停留在染色體的核仁組織區(qū)，在這里它與RNA聚合酶緊密結(jié)合。作為自身抗原核仁蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ASE-1是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)可靠的血清標(biāo)記。該發(fā)現(xiàn)使得ASE-1用于疾病的臨床檢測和表征。為了診斷SLE在個(gè)體患者中存在與否，可以取血清樣品并用克隆的ASE-1蛋白進(jìn)行篩選，以鑒定含有抗-ASE-1自身抗體的血清。該篩選可以通過使用ELISA測定方法、western印跡技術(shù)進(jìn)行，或通過將抗原結(jié)合到微球體并通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定反應(yīng)性血清而進(jìn)行。
針對核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs)的循環(huán)抗體的產(chǎn)生是某些風(fēng)濕性自身免疫疾病的共同特征。在SLE和密切相關(guān)的病癥中最常見的抗原包括Ro/SSA、La/SSB、nRNP和Sm。最初，這些抗體通過使用雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion)而被發(fā)現(xiàn)，但是近來，已經(jīng)開發(fā)出靈敏的固相測定方法來對自身抗體進(jìn)行定量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Ro/SSA RNA-蛋白質(zhì)顆粒是目前所有被評測的人細(xì)胞的組成成分。
用于本發(fā)明方法和組合物來治療SLE的另一抗原是HP-8。HP-8轉(zhuǎn)錄子在腦、心臟、胎盤、肺、骨骼肌、胰腺組織和腎中被表達(dá)。
子宮內(nèi)膜異位 本發(fā)明提供了用于改善子宮內(nèi)膜異位的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的抗原，例如Repro-EN-1.0，IB1。參見美國專利6,525,187。
子宮內(nèi)膜異位是疼痛性病癥，其特征是功能性子宮內(nèi)膜組織異位移植到腹壁和各種器官的外表面上，最常見地，包括是直腸(lower bowel)、卵巢和輸卵管。P.Vigano et al.(1991)Fertility and Sterility 56894。子宮內(nèi)膜異位具有自身免疫成份。與多種子宮內(nèi)膜抗原反應(yīng)的IgG和IgA自身抗體已被記錄存在于患有子宮內(nèi)膜異位的患者中。研究已經(jīng)顯示，結(jié)合多種子宮內(nèi)膜蛋白的循環(huán)IgG抗體可以在患有不同程度子宮內(nèi)膜異位的婦女中被檢測到。35％至74％的患者具有子宮內(nèi)膜蛋白反應(yīng)活性的血清，參見例如Odukoya(1996)Acta Obstet.Gynecol.Scand.75927-931；Kim(1995)Am.J.Reprod.Immunol.3480-87；Odukoya(1995)Hum.Reprod.101214-1219。
Repro-EN-1.0和它的另一種剪接變體IB1被用于本發(fā)明的組合物和方法中。診斷患有子宮內(nèi)膜異位的對象已被發(fā)現(xiàn)具有特異性結(jié)合Repro-EN-1.0多肽和/或IB1多肽的抗體。這些抗體是子宮內(nèi)膜異位的高靈敏性和特異性診斷標(biāo)記。重組Repro-EN-1.0蛋白質(zhì)和重組IB1蛋白質(zhì)可用于在免疫測定中檢測此類抗體。
獲得性甲狀旁腺功能低下癥(AH) 本發(fā)明提供了用于改善獲得性甲狀旁腺功能低下癥的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與獲得性甲狀旁腺功能低下癥(AH)相關(guān)的抗原，包括鈣敏感受體(calcium sensing receptor)(CA-SR)。參見例如美國專利6,066,475。
獲得性甲狀旁腺功能低下癥(AH)反應(yīng)于70kDa和80kDa的胞質(zhì)抗原(cytosolic antigen)，以及120-140kDa的膜相關(guān)抗原，鈣敏感受體(CA-SR)。在許多患有AH的患者中發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺特異性自身抗體，證明了該疾病的自身免疫特性，而CA-SR的反應(yīng)活性表位定位在它的外部結(jié)構(gòu)域表明，受體的激活能夠誘發(fā)抑制該疾病中PTH的分泌。
多發(fā)性硬化癥(MS) 本發(fā)明提供了用于改善多發(fā)性硬化癥(MS)的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與MS相關(guān)的抗原，包括髓鞘堿性蛋白(MBP)、轉(zhuǎn)醛縮酶。參見例如美國專利6,018,021；5,879,909。
原發(fā)性膽汁性肝硬變癥(PBC) 本發(fā)明提供了用于改善原發(fā)性膽汁性肝硬變癥(PBC)的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與原發(fā)性膽汁性肝硬變癥(PBC)相關(guān)的抗原，包括線粒體抗原。參見例如美國專利5,891,436。
原發(fā)性膽汁性肝硬變癥(PBC)是慢性疾病，特征為肝內(nèi)膽管的進(jìn)行性炎癥性阻塞。該疾病的特點(diǎn)是針對線粒體的自身抗體應(yīng)答，這最初用免疫熒光鑒定。特異性蛋白已經(jīng)被認(rèn)為是PBC的抗線粒體抗體(AMA)的目標(biāo)。特別地，針對70千道爾頓(kd)蛋白的血清抗體在超過95％的PBC患者中發(fā)現(xiàn)，但在患有其他自身免疫肝病的患者中沒有被發(fā)現(xiàn)。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA) 本發(fā)明提供了用于改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)的抗原，包括II型膠原質(zhì)、骨橋蛋白(osteopontin)、蛋白多糖、纖連蛋白(fibronectin)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、角蛋白、高爾基體蛋白(golgin)、HC gp-39。參見例如美國專利5,869,093；5,843,449。
本發(fā)明提供了用于涉及佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的研究的方法和組合物，佐劑性關(guān)節(jié)炎是炎癥性關(guān)節(jié)疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的模型。佐劑性關(guān)節(jié)炎通過皮內(nèi)注射處于油中的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(MT)的懸浮液而被誘發(fā)。注射之后10至15天，動(dòng)物患上嚴(yán)重的進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎。
由于它與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在臨床和組織病理學(xué)特征上的相似性，AA已被用作模型，來研究免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)疾病的機(jī)制，和來研究治療器官特異性自身免疫疾病的方法，并可以用于確定本發(fā)明方法和組合物中的制劑和劑量等。
人軟骨糖蛋白39(HC gp-39)是RA患者中的目標(biāo)自身抗原，其激發(fā)特定T細(xì)胞，從而引起或介導(dǎo)炎癥性過程。HC gp-39衍生的肽主要被來自RA患者的自身反應(yīng)性T細(xì)胞識別，但是很少被來自正常供體的T細(xì)胞識別，因而表明HC gp-39是RA中的自身抗原。
自身免疫不孕癥 本發(fā)明提供了用于改善自身免疫不孕癥的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與自身免疫不孕癥相關(guān)的抗原，包括哺乳動(dòng)物Sp 17蛋白質(zhì)。參見例如美國專利5,820,861。
自身免疫性阿狄森病 本發(fā)明提供了用于改善自身免疫性阿狄森病的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物使用與自身免疫性阿狄森病相關(guān)的抗原，包括腎上腺自身抗體。參見例如美國專利5,705,400。
腎上腺自身抗體的表位觀察到的分子量為約50,000至約60,000，通過下述方法獲得使腎上腺均質(zhì)化，對勻漿進(jìn)行差異離心以獲得微粒體部分，將微粒體部分懸浮在磷酸鹽緩沖液中，在膽酸鈉存在下離心懸浮液形成上清液，將聚乙二醇和額外的膽酸鈉加入到上清液并混合上清液，離心混合的上清液形成沉淀(pellet)，將沉淀再次懸浮在含水膽酸鈉中形成懸浮液，用含水膽酸鈉透析懸浮液以形成增溶的微粒體制品，并通過柱層析純化增溶的微粒體制品以獲得含有蛋白質(zhì)的柱級分。蛋白質(zhì)可以從人腎上腺獲得。
藥物的制劑和給藥 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括未修飾的自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的藥物組合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體的藥物組合物。在一個(gè)方面，藥物組合物是包括藥理學(xué)上有效數(shù)量的這些抗體和抗原的制劑。在一個(gè)方面，藥理學(xué)上有效數(shù)量的本發(fā)明的藥物組合物是足以改善自身免疫疾病(當(dāng)給予包括未修飾的自身抗原和抗原-特異性多價(jià)抗體的組合物時(shí))，或改善與外來抗原或病原體相關(guān)抗原諸如癌癥抗原、細(xì)菌或病毒抗原和類似抗原相關(guān)的疾病或狀態(tài)(當(dāng)給予包括修飾的抗原和抗原-特異性二價(jià)抗體的組合物時(shí))的數(shù)量。在可選擇的方面，通過改善自身免疫疾病或與外來抗原或病原體相關(guān)抗原相關(guān)的疾病或狀態(tài)，本發(fā)明的方法和組合物可以治療自身免疫疾病或與外來抗原或病原體相關(guān)抗原有關(guān)的疾病或狀態(tài)、減輕它們的嚴(yán)重性、減緩或預(yù)防它們的發(fā)作，和/或減緩它們的進(jìn)展。
本發(fā)明的藥物可以通過任何方式，以任何合適的制劑給藥。確定藥物給藥方案和制劑以實(shí)施本發(fā)明的方法的常規(guī)手段被充分描述在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中。例如，有關(guān)制劑、劑量、給藥和類似事宜的技術(shù)細(xì)節(jié)描述在例如最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences，Maack Publishing Co，Easton PA中。
本發(fā)明的制劑可以包括藥學(xué)上可接受的載體，其可以含有生理學(xué)上可接受的化合物，其用來例如穩(wěn)定組合物或增加或減少藥物組合物的吸收。生理上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑，諸如抗壞血酸或谷胱甘肽、螯合劑、低分子量蛋白質(zhì)、減少任何共同給藥的試劑的清除或水解的組分，或賦形劑或其他穩(wěn)定劑和/或緩沖物。洗滌劑也可以用于穩(wěn)定組合物或用于增加或減少藥物組合物的吸收。其他生理學(xué)上可接受的化合物包括濕潤劑、乳化劑、分散劑或防腐劑，其特別用于防止微生物的生長或活動(dòng)。各種防腐劑是公知的，例如抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到藥學(xué)上可接受的載體包括生理學(xué)上可接受的化合物的選擇取決于例如給藥途徑和取決于共同給藥的試劑的特定物理-化學(xué)特性。
在一個(gè)方面，用于給藥的組合物包括藥學(xué)上可接受的載體，例如含水載體?？梢允褂酶鞣N載體，例如緩沖鹽水和類似物。這些溶液是無菌的，并通常無不想要的物質(zhì)。這些組合物可以通過常規(guī)、已知的滅菌技術(shù)滅菌。當(dāng)需要接近生理?xiàng)l件時(shí)，組合物可以含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑和類似物，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉和類似物。活性試劑在這些制劑中的濃度可以在寬范圍內(nèi)變化，并將主要根據(jù)流體體積、粘性、體重和類似情況，根據(jù)選定的特定給藥方式和成像模態(tài)進(jìn)行選擇。
本發(fā)明的藥物組合物可以各種單位劑型被給藥，取決于每個(gè)患者的一般醫(yī)學(xué)狀態(tài)、給藥方法和類似情況。有關(guān)劑量的細(xì)節(jié)充分描述在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，參見例如最近版的Remington′s Pharmaceutical Sciences。本發(fā)明藥物的精確數(shù)量和濃度以及給定劑量的制劑的量，或“有效數(shù)量”可以通過常規(guī)方法確定，例如由臨床醫(yī)師測定(參見上面對藥學(xué)上有效數(shù)量的本發(fā)明組合物的論述)。“劑量方案(dosingregimen)”將取決于各種因素，例如患者健康的一般狀態(tài)、年齡和類似情況。通過使用描述了其它劑量方案例如使用其他成像造影劑的指南，技術(shù)人員能夠通過常規(guī)試驗(yàn)確定本發(fā)明藥物組合物的最有效的濃度。本發(fā)明不受任何特定劑量范圍的限制，本發(fā)明的藥物可以以替代劑量給藥。
例如，抗原，無論是可溶性的、顆粒的、超聲破碎的或部分降解的，其數(shù)量(其在組合物中可以表示成mg/ml)可以根據(jù)接受者的大小和/或重量而變化，以獲得可能最好的理想的免疫應(yīng)答?？贵w——其對抗原的滴度為已知——的數(shù)量可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便在Ag:Ab復(fù)合物中抗原微微超出。
例如，在一個(gè)方面，組合物根據(jù)下述接種疫苗方案給藥最初一周兩次給藥，約3周，然后每周1次給藥，約5個(gè)月，然后每月一次給藥(給藥頻率將取決于征兆、癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查)。為了保持高水平的特異性循環(huán)IgM自身抗體，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞受到比平時(shí)更多的刺激，這通過連續(xù)注射Ag微微超量的本發(fā)明的合適的Ab:Ag復(fù)合來物進(jìn)行。當(dāng)致病性抗體應(yīng)答終止時(shí)，本發(fā)明的Ab:Ag復(fù)合物的給藥頻率可以開始減少，包括給予摩爾量相等或抗體超量的Ab:Ag復(fù)合物。然而，在兩種制劑中，特別是Ab過量時(shí)，抗體應(yīng)答被抑制。
在一個(gè)方面，一旦免疫系統(tǒng)被諧調(diào)至對通過本發(fā)明Ab:Ag復(fù)合物給藥的(例如注射的)修飾抗原產(chǎn)生應(yīng)答時(shí)，那么僅僅給予修飾的抗原也能維持特異性免疫應(yīng)答(盡管免疫應(yīng)答水平較低)。
在實(shí)施本發(fā)明的方法中，合適的劑量可以由熟練的臨床醫(yī)師確定。在一個(gè)方面，抗原的數(shù)量，無論是可溶性的、顆粒狀的、超聲破碎的、還是部分降解的，在藥物組合物中都表述為mg/ml，抗原的數(shù)量可以根據(jù)接受者的大小/體重而變化，以便在期望的時(shí)間內(nèi)，獲得最好的可能的免疫應(yīng)答。對抗原的抗體滴度已知的抗體的數(shù)量可以以這樣的方式調(diào)節(jié)，以便本發(fā)明的Ag:Ab復(fù)合體中抗原微微過量?？乖慕o予(例如給藥方法)、抗原給藥頻率、抗原劑量、在本發(fā)明Ag:Ab復(fù)合體中過量的抗原的量和類似情況將決定免疫應(yīng)答。一般來講，在本發(fā)明Ag:Ab復(fù)合體中低劑量的抗原可以在個(gè)體中引發(fā)和維持，存在于Ag:Ab復(fù)合體中的同一類抗體針對存在于Ag:Ab復(fù)合體中的該抗原的增高的免疫應(yīng)答(抗體信息傳遞(antibodyinformation transfer))。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段傳遞，全身性的(例如靜脈內(nèi))、區(qū)域性的、或局部的(例如腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍或胞質(zhì)內(nèi)注射)通過例如動(dòng)脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)(IV)、腸胃外、胸膜腔內(nèi)、表皮、口或局部給藥，如皮下、氣管內(nèi)(例如通過氣霧劑)或經(jīng)粘膜(例如口腔、膀胱、陰道、子宮、直腸、鼻粘膜)、腫瘤內(nèi)(例如經(jīng)皮涂敷或局部注射)給藥。例如，動(dòng)脈內(nèi)注射可以用于獲得“區(qū)域性效果”，例如以集中在特定器官(例如腦、肝、脾、肺)上。
適合于口服給藥的制劑可以包括液體溶液，諸如有效數(shù)量的溶解于稀釋劑中的化合物，稀釋劑諸如水、鹽水或果汁；膠囊、袋劑(sachets)或片劑，每一個(gè)含有預(yù)先設(shè)定數(shù)量的活性成分，如固體、顆?；蚶鋬龈稍锏募?xì)胞；含水液體中的溶液或懸浮液；以及水包油乳狀液或油包水乳狀液。片劑形式可以包括一種或多種乳糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微結(jié)晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠狀二氧化硅、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、云母、硬脂酸鎂、硬脂酸和其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖試劑、潤濕劑、防腐劑、芳香劑和藥理學(xué)上相容的載體。用于經(jīng)口傳遞的合適的制劑也可以被合并入到合成和天然的聚合微球體中，或其他介質(zhì)中，以保護(hù)本發(fā)明的試劑在腸胃道內(nèi)免遭降解。參見例如Wallace(1993)Science260912-915。
本發(fā)明的藥物組合物可以制成氣霧劑，以通過吸入給藥。這些氣霧劑可以置入加壓的可接受的推進(jìn)劑，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和類似物。
Cyanovirins或其結(jié)合物——單獨(dú)或與其他抗病毒化合物或吸收調(diào)節(jié)物聯(lián)合使用——可以制成合適的制劑，以經(jīng)皮涂敷和吸收。經(jīng)皮電穿孔或離子等滲法也可以用于促進(jìn)和/或控制本發(fā)明多肽經(jīng)皮膚的系統(tǒng)性傳遞，例如參見Theiss(1991)Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.13353-359。
適合于局部給予本發(fā)明藥物組合物的制劑可以包括糖錠(lozenges)，其包括在風(fēng)味劑通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中的活性組分；錠劑(pastilles)，其包括在惰性物質(zhì)中的活性組分，惰性組分諸如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠；以及漱口劑，其包括在合適液體載體中的本發(fā)明的藥物組合物；以及膏劑、乳狀液、凝膠和類似物。
適合于腸胃外給藥的制劑可以包括含水和非含水等滲壓無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得制劑與目標(biāo)接受者的血液具有等滲壓的溶質(zhì)，以及含水和非含水無菌懸浮液，其包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
