專利名稱：絲素蛋白多孔管的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為制備具有良好生物相容性的絲素蛋白多孔管的新方法，涉及生物 材料領(lǐng)域，具體涉及到組織工程支架領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，動脈硬化等血管閉塞性疾病的發(fā)病日漸增多，需要進行血管移 植手術(shù)的病人也越來越多。由于異體血管的排異反應(yīng)以及自體血管的有限性，移植手術(shù)所用的血管多來源于人造血管。目前，直徑大于6毫米，特別是大于 10毫米的人造血管已經(jīng)實現(xiàn)了商品化，而小于6毫米的小口徑血管則成為一 個國際性難題，其主要原因在于血栓的形成和新生內(nèi)膜的增厚，導(dǎo)致血管堵塞， 而使移植失敗。在中小直徑的人造血管中，過去多使用ePTFE(膨化聚四氟乙 烯)和Dacron(滌綸)，但其血管順應(yīng)性較差，臨床資料表明ePTFE人造血管通 暢率僅為30%。1987年美國自然科學(xué)基金工程理事會在生物工程研討會上提出了組織工 程概念，為小口徑血管的制備提供了一個新的思路，即"應(yīng)用工程學(xué)和生命學(xué) 的原理和方法來了解正常的和病理的哺乳類動物的組織結(jié)構(gòu)一功能的關(guān)系，并 研制生物組織代用品，用于修復(fù)、維持和改善人體組織的功能"。對于血管來 說，由于合成材料在體內(nèi)長期使用會對人體帶來負面影響，制備一種能修復(fù)和 替代原有的小口徑血管顯得尤為必要。組織工程的基本原理和方法是，將體外 培養(yǎng)的高濃度組織細胞擴增后吸附于一種生物相容性良好，并可被人體逐步降 解吸收的細胞外基質(zhì)(ECM)材料上，形成細胞-生物材料復(fù)合物。該材料可為細 胞提供生存的三維空間，有利于細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進行新陳代謝，使 細胞按預(yù)制形態(tài)的三維支架生長；然后將這種復(fù)合體植入機體所需部位。種植 的細胞在生物支架降解吸收過程中，繼續(xù)增生繁殖，形成了新的具有原來特殊 功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官，從而可達到修復(fù)組織外形和功能重建的目的。 理想的組織工程支架材料或細胞載體應(yīng)具有以下條件①良好的生物相容性； ②適宜的生物降解性；③有效的表面活性；④一定的可塑性；⑤具有三維多孔
結(jié)構(gòu)。組織在體內(nèi)常為三維空間構(gòu)型，給細胞的生長提供了適宜的營養(yǎng)條件和 空間條件，有利于組織發(fā)揮特定的生理功能。因此，植入物的設(shè)計應(yīng)主要考慮 載體材料的空間構(gòu)型，如孔的尺寸、孔之間的連通性、材料內(nèi)部的表面積等。 開孔材料表面可以比普通的材料表面更有利于細胞偽足的攀附，增加細胞層與 基底材料之間的物理作用力?；撞牧仙系拈_孔有利于水分、無機鹽以及其它 營養(yǎng)物質(zhì)和細胞代謝產(chǎn)物的運輸和交換，從而更有利于細胞的正常生長和生理 代謝。為了進行多層細胞的體外培養(yǎng)，如何制備三維多孔結(jié)構(gòu)的細胞載體材料 已成為材料科學(xué)研究的熱點。目前，應(yīng)用在組織工程中的主要結(jié)構(gòu)形式有纖維 支架和多孔泡沫兩種。組織工程支架的制備方法主要有纖維編織法，鹽析法，氣體發(fā)泡法，熔融 成型法，相分離法、冷凍干燥技術(shù)以及靜電紡絲等方法。對于血管組織工程支 架來說，不僅需要材料具備良好的生物相容性，實際應(yīng)用中還需要將支架制備 成呈三維管材。目前，制備多孔管狀支架的方法多為編織法，低溫擠出成形， 多孔膜繞成圓柱狀后噴涂聚合物溶液，模具中冷凍干燥成型。靜電紡絲作為一 種制備多孔材料有其獨特的優(yōu)點，其過程是溶液在電場力的作用下分化成納 米到微米級的纖維，溶劑在到達接收裝置的過程中揮發(fā)掉，所得到的纖維在接 收裝置表面相互搭接而成多孔材料。近來，用靜電紡絲的方法制備基因重組蜘 蛛絲蛋白管狀支架己有報道。絲素蛋白作為天然生物蛋白，以其優(yōu)異的生物相容性，低炎癥反應(yīng)性和良 好的力學(xué)性能，受到生物材料界廣泛的研究。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，絲素作為手術(shù) 縫合線己有幾百年的歷史，在人造皮膚，人造韌帶，人造骨，人造血管，藥物 緩釋材料以及酶固定化材料方面已取得了一系列的基礎(chǔ)研究成果，顯示了巨大 的應(yīng)用潛力。由于絲素蛋白支鏈有細胞生長和黏附因素，且可以通過再生制得 納米級到微米級的蛋白纖維，與體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)相似，因此在組織工程領(lǐng)域也得 到廣泛的研究。絲素蛋白不僅擁有優(yōu)異的生物相容性，而且價廉易得，使得絲素蛋白受到 更為廣泛的關(guān)注，更利于商業(yè)化生產(chǎn)。絲素蛋白通過各種不同的方法，包括靜 電紡絲，冷凍干燥，鹽析法等制備成多孔支架，但是絲素蛋白多孔管的制備尚 沒有報道。由于絲素蛋白的特殊理化性質(zhì)，通過模具難以制備出均勻的管材。 而絲素蛋白的靜電紡絲已經(jīng)研究的比較全面，而且研究證明由靜電紡絲法制備
