專利名稱：一種靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子及其合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有生物兼容性的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，尤 其是以二氧化硅納米粒子為核，表面包裹金殼的納米核殼粒子，在金殼表面含有 靶向多肽的復(fù)合納米粒子，并提供該納米復(fù)合物金/二氧化硅核殼粒子的制備方 法，屬材料科學(xué)的納米生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
眾所周知，固體金納米粒子具有特殊的光學(xué)性質(zhì)，即等離子共振吸收。這 種等離子共振吸收是源于金中的電子與瞬時(shí)電磁場(chǎng)之間的耦合產(chǎn)生，這種等離子 共振吸收波長(zhǎng)可以通過(guò)控制納米粒子的粒徑，從而改變由瞬時(shí)電磁輻射導(dǎo)致的紫 外吸收和散射的波長(zhǎng)范圍。但是這些純的金粒子無(wú)論怎樣改變粒徑，最大紫外吸 收或散射只能在520 nm以下，并且變化程度不明顯。如果在非導(dǎo)電介質(zhì)的納米 粒子上包裹金層，則可使得其在更大范圍內(nèi)改變紫外吸收或散射，甚至到700 至2000nm。這對(duì)生物學(xué)中癌癥的光熱療法具有重要意義800nm以下的光源很 難穿透肌肉或者皮膚組織，容易灼傷組織；而800 nm以上的光源不被人體組織 吸收，可以穿透組織被納米核殼粒子吸收、放熱，從而使其在癌癥的光熱療法中 具有重要意義。如果在這些具有近紅外光學(xué)響應(yīng)的納米粒子表面通過(guò)化學(xué)方法或 者物理吸附連接對(duì)特定癌細(xì)胞具有特定導(dǎo)向性的基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定癌癥的靶 向治療。這些表面經(jīng)過(guò)功能化衍生的納米金核殼粒子被注入癌變部位，在靶向肽 的作用下濃集于腫瘤周圍，吸收近紅外光源，放出熱量升溫殺死癌細(xì)胞，而對(duì)正 常組織沒(méi)有灼傷。功能化的納米復(fù)合顆粒的制備已經(jīng)成為生物醫(yī)藥技術(shù)中十分活 躍的研究領(lǐng)域。通過(guò)控制核-殼結(jié)構(gòu)的組成、形狀和尺寸，人們能夠定制所需要 的納米復(fù)合顆粒，從而滿足特定領(lǐng)域的應(yīng)用需要。
錢衛(wèi)平(金納米核殼粒子的制備及其潛在的生物學(xué)應(yīng)用，談?dòng)?、丁少華、 王毅、錢衛(wèi)平，化學(xué)學(xué)報(bào)，2005， 63 (10)， 929-933)等曾經(jīng)報(bào)道了共振吸收峰 位置分別約在720 nm和760 nm的金納米核殼粒子，并研究了其在全血中的光 學(xué)性質(zhì)。錢旻等利用噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)篩選出能與肝癌特異性結(jié)合的由十二個(gè) 氨基酸(A — G —K一G — T一P — S — L一E — T一T一P)組成的多肽(中國(guó)專利， No.200410017049.4)。本發(fā)明制備出了在近紅外區(qū)(>800 nm)具有最大散射峰 和紫外吸收的納米核殼粒子，并且可以通過(guò)控制核的大小和殼的厚度來(lái)控制核殼
粒子的光學(xué)性質(zhì)。再在納米復(fù)合粒子表面結(jié)合特異性的靶向肽，進(jìn)行組裝制成具 有生物兼容性的靶向納米金復(fù)合核殼粒子，并進(jìn)一步探索了其在光熱療法治療肝 癌中的在應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容性好、水溶性好，具有特定光學(xué)性質(zhì) 的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制 備方法。
本發(fā)明所述的一種靶向納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子為一種以二氧化 硅納米粒子為核，表面包裹金殼，繼而在金殼表面覆蓋有肝癌靶向十二肽的納米 復(fù)合核殼粒子。該靶向納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子包括二氧化硅核和金 屬殼，以及金屬殼外層通過(guò)連接臂的含硫基團(tuán)連接的靶向多肽，核為粒徑在50nm 至300nm之間的二氧化硅，殼為金，且殼的厚度為5 nm至30 nm之間，金殼通 過(guò)交聯(lián)劑連接在二氧化硅核粒子的表面。