本發(fā)明的藥物制劑可以以單劑量或多劑量密封容器提供，諸如安瓿和瓶，可以保存在冷凍干燥(凍干)條件中，僅需要在使用之前即刻加入無菌液體賦形劑，例如水，以用于注射。即配即用注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和片劑制備而得。
治療組合物也可以以液體制劑給藥，例如與脂質(zhì)體復(fù)合，或以脂/核酸復(fù)合體給藥，或封裝入脂質(zhì)體，如封裝入針對特定細(xì)胞的免疫脂質(zhì)體。這些液體制劑可以局部、全身性給藥，或通過氣霧劑傳遞。參見例如美國專利6,149,937；6,146,659；6,143,716；6,133,243；6,110,490；6,083,530；6,063,400；6,013,278；5,958,378；5,552,157。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物制劑可以與增加吸收的試劑一起給藥?？梢允褂萌魏卧黾游盏脑噭?，例如那些與蛋白質(zhì)和肽藥物組合使用，用于經(jīng)口傳遞和通過其他途徑傳遞的試劑。參見例如van Hoogdalem，Pharmac.Ther.44，407-443，1989；Davis，J.Pharm.Pharmacol.44(Suppl.1)，186-190，1992。用于本發(fā)明組合物和方法的增強(qiáng)劑包括，例如(a)螯合劑，諸如EDTA、水楊酸鹽和膠原質(zhì)的N-?；苌?；(b)表面活性劑，諸如十二烷基硫酸鹽(lauryl sulfate)和聚氧乙烯-9-十二烷基醚；(c)膽汁鹽，諸如乙醇酸鹽和?；悄懰猁}以及衍生物，諸如?；请p氫褐霉素鹽(taurodihydrofusidate)；(d)脂肪酸，諸如油酸和癸酸，和它們的衍生物，諸如酰肉堿、甘油單酯和甘油二酯；(e)非表面活性劑，諸如不飽和環(huán)尿(cyclic ureas)；(f)皂甙；(g)環(huán)糊精，和(h)磷脂。
增加蛋白質(zhì)和肽藥物(例如本發(fā)明的抗原抗體復(fù)合物)經(jīng)口傳遞的其他方法也可以用于實(shí)施本發(fā)明，例如進(jìn)行化學(xué)修飾，以增加對腸胃酶的穩(wěn)定性和/或增加親脂性?？商娲?，或此外，本發(fā)明的藥物制劑可以與其他藥物或物質(zhì)聯(lián)合給藥，所述藥物或物質(zhì)直接抑制蛋白酶和/或蛋白質(zhì)和肽的酶促降解的其他潛在來源。防止或延遲腸胃吸收cyanovirin的另一可替代方法是將它并入傳遞系統(tǒng)，傳遞系統(tǒng)設(shè)計(jì)成保護(hù)本發(fā)明藥物制劑中蛋白質(zhì)或肽不與腸腔中的蛋白水解酶接觸，并僅在達(dá)到有利于它接受的區(qū)域時(shí)釋放完整的蛋白質(zhì)或肽。在一個(gè)方面，將生物可降解的微囊或微球體與本發(fā)明的藥物制劑一起使用，不但保護(hù)它們免遭降解，也實(shí)現(xiàn)活性藥物的延長釋放，參見例如Deasy，in Microencapsulation and Related Processes，Swarbrick，ed..，Marcell Dekker，Inc.New York，1984，pp.1-60，88-89，208-211。微囊也可以提供有效的途徑，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明藥物制劑在注射之后傳遞的延長，參見例如Maulding，J.Controlled Release 6，167-176，1987。
實(shí)施例實(shí)施例1致病性自身抗體應(yīng)答的下調(diào) 下述實(shí)施例表明本發(fā)明的組合物和方法能有效地下調(diào)哺乳動(dòng)物致病性自身抗體應(yīng)答。本發(fā)明首次描述了致病性自身抗體介導(dǎo)的疾病進(jìn)程的抗原特異性下調(diào)。抗原特異性下調(diào)已經(jīng)在自身免疫腎病，即稱為緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(SPHN)的鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腎病的模型中得到證明，參見下面的實(shí)施例2。該自身免疫疾病由致病性自身抗體啟動(dòng)和維持，該抗體引起免疫復(fù)合物腎小球腎炎，從而導(dǎo)致蛋白尿。
通過注射本發(fā)明的示范性免疫復(fù)合物，在SPHN鼠中致病性自身抗體應(yīng)答被下調(diào)，其中所述示范性免疫復(fù)合物含有天然致腎炎抗原和特異性IgM自身抗體，其中抗原超量。注射的免疫復(fù)合物提高了循環(huán)非致病性IgM自身抗體的水平，其反過來，通過移除注射的改變了的致腎炎自身抗原和釋放的自身抗原(來自腎小管)，大大地減少致病性自身抗體的產(chǎn)生和腎小球中免疫沉積物(immune deposits)的持續(xù)積聚。較早被治療的動(dòng)物的反應(yīng)比進(jìn)入疾病狀態(tài)較晚被治療的鼠更好，但考慮到蛋白尿的改善、腎損害的減少和致病性自身抗體應(yīng)答的改善，它們都表現(xiàn)得很好。在29周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，80％的鼠具有可以忽略不計(jì)的低水平的循環(huán)IgG自身抗體，這表明致病性自身抗體停止產(chǎn)生，疾病過程相應(yīng)終止。另一方面，未治療的鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)依然具有高水平的循環(huán)致病性自身抗體，這表明存在持續(xù)的疾病進(jìn)展(發(fā)展)(progression)。
如上所述，海曼氏腎炎(HN)是自身免疫腎病的經(jīng)典模型(art-recognizedmodel)。它是真正的鼠自身免疫腎病，由Heymann和同事首先描述，參見例如Adorini(1993)Immunol.Today 14285-289。它是得到最好研究的實(shí)驗(yàn)自身免疫腎病模型之一。該疾病由致病性自身抗體啟動(dòng)和維持，參見例如Glassock(1968)J.Exp.Med.127573-588；Mendrick(1980)Kidney Int.18328-343。在IP或足墊內(nèi)(intra-footpad)注射同源的化學(xué)修飾的或未修飾的腎小管抗原之后——最常見的是摻入到FCA中——典型的HN發(fā)展起來，表現(xiàn)為免疫復(fù)合物腎小球腎炎和蛋白尿。
自體同源和異源腎小管抗原也可以與佐劑一起使用，來產(chǎn)生腎病。致腎炎抗原被純化并被若干研究人員表征，制備物分別命名為gp 330和gp 600。參見例如Kerjaschki(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 795557-5581。其他更小的MW的致腎炎抗原也已被鑒定。當(dāng)以合適的形式注射時(shí)，所有純化的抗原都能夠在易感品種的鼠中誘發(fā)疾病，參見例如Kerjaschki(1983)J.Exp.Med.157667-686。免疫病理性事件——其導(dǎo)致腎形態(tài)變化——已被組織學(xué)研究、熒光抗體和電子顯微術(shù)研究充分描述；由循環(huán)致病性自身抗體和蛋白尿表征的功能變化已被充分地記錄。
本發(fā)明也提供了新的、緩慢進(jìn)行性HN(SPHN)腎病模型。在誘導(dǎo)疾病之后17周，忠有SPHN的動(dòng)物開始出現(xiàn)蛋白尿，早期的腎損害也不太嚴(yán)重。該新的實(shí)驗(yàn)自身免疫腎病模型被用于證明本發(fā)明組合物和方法特異性除去循環(huán)致腎炎抗原，從而阻止它們刺激產(chǎn)生致病性自身抗體的免疫細(xì)胞的功效。因此，本發(fā)明的組合物和方法也幫助防止免疫復(fù)合物沉積在腎小球中。本研究通過在兩群動(dòng)物中使用本發(fā)明的組合物和方法研究了介入(intervention)的效果。在一群鼠中，介入在實(shí)驗(yàn)開始之前開始并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中持續(xù)，在另一群中，在疾病確定之后14周開始。未治療的正常鼠和患有腎病的動(dòng)物作為對照。
動(dòng)物兩個(gè)月大的雄性斯普拉道來氏鼠(Sprague Dawley rat)被用于實(shí)驗(yàn)。將來自當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)場的動(dòng)物用耳朵辨認(rèn)系統(tǒng)(ear identification system)編號，并隨機(jī)分配到代謝對照和測試組。對異氟烷麻醉的鼠實(shí)施侵入性實(shí)驗(yàn)操作。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，誘導(dǎo)疾病后29周，通過IP注射Euthanyl(MTC藥物)(180mg/kg體重)對鼠實(shí)施安樂死。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 組I代謝對照該組包括8只鼠。這些動(dòng)物未被注射和治療。然而，與其他組的鼠同時(shí)進(jìn)行每周一次的蛋白尿研究，從這些鼠定期獲得血液收集物和腎樣品。
組II緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(SPHN)通過前述技術(shù)(B+C+B+L 29)，10只鼠皮下注射明礬和瘟熱復(fù)合病毒疫苗(Alum and Distemper complex virus vaccine)(Olson 30)中的超聲的超離心(u/c)Azo-rKF3抗原。鼠用0.2ml的抗原佐劑混合物注射三次。在第0天，混合物含有160μg抗原，在第16天和33天，含有80μg抗原。在第26、43、65、72、79和86天，額外地六次皮下(SC)注射160μg的含水超聲的u/c Azo-rKF3抗原。肩胛之間的背面用于所有SC注射。
組III進(jìn)行預(yù)先處理(pre-treated)并且之后被治療(post-treated)的SPHN鼠10只鼠(在用組II動(dòng)物中使用的同樣方案誘導(dǎo)SPHN之前的27天)用0.2ml IP注射的抗原或下述組合進(jìn)行預(yù)先處理在第-27天，以500μg含水rKF3抗原/鼠進(jìn)行預(yù)先處理。在第-22、-20和-15天，以100μg含水rKF3抗原/鼠進(jìn)行預(yù)先處理。在第-12天，以0.2ml帶有特異性IgM抗體的免疫復(fù)合物(MICs)—所述MICs含有60μg超聲的u/c rKF3抗原和150μg rarKF3 IgM/鼠——進(jìn)行預(yù)先處理；在第-8、-5和-1天，用含有30μg超聲的u/c rKF3抗原和75μg rarKF3 IgM/鼠的MICs進(jìn)行預(yù)先治療。在誘導(dǎo)SPHN之后，在頭4周中，鼠用含有30μg超聲的u/c rKF3抗原和75μg的rarKF3IgM/鼠的0.2ml MICs，每周兩次進(jìn)行后期治療，然后每周一次給予同樣劑量的MICs，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
組IV-進(jìn)行后期治療的SPHN鼠通過組II鼠中所描述的同樣方案，在10只鼠中誘導(dǎo)SPHN。從誘導(dǎo)疾病之后的14周起，鼠每周一次以含有30μg超聲的u/c rKF3抗原和75μg的rarKF3 IgM/鼠的0.2ml IP注射MICs進(jìn)行治療。
鼠腎小管級分3抗原(rat kidney tubular fraction 3 antigen)(rKF3)的制備在出血并用冷生理鹽水洗去它們的血管之后，從安樂死的成年斯普拉道來氏鼠獲得正常的鼠腎臟。收集腎樣品，并用0.25mol/L緩沖蔗糖溶液pH 7.4洗滌若干次，并均質(zhì)化制得精細(xì)的(fine)懸浮液。鼠腎級分3通過利用本文中描述的技術(shù)在4℃，用差異離心方法獲得。
超聲處理的超離心(u/c)Azo-rKF3的制備利用兩步程序。在超聲處理和超離心之前，測定之前制備的rKF3級分的蛋白濃度并調(diào)整到10mg/ml。將超離心的上清液——命名為超聲u/c rKF3制品——的蛋白含量，調(diào)節(jié)到4mg/ml，參見實(shí)施例2。超聲u/c rKF3制品的化學(xué)偶聯(lián)作用在含有重氮鹽的0.1mol/L緩沖硼砂溶液pH 8.2中進(jìn)行。在徹底透析azo-蛋白制品(以除去未偶聯(lián)的重氮鹽)之后，將它的蛋白含量調(diào)節(jié)到4mg/ml(B+L，29)。
抗-rKF3 IgM的制備可以提高針對腎小管BB區(qū)域的循環(huán)中的天然發(fā)生的IgM自身抗體的低水平。參見例如Weir(1966)Clin.Exp.Immunol.1433-442。成年Wistar鼠每周一次注射，IP給予PBS中的0.2ml 50μg rKF3抗原，進(jìn)行4周。最后一次注射之后4天，使鼠出血以獲得血清，個(gè)體血清樣品在正常鼠腎切片上，用間接熒光抗體測試方法進(jìn)行測試。收集在1∶70-1∶180滴度之間的、對腎小管bb相關(guān)抗原具有高IgM抗體活性的鼠血清，并等份裝入瓶中，用于MIC制備，并保存在-35℃直到使用。如實(shí)驗(yàn)需要，為了獲得額外的rarKF3IgM抗體，重新刺激鼠。
命名為MICs的超聲u/c rKF3x rarKF3IgM免疫復(fù)合物的制備下述試劑是制備MICs所必需的。超聲u/c rKF3抗原5mg/ml和rarKF3 IgM抗體，對腎小管BB相關(guān)抗原具有約1∶120的活性。我們的制品的IgM濃度考慮為約2mg/ml。在注射之前制備新鮮的MICs制品。每只鼠接受IC中的30μg超聲u/c rKF3抗原和75mg rarKF3 IgM，除非另外指明。例如，為了制備用于IP注射10只鼠的MICs，使用下述程序提供300μg超聲u/c rKF3抗原和750μg rarKF3 IgM，并且它的體積用PBS調(diào)節(jié)到2ml。注射之前，溫育混合物，并在室溫(RT)旋轉(zhuǎn)30分鐘。MIC品中的抗原被考慮為微微超量。
光學(xué)顯微術(shù)將皮質(zhì)腎組織固定在10％的中性緩沖福爾馬林中，并包埋在石蠟中。將3μm厚的切片用蘇木精和伊紅，過碘酸-Schiff反應(yīng)和通過六亞甲基四胺銀染料染色，如Barabas(1969)Clin.Exp.Immunol.5419-427所述。
電子顯微術(shù)將1mm的腎皮質(zhì)塊(block)固定在緩沖戊二醛中，然后固定在Caulfield’s四氧化鋨中，并包埋在Peon中。適當(dāng)染色的薄切片用Hitachi H600電子顯微鏡檢查，如Barabas(1969)Clin.Exp.Immunol.5419-427描述。
尿蛋白評估在開始實(shí)驗(yàn)之前8周，從代謝籠(metabolic cages)中的鼠個(gè)體上收集二十四小時(shí)尿樣品，以獲得代表性基線值。每周收集尿，持續(xù)到在29周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。通過biurette方法，在540nm處使用Spectromic GENESIS 5TM分光光度計(jì)，用0.5ml尿樣品測定尿蛋白含量。
免疫熒光研究 直接熒光抗體測試8周時(shí)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的鼠個(gè)體的3μ厚的新鮮腎切片在Microm HM500M恒冷切片機(jī)上切割，并固定在醚∶醇(50∶50)中。洗過的腎切片進(jìn)行染色，對于鼠IgG用Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)的合適稀釋物，對于鼠IgM，用Alexa Fluor山羊抗-鼠IgM((μ)鏈)(Molecular Probe)的合適稀釋物。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腎切片也用單克隆小鼠抗-鼠C5b-9 IgG抗體對C5b-9染色，并用Alexa Fluor488高吸附的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(MolecularProbe)的合適稀釋物進(jìn)行復(fù)染色(counter-stain)。
間接熒光抗體試驗(yàn)對在第0、2、8、16、22和29周獲得的所有鼠血清稀釋物進(jìn)行測試，以測試鼠IgG和IgM抗體對正常鼠腎冷凍切片上的鼠腎小管成份的活性。記錄IgG和IgM抗體的抗體滴度，用可得到陽性結(jié)果的最后稀釋度的倒數(shù)表示，制成表格，計(jì)算G/M比率。用Axioscop Zeiss顯微鏡觀察免疫熒光抗體染色的切片，拍攝數(shù)字圖片，并保存在Micron計(jì)算機(jī)中。
因鼠IgG沉積在腎小球中而引起的腎小球損傷的分級對最豐富的免疫球蛋白鼠IgG進(jìn)行分級，鼠IgG是腎臟自身免疫病理學(xué)的原因所在。根據(jù)下述描述，腎小球中的熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)(成珠的免疫復(fù)合物)的數(shù)量分級為0-4+等級。也觀察到鼠IgG存在于腎小管基底膜(TBM)、近端腎小管的刷狀緣區(qū)域(BB)和鮑曼氏囊中，并記錄下來。
IgM也發(fā)現(xiàn)存在于腎小球系膜(mesangium)和腎小球毛細(xì)血管中。根據(jù)熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)的數(shù)量，依照0-4+等級，對珠狀(beaded)腎小球系膜沉積物進(jìn)行分級。也觀察到并記錄下腎小球毛細(xì)血管周圍小量的鼠IgM珠狀沉積。
蛋白尿在誘發(fā)腎病之前，通過8個(gè)每周一次收集的尿樣，由所有鼠獲得基線蛋白尿量度(Baseline proteinuria measurements)。尿也被收集來檢查用MICs對組III鼠進(jìn)行的預(yù)先處理是否會影響蛋白尿。未治療的SPHN鼠具有最高水平的蛋白尿，而進(jìn)行預(yù)先處理并而后治療的組III鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與組I代謝對照具有差不多同樣水平的蛋白尿。用MICs進(jìn)行后期治療的組IV鼠顯示出稍微增加水平的蛋白尿。當(dāng)我們在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將平均日蛋白尿結(jié)果與對照組I鼠的尿蛋白產(chǎn)生進(jìn)行比較時(shí)，預(yù)先處理并而后治療的SPHN鼠增高12％，后治療的鼠增高81％，未處理的鼠尿蛋白損失增高230％，這說明在治療過的鼠中蛋白尿值顯著減少。
組III鼠的早期處理導(dǎo)致蛋白尿增加非常微小組織學(xué)組I 8，13正常鼠2，3，6，8 in I after I el.γG. (6)SPHN組II9，10，17，25，47，50，65，81，83，87 (7)
SPHN p/p TX(III)組VI 21，40，41，43，44，56，61，68，76(5)SPHN/p TX(IV)組VII 3，7，12，16，20，45，51，66，83，89，92 (6) 光學(xué)顯微術(shù)H&E切片顯示，在SPHN組II、III和IV鼠的腎小球中沒有顯著的變化，但是在所有SPHN動(dòng)物的腎中觀察到腎小球細(xì)胞結(jié)構(gòu)(glomerularcellularity)的些許增加。蛋白尿組II鼠的甲胺銀(silver methanamine)染色的腎切片顯示出增厚并常常顯示出空泡的(vacuolated)腎小球毛細(xì)血管，在它們的外周圍和顯著的系膜區(qū)域(prominent mesangial areas)周圍有大量的銀陽性突起(silver positive projections)。
電子顯微術(shù)代謝組I對照鼠在它們的腎小球里沒有顯示出免疫沉積。組II蛋白尿動(dòng)物顯示出典型的HN腎損害。在GBM的上皮一側(cè)具有由小到大的電子致密沉積物(electron dense deposits)，部分地或完全地被基底膜(BM)樣物質(zhì)包圍。觀察到BM樣突起不規(guī)則地增厚GBM，并且，與沉積相關(guān)的足突融合(foot-processfusions)被觀察到。上皮細(xì)胞顯示出斑狀嗜鋨區(qū)域(patchy osmiophilic areas)，尤其是與沉積物相對應(yīng)。預(yù)先處理和后治療組III的鼠顯示出溫和形式的HN腎損害。在這些動(dòng)物中，GBMs未被增厚，位于GBM的上皮一側(cè)的偶爾的沉積沒有BM樣突起。足突保留在大部分的區(qū)域中，其融合僅僅涉及沉積。在組IV鼠中，HN腎損害大致在組II和組III鼠的腎損害之間。沉積物的一些限制在GBM上皮一側(cè)的區(qū)域，其中GBM樣物質(zhì)開始有突出物環(huán)繞或包圍沉積物。在這些區(qū)域中，上皮細(xì)胞融合，嗜鋨區(qū)域存在于上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在其他區(qū)域，沉積物位于GBM沒有明顯變化的GBM上皮一側(cè)。