的絲素蛋白無紡布適于細胞生長繁殖。本文通過直接用靜電紡絲的方法將絲素水溶液制備成多孔管。這種方法綜 合了絲素水溶液紡絲的優(yōu)點以及避免了由膜制管過程中交聯(lián)劑的使用，使制備過程簡單易行。制備出的絲素管管徑可控，兼有良好的生物相容性及多孔性利 于細胞生長，有望用于組織工程血管支架。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了制備絲素蛋白多孔管支架，以利用絲素蛋白良好的生 物相容性，以及電紡絲纖維所具有的高比表面積，從而開發(fā)絲素蛋白多孔管在 組織工程支架領(lǐng)域的應(yīng)用，包括血管組織工程支架、氣管組織工程支架、尿道 組織工程支架及其他管狀支架。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的制備高濃度的絲素蛋白水溶液同專利"不溶性絲素蛋白薄膜及絲素蛋白管的制備"(專利號為03131142.3)，即白廠絲經(jīng)脫膠、溶解、透析、抽濾、濃 縮得到濃度為30%-50% (w/w)的絲素蛋白水溶液。本發(fā)明將30%-50%&/%)高濃度的絲素蛋白水溶液置于容器中，溶液在 電壓為500V-60kV的靜電力作用下，形成直徑為200nm-3000nm的絲素蛋白纖 維，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒或管接收絲纖維，接收距離為5-100cm， 5-480min后就能 在金屬棒上得到管徑為l-10mm、壁厚為0. Ol-lmm、長度不低于30cm的絲素多 孔管，然后用90X — 100X(v/v)甲醇水溶液處理使其變性，經(jīng)常溫真空干燥 后得到非水溶性的絲素蛋白多孔管。所使用的金屬棒或管的直徑及長度根據(jù)需 要可調(diào)。所制備的絲素蛋白多孔管用于組織工程支架，包括血管組織工程支架、 氣管組織工程支架、尿道組織工程支架及其他管狀支架。制備出的絲素蛋白多孔管取其中的樣品用掃描電子顯微鏡觀察其微觀形 貌，用傅立葉變換紅外光譜，X射線衍射測定材料中絲素蛋白的結(jié)構(gòu)，并對管 材進行力學(xué)性能分析。測試結(jié)果表明材料中絲素蛋白主要為無規(guī)線團結(jié)構(gòu)，干 態(tài)拉伸強度不小于0. 37MPa，斷裂伸長率23. 3%，用甲醇進行后處理后silk II 結(jié)構(gòu)增加，材料不溶于水，濕態(tài)下拉伸強度為1. 17MPa，斷裂伸長率82. 2%，彈 性模量為3. 6 MPa，顯示出了良好的韌性。本發(fā)明的優(yōu)點是 1. 直接制備出了絲素蛋白多孔管，避免了有機粘結(jié)劑的使用以及絲素模具 加工難的問題。2. 采用靜電紡絲的方法，工藝簡單，耗量少，易實現(xiàn)商業(yè)生產(chǎn)。3. 絲素蛋白水溶液紡絲，安全環(huán)保，避免有機溶劑的使用，生物相容性好， 且成本低。4. 制備出的絲素蛋白多孔管具有高孔隙率，孔具有好的連通性，利于細胞 生長，營養(yǎng)物質(zhì)傳輸。故本發(fā)明對絲素蛋白多孔管在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用具有重大意義和實用價 值。


圖l一是本發(fā)明的絲素蛋白多孔管的宏觀圖。
具體實施方式
實施例l:將蠶絲在0. 5% (w/w)的Na2C(V溶液中IO(TC下煮60min以脫去蠶絲表層的 絲膠蛋白，脫膠后的絲素蛋白用蒸餾水多次洗滌后干燥，獲得純的絲素蛋白。 將一定量的絲素蛋白溶于CaCl2/H20/CH3CH2OH (摩爾比為1: 8: 2)三元溶液或 其它濃鹽溶液中，在蒸餾水中透析三天以除去溶液中的氯化鈣和乙醇，過濾溶 液即得到濃度為3% (w/w)的絲素蛋白水溶液。實施例2:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備500mL純絲素蛋白水溶液在7(TC下加熱攪拌18h，攪拌速 度為50rpm，得到濃度為30%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程采用直徑為4mm，長度為300mm的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋 轉(zhuǎn)速度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV，紡絲速度為0. 15mL/min， 2h后，金屬棒上接收到絲直徑在700nm左右，厚度約為0. 4mm的蓬松狀絲素 蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于90%甲醇溶液中處理lh，常溫 真空干燥24h得到厚度為0. 2mm，管內(nèi)徑為4mm的絲素蛋白多孔管。