直接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果下表1顯示了通過直接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果獲得的有關(guān)組II、III和IV中的鼠的腎臟切片的許多重要的觀察結(jié)果。在第8周，在組II、III和IV鼠的腎小球中觀察到具有不同程度的晚期損害的腎臟活檢。在組II和IV鼠的腎切片上觀察到中等程度的珠狀腎小球毛細(xì)血管沉積物，對鼠IgG具有強(qiáng)烈的熒光染色。在組III鼠中，在腎小球毛細(xì)血管的周圍，觀察到具有相對不強(qiáng)烈的熒光的小量的鼠IgG沉積。僅僅在組II和IV鼠中，在一些鼠腎切片上，腎小管基底膜(TBMs)、BBs和鮑曼氏囊(BCs)著色。代謝對照鼠的腎切片未出現(xiàn)針對鼠IgG的染色。在所有組的鼠中(包括代謝對照組)，針對鼠IgM而進(jìn)行染色的鼠腎切片的系膜區(qū)域具有類似的熒光強(qiáng)度和等級。在早期階段，在系膜沉積方面，治療或不治療沒有明顯區(qū)別。
在第29周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在組II鼠的腎切片上，存在有具有更強(qiáng)烈熒光和增加數(shù)量的腎小球沉積并對之進(jìn)行分級，在組III動(dòng)物中，依然較少受累(involvement)。在組IV鼠中，對于鼠IgG，腎小球免疫沉積染色在熒光強(qiáng)度和數(shù)量上增加，但是未達(dá)到組II動(dòng)物同樣的程度。對于鼠IgM的沉積，組I和II鼠腎的系膜區(qū)域具有與以前在第8周大致相同的等級。另一方面，組III鼠和組IV動(dòng)物尤其顯示出大大減少的等級，這表明在系膜中具有更少的IgM沉積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腎切片也對C5b-9染色。針對該膜攻擊復(fù)合體(membrane attack complex)的組II鼠腎染色，顯示出在腎小球毛細(xì)血管周圍有模糊的珠狀沉積。組III在它們的腎小球中沒有C5b-9，而在組IV中的鼠具有非常模糊的沉積。
間接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)知道，SPHN，HN的變體，由致病性IgG自身抗體引發(fā)并維持，致病性IgG自身抗體是在注射改變的致腎炎抗原之后產(chǎn)生的。因此，疾病的進(jìn)展由循環(huán)中的致病性IgG自身抗體的數(shù)量確定。通過除去循環(huán)致腎炎抗原，可期待致病性抗體應(yīng)答減少，并相應(yīng)地出現(xiàn)形態(tài)和功能變化的改善。
在該實(shí)驗(yàn)中，代謝對照鼠未被處理，作為正常對照。在這組中被分析的血清樣品顯示，針對近曲小管的BB區(qū)域的循環(huán)的天然發(fā)生的IgM自身抗體水平低。在鼠個(gè)體中，在一個(gè)分析和下一個(gè)分析之間，循環(huán)IgM自身抗體的水平稍微有所變化，但是變化程度不大。
在組II未治療的SPHN鼠中，平均循環(huán)致病性自身抗體應(yīng)答相當(dāng)高，既便是在29周的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)也如此。在G/M比率或低或高的5只鼠組中分析和平均的血清樣品，也未顯示出自身抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有下降趨勢。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，80％的鼠對腎中的目標(biāo)抗原依然具有高的自身抗體應(yīng)答。在組III的預(yù)先處理和而后治療的SPHN鼠中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，平均循環(huán)致病性IgG自身抗體水平低。在第29周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，總體上說，在90％的鼠中，它低于1∶10稀釋度，在80％鼠中，它為0。同時(shí)，在80％的動(dòng)物中，循環(huán)的天然發(fā)生的IgM自身抗體被提高，G/M比率接近0。增加水平的IgM自身抗體能夠除去大部分的注射的化學(xué)改變的rKF3抗原，并因此，預(yù)防了增高的致病性IgG自身抗體產(chǎn)生的發(fā)展。
組IV鼠在誘發(fā)疾病后14周，用MICs進(jìn)行后期治療。在大約頭8周期間，最初的致病性IgG自身抗體應(yīng)答是高的，在許多方面類似于在組II鼠中觀察到的應(yīng)答。在開始治療之后不久，它開始下降，直到29周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，平均IgG抗體滴度為約1∶10。80％的鼠具有明顯低的IgG自身抗體水平，50％的鼠沒有循環(huán)IgG自身抗體。在任何階段用MICs進(jìn)行治療，都將通過除去改變的致腎炎自身抗原，引起致病性自身抗體應(yīng)答的下調(diào)，并導(dǎo)致減輕。
自身免疫疾病過程在治療和未治療的鼠中的總體上的進(jìn)展觀察到，與組II未治療的鼠的進(jìn)展相比，用MICs預(yù)先治療并后期治療的鼠具有最弱的發(fā)展，后期治療的鼠的疾病發(fā)展大大減弱。通過維持高的IgM自身抗體應(yīng)答，破壞性的IgG自身抗體產(chǎn)生被抑制，致病性應(yīng)答繼而出現(xiàn)減緩甚至停止。觀察在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中總體的疾病發(fā)展，可以注意到組III鼠比組II鼠好出16倍，組IV鼠比組II鼠好出4.5倍。如果我們觀察在臨界點(diǎn)時(shí)的致病性自身抗體應(yīng)答的上調(diào)或下調(diào)，(8至16周的結(jié)果)其通過組II和在治療之前和治療之后的后期治療組IV動(dòng)物的G/M比率測得，那么我們可以注意到下述內(nèi)容。在組II動(dòng)物中，致病性自身抗體應(yīng)答猛增90％，而在組IV鼠中，在致病性自身抗體的產(chǎn)生中有幾乎250％的下調(diào)應(yīng)答，這表明了對治療具有令人驚訝的快速應(yīng)答。在29周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，觀察到組II的鼠依然顯示出進(jìn)行性疾病(G/M比率＞3)，而在組III和IV鼠中，觀察到致病性自身抗體應(yīng)答幾乎停止，表現(xiàn)出非常低的G/M比率(分別為0.0636和0.105)。
表1示出了在第8周和第29周的腎臟切片，其通過直接熒光抗體試驗(yàn)對鼠IgG和IgM染色。在各組中給出的是平均值。示出了SPHN未治療的(組II)和測試的(組III和IV)鼠的熒光強(qiáng)度和腎小球損傷等級。也對代謝對照組(組I)進(jìn)行分級。除了代謝對照組，每個(gè)組有10只鼠，對照組有8只鼠。
Tcnop=UO+(1-Qnop)Qnop·krckcr·TO1+(1-Qnip)Qnip·krckcr.---(33).]]>當(dāng)滿足條件(31)，即受控塊狀物中有價(jià)值的成分的量等于或超出閾值，且伴有將塊狀物進(jìn)料至分離裝置的有效區(qū)域所必需的延時(shí)的情況下，處理系統(tǒng)通過輸出接口啟動(dòng)分離裝置。分離裝置改變含有有價(jià)值的成分的塊狀物的下落路線并將原料分別分成兩種工藝股含有有價(jià)值的成分的一股和不含它的一股。
方法實(shí)施例1將包含兩種主要組分-磁鐵巖和石英巖的塊狀物進(jìn)行微波電磁場作用1秒鐘。在輻射和微波場作用下的塊狀物的物理參數(shù)列于表3中。
表3

實(shí)施例2緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎新型模型的產(chǎn)生 本發(fā)明提供了緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎的新型模型。該緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(HN)的新型模型被用于證明本發(fā)明的組合物和方法的功效，如本文中所述(例如見實(shí)施例1)。
緩慢進(jìn)行性自身免疫腎病通過下述方法在Sprague Dawley鼠中產(chǎn)生皮下注射整合入明礬和瘟熱復(fù)合物疫苗的化學(xué)修飾的腎抗原(rkF3)；然后皮下注射同樣抗原的含水制劑。腎病通過發(fā)展致病性自身抗體，然后通過它們與腎小球固定的致腎炎抗原反應(yīng)而誘發(fā)。結(jié)果，免疫病理學(xué)事件導(dǎo)致慢性進(jìn)行性免疫復(fù)合體腎小球腎炎和蛋白尿。
該緩慢發(fā)展的疾病在形態(tài)上和功能上與海曼氏腎炎相似。通過直接熒光抗體試驗(yàn)、組織學(xué)和電子顯微術(shù)，于第8周和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在收集的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎樣品中觀察到的損害與在海曼氏腎炎鼠腎臟發(fā)現(xiàn)的典型的損害相似，但嚴(yán)重性減弱。從17周開始(而不是通常的4-8周)動(dòng)物出現(xiàn)蛋白尿，在8個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，100％的鼠有蛋白尿。該新型的自身免疫腎病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒粫蚋鼓?nèi)沉積和保留Freund’s完全佐劑和腎小管抗原而變得復(fù)雜，這使得我們能從不同的方面研究疾病過程的發(fā)病機(jī)理，而且是研究進(jìn)一步的治療方案的更好的模型。
實(shí)驗(yàn)性腎病，類似于HN，也已被描述，諸如被動(dòng)海曼腎炎和進(jìn)行性被動(dòng)海曼腎炎，參見例如Adler(1984)Kidney Int.26830-837；Barabas(1974)Br.J.Exp.Pathol.55282-290；Barabas(1974)Br.J.Exp.Pathol.5547-55；Feenstra(1975)Lab.Invest.32235-242。通過IV注射針對鼠腎小管抗原的異源抗體，后面這些狀態(tài)可以在敏感鼠中產(chǎn)生。后面這些形式的腎病因注射的異源抗體與腎小球固定抗原(fixed antigens)反應(yīng)而產(chǎn)生，這反過來又在腎小球中激發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的額外的損傷，從而導(dǎo)致蛋白尿。這些狀態(tài)不是自身免疫疾病，而且它們在尋找人類天然存在的自身免疫腎病的治療方案中的實(shí)用性(relevance)不清楚。然而，加快腎小球中的免疫復(fù)合體分解將是最理想的成就，因?yàn)楦鞣N事件——其在HN和被動(dòng)性HN中發(fā)生并引起腎小球損傷——能夠被減弱或甚至可能被阻止。
本發(fā)明提供了新的緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(SPHN)模型，從發(fā)作和發(fā)展來看，SPHN與人的膜性腎小球腎炎非常相似。用于產(chǎn)生SPHN的新方法最初在3組鼠中，在不同的時(shí)期進(jìn)行研究，顯示出重復(fù)性。在本文描述的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將該新的SPHN模型與對照和HN鼠比較。在進(jìn)行疾病的誘導(dǎo)之后，HN鼠在4周時(shí)患有蛋白尿，而在新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械氖笤?7周后逐漸患蛋白尿。類似地，新實(shí)驗(yàn)組的鼠的致病性自身抗體應(yīng)答(利用間接熒光抗體技術(shù)用抗體滴度來量度)在疾病誘發(fā)期的最初8周內(nèi)大大減少。
盡管HN是研究自身免疫腎病的發(fā)病機(jī)理和出現(xiàn)的形態(tài)及功能變化的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但是在某些情況下，由于其快速且不可逆轉(zhuǎn)的過程，它不適合研究治療選擇方案。本發(fā)明提供了鼠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腎病模型，其逼真地模擬緩慢進(jìn)行的天然存在的人自身免疫疾病。本發(fā)明的SPHN腎病模型可以操作免疫系統(tǒng)，這樣，可以比在HN中更容易地減慢或終止免疫病理學(xué)事件。
鼠腎小管(級分3)抗原的制備將成年正常斯普拉道來氏鼠進(jìn)行安樂死，立即放血，并用冷的生理鹽水洗血管。將腎收集在0.25mol/L的緩沖蔗糖溶液pH7.4中，并通過Cyclone virtishear(Virtis)均質(zhì)化，成為相對精細(xì)的懸浮液。通過隨后在Potter-Elverhjem均質(zhì)器中均質(zhì)化該精細(xì)的腎懸浮液，獲得胞內(nèi)成份。使用Beckman Model J2.21離心機(jī)，通過差異離心收集鼠腎級分3(rKF3)，線粒體豐富的級分，如Hubscher(1965)Biochem.J.97629-642；Pinckard(1966)Clin.Exp.Immunol.133-43所述；所有程序都在4℃中進(jìn)行。
超聲破碎的超速離心rKF3級分的制備將用上述技術(shù)制備的rkF3重新懸浮在0.25mol/L的緩沖蔗糖溶液中，并保存在-35℃中，直到使用。解凍的rKF3制備物的蛋白質(zhì)濃度通過縮二脲蛋白評價(jià)方法(biurette protein estimation)測定，如Weichselbaum(1946)Am.J.Clin.Path.Tech.Suppl.1040-49所述。將rKF3制備物的最終蛋白濃度調(diào)到10mg/ml，然后在設(shè)置為60％工作循環(huán)和微探頭設(shè)限為8(8micro-tip limit)的情況下，使用Branson Sonifier 250，于4℃中超聲破碎5分鐘。使用Beckman L8-M超高速離心機(jī)，在4℃中，以100,000G，將超聲破碎的制備物超離心1小時(shí)。收集上清液，命名為u/c rKF3制品。將蛋白質(zhì)含量調(diào)節(jié)為4mg/ml。
Azo-u/c rKF3的制備然后使用Lannigan和Barabas描述的方法來制備Azo-rKF3，如Lannigan(1969)J.Pathol.97537-543所述。制品的化學(xué)偶聯(lián)在0.1mol/L的緩沖硼砂溶液pH 8.2中，于4℃中進(jìn)行2小時(shí)。在不斷攪拌和維持pH的條件下，將重氮鹽逐滴加到制品中。用PBS pH 7.3透析Azo-蛋白質(zhì)制品，PBS更換3次，從而除去未偶聯(lián)的重氮鹽。使用聚乙二醇8000，將制品的蛋白質(zhì)含量調(diào)節(jié)到4mg/mL。
尿蛋白評價(jià)-在誘導(dǎo)疾病之前，從代謝籠中的鼠個(gè)體上收集24小時(shí)尿樣品，每周1次，共6次，然后在誘導(dǎo)疾病之后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行每周一次的收集。使用Spectronic Genesis 5分光光度計(jì)，在540nm處，通過縮二脲方法測定尿蛋白含量，方法參見Weichselbaum(1946)supra。
光學(xué)顯微術(shù)將腎樣的代表性的樣品固定在10％甲醛鹽水中，并包埋在石蠟中，3μm厚的組織切片用蘇木素-伊紅，過碘酸希夫反應(yīng)(periodic acid-Schiffreaction)，和甲胺銀(methanamine silver stain)染色，如Barabas and Lannigan(1969)supra所述。
電子顯微術(shù)將腎臟的代表性樣品的1mm3的皮質(zhì)塊固定，準(zhǔn)備用于電子顯微術(shù)，如Barabas and Lannigan(1969)supra所述。
免疫熒光研究 直接熒光抗體試驗(yàn)在進(jìn)行疾病的誘導(dǎo)之后8周，和在8個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)鼠獲得腎臟活體樣品。用Microm HM 500M恒冷切片機(jī)中切割出2-3μ厚的冷凍切片，置于0.9％鹽水中20分鐘，然后固定在醚-醇(50∶50)中。固定之后，將切片洗滌兩次，再進(jìn)行染色，對于鼠IgG，用Alexa Fluor488-山羊抗-鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)的合適稀釋物，對于鼠IgM，用Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgM(μ鏈)(Molecular Probe)的合適稀釋物。Alexa Fluor染色的切片用Axioscop Zeiss顯微鏡觀察，用數(shù)碼相機(jī)(Diagnostic Instruments inc.)拍攝數(shù)碼相片，并存入微型計(jì)算機(jī)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從鼠個(gè)體獲得的切片，也用單克隆小鼠抗-鼠C5b-9 IgG抗體對C5b-9染色，并用Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)的合適稀釋物進(jìn)行復(fù)染。
間接熒光抗體試驗(yàn)從鼠個(gè)體收集血液，以用于評價(jià)腎特異性自身抗體的循環(huán)水平。在0，2，7，8，12，16，22，26，29和32周，從三組鼠獲得血液，以獲取血清樣品。將從鼠個(gè)體收集到的血清樣品保存在-35℃，直到使用。切割新鮮正常的鼠腎切片，用于研究。測試血清稀釋物與腎小管細(xì)胞成份的反應(yīng)活性，以測試IgG和IgM。記錄血清滴度，以反映IgG和IgM組分的反應(yīng)活性。
從患病的鼠腎洗脫γ球蛋白使用pH 3.2的0.02mol/L的檸檬酸，通過洗脫程序，從典型的HN和SPHN患病鼠的均質(zhì)化腎臟獲得洗脫的γ-球蛋白，如例如由Freedman(1960)Arch.Int.Med.105224-235；Freedman(1959)Lancet 245-46；Lerner(1968)J.Immunol.1001277-1287所述。洗脫2小時(shí)后，將含有γ-球蛋白的上清液重新調(diào)整到pH 7.2，用PBS透析，然后用carborax 8000將體積減少到0.5cc/2腎臟。它們的蛋白質(zhì)含量通過縮二脲試驗(yàn)測定，它們與腎臟結(jié)構(gòu)成份的反應(yīng)活性在間接熒光抗體試驗(yàn)中，在正常鼠腎臟切片上觀察。通過IV注射洗脫的γ-球蛋白，在正常鼠中測試它們的生物反應(yīng)性(在去除它們的其中一個(gè)腎臟之后)。注射后四天，殺死動(dòng)物，就鼠IgG和鼠IgM對它們的腎臟切片染色。在注射洗脫的γ-球蛋白之前，類似地測試被去除的腎臟。
對患病鼠的腎小球中的鼠IgG分級用半定量方法對最豐富的成份，即負(fù)責(zé)自身免疫腎病的啟動(dòng)和維持的成份，進(jìn)行分級，描述如下 (1)熒光強(qiáng)度記錄為0-4+等級。對熒光的分級受到存在于腎小球中的熒光物質(zhì)(珠狀免疫復(fù)合物)的數(shù)量影響，并因此由該數(shù)量決定。在固定的顯微鏡設(shè)置中觀察0-4級別的熒光，記錄熒光強(qiáng)度的差異。
(2)沉積在腎小球毛細(xì)血管環(huán)(loop)中的熒光物質(zhì)(珠狀免疫復(fù)合物)的數(shù)量也可以分級為0-4-0級損傷，在腎小球中沒有珠狀沉積；-1級損傷，在腎小球毛細(xì)血管環(huán)周圍有少量和很少數(shù)目的小的免疫復(fù)合物；
-2級損傷，在腎小球毛細(xì)血管環(huán)周圍具有變化數(shù)量和數(shù)目的免疫復(fù)合物，但是分布依然相當(dāng)稀疏；-3級損傷，在緊密靠近腎小球毛細(xì)血管環(huán)周圍具有許多由小到大的免疫復(fù)合物，并且常常是多層排列；-4級損傷，在腎小球毛細(xì)血管的周圍具有彌漫的大的珠狀沉積，并且常常是多層形式。
也觀察到在腎小球毛細(xì)血管之外的地方存在鼠IgG，并記錄到鼠IgG存在于腎小管基底膜(TBM)、腎小管細(xì)胞質(zhì)、腎小管的刷狀緣(BB)和鮑曼氏囊中。
鼠IgM的存在也發(fā)現(xiàn)并記錄在系膜(mesangium)中。就熒光強(qiáng)度，將珠狀系膜沉積分級為0-4等級，也按照0-4等級來描述存在于系膜中的熒光物質(zhì)的數(shù)量(從在系膜中沒有沉積到在系膜樹(mesangial tree)內(nèi)有大量的IgM沉積)。也觀察并記錄到在腎小球毛細(xì)血管的周圍存在具有珠狀圖案的很少數(shù)量的IgM，通常帶有微微的熒光。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各個(gè)編號的鼠隨機(jī)分派到實(shí)驗(yàn)的三個(gè)組中。
代謝對照10只鼠不進(jìn)行注射，作為對照。在與試驗(yàn)組中的鼠相同的時(shí)間進(jìn)行下面操作將該組的鼠放血獲取血清，對它們的腎臟進(jìn)行組織活檢，收集它們的尿并進(jìn)行分析。
試驗(yàn)組I緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(SPHN)10只鼠皮下注射在明礬和瘟熱復(fù)合體病毒疫苗中的u/c Azo-rKF3(Olson et al.，2000)。明礬與免疫原-明礬混合物的最終體積比是1∶3。佐劑抗原混合物如下制備 在注射之前，將1體積的明礬(ImjectAlum，Pierce)逐滴加入到下述兩種物質(zhì)的混合物中1體積的瘟熱復(fù)合病毒疫苗(Duramune DA2P+PV，F(xiàn)ort Dodge，Iowa，USA)和2體積的Azo u/c rKF3(將PBS加入到抗原，使它達(dá)到2體積)，并在室溫中攪拌30分鐘。
鼠用0.2mL的抗原佐劑混合物注射4次。在0天，混合物含有160μg，在第10、20和35天，含有80μg抗原。在第42、49和55天，通過額外3次SC注射給予100μg的含水Azo u/c rKF3抗原。所有的SC注射在肩胛之間的背面實(shí)施。
試驗(yàn)組II海曼氏腎炎(HN)腎病10只鼠腹膜內(nèi)4次注射加入到FCA中的Azo-rKF3抗原。FCA與免疫原-FCA混合物的最終體積比率是1∶2。佐劑抗原混合物按如下制備在注射之前，使用帶有18G 2way針的注射器，向2體積的FCA(含有2mg結(jié)核分枝桿菌/mL)加入1體積的Azo-rKF3(24mg/mL)，進(jìn)入乳化。在第0、10、20和35天，鼠腹膜內(nèi)接受含有2mg Azo-rKF3抗原的0.25mL乳化的制品，在第42、49和55天在肩胛之間皮下給予含有2mg Azo-rKF3的0.25mL含水制品。
在第22、23和24周，試驗(yàn)組I和II的鼠通過SC注射，用0.2ml含水的100μg Azo u/c rKF3抗原制品重新刺激。
結(jié)果 蛋白尿在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每周一次的蛋白尿評價(jià)在獲自鼠個(gè)體的24小時(shí)尿樣品上實(shí)施。在開始實(shí)驗(yàn)之前6周，由鼠個(gè)體獲得的蛋白尿測量值建立了良好的基線，并顯示在三組所有的鼠中都沒有蛋白尿癥。在引發(fā)疾病之后13周，在試驗(yàn)組I SPHN鼠中，蛋白尿開始發(fā)展，從17周開始，它變?yōu)榫徛M(jìn)行性。在32周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，100％的鼠患有中等程度的蛋白尿，其水平與HN鼠在引發(fā)它們的疾病之后約7周的水平相同。在試驗(yàn)組II HN鼠中，蛋白尿早在首次注射FCA中的Azo-rKF3抗原之后5周便開始，然后它變得強(qiáng)烈，尿蛋白損失水平大大提高。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，100％的鼠患有嚴(yán)重的蛋白尿。在該階段，動(dòng)物每天幾乎排泄出與它們總的血清蛋白含量相等的蛋白。此外，在該組中，因?yàn)榕c極度蛋白尿癥相關(guān)的代謝功能障礙的緣故，大部分的鼠看上去瘦弱。代謝對照組——其被保持以了解在實(shí)驗(yàn)期間是否發(fā)生與年齡相關(guān)的蛋白尿增加現(xiàn)象——顯示在38周的整個(gè)試驗(yàn)期間沒有明顯的變化，如圖1所示。
光學(xué)顯微術(shù)HxE切片顯示試驗(yàn)組I和II鼠的腎小球的細(xì)胞結(jié)構(gòu)微微增加，而代謝對照中沒有一個(gè)有增加。蛋白尿試驗(yàn)組I和II鼠的甲胺銀染色的腎臟切片顯示增厚的腎小球毛細(xì)血管，顯著的系膜區(qū)域以及在增厚的腎小球毛細(xì)血管的外表面上的銀陽性刺突(silver positive spikes)。
電子顯微術(shù)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每組鼠獲得三個(gè)代表性的鼠腎樣品。攜帶SPHN的組I鼠顯示出特征性的形態(tài)學(xué)損傷，其可以在活性海曼氏腎炎鼠的腎臟中觀察到。腎小球的腎小球基底膜(GBMs)沿著它們整個(gè)周圍被不規(guī)則地增厚，這是由于基底膜(BM)物質(zhì)生長并在上皮方向部分地或完全地環(huán)繞著嗜鋨致密物(osmiophilic densities)。與嗜鋨沉積和GBM變化相關(guān)地，足突消失，覆蓋損傷的上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的嗜鋨區(qū)域。系膜區(qū)域顯示出電子致密沉積物和局灶性增加的系膜細(xì)胞。攜帶活性HN的組II鼠基本上顯示出相似的但更為嚴(yán)重的腎小球和相關(guān)超微結(jié)構(gòu)的變化，這表明有更進(jìn)一步的損傷，這是由于致病性自身抗體水平增加引起的損害的緣故。GBMs受到不規(guī)則增厚的多層和多突出(multiprojected)的BM樣物質(zhì)——其環(huán)繞并圍住由小及大的嗜鋨沉積物——更為嚴(yán)重的影響。與沉積物和GBM變化有關(guān)地，足突消失，它們的上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)含有不同程度的嗜鋨染色。代謝對照腎臟的超顯微圖顯示在它們的GBM和相關(guān)結(jié)構(gòu)中沒有超微結(jié)構(gòu)的變化。
洗脫的γ-球蛋白的分析在間接熒光抗體試驗(yàn)中，獲自組I和II鼠的腎臟的洗脫的γ-球蛋白染色了正常鼠腎切片的近曲小管的BB區(qū)域。當(dāng)洗脫的γ-球蛋白的樣品靜脈內(nèi)注射入單邊腎切除的鼠，并在4天后進(jìn)行活組織檢查時(shí)，在腎小球毛細(xì)血管環(huán)的周圍觀察到成片的微細(xì)的珠狀鼠IgG沉積。在注射之前從該單邊腎切除的鼠獲得的腎切片在腎小球中沒有顯示鼠IgG。在注射洗脫的γ-球蛋白之前從單邊腎切除的鼠獲得的腎切片也對鼠IgM進(jìn)行了染色。在注射前和注射后腎樣中，觀察到同樣熒光圖式的系膜和微細(xì)腎小球毛細(xì)血管環(huán)染色。從攜帶SPHN的組I鼠和從攜帶典型HN的組II鼠獲得的洗脫γ-球蛋白樣品給出了類似的體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果。
直接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果下表2顯示了在腎臟切片上的直接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果，腎臟切片在8周時(shí)和在32周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)獲自3組鼠。
代謝對照鼠在8周或32周時(shí)，在它們的腎切片中沒有IgG被定位的成份。然而，在所有鼠中，所有的鼠腎切片在它們的系膜中都具有確定的珠狀I(lǐng)gM沉積，或局灶性地或彌漫性地具有很小至中等程度的受累和類似的熒光強(qiáng)度和等級。此外，也注意到腎小球毛細(xì)血管環(huán)的細(xì)微的珠狀染色，這表明在這些位置有鼠IgM沉積物。
試驗(yàn)組I SPHN鼠顯示在腎小球、刷狀緣相關(guān)區(qū)域和TBM中有IgG沉積物。在腎小球毛細(xì)血管中觀察到最清楚存在的鼠IgG的珠狀圖樣。在8和32周，在這些地方觀察到稀少的小的珠狀沉積物到大的匯合的多層珠狀沉積物，對它們進(jìn)行分級并記錄。此外，偶爾的近曲小管的BB區(qū)域也被染色，但是熒光較微弱，在第8周時(shí)尤其如此，然后是在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)。TBM染色有斑狀分布(patchydistribution)的珠狀圖案。在8周較早時(shí)期，觀察到該熒光圖案，在32周時(shí)較不常見。在第8周和32周時(shí)，IgM存在于每個(gè)鼠腎切片的系膜中，具有珠狀圖案，它的存在和分布似乎不受疾病狀態(tài)的影響。也觀察到在第8和32周，在大部分的腎切片的腎小球毛細(xì)管的周圍具有珠狀的相當(dāng)微弱的熒光。
試驗(yàn)組II HN鼠在第8周時(shí)，鼠IgG被發(fā)現(xiàn)在腎小球毛細(xì)血管中有大量的粒狀沉積，常常是多層模式的，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，更加明顯，具有匯合的大的沉積。在第8周，腎小管BB區(qū)域被染得彌漫而強(qiáng)烈，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腎小管BB染色更為強(qiáng)烈和彌漫，顯示隨著時(shí)間推移損害在增加。在第8周，鼠腎小管基底膜有染色，帶有珠狀圖案的IgG染色，其相當(dāng)廣泛地分布在腎切片上，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)染色情況類似。鮑曼氏囊僅在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在一些鼠腎切片上有針對IgG的部分染色，帶有珠狀沉積。鼠IgM在系膜和腎小球毛細(xì)血管環(huán)中被發(fā)現(xiàn)，如同代謝對照和SPHN鼠的情況。此外，5只鼠在第8周對IgM顯示出少量的但明顯的BB區(qū)域染色。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，7只鼠對IgM顯示出腎近端小管的彌漫性細(xì)胞質(zhì)染色。1只鼠對IgM顯示出珠狀的腎小球毛細(xì)管彌漫性染色。
所有的鼠腎切片通過夾心技術(shù)對膜攻擊復(fù)合物C5b-9進(jìn)行染色。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，組I和II鼠的腎切片的腎小球毛細(xì)管環(huán)針對C5b-9強(qiáng)烈地染出彌漫的珠狀圖案。來自代謝對照鼠的腎切片則沒有出現(xiàn)染色。
間接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果 代謝對照在實(shí)驗(yàn)之前和實(shí)驗(yàn)期間由間接熒光抗體試驗(yàn)分析的正常鼠的血清顯示出低水平的循環(huán)的自然發(fā)生的IgM自身抗體，該抗體針對正常鼠腎切片的近曲小管的BB區(qū)域。在近曲小管的腔周區(qū)域(periluminal region)的免疫熒光的圖案由復(fù)雜的微細(xì)的線型染色組成。最常見地，針對鼠IgM的典型的腎小管染色不是彌漫性的，而是隨機(jī)地分布在腎切片上，涉及任意一個(gè)位置的一個(gè)或多個(gè)腎小管。在鼠個(gè)體中，在一個(gè)分析與下一個(gè)分析之間，循環(huán)IgM自身抗體的水平微微變化，但是變化程度不顯著。血清樣品對正常的鼠腎臟切片成份不具有鼠IgG抗體引起的抗體活性。
試驗(yàn)組I SPHN在2周內(nèi)，出現(xiàn)針對腎小管上皮細(xì)胞成份的中等程度的IgG抗體應(yīng)答；到第7周，記錄到極度增加的應(yīng)答，其持續(xù)到第8和第12周。從16周起，自身抗體應(yīng)答逐漸減弱，通過第22周起三次注射含水Azo u/c rKF3抗原而使其提高。在整個(gè)研究中，間接熒光抗體試驗(yàn)獲得的腎小管熒光是彌漫性的，實(shí)際上涉及所有腎小管，這由具有典型的寬范圍染色圖案的BB相關(guān)區(qū)域染色顯示出來。從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束，針對腎小管BB相關(guān)區(qū)域的IgM抗體應(yīng)答比正常生理范圍平均增加四倍。自22周注射Azo u/c rKF3抗原后，IgM自身抗體應(yīng)答也增加。
試驗(yàn)組II HN鼠在該組鼠中，抗腎小管BB IgG抗體應(yīng)答是迅速的，在誘發(fā)疾病之后兩周時(shí)，平均抗體滴度超過1000。到7周時(shí)，抗體滴定度達(dá)到它的最高點(diǎn)，超過30,000，隨后在第8、12和16周時(shí)，它依然高，但是出現(xiàn)減退，在32周時(shí)達(dá)到相對低但是依然明顯高的水平(圖14)。在該組中，每只鼠具有高的致病性自身抗體應(yīng)答。就如在試驗(yàn)組I鼠中的情況，在間接熒光抗體試驗(yàn)中觀察到典型的BB染色圖案。在22周時(shí)用含水Azo-rKF3抗原再次刺激這些鼠，未增加抗體應(yīng)答。到第7周時(shí)，對腎小管BB相關(guān)區(qū)域的IgM抗體應(yīng)答平均超出正常生理值約100倍，然后在第8和12周時(shí)，依然保持非常高的水平，然后微微逐漸降低。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，IgM抗腎小管抗體應(yīng)答依然平均高出正常生理值10倍。針對IgM的腎近端小管的免疫熒光染色大大增強(qiáng)，顯示出彌散的粒狀細(xì)胞質(zhì)染色和粗的多線條染色圖樣。
討論本發(fā)明提供了制備和使用新型自身免疫腎病的方法，其形態(tài)和功能上類似于HN，通過新的技術(shù)在斯普拉道來氏鼠中產(chǎn)生，所述新的技術(shù)是具有最低程度的侵入性的方法。在本文描述的實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物接受SC注射的低劑量的化學(xué)修飾的腎小管抗原，所述抗原被摻入到明礬和瘟熱復(fù)合體疫苗中，然后SC注射水介質(zhì)中的同樣的抗原。
患得的疾病是緩慢進(jìn)行的。在第13周開始出現(xiàn)小量的蛋白尿，從17周開始出現(xiàn)明顯的蛋白尿，在8個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，100％的鼠有蛋白尿。用于直接熒光抗體研究的在8周獲得的早期腎臟組織切片樣品顯示，在腎小球毛細(xì)管周圍有成珠狀圖案的鼠IgG免疫沉積染色。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用于熒光抗體試驗(yàn)、組織學(xué)和電子顯微術(shù)的獲得的腎組織樣品顯示出典型的HN變化。通過直接熒光抗體試驗(yàn)，在為鼠IgG和C5b-9而染色的腎小球毛細(xì)血管周圍，觀察到免疫復(fù)合物的彌漫性珠狀沉積；近曲小管的BB區(qū)域和TBMs也被染色，如表2所示。蛋白尿鼠的甲胺銀染色的腎切片的組織學(xué)分析顯示了增厚的腎小球毛細(xì)管，在它們的外周圍以及顯著的系膜處具有銀陽性刺突。
電子顯微術(shù)顯示了包埋在不規(guī)則增厚的GBM外表面中的巨大的嗜鋨沉積。此外，也觀察到與沉積物相關(guān)的足突消失。
通過間接熒光抗體試驗(yàn)，我們檢測了循環(huán)致病性和非致病性自身抗體的存在。顯示，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，特別是隨著持續(xù)地注射摻入到明礬的抗原，循環(huán)致病性自身抗體的水平是高的，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，它的水平降低。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，依然可以檢測到針對腎小管BB相關(guān)抗原的低水平的循環(huán)自身抗體。這些自身抗體(其因自體樣抗原(self-like antigens)的“非尋常的呈遞(unusual presentation)”而產(chǎn)生)是引起最初階段的事件的原因所在。因此，發(fā)展中的自身抗體與結(jié)合于腎小球的致腎炎抗原反應(yīng)，并形成免疫復(fù)合物。如果隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行沒有額外的化學(xué)改變的抗原可以加以利用，那么有理由認(rèn)為沒有更多的循環(huán)致病性自身抗體形成，同樣地，沒有更多的抗原可以用于在GBM上皮面形成不斷擴(kuò)大和增長的免疫復(fù)合體(該復(fù)合體由致腎炎抗原、自身抗體和補(bǔ)體成份構(gòu)成)。
表2說明了在3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中進(jìn)行染色的鼠個(gè)體的腎臟切片，所述染色是通過直接免疫熒光技術(shù)針對鼠IgG和IgM進(jìn)行的染色。顯示了在第8和32周時(shí)，各組鼠內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度和平均等級，以及腎組織被定位組分(kidney tissuelocalized components)的存在或不存在。
表2

BB刷狀緣，TBM腎小球基底膜，HN海曼氏腎炎，SPHN緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎實(shí)施例3由化學(xué)修飾的腎抗原產(chǎn)生海曼氏腎炎 本實(shí)施例描述了通過用化學(xué)修飾的腎抗原產(chǎn)生海曼氏腎炎(HN)，并證明了在水介質(zhì)中的化學(xué)修飾的腎炎抗原，在不使用任何佐劑的情況下，能夠在敏感鼠品系中引發(fā)致病性自身免疫應(yīng)答。
形態(tài)上和功能上類似于海曼氏腎炎(HN)的自身免疫腎病，通過每周一次反復(fù)IP注射在水介質(zhì)中的化學(xué)修飾的Azo超離心(u/c)rKF3抗原，在成熟雄性斯普拉道來氏鼠中被誘導(dǎo)。參見上面的實(shí)施例2。
在首次注射化學(xué)改變的抗原15周后，終止實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)期間，血清樣品被收集，并通過間接熒光抗體試驗(yàn)在正常鼠腎切片上進(jìn)行分析，顯示循環(huán)致病性自身抗體逐漸升高，所述循環(huán)致病性自身抗體針對近端小管刷狀緣區(qū)域。蛋白尿存在于一些鼠的尿中并顯著增加。通過組織學(xué)、直接熒光抗體和電子顯微術(shù)檢查，發(fā)展出的免疫復(fù)合物腎小球腎炎顯示，在70％鼠中具有典型的HN腎病損傷。
類似地注射同樣的化學(xué)未修飾的抗原的對照鼠未出現(xiàn)特征性的形態(tài)和功能變化。
這些數(shù)據(jù)首次描述了自身免疫腎病——命名為活性HN(active HN)——可以通過給予在水溶液中的化學(xué)改變的腎抗原而產(chǎn)生，并不由在佐劑中的致腎炎腎抗原的平常呈遞產(chǎn)生。
動(dòng)物1年以上的成年雄性斯普拉道來氏鼠用于實(shí)驗(yàn)中。從當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)場獲得鼠，進(jìn)行編號并隨機(jī)分配到對照組和試驗(yàn)組中。在異氟烷麻醉的鼠上進(jìn)行所有侵入性實(shí)驗(yàn)程序。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過IP注射Euthanyl(MTC pharmaceuticals)(180mg/kg體重)，對動(dòng)物進(jìn)行安樂死。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對照鼠該組使用15只鼠。這些動(dòng)物每周一次腹膜內(nèi)注射100μg的在0.2mlPBS pH 7.3中的未修飾的超聲破碎的超離心rKF3制劑。
試驗(yàn)鼠8只鼠每周一次腹膜內(nèi)注射在0.2ml PBS pH 7.3中的100μg Azo-超聲破碎的超離心rKF3制劑。