實施例3:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備500mL純絲素蛋白水溶液在70。C下加熱攪拌22h，攪拌速 度為50rpm，得到濃度為50%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程采用直徑為4腿，長度為300mm的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋 轉(zhuǎn)速度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV，紡絲速度為0. 15mL/min， 2h后，金屬棒上接收到絲直徑為2500nm，厚度約為0. 4腿的蓬松狀絲素蛋白纖 維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于90%甲醇溶液中處理lh，常溫 真空干燥24h得到厚度為0. 2mm，管內(nèi)徑為4醒的絲素蛋白多孔管。實施例4:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備純絲素蛋白水溶液在7(TC下加熱攪拌20h，攪拌速度為 50rpm，得到濃度為40%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程采用直徑為lmm，長度為300mm的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋 轉(zhuǎn)速度為5rpm，接收距離為20cm,針頭處電壓為20kV，紡絲速度為0. 15mL/min， 2h后，金屬棒上接收到絲直徑在2000nm左右，厚度約為0. 4mm的蓬松狀絲素 蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于90%甲醇溶液中處理lh，常溫 真空干燥24h得到厚度約為0. 2mm，內(nèi)徑為lmm的絲素蛋白多孔管。實施例5:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備純絲素蛋白水溶液在70。C下加熱攪拌20h，攪拌速度為 50rpm，得到濃度為400%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程采用直徑為10mm，長度為300mm的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收， 旋轉(zhuǎn)速度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV，紡絲速度為 0. 15mL/min， 2h后，金屬棒上接收到厚度約為0. 4mm的蓬松狀絲素蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于90%甲醇溶液中處理lh,常溫 真空干燥24h得到厚度約為0. 2mm，內(nèi)徑為10mm的絲素蛋白多孔管。實施例6:
制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備純絲素蛋白水溶液在70。C下加熱攪拌20h，攪拌速度為50rpm，得到濃度為40%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程采用直徑為4mra，長度為20mm的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋 轉(zhuǎn)速度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV,紡絲速度為0. 15mL/min， 2h后，金屬棒上接收到厚度約為0. 4mm的蓬松狀絲素蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于90%甲醇溶液中處理lh，常溫 真空干燥后得到內(nèi)徑為4mm，厚度約為0. 2mm，長度為20腿的絲素蛋白多孔管。 (見圖l)實施例7:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備純絲素蛋白水溶液在70。C下加熱攪拌20h，攪拌速度為 50rpm，得到濃度為40%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程直徑為4mm，長度為300mm的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋轉(zhuǎn)速 度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV，紡絲速度為0. 15mL/min， 2h后，金屬棒上接收到厚度約為0. 4mm的蓬松狀絲素蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于90X甲醇溶液中處理lh，常溫 真空干燥后得到厚度約為0. 2腿，內(nèi)徑為4mm的絲素蛋白多孔管。實施例8:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。1. 紡絲液制備純絲素蛋白水溶液在70。C下加熱攪拌20h，攪拌速度為 50rpm，得到濃度為40%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程直徑為4mm，長度為300腿的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋轉(zhuǎn)速 度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV，紡絲速度為0. 15mL/min， 5min后，金屬棒上接收到厚度約為0. Olmm的蓬松狀絲素蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于甲醇溶液中處理lh，常溫真空 干燥后得到內(nèi)徑為4mm，厚度約為0. 005ram，長度為300mm的絲素蛋白多孔管。實施例9:制備純的絲素蛋白水溶液如實施例1所示。l.紡絲液制備純絲素蛋白水溶液在7CTC下加熱攪拌20h，攪拌速度為50rpm，得到濃度為40%的絲素蛋白水溶液。2. 靜電紡絲過程直徑為4mm，長度為300腿的金屬棒旋轉(zhuǎn)接收，旋轉(zhuǎn)速 度為5rpm，接收距離為20cm，針頭處電壓為20kV，紡絲速度為0. 15mL/min， 480min后，金屬棒上接收到厚度約為lmm的蓬松狀絲素蛋白纖維。3. 多孔管形成蓬松狀絲素蛋白纖維置于甲醇溶液中處理lh，常溫真空 干燥后得到內(nèi)徑為4mm，厚度約為0. 5腿,長度為300mm的絲素蛋白多孔管。
權(quán)利要求
1.絲素蛋白多孔管的制備及用途，其特征在于將30％-50％(w/w)高濃度的絲素蛋白水溶液置于容器中，溶液在電壓為500V-60kV的靜電力作用下，形成直徑為200nm-3000nm的絲素蛋白纖維，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒或管接收絲纖維，接收距離為5-100cm，5-480min后就能在金屬棒上得到管徑為1-10mm、壁厚為0.01-1mm、長度不低于30cm的絲素多孔管，然后用90％-100％(v/v)甲醇水溶液處理使其變性，經(jīng)常溫真空干燥后得到非水溶性的絲素蛋白多孔管。
2. 絲素蛋白多孔管的制備及用途，其特征在于所制備的絲素蛋白多 孔管用于組織工程支架。
3. 如權(quán)利要求1所述的絲素蛋白多孔管的制備及用途，其特征在于 所使用的金屬棒或管的直徑及長度根據(jù)需要可調(diào)。
4. 如權(quán)利要求2所述的絲素蛋白多孔管的制備及用途，其特征在于 組織工程支架包括血管組織工程支架，氣管組織工程支架，尿道組織工程支 架及其它管狀支架。
全文摘要
絲素蛋白多孔管的制備及用途，涉及生物材料領(lǐng)域，具體涉及到組織工程支架領(lǐng)域。本發(fā)明是將30％-50％高濃度的絲素水溶液置于容器中，溶液在電壓為500V-60kV的靜電力作用下，形成直徑為200nm-3000nm的絲素纖維，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒或管接收絲纖維，接收距離為5-100cm，5-480min后就能在金屬棒上得到管徑為1-10mm、壁厚為0.01-1mm、長度不低于30cm的絲素多孔管。然后用90％-100％甲醇水溶液處理使其變性，經(jīng)常溫真空干燥后得到非水溶性的絲素蛋白多孔管。本發(fā)明的絲素管管徑可控，兼有的生物相容性和多孔性利于細胞生長，可用于組織工程支架，且制備過程簡單易行，成本低，可實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61L29/04GK101156967SQ20071017710
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者涓 周, 曹傳寶, 王玉晶, 馬西蘭 申請人:北京理工大學(xué)