在實(shí)驗(yàn)開始前和在2、4、6、12和15周，從每只鼠獲得血樣，以獲得血清。
在實(shí)驗(yàn)開始之前從每只鼠、在進(jìn)入研究兩周后從一些鼠，以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從所有鼠，獲得腎臟活體組織樣品，用于直接熒光抗體試驗(yàn)的分析。在研究結(jié)束時(shí)，對在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中收集到的每一血清樣品進(jìn)行間接熒光抗體試驗(yàn)。此外，通過特異性染色組織切片的組織學(xué)技術(shù)，也檢查每只鼠的腎樣品。通過電子顯微術(shù)，對所有試驗(yàn)組的腎進(jìn)行了檢查，但是在對照組中僅對一些腎樣品進(jìn)行了檢查。在15周時(shí)，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。
尿蛋白評價(jià)；在實(shí)驗(yàn)開始之前，從在代謝籠中的鼠個(gè)體上收集24小時(shí)尿樣品，每周一次，共三次，然后在實(shí)驗(yàn)期間兩次。使用Spectronic Genesis 5分光光度計(jì)，在540nm處，使用縮二脲方法，對0.5ml尿樣品進(jìn)行尿蛋白評價(jià)。計(jì)算日蛋白尿，并用mg/天蛋白質(zhì)損失/100gm體重來表示。
鼠腎小管級分3(rKF3)抗原的準(zhǔn)備放血并用4℃PBS pH 7.2洗去血管之后，從安樂死的成年斯普拉道來氏鼠獲得腎臟。將腎收集在4℃的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液pH 7.4中，在緩沖液中洗滌若干次，以除掉血液成份。通過CycloneVirtishear(Virtis)，將腎樣品均質(zhì)成微細(xì)懸浮液，并使用Potter-Elverjhem Teflon均質(zhì)機(jī)，將胞質(zhì)內(nèi)成份釋放到蔗糖緩沖液中。鼠腎級分3，命名為rKF3，使用BeckmanModel L-2超高速離心機(jī)通過差異超離心[17]獲得。所有程序在4℃中進(jìn)行。rKF3制備物的蛋白質(zhì)濃度通過縮二脲技術(shù)[16]測定，并在保存于-35℃中之前將濃度調(diào)節(jié)到30mg/ml。
超聲破碎的u/c rKF3的準(zhǔn)備使用設(shè)為60％工作循環(huán)、微探頭設(shè)限為9的Branson超聲破碎儀250，將處于0.25mol/L緩沖蔗糖溶液pH 7.2中的10mg/mlrKF3制備物在4℃超聲5分鐘。使用Beckman L8-M超高速離心機(jī)，在4℃，以100,000G，將超聲處理的制備物超高速離心1小時(shí)。所得的上清液命名為u/c rKF3制品，將蛋白含量調(diào)節(jié)到4mg/ml，再保存在-35℃中，直到使用。
Azo超聲處理的u/c rKF3的制備利用Lannigan等描述的方法來制備Azo-rKF3(Lannigan，et al.，Some experimental models of the nephritic syndrome.InBajusz E.，Jasmin G.，eds.Meth Achievement Experimental Pathology.New YorkKarger，Basel，1969)。在4℃，在pH 8.2的0.1mol/l的緩沖硼砂溶液中進(jìn)行超聲處理過的u/c rKF3制品的化學(xué)偶聯(lián)，2小時(shí)。在持續(xù)攪拌中，將重氮鹽逐滴加入到制品中，同時(shí)將pH維持在8.2。用PBS pH 7.2對出現(xiàn)的黃色Azo-蛋白質(zhì)制備物進(jìn)行透析，PBS更換數(shù)次，以除去未偶聯(lián)的重氮鹽。使用聚乙二醇8000將Azo-蛋白質(zhì)化合物的蛋白質(zhì)含量重新調(diào)節(jié)到4mg/ml。
組織學(xué)將腎樣品的皮質(zhì)部分固定在10％的中性緩沖福爾馬林中，切割石蠟包埋的切片，并用蘇木精和伊紅(H&E)、高碘酸-Schiff(PAS)和高碘酸Schiff六亞甲基四胺(PASM)染料染色。切片用Zeiss Axioscope Microscope檢查。
電子顯微術(shù)將代表性的腎樣品1mm3的皮質(zhì)塊固定在2.5％的二甲胂酸鹽緩沖的戊二醛中2小時(shí)，而后固定在Caulfield’s四氧化鋨溶液中，并包埋在Epon中。含有腎小球的薄切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。使用Hitachi H600電子顯微鏡檢查超薄切片。
免疫熒光研究使用微米HM 500M恒冷切片機(jī)，將冷凍的皮質(zhì)腎組織樣品切片切割成2-3μ的厚度，并置于含有0.9％鹽水的科普林染色缸(coplin staining jar)中10分鐘，然后固定在醚∶醇(50∶50)中2分鐘，然后再次洗滌。
直接熒光抗體試驗(yàn)醚∶醇固定的切片用Alexa Fluor488-抗-鼠IgG(H+L)和Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgM(μ鏈)(Molecular Probe)的合適稀釋物在濕盒(wet box)中溫育30分鐘。用標(biāo)記的抗體溫育之后，切片用更換兩次的鹽水洗滌，再用甘油/PBS(50∶50)封固(mount)。
夾心技術(shù)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從鼠個(gè)體獲得的切片，也針對C5b-9用單克隆小鼠抗-鼠C5b-9IgG抗體染色，并用4000倍稀釋的高度交叉吸附的Alexa Fluor488山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)復(fù)染色。類似地，鼠腎切片也針對鼠C-3用兔抗-鼠C-3IgG抗體染色，用Alexa Fluor488山羊抗-兔IgG(H+L)(MolecularProbe)復(fù)染色。
間接熒光抗體試驗(yàn)對在實(shí)驗(yàn)之前、實(shí)驗(yàn)期間和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)獲得的鼠個(gè)體血清樣品的稀釋物進(jìn)行測試，以測試對腎小管成份的活性，測試按鼠IgG和鼠IgM部分在正常鼠腎切片上進(jìn)行。用血清稀釋物溫育之后，合適的切片組用Alexa Fluor488山羊抗鼠IgG(H+L)和Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgM(μ鏈)(Molecular Probe)染色。在熒光抗體試驗(yàn)中包括有合適的對照。
從患病的鼠的腎洗脫γ-球蛋白使用pH 3.2的0.02mol/L的檸檬酸，通過酸洗脫技術(shù)，從適當(dāng)制備的腎小球制備物獲得洗脫的γ-球蛋白，參見例如Freedman(1959)Lancet 245-6；Freedman(1960)Arch.Int.Med 105224-235。洗脫過程進(jìn)行2小時(shí)。離心之后，將含有洗脫的γ-球蛋白的上清液重新調(diào)節(jié)到pH 7.2，并用PBS透析，PBS更換3次，然后通過Carbovax 8000將體積減少到0.5ml/2腎。通過縮二脲試驗(yàn)測定濃縮樣品的蛋白質(zhì)含量(參見例如Weichelbaum(1946)Am.J.Clin.Path.Tech.Suppl.1040-49)，在正常的鼠腎切片上，在間接熒光抗體試驗(yàn)中，觀察它們與正常的鼠腎成份的反應(yīng)活性。將洗脫的γ-球蛋白IV注射入單邊腎切除的斯普拉道來氏鼠后，測試洗脫的γ-球蛋白的生物活性。在注射之后4天，將鼠安樂死，針對鼠IgG和鼠IgM將它的腎切片染色。在注射洗脫的γ-球蛋白之前，以類似的方法測試腎切片。
腎小球中被定位的(localized)自身成份的分級最豐富的腎小球定位成份——其引起疾病形成——是鼠IgG。熒光的強(qiáng)度由熒光物質(zhì)(珠狀腎小球免疫復(fù)合物)的數(shù)量確定，在固定的顯微鏡設(shè)置上，通過半定量的方法，將它分為0-4+等級。在腎小球中的熒光物質(zhì)的數(shù)量也分為0-4+等級(參見實(shí)施例2)。等級0損傷沒有腎小球沉積，而等級4+損傷在腎小球毛細(xì)血管的周圍具有彌漫性的大的常常是多層的珠狀沉積。等級之間的中間等級，依據(jù)設(shè)定值進(jìn)行確定。
也在腎小管基底膜(TBM)、腎小管細(xì)胞質(zhì)、刷狀緣(BB)和鮑曼氏囊中注意到并記錄下存在鼠IgG。鼠IgM的存在也在系膜中觀察到并記錄。系膜中熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)的數(shù)量分級為0-4+分級。具有隱約的珠狀圖案的很少數(shù)量的IgM也存在于注射前和注射后的動(dòng)物腎樣品的腎小球中，對此進(jìn)行記錄。
結(jié)果 蛋白尿?qū)嶒?yàn)之前從鼠個(gè)體獲得的三個(gè)每周一次的蛋白尿結(jié)果顯示在兩組鼠中具有低水平的正常的蛋白尿值(12mg/天/100gr體重)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中的兩只鼠具有高的蛋白尿水平，分別為140和290mg/天/100gr體重，而對照組中則沒有。
光學(xué)顯微術(shù)試驗(yàn)組鼠的腎切片顯示，在H&E切片上的細(xì)胞構(gòu)成微微增加。PAS染色的腎切片顯示，在測試組和對照組動(dòng)物中，致病性硬化性腎小球損傷特征性地在年老的鼠中發(fā)現(xiàn)。兩個(gè)具蛋白尿的試驗(yàn)組鼠的甲胺銀染色的腎切片顯示出顯著的系膜區(qū)域和增厚的腎小球毛細(xì)血管，在它們的外周圍具有多層銀陽性刺突。四只非蛋白尿的試驗(yàn)組鼠顯示出類似的但是更輕微一些的腎小管受累，在它們的外壁上偶爾有銀陽性刺突。對照鼠沒有典型的損傷。
電子顯微術(shù)通常在活性HN鼠腎中觀察到的若干超微結(jié)構(gòu)變化在兩只蛋白尿鼠的腎小球中發(fā)現(xiàn)。厚重且不規(guī)則增厚的腎小球基底膜(GBM)朝向腎小球的上皮方向部分地或完全地包圍大大小小的嗜鋨沉積物。與GBM變化和足突融合相關(guān)地，上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)顯示出嗜鋨區(qū)域，其強(qiáng)烈程度與沉積物本身一樣。另外4只試驗(yàn)鼠的腎顯示了更溫和形式的活性HN損傷。在這些鼠中，觀察到具有小的嗜鋨沉積物的斑狀不規(guī)則增厚的GBM。上皮細(xì)胞足突融合僅僅涉及發(fā)現(xiàn)有沉積物的GBM，而在許多不存在沉積物的區(qū)域則保留了足突。在試驗(yàn)組中的兩只鼠沒有HN腎損傷，對照組中沒有鼠具有HN腎損傷。
直接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果表3顯示了在第0和15周，在腎組織中定位的鼠IgG和鼠IgM抗體的存在或不存在。在第0和15周，對照鼠顯示，在腎小球或相關(guān)結(jié)構(gòu)中沒有IgG。另一方面，鼠IgM的系膜珠狀沉積物——最常見地具有強(qiáng)烈的熒光——在所有鼠的腎切片中被觀察到。在腎小球毛細(xì)血管的周圍，也觀察到微弱的鼠IgM珠狀沉積物。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腎樣品中，C5b-9以微弱量存在于系膜中，具有微弱的珠狀免疫熒光圖案，但不存在C-3。
在第0周時(shí)，試驗(yàn)組鼠顯示出與對照相同的熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果。在第一次注射修飾的腎抗原3周后，8只鼠中的5只被活檢，檢查皮質(zhì)腎樣品，結(jié)果顯示，在一個(gè)腎活檢樣品中，在腎小球毛細(xì)血管具有微細(xì)的彌漫性珠狀I(lǐng)gG沉積物，同一樣品還顯示在腎小管的刷狀緣(BB)區(qū)域有幾處染色。另外三個(gè)腎活檢樣品對于鼠IgG顯示出幾乎不能檢測的微細(xì)的腎小球毛細(xì)血管環(huán)珠狀染色，有一個(gè)樣品為陰性。
在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，8只鼠中的6只患有免疫復(fù)合物腎小球腎炎，在5只鼠中表現(xiàn)為在腎小球毛細(xì)血管環(huán)周圍具有嚴(yán)重的鼠IgG珠狀沉積，在一只鼠中具有類似但是較輕微的沉積。在典型HN中在BB區(qū)域和TBM中發(fā)現(xiàn)的具有珠狀圖案的特征性鼠IgG定位也在三只鼠的腎中觀察到，在2只鼠腎中，鮑曼氏囊的偶爾片段具有微弱的珠狀圖案染色。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，也針對C5b-9和C-3，對腎切片染色。三只鼠的腎切片，腎小球毛細(xì)血管有針對C5b-9的不同程度的成珠狀形式的染色，所有其他鼠的腎切片都顯示出微弱的珠狀系膜染色。四個(gè)鼠腎切片針對C-3染色有微細(xì)的彌漫性珠狀圖案。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，鼠IgM以增加的數(shù)量、以珠狀圖案存在于系膜中，腎小球毛細(xì)血管的染色具有微弱的細(xì)小的彌漫性珠狀熒光圖案。
間接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)開始之前，對照和試驗(yàn)鼠的血清顯示出低水平的循環(huán)的天然發(fā)生的IgM自身抗體，所述IgM自身抗體針對近曲小管的BB區(qū)域，在正常鼠腎切片上具有微細(xì)的線型熒光圖案。未觀察到對正常鼠腎組織成份具有循環(huán)鼠IgG抗體活性。在實(shí)驗(yàn)期間，六次從鼠個(gè)體中獲得血清樣品。
注射天然致腎炎抗原的對照鼠沒有發(fā)展出致病性IgG自身抗體，但產(chǎn)生水平微微提高的、針對腎小管抗原的IgM自身抗體。注射化學(xué)修飾的致腎炎抗原的8只鼠中的6只，隨著疾病進(jìn)行，致病性IgG自身抗體的水平提高，所述抗體針對腎近曲小管的BB相關(guān)區(qū)域。比起對照鼠，非致病性IgM自身抗體水平也增加許多，表明對產(chǎn)IgM的細(xì)胞系的刺激增加。
洗脫出的γ-球蛋白的分析洗脫的γ-球蛋白僅獲自試驗(yàn)組的鼠。它以5mg/ml的蛋白質(zhì)濃度，在間接熒光抗體試驗(yàn)中被測試。在達(dá)1∶40的稀釋度時(shí)，它仍與近曲小管的BB區(qū)域反應(yīng)。將0.5ml的洗脫的γ-球蛋白樣品靜脈內(nèi)注射到單邊腎切除的鼠中，4天后進(jìn)行活檢，直接熒光抗體試驗(yàn)顯示，在腎小球毛細(xì)血管的周圍觀察到彌漫性的微細(xì)珠狀鼠IgG沉積物。注射前的腎切片針對鼠IgG沒有出現(xiàn)染色，但是針對鼠IgM出現(xiàn)染色，如同針對對照所描述的情況。
論述本發(fā)明的方法通過反復(fù)注射在含水溶液中的化學(xué)修飾的致腎炎抗原，在一組鼠中產(chǎn)生HN。發(fā)展中的疾病，表現(xiàn)為在腎小球中具有免疫復(fù)合物沉積，在受影響最嚴(yán)重的鼠中具有蛋白尿。自身免疫疾病由致病性自身抗體引起并維持。那些注射了同樣的但是化學(xué)未修飾的抗原的對照鼠，未患上自身免疫腎病。
這些實(shí)驗(yàn)表明，在致病性免疫應(yīng)答發(fā)生之前，自身抗原必須被充分改變才能之后被適當(dāng)?shù)拿庖呒?xì)胞識別為外來物。這一點(diǎn)已經(jīng)在用某些藥物治療并隨后患上狼瘡樣綜合癥的患者中得到充分說明。參見例如Jiang(1994)Science266810-813；Rich(1996)Postgrad.Med 100299-298；Totoritis(1985)Postgrad.Med78149-161；Yung(1995)Lab Invest.73746-759。當(dāng)藥物被撤去時(shí)，狼瘡樣綜合癥消失。在敏感患者中，藥物誘發(fā)的狼瘡必定是通過活性成份或藥物的降解產(chǎn)物而啟動(dòng)，這些物質(zhì)能夠充分改變合適的胞質(zhì)內(nèi)抗原并啟動(dòng)免疫病理學(xué)事件。在某些個(gè)體中，陽光或極度寒冷也能產(chǎn)生狼瘡樣綜合癥，如果隨后不再暴露于這些危險(xiǎn)的情況，癥狀便消失。
這些實(shí)驗(yàn)也證明了，在實(shí)驗(yàn)期間，反復(fù)注射了修飾的腎抗原的動(dòng)物產(chǎn)生升高水平的致病性和非致病性自身抗體，而那些注射了天然腎抗原的鼠僅僅產(chǎn)生微微增加水平的天然發(fā)生的非致病性IgM自身抗體。
本實(shí)驗(yàn)，以及本發(fā)明的方法和組合物清楚證明，通過利用IgM自身抗體，自身免疫能夠在幫助有效除去釋放的胞質(zhì)內(nèi)成份方面，提供有益的作用。這些實(shí)驗(yàn)也證明，不恰當(dāng)?shù)靥峁┏浞指淖兊淖陨砜乖谀承┣闆r下會引起有害的致病性自身抗體應(yīng)答并引起疾病。
表3顯示了利用直接免疫熒光技術(shù)染色的腎切片，顯示了在0和15周時(shí)，定位于組織的鼠IgG和鼠IgM的存在/不存在。
表3

BB＝刷狀緣；F1*＝熒光；TBM＝腎小管基底膜；對照中有15只鼠，試驗(yàn)組中有8只鼠。
實(shí)施例4在用致腎炎抗原反復(fù)刺激的緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎鼠中致病性自身抗體應(yīng)答的下調(diào) 這些實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明的方法和組合物的效果。特別地，它們證明了在用致腎炎抗原反復(fù)刺激的緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎鼠中，致病性自身抗體應(yīng)答的下調(diào)。
在3組鼠中，誘導(dǎo)稱為緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(SPHN)(參見上面實(shí)施例2)的自身免疫腎病，這通過反復(fù)SC注射小劑量的azo超高速離心的(u/c)鼠腎臟級分3(rKF3)制備物而進(jìn)行，所述制備物摻入到明礬和瘟熱復(fù)合體病毒疫苗中。出現(xiàn)的腎病表征為免疫復(fù)合物腎小球腎炎(ICGN)和緩慢進(jìn)行性蛋白尿。它由發(fā)展中的致病性自身抗體起始并維持，所述抗體針對存在于腎小球和鼠腎近曲小管的刷狀緣(BB)區(qū)域中的致腎炎抗原。為了使疾病更具進(jìn)行性，我們在首次注射之后24周以及最后一次注射致腎炎抗原后的14周，用含水a(chǎn)zo u/c rKF3制備物重新注射所有SPHN鼠三次。組II鼠接受產(chǎn)生疾病的注射物，不接受其他治療；組III動(dòng)物此外還用免疫復(fù)合物(ICs)進(jìn)行預(yù)先處理和后治療，免疫復(fù)合物由rKF3抗原和鼠抗-rKF3IgM抗體構(gòu)成，其中抗原過量，命名為“MICs”。組IV鼠在誘導(dǎo)疾病后7周注射MICs。
在那些用MICs注射的動(dòng)物中循環(huán)特異性IgM自身抗體的水平提高，致病性IgG自身抗體應(yīng)答減少。在MICs治療的動(dòng)物中，用含水a(chǎn)zo u/c rKF3抗原重新刺激之后，這種抗原特異性下調(diào)的效果依然通過升高的循環(huán)IgM自身抗原水平而被維持。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，MICs治療的組III和IV鼠的60％在它們的循環(huán)中沒有致病性IgG自身抗體，而在未治療的組II鼠中則全部都有。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在未治療的SPHN鼠中，循環(huán)致病性IgG自身抗體水平高，在用致腎炎抗原重新刺激后，在大部分鼠中變得更高一些。在這些動(dòng)物中，疾病進(jìn)行也更明顯。
這些實(shí)驗(yàn)證明，使用定制的(tailor made)MICs(本發(fā)明的示范性組合物)，通過抗原特異性治療方案，致病性IgG自身抗體誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腎病過程可以在疾病的早期和甚至慢性進(jìn)行性階段被下調(diào)。似乎是，通過除去或阻止致腎炎性抗原，發(fā)展的IgM自身抗體能夠防止產(chǎn)生IgG自身抗體的細(xì)胞系受刺激制備出更多導(dǎo)致疾病的致病性自身抗體。
動(dòng)物對獲自當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)場的兩個(gè)月大的雄性斯普拉道來氏鼠進(jìn)行隨機(jī)分配并編號，用于實(shí)驗(yàn)。所有侵入性程序在異氟烷麻醉的鼠上實(shí)施，在32周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過IP注射Euthanyl(MTC pharmaceuticals)(180mg/kg體重)，對鼠實(shí)施安樂死。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 組I.代謝對照10只鼠未注射、未治療，但是進(jìn)行蛋白尿研究，獲取血液樣品以獲得血清，也獲取腎樣品，以研究變化。
組II.緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎(SPHN)通過前述方法，10只鼠被反復(fù)SC注射0.2ml的azo-u/c rKF3抗原，該抗原摻入到明礬和瘟熱病毒疫苗中，參見上述實(shí)施例。在0天，注射含有160μg抗原的混合物；在10、20和35天，80μg；在42、49和55天，100μg含水a(chǎn)zo u/c rKF3抗原。
組III.SPHN預(yù)先處理且隨后治療10只鼠用MICs預(yù)先處理，描述如下。按照針對組II鼠所描述的方案誘導(dǎo)疾病之前的第-22、-18、-14、-8和-3天，動(dòng)物被IP注射MICs，MICs含有在0.2ml PBS中的60μg rKF3和150μg rarKF3IgM，誘導(dǎo)疾病之后則每周一次注射。
組IV.SPHN后期治療的鼠按照與針對組II鼠所描述的方案相同的方案，在10只鼠中誘導(dǎo)SPHN。在誘導(dǎo)疾病之后7周，鼠通過每周一次IP注射MICs進(jìn)行治療，MICs含有在0.2ml PBS中的60μg rKF3和150μgrarKF3IgM。
組II、III和IV中的鼠在22周用100μg含水a(chǎn)zo u/c超聲處理的rKF抗原重新刺激，以5天為間隔，共進(jìn)行3次。
azo u/c超聲處理的rKF3抗原的制備通過差異離心，在0.2M蔗糖pH 7.4中的均質(zhì)化的正常鼠腎用于制備rKF3。將rKF3制備物超聲處理并于100,000G超高速離心1小時(shí)，以獲得u/c超聲上清液制備物[B+C+D+C]。使用重氮鹽，在pH 8.4的0.1mol/L緩沖硼砂溶液中，將它進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得azo u/c超聲r(shí)KF3制備物。將azo-蛋白結(jié)合物的蛋白質(zhì)含量調(diào)節(jié)到4mg/ml。
鼠抗-rKF3 IgM的制備低水平的循環(huán)的天然發(fā)生的IgM自身抗體可以被刺激，以獲得針對腎近端小管的BB區(qū)域的更高水平的IgM自身抗體應(yīng)答。通過IP給予在PBS中的100μg rKF3抗原，我們每周一次注射成年Wistar鼠，注射4周。最后一次注射抗原之后4天，將鼠個(gè)體放血以獲得血清，并通過間接熒光抗體試驗(yàn)測試抗體活性，在正常鼠腎切片上測試針對BB相關(guān)抗原的鼠IgG和鼠IgM抗體活性。收集具有高IgM抗體滴度(1∶70-1∶180)的血清，等份分成幾份，保存在-35℃直到使用。如果需要，在重新刺激同樣的鼠后，獲取額外的rarKF3IgM抗體。
命名為MICs的rKF3 x rarKF3 IgM免疫復(fù)合物的制備每次制備用于10只鼠的新鮮MICs，描述如下向600μg rKF3，加入1500μg rarKF3 IgM(2000μgIgM/ml血清)，所述IgM對BB抗原具有1∶120的抗體活性，并用PBS補(bǔ)到2ml。將抗原微微過量的混合物在室溫中溫育并旋轉(zhuǎn)30分鐘，然后在合適的時(shí)間以0.2ml的量IP注射試驗(yàn)鼠。
尿蛋白評價(jià)從代謝籠中的鼠個(gè)體收集24小時(shí)的尿樣品。在開始研究之前通過每周一次的采樣獲得8份尿樣品，進(jìn)行分析以獲得基線值，研究開始之后每周一次收集樣品并進(jìn)行分析，以觀察治療和未治療之間的差異。使用SpectronicGenesis 5分光光度計(jì)，在540nm處，用0.5ml的尿樣品，測定尿蛋白值(參見上面描述)。
在腎皮質(zhì)樣品上進(jìn)行組織學(xué)、電鏡和直接熒光抗體試驗(yàn)將10％中性緩沖福爾馬林固定的腎皮質(zhì)樣品包埋在石蠟中，切割出3μm厚的切片，用蘇木素-伊紅和甲胺銀染料[B+L]染色。用Hitachi H600電子顯微鏡，電子顯微檢查已被適當(dāng)固定并染色的超薄腎皮質(zhì)樣品切片，如之前所述(B+C+B+L)。在第8周和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將來自鼠個(gè)體的、適當(dāng)處理的、3μm厚的新鮮腎皮質(zhì)樣品進(jìn)行染色，以查看鼠IgG和鼠IgM存在與否，染色用Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗-鼠IgG(H+L)和山羊抗-鼠IgM(μ鏈)(Molecular Probe)的合適稀釋物進(jìn)行。也針對C5b-9使用單克隆鼠抗-鼠C5b-9IgG抗體對腎切片染色，并用Alexa Fluor488高度吸附的山羊抗-鼠IgG[H+L](Molecular Probe)的合適稀釋物復(fù)染，這僅僅是在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(B+L+B+L)進(jìn)行。參見表4。
間接熒光抗體試驗(yàn)和對因在腎小球中沉積鼠IgG而引起的腎小球損傷進(jìn)行分級測定針對正常鼠腎小管成份的、鼠個(gè)體的血清樣品的鼠IgG和鼠IgM抗體的滴度，并用給出陽性結(jié)果的最末的血清稀釋度的倒數(shù)表示。按照0-4+等級，對腎小球定位的免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)的數(shù)量進(jìn)行分級，如之前所述(B+C+B+L)。也記錄到在腎小管基底膜、近端腎小管的刷狀緣區(qū)域和鮑曼氏囊中存在鼠IgG，并且類似地，在系膜和腎小球毛細(xì)血管中發(fā)現(xiàn)鼠IgM，記錄并進(jìn)行分級。
疾病的進(jìn)行(progression)通過計(jì)算和對G/M比率作圖，測定疾病的進(jìn)行。G/M比是用最高IgM自身抗體滴度的倒數(shù)除最高IgG身抗體滴度的倒數(shù)所產(chǎn)生的數(shù)，滴度在間接熒光抗體試驗(yàn)中獲得。產(chǎn)生疾病的IgG自身抗體為陰性的鼠的G/M比是0。對在第2、7、8、12、16、22、26、29和32周收集的鼠個(gè)體血清測定G/M比。確定在各組鼠內(nèi)的平均G/M比，也計(jì)算了在5只具有最低值的鼠中和5只具有最高值的鼠中的同樣的比率，并作圖。
蛋白尿在誘導(dǎo)腎病之前，分析從鼠個(gè)體獲得的8份周尿樣收集物，分析蛋白尿，建立代表性的基線值。然后在實(shí)驗(yàn)期間，代謝對照鼠提供持續(xù)的基線蛋白尿值。實(shí)驗(yàn)將要結(jié)束時(shí)，在該組鼠中，平均蛋白尿值微微增加，很可能是因?yàn)槟I功能發(fā)生與年齡相關(guān)的變化。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將未治療和治療鼠中的蛋白尿增加與代謝對照組鼠中獲得的蛋白尿值作比較。
組II的未被治療的SPHN動(dòng)物在誘導(dǎo)疾病13周后開始出現(xiàn)蛋白尿，到32周，100％的鼠患蛋白尿癥，蛋白尿平均為350mg/天。用MICs預(yù)先處理而后治療的攜帶SPHN的組III鼠也在誘導(dǎo)疾病13周后開始出現(xiàn)蛋白尿，到32周，50％的鼠患蛋白尿癥，蛋白尿平均為140mg/天。
用MICs進(jìn)行后期治療的攜帶SPHN的組IV鼠，正如組II和III鼠，在誘導(dǎo)疾病13周后開始出現(xiàn)蛋白尿，到32周，80％的鼠患蛋白尿癥，蛋白尿平均為220mg/天。
在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與對代謝對照組相比，組II鼠多10倍，組III鼠多4倍，組IV鼠多6倍的蛋白尿。
光學(xué)顯微術(shù)在H&E和甲胺銀染色的切片上，代謝對照鼠的腎切片沒有顯示形態(tài)學(xué)上的變化。攜帶SPHN的組II鼠的H&E染色的腎切片顯示出增加的腎小球細(xì)胞構(gòu)成，通過甲胺銀染料，顯示出顯著的系膜區(qū)域以及增厚的腎小球毛細(xì)血管，在它們的外周圍上具有銀陽性突起(projections)。用MICs預(yù)先處理而后治療的組III SPHN鼠顯示出與組II鼠類似但是較不顯著的腎損傷；蛋白尿值低于100mg/天的動(dòng)物顯示出均勻的薄的腎小球毛細(xì)血管環(huán)，在它們的外周圍具有偶爾的銀陽性突起。用MICs后期治療的組IV SPHN鼠顯示出組II和III鼠中觀察到的腎損傷之間的腎損傷。
電鏡代謝鼠腎切片沒有顯示超結(jié)構(gòu)異常。攜帶SPHN的組II鼠的超薄腎皮質(zhì)切片顯示出典型的HN腎損傷。在不規(guī)則增厚的GBM的上皮方向有大大小小的嗜鋨沉積物，它們部分地或完全地被BM樣物質(zhì)包圍。足突發(fā)生與沉積物相關(guān)的融合，上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)顯示出嗜鋨區(qū)域，特別是靠近沉積物區(qū)域。用MICs預(yù)先處理而后治療的組III SPHN鼠顯示溫和形式的HN。主要地，小的嗜鋨沉積物存在于GBM的上皮側(cè)。GBM突起在許多區(qū)域是明顯的，但是因突起而引起的GBM增厚并沒有產(chǎn)生多層沉積陷套(trapping of deposits)，而這種情況則在組II鼠的腎切片上被發(fā)現(xiàn)。足突發(fā)生與沉積物相關(guān)的融合，上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)顯示出嗜鋨區(qū)域，與沉積物相對。用MICs后期治療的組IV SPHN鼠顯示一定范圍的典型HN-腎損傷。高蛋白尿的鼠顯示出在它們的GBMs上具有更多的沉積物，帶有額外的典型變化，而低蛋白尿的鼠在它們的GBMs上具有較少的沉積物，如同組III鼠。
直接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果在誘導(dǎo)疾病之后8周，在組II鼠的腎切片上觀察到，在腎小球毛細(xì)血管環(huán)的周圍的彌漫性珠狀鼠IgG染色沉積，具有強(qiáng)烈的熒光。此外，在7只鼠的腎切片上記錄到，鼠IgG存在于一種或所有下列結(jié)構(gòu)中BB、TBM和BC。組III和IV中預(yù)治療和后治療的鼠具有更低等級的腎小球損傷，更少的切片有BB、TBM和BC染色。代謝鼠的腎切片沒有出現(xiàn)針對鼠IgG的染色。在所有組鼠中，包括代謝對照組的鼠，鼠腎切片的系膜區(qū)域?qū)κ驣gM有染色，具有類似的熒光強(qiáng)度和等級。
在32周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，針對鼠IgG被ICs染色的腎小球沉積物在組II SPHN鼠中最為嚴(yán)重。最溫和的腎小球損傷依然在用MICs治療的組III和IV鼠中觀察到。在這些動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)較低等級的腎小球損傷，極少的鼠腎切片BB、TBM或BC染色。在組I和II鼠的腎中，鼠IgM的系膜沉積與在第8周時(shí)相同，但是在治療組III和IV鼠中，大大減少。無論它們屬于何組，在大部分鼠腎小球的腎小球毛細(xì)血管周圍都觀察到微弱的珠狀鼠IgM沉積物。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，也對腎切片染色，以查看C5b-9存在與否。未治療組II鼠的腎小球毛細(xì)血管有針對C5b-9的強(qiáng)烈染色，成珠狀圖案，而大部分組III和IV鼠的腎小球染色為微弱的珠狀熒光圖案。
間接熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果SPHN的進(jìn)行由循環(huán)中的致病性自身抗體維持。因此，周期性評價(jià)循環(huán)致病性和非致病性自身抗體能夠給我們一個(gè)良好的主意，其相位(向下或向上的趨勢)提示了未治療和治療的鼠的疾病進(jìn)行情況。
組I.在實(shí)驗(yàn)期間，代謝對照鼠在它們的循環(huán)中具有低水平的天然發(fā)生的IgM自身抗體，所述抗體針對近曲小管的腎小管BB區(qū)域。
在組II SPHN未治療鼠中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，甚至在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，平均循環(huán)IgG自身抗體水平高。IgM自身抗體水平低于IgG自身抗體水平，但稍微高于正常值。5只具有低G/M比的鼠具有較低的IgG自身抗體和較高的IgM自身抗體應(yīng)答，表明至少在一些鼠中，出現(xiàn)了自然發(fā)生的下調(diào)趨勢，其目標(biāo)是終止疾病過程。然而，5只具有高G/M比的鼠，具有持續(xù)高的致病性自身抗體應(yīng)答，沒有顯示出消除的跡象。
在22周，間隔5天，3次注射含水a(chǎn)zo rKF3抗原，超過70％的鼠立即增加致病性自身抗體應(yīng)答，該增加的應(yīng)答在32周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在約60％的鼠中依然明顯。
在組III用MICs預(yù)先處理而后治療的SPHN鼠中，到第2、7和8周，最初的致病性自身抗體應(yīng)答是高的，盡管事實(shí)上，比組II動(dòng)物低約3x，然后到12周時(shí)，低7x，16周時(shí)，低8x。后來，甚至在22周反復(fù)注射含水a(chǎn)zo-rKF3抗原后，致病性自身抗體的水平在每只鼠的血清中也是低的，這表明，在低和高G/M比的鼠中，對注射的MICs都具有良好的應(yīng)答。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在第7個(gè)月90％的鼠具有可忽略的低水平的循環(huán)IgG自身抗體；在第8個(gè)月，為70％的鼠。到7個(gè)月為止有5只鼠，到8個(gè)月為止有6只鼠在它們的循環(huán)中沒有致病性自身抗體。這些結(jié)果顯示，增加水平的特異性IgM自身抗體能夠有效地將改變的自身抗原清出循環(huán)。該效果得到22周后的結(jié)果充分證明，即，當(dāng)反復(fù)注射含水a(chǎn)zo-rKF3抗原時(shí)，致病性自身抗體的增加僅僅是可忽略的水平，且僅僅持續(xù)一小段時(shí)間，之后甚至在6只鼠中減少為0。
在組IV用MICs后期治療的SPHN鼠中，在第7和8周時(shí)，最初的致病性自身抗體應(yīng)答相當(dāng)高，之后它開始急劇下降，相應(yīng)地，循環(huán)中IgM自身抗體的存在量增加。平均說來，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，致病性IgG自身抗體水平是低的。在32周，在它們的血清中，90％的鼠具有可忽略的低水平的IgG自身抗體，60％的鼠沒有IgG自身抗體。在第22周，用含水a(chǎn)zo-rKF3抗原反復(fù)刺激組IV鼠，只是臨時(shí)性地增加IgG抗體應(yīng)答，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，6只鼠在它們的循環(huán)中沒有任何致病性自身抗體。這些結(jié)果顯示，在發(fā)展的自身免疫疾病期間，通過免疫調(diào)節(jié)可以有效地控制由修飾的自身抗原驅(qū)動(dòng)的致病性自身抗體應(yīng)答。
治療的和未治療的鼠中的自身免疫疾病過程的總體進(jìn)展自身免疫疾病過程的總體進(jìn)展顯示在圖X中。對于組II未治療的鼠和用MICs治療的組III和IV鼠，根據(jù)G/M比率的組合結(jié)果進(jìn)行作圖。相比起未治療的組II鼠的疾病發(fā)展，組III中用MICs預(yù)先處理而后治療的鼠，具有最少的自身免疫疾病發(fā)展，從第7周起，治療的動(dòng)物具有大大減弱的疾病發(fā)展。觀察疾病在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的總體進(jìn)展，組III鼠比組II鼠好11倍，組IV鼠比II鼠好2.5倍。似乎，在組III動(dòng)物中，在頭8周的時(shí)間，由MICs引起的致病性自身抗體應(yīng)答下調(diào)的效果不如疾病晚期的效果好。然而，到12周，對MIC治療的下調(diào)性應(yīng)答在組III和IV動(dòng)物中都是效果最明顯的。在22周用含水a(chǎn)zo rKF3抗原重新刺激，組II鼠以明顯而持續(xù)地產(chǎn)生致病性自身抗體作出應(yīng)答，而組III和IV鼠卻沒有，這表明MICs產(chǎn)生良好的下調(diào)性效果。在32周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在組II鼠中，平均G/M比是8，表明進(jìn)行性自身免疫疾病在繼續(xù)，而在組III和IV鼠中，平均G/M比分別是0.12和0.375，說明了致病性自身抗體應(yīng)答的下調(diào)。
討論這些實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法和組合物可以用于改善自身免疫疾病。本發(fā)明的組合物包括抗原微微超量的ICs。在上述實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的示范性的組合物包含致腎炎抗原和針對該抗原的同源IgM抗體。注射這些ICs(命名為MICs)，通過特異性地刺激CD5+B細(xì)胞系，增加了循環(huán)IgM自身抗體的水平。水平增加的IgM自身抗體能夠除去循環(huán)的化學(xué)改變的和由腎近曲小管釋放的未改變的致腎炎自身抗原，從而預(yù)防兩大主要事件的持續(xù)發(fā)生，而所述兩種事件的持續(xù)則是自身免疫疾病的慢性發(fā)展的重要促進(jìn)因素。首先，本發(fā)明的方法和組合物有助于除去改變的自身抗原，從而防止致病性IgG自身抗體的產(chǎn)生，其次，本發(fā)明的方法和組合物有助于除去從近曲小管釋放的未改變的致腎炎自身抗原，并防止這種自身抗原在腎小球中的進(jìn)一步固定和沉積，從而釋放IgG自身抗體位點(diǎn)。
這些實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法和組合物有效地、抗原特異性地下調(diào)致病性自身抗體應(yīng)答。本發(fā)明的方法和組合物包括新的疫苗接種技術(shù)，該技術(shù)通過給予本發(fā)明的組合物(例如，通過注射的MICs)，利用抗體信息轉(zhuǎn)移，來治療大量的人類自身免疫疾病。本發(fā)明的治療方案能夠特異性地提高循環(huán)中的天然發(fā)生的IgM自身抗體的水平，能夠終止致病性自身抗體應(yīng)答——甚至在自身免疫疾病的急性或慢性階段，而不引起副作用。
表4顯示了，在8和32周通過直接熒光抗體試驗(yàn)對鼠IgG和鼠IgM染色的腎活檢。給出了各個(gè)組的平均值。SPHN未治療的鼠(組II)和接受不同治療的鼠(組III和IV)的熒光強(qiáng)度和腎小球損傷等級被示出。代謝對照(組I)也被分級。每組有10只鼠。
本發(fā)明的許多實(shí)施方案已被描述。盡管如此，應(yīng)該理解可以進(jìn)行各種修改，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其他實(shí)施方案也在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
表4

縮寫B(tài)B刷狀緣；BC鮑曼氏囊；MICs免疫復(fù)合物M；SPHN緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎；TBM腎小管基底膜；*這些結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)有染色的鼠腎數(shù)；+腎小球損傷等級在2以下的鼠腎數(shù)(在括號中)。
權(quán)利要求
1.增加哺乳動(dòng)物中自身抗原特異性IgM抗體的水平的方法，包括下述步驟(a)提供包含未修飾的自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于所述組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原特異性IgM抗體的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物以所述組合物。
2.降低哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平的方法，包括下述步驟(a)提供包含未修飾的自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于所述組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原特異性IgM抗體的水平，進(jìn)而降低所述哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物以所述組合物。
3.改善哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的方法，包括下述步驟(a)提供包含未修飾的自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于所述組合物中；和(b)以足以降低所述哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平，進(jìn)而改善所述哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的量給予所述哺乳動(dòng)物以所述組合物。
4.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
5.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述多價(jià)抗體包括IgM。
6.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述多價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。
7.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述多價(jià)抗體包括人源化的抗體。
8.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述多價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因鼠中產(chǎn)生的人抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
10.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在制備包含所述自身抗原和所述抗原特異性多價(jià)抗體的組合物時(shí)，在給藥之前即刻將所述未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
11.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在制備包含所述自身抗原和所述抗原特異性多價(jià)抗體的組合物時(shí)，在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)之間，將所述未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，在給藥之前約5分鐘至1小時(shí)之間，將所述自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，在給藥之前約10分鐘至30分鐘之間，所述自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
14.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在制備包含所述自身抗原和所述抗原特異性多價(jià)抗體的組合物時(shí)，將所述未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合，并將所述混合物冷凍干燥。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，在給藥時(shí)，將所述冷凍干燥的混合物重構(gòu)成制劑以用于給藥。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述冷凍干燥的混合物保存在約-20℃至4℃之間的溫度中。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述冷凍干燥的混合物重構(gòu)成含水制劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述含水制劑包括無菌蒸餾水或緩沖鹽水。
19.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括純化的自身抗原。
20.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括重組或合成的多肽。
21.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括可溶性抗原。
22.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括顆粒性抗原。
23.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括小分子量抗原。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述抗原的分子量在約0.1至10kd或約0.5至5kd之間。
25.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括大分子量抗原。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗原的分子量在約5至50kd或約10至25kd之間。
27.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的自身抗原。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述自身抗原包括腎小管致腎炎抗原、腎小球致腎炎抗原、子宮內(nèi)膜repro-EN-1.0抗原、子宮內(nèi)膜IB1抗原、谷氨酸脫羧酶、核仁ASE-1抗原、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、轉(zhuǎn)醛縮酶、髓鞘堿性蛋白、70kD線粒體膽汁自身抗原、人軟骨糖蛋白39、人Sp17蛋白、人胎盤Hp-8。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括多種參與自身免疫應(yīng)答的自身抗原。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞或組織勻漿或者細(xì)胞、組織或器官提取物。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官包括腎近端小管或腎近曲小管或其亞細(xì)胞組分。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述自身免疫應(yīng)答包括對腎小球基底膜自身抗原或腎近曲小管抗原的自身免疫應(yīng)答。
34.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括自身免疫腎病。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述自身免疫腎病包括被動(dòng)海曼氏腎炎、狼瘡性腎炎或膜性腎病。
36.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫胰島素依賴性糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、自身免疫甲狀旁腺功能減退癥、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變癥、自身免疫溶血性貧血癥、接觸敏感性皮炎、自身免疫發(fā)泡性紊亂、尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、大皰性類天皰瘡、自身免疫不孕癥、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病。
37.如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，按摩爾計(jì)算，存在于所述組合物中的所述自身抗原比所述多價(jià)抗體多約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
38.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述組合物通過腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。
39.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述組合物一天一次、一天兩次、或一天三次給藥。
40.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述組合物一周約一次至兩次給藥。
41.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述組合物先一周兩次給藥，給藥約3周，然后每周一次給藥，給藥約5個(gè)月，然后每月一次給藥。
42.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述組合物包括無菌含水制劑。
43.藥物組合物，包含(i)未修飾的自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體，其中所述多價(jià)抗體對所述自身抗原具有特異性，并且所述多價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述自身抗原以超過所述多價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于組合物中；和(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述多價(jià)抗體包括IgM。
45.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述多價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。
46.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述多價(jià)抗體包括人源化的抗體。
47.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述多價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因鼠中產(chǎn)生的人抗體。
48.如權(quán)利要求47所述的藥物組合物，其中所述轉(zhuǎn)基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
49.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中在制備包含自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物中，在給藥之前片刻，所述未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
50.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中在制備包含自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物中，在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)之間，所述未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
51.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中，在給藥之前約5分鐘至1小時(shí)之間，所述自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
52.如權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其中，在給藥之前約10分鐘至30分鐘之間，所述自身抗原與所述多價(jià)抗體混合。
53.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中在制備包含自身抗原和抗原特異性多價(jià)抗體的組合物中，所述未修飾的自身抗原與所述多價(jià)抗體混合，并且所述混合物被冷凍干燥。
54.如權(quán)利要求53所述的藥物組合物，其中在給藥時(shí)，所述冷凍干燥的混合物被重構(gòu)成制劑，以用于給藥。
55.如權(quán)利要求53所述的藥物組合物，其中，所述冷凍干燥的混合物保存在約-20℃至4℃之間的溫度中。
56.如權(quán)利要求53所述的藥物組合物，其中，所述冷凍干燥的混合物被重構(gòu)成含水制劑中。
57.如權(quán)利要求56所述的藥物組合物，其中，所述含水制劑包括無菌蒸餾水或緩沖鹽水。
58.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括純化的自身抗原。
59.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括重組或合成的多肽。
60.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括可溶性抗原。
61.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括顆粒性抗原。
62.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括小分子量抗原。
63.如權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中所述抗原的分子量在約0.1至10kd或約0.5至5kd之間。
64.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括大分子量抗原。
65.如權(quán)利要求64所述的藥物組合物，其中所述抗原的分子量在約5至50kd或約10至25kd之間。
66.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的自身抗原。
67.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括腎小球基底膜自身抗原、腎小管致腎炎抗原、腎小球致腎炎抗原、子宮內(nèi)膜repro-EN-1.0抗原、子宮內(nèi)膜IB1抗原、谷氨酸脫羧酶、核仁ASE-1抗原、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、轉(zhuǎn)醛縮酶、髓鞘堿性蛋白、70kD線粒體膽汁自身抗原、人軟骨糖蛋白39、人Sp17蛋白、人胎盤Hp-8。
68.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，進(jìn)一步包括多種參與自身免疫應(yīng)答的自身抗原。
69.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述自身抗原包括參與自身免疫應(yīng)答的亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官。
70.如權(quán)利要求69所述的藥物組合物，其中所述細(xì)胞或所述組織包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞或組織勻漿或者細(xì)胞、組織或器官提取物。
71.如權(quán)利要求70所述的藥物組合物，其中所述亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官包括腎近端小管或腎近曲小管或其亞細(xì)胞組分。
72.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述自身免疫應(yīng)答包括對腎小球基底膜自身抗原或腎近曲小管抗原的自身免疫應(yīng)答。
73.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述自身免疫應(yīng)答包括自身免疫腎病。
74.如權(quán)利要求73所述的藥物組合物，其中所述自身免疫腎病包括被動(dòng)海曼腎炎、狼瘡性腎炎或膜性腎病。
75.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述自身免疫應(yīng)答包括自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫胰島素依賴性糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、自身免疫甲狀旁腺功能減退癥、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變癥、自身免疫溶血性貧血癥、接觸敏感性皮炎、自身免疫發(fā)泡性紊亂、尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、大皰性類天皰瘡、自身免疫不孕癥、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病。
76.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中，按摩爾計(jì)算，存在于所述組合物中的自身抗原比多價(jià)抗體多約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
77.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制成腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。
78.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中，所述組合物一天一次、一天兩次、或一天三次給藥。
79.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述組合物一周約一次至兩次給藥。
80.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中，所述組合物先一周兩次給藥，約3周，然后每周一次給藥，約5個(gè)月，然后每月一次給藥。
81.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制成無菌液體制劑。
82.增加哺乳動(dòng)物中抗原特異性IgG抗體的水平的方法，包括下述步驟(a)提供包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物，其中所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于所述組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原特異性IgG抗體的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物以所述組合物。
83.降低哺乳動(dòng)物中循環(huán)抗原的水平的方法，包括下述步驟(a)提供包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物，其中所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于所述組合物中；和(b)以足以增加個(gè)體中抗原特異性IgG抗體的水平，進(jìn)而降低所述哺乳動(dòng)物中循環(huán)抗原的水平的量給予所述哺乳動(dòng)物以所述組合物。
84.改善哺乳動(dòng)物的疾病或狀態(tài)的方法，包括下述步驟(a)提供包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物，其中所述抗原與所述疾病或狀態(tài)有關(guān)，所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對所述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾數(shù)存在于所述組合物中；和(b)以足以增加哺乳動(dòng)物中抗原特異性二價(jià)抗體的水平，進(jìn)而改善所述哺乳動(dòng)物疾病或狀態(tài)的量給予所述哺乳動(dòng)物以所述組合物。
85.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
86.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述二價(jià)抗體包括IgG。
87.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述二價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。
88.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述二價(jià)抗體包括人源化的抗體。
89.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述二價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因鼠中產(chǎn)生的人抗體。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
91.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在制備包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物時(shí)，在給藥之前的片刻，將所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合。
92.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在制備包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物時(shí)，在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)之間，將所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，在給藥之前約10分鐘至1小時(shí)之間，將所述抗原與所述二價(jià)抗體混合。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其中，在給藥之前約30分鐘至1小時(shí)之間，將所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體所述混合。
95.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在制備包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物時(shí)，將所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合，并且將所述混合物冷凍干燥。
96.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，在給藥時(shí)，將所述冷凍干燥的混合物重構(gòu)成制劑，以用于給藥。
97.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述冷凍干燥的混合物保存在約-20℃至4℃之間的溫度中。
98.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述冷凍干燥的混合物被重構(gòu)成含水制劑。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中，所述含水制劑包括無菌蒸餾水或緩沖鹽水。
100.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括純化的抗原。
101.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括重組或合成的多肽。
102.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括可溶性抗原。
103.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括顆粒性抗原。
104.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括小分子量抗原。
105.如權(quán)利要求104所述的方法，其中所述抗原的分子量在約0.1至10kd或約0.5至5kd之間。
106.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括大分子量抗原。
107.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原的分子量在約5至50kd或約10至25kd之間。
108.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括癌癥特異性抗原或?qū)υ錾?xì)胞或組織具有特異性的抗原。
109.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括外來抗原。
110.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述外來抗原包括細(xì)菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、酵母抗原或原生動(dòng)物抗原。
111.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官。
112.如權(quán)利要求111所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞或組織勻漿或者細(xì)胞、組織或器官提取物。
113.如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述癌癥是黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肝癌、乳癌、肺癌或胃癌。
114.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述外來抗原包括來自病原體或感染性疾病媒介物的抗原。
115.如權(quán)利要求114所述的方法，其中所述來自病原體或感染性疾病媒介物的抗原包括細(xì)菌抗原、病毒抗原或來自原生動(dòng)物的抗原。
116.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述病原體或感染性疾病媒介物包括葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、流感病毒、肝炎A、B或C或瘧疾。
117.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，按摩爾計(jì)算，存在于所述組合物中的所述修飾的抗原比所述二價(jià)抗體多約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
118.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含約0.1mg至10mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，維持所述抗原的摩爾數(shù)超過所述二價(jià)抗體。
119.如權(quán)利要求118所述的方法，其中所述組合物包含約0.1mg至1.0mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，維持所述抗原的摩爾數(shù)超過所述二價(jià)抗體。
120.如權(quán)利要求119所述的方法，其中所述組合物包括約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，維持所述抗原的摩爾數(shù)超過所述二價(jià)抗體。
121.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物通過腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。
122.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述組合物一天一次、一天兩次、或一天三次給藥。
123.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物一周約一次至兩次給藥。
124.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物先一周兩次給藥，約3周，然后每周一次給藥，約5個(gè)月，然后每月一次給藥。
125.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包括無菌含水制劑。
126.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物與佐劑一起給藥。
127.如權(quán)利要求所述的方法126，所述佐劑包括明礬或弗氏佐劑。
128.如權(quán)利要求82至84中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原用半抗原修飾。
129.如權(quán)利要求128所述的方法，其中所述半抗原修飾的抗原包括半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
130.如權(quán)利要求129所述的方法，其中所述半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物包括對氨基苯基砷酸-蛋白質(zhì)、對氨基苯磺胺-蛋白質(zhì)、或?qū)Π被交樗?對氨基苯磺胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
131.藥物組合物，包含(i)修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體，其中所述二價(jià)抗體對所述抗原具有特異性，并且所述二價(jià)抗體對述哺乳動(dòng)物是天然的或?qū)λ霾溉閯?dòng)物無免疫原性，所述修飾的抗原以超過所述二價(jià)抗體的摩爾量存在于組合物中；和(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
132.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述二價(jià)抗體包括IgG。
133.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述二價(jià)抗體包括分離的抗體、合成產(chǎn)生的抗體、或重組產(chǎn)生的抗體。
134.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述二價(jià)抗體包括人源化的抗體。
135.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述二價(jià)抗體包括在轉(zhuǎn)基因鼠中產(chǎn)生的人抗體。
136.如權(quán)利要求135所述的藥物組合物，其中所述轉(zhuǎn)基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
137.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中在制備包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物中，在給藥之前的片刻，所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合。
138.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中在制備包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物中，在給藥之前約1分鐘至2小時(shí)之間，所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合。
139.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中在給藥之前約10分鐘至1小時(shí)之間，所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合。
140.如權(quán)利要求139所述的藥物組合物，其中，在給藥之前約30分鐘至1小時(shí)之間，將所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合。
141.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中在制備包含修飾的抗原和抗原特異性二價(jià)抗體的組合物中，所述修飾的抗原與所述二價(jià)抗體混合，并且所述混合物被冷凍干燥。
142.如權(quán)利要求141所述的藥物組合物，其中，在給藥時(shí)，所述冷凍干燥的混合物被重構(gòu)成制劑，以用于給藥。
143.如權(quán)利要求141所述的藥物組合物，其中，所述冷凍干燥的混合物保存在約-20℃至4℃的溫度中。
144.如權(quán)利要求141所述的藥物組合物，其中，所述冷凍干燥的混合物被重構(gòu)成含水制劑。
145.如權(quán)利要求144所述的藥物組合物，其中，所述含水制劑包括無菌蒸餾水或緩沖鹽水。
146.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括純化的抗原。
147.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括重組或合成的多肽。
148.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括可溶性抗原。
149.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括顆粒性抗原。
150.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括小分子量抗原。
151.如權(quán)利要求150所述的藥物組合物，其中所述抗原的分子量在約0.1至10kd或約0.5至5kd之間。
152.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括大分子量抗原。
153.如權(quán)利要求152所述的藥物組合物，其中所述抗原的分子量在約5至50kd或約10至25kd之間。
154.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括癌癥特異性抗原或?qū)υ錾?xì)胞或組織具有特異性的抗原。
155.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括外來抗原。
156.如權(quán)利要求155所述的藥物組合物，其中所述外來抗原包括細(xì)菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、酵母抗原或原生動(dòng)物抗原。
157.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞、組織或器官。
158.如權(quán)利要求157所述的藥物組合物，其中所述細(xì)胞或組織包括亞細(xì)胞組分、細(xì)胞或組織勻漿或者細(xì)胞、組織或器官提取物。
159.如權(quán)利要求154所述的藥物組合物，其中所述癌癥是黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肝癌、乳癌、肺癌或胃癌。
160.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述外來抗原包括來自病原體或感染性疾病媒介物的抗原。
161.如權(quán)利要求160所述的藥物組合物，其中所述來自病原體或感染性疾病媒介物的抗原包括細(xì)菌抗原、病毒抗原或來自原生動(dòng)物的抗原。
162.如權(quán)利要求160所述的藥物組合物，其中所述病原體或感染性疾病媒介物包括葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、流感病毒、肝炎A、B或C或瘧疾。
163.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中，按摩爾計(jì)算，存在于所述組合物中的所述修飾的抗原比所述二價(jià)抗體多約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
164.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述組合物包括約0.1mg至10mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，維持所述抗原的摩爾數(shù)超過所述二價(jià)抗體。
165.如權(quán)利要求164所述的藥物組合物，其中所述組合物包括約0.1mg至1.0mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，維持所述抗原的摩爾數(shù)超過所述二價(jià)抗體。
166.如權(quán)利要求165所述的藥物組合物，其中所述組合物包括約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合適數(shù)量的二價(jià)抗體，維持所述抗原的摩爾數(shù)超過所述二價(jià)抗體。
167.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制成通過腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)或眼睛途徑給藥。
168.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制成無菌液體制劑。
169.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述組合物與佐劑一起給藥。
170.如權(quán)利要求169所述的藥物組合物，其中，所述佐劑包括明礬或弗氏佐劑。
171.如權(quán)利要求131所述的藥物組合物，其中所述抗原用半抗原修飾。
172.如權(quán)利要求171所述的藥物組合物，其中所述半抗原修飾的抗原包括半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
173.如權(quán)利要求172所述的藥物組合物，其中所述半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物包括對氨基苯基砷酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、對氨基苯磺胺-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、或?qū)Π被交樗?對氨基苯磺胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物中自身抗原特異性IgM抗體的水平，并因此減少哺乳動(dòng)物中循環(huán)自身抗原的水平的組合物和方法。使用這些自身抗原特異性IgM抗體，本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物自身免疫性疾病的組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物中抗原特異性IgG抗體的水平，并因此減少哺乳動(dòng)物中循環(huán)抗原的水平的組合物和方法。通過使用這些抗原特異性IgG抗體，本發(fā)明提供了改善哺乳動(dòng)物疾病和狀況例如癌癥或外來抗原諸如病原體的組合物和方法。
文檔編號A61P37/00GK1863555SQ200480025721
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月15日
發(fā)明者A·Z·巴拉巴什 申請人:卡爾加里大學(xué)理事會