本發(fā)明提供的靶向納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子，其中二氧化硅核粒 子形狀為球形。組成殼的金屬層為一種金形成的單層，或者多層。且交聯(lián)劑為氨 丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅垸、二氨丙基二乙氧基硅烷、4-氨丁基二 甲基甲氧基硅烷或者苯基三乙氧基硅垸。納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子的 形狀為球形，納米核殼粒子的金屬層完全包裹二氧化硅粒子核的部分。納米核殼 粒子的金層外表面通過(guò)連接臂中的含硫基團(tuán)生成Au-S鍵，或者吸附作用，連接 靶向性的多肽，連接臂可以是氨基酸殘基，或者具有生物兼容性的高分子，或者 其他化學(xué)基團(tuán)。含硫基團(tuán)可以是任何含硫的化學(xué)基團(tuán)，特別是巰基，或二硫鍵。 靶向性多肽包含有十二個(gè)氨基酸單元，并具有特定序列(A—G—K一G—T一P—S 一L一E—T一T一P)。本發(fā)明所述的一種納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子中最大 消光值在600 -2000 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，最大紫外吸收在600 nm至2000 nm的波 長(zhǎng)范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述的一種靶向納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子能通過(guò)化學(xué)作 用或吸附作用特定靶向肝癌細(xì)胞Bel-7404和Bel-7402。
為得到一種靶向性納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子，本發(fā)明采用一種分 子交聯(lián)劑把二氧化硅和金屬層進(jìn)行交聯(lián)，先通過(guò)物理吸附在二氧化硅納米粒子表 面吸附20 30%的納米金屬顆粒，再用化學(xué)還原相應(yīng)金屬鹽溶液將剩余部分二 氧化硅包裹，從而得到具有特殊光學(xué)性質(zhì)的納米核殼粒子，繼而在該納米核殼粒 子表面通過(guò)化學(xué)方法或物理吸附結(jié)合對(duì)肝癌細(xì)胞具有特定導(dǎo)向性的十二肽。 各步合成如下-
一、 納米金核殼粒子的合成
(1) 核殼粒子中以二氧化硅為基質(zhì)的核的合成
第一步以極性溶劑用氨水為催化劑還原正硅酸乙酯(TEOS)，通過(guò)調(diào)節(jié) TEOS的用量、氨的用量、醇/水的比例、攪拌速度等得到不同粒徑的單分散的二 氧化硅粒子。該發(fā)明中醇為乙醇時(shí)效果最好。
第二步該二氧化硅粒子在醇中與帶氨基的硅烷試劑反應(yīng)2 3小時(shí)，用醇 溶液稀釋50 100倍后再加熱回流1 2小時(shí)，使得交聯(lián)劑與二氧化硅粒子表面 的鍵合更加牢固，形成一種表面氨化的二氧化硅粒子。離心分離，棄去上層清液， 沉淀物用超聲再分散，反復(fù)4 5次除去未反應(yīng)的硅烷試劑。
(2) 以二氧化硅為核的種金粒子的制備
第一步在水溶液中以還原劑在堿性條件還原高氯酸金鹽溶液，得到粒徑在 1 nm至3 nm的單分散的金屬粒子的膠體溶液，過(guò)濾，該溶液在4'C下靜置5 50天。該步中還原劑以四羥甲基氯化轔(THPC)或硼氫化鈉(NaBH4)為佳。 反應(yīng)溶液加入的最佳順序?yàn)閴A液、還原劑和高氯酸金鹽溶液。
第二步上步所述的金屬膠體溶液與上述制得的表面氨化的二氧化硅粒子溶 液混合，溫和攪拌2 3小時(shí)。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)把表面氨化的二氧化硅粒子溶液加 入到金屬膠體溶液中效果較好。
第三步離心分離棄去未被吸附到二氧化硅粒子表面的膠體溶液，加入乙醇 超聲分散，此操作反復(fù)重復(fù)4 5次，得到以二氧化硅為核的種金粒子。此粒子 表面金屬的覆蓋率約為20 30%，剩余部分的覆蓋在下步中進(jìn)行。
(3) 以二氧化硅為核的核殼粒子的制備
第一步配制含有一定濃度的高氯酸金鹽溶液和碳酸鉀的水溶液。
第二步上述所得的種金粒子與該溶液按照不同的體積比例混合后，在劇烈
攪拌下加入還原劑，反應(yīng)0.5小時(shí)后，離心分離去除未被吸附到種金表面的納米
金屬粒子，得到表面完全覆蓋有不同厚度金屬層的核殼粒子。該步驟中還原劑最 好為1%的甲醛水溶液。
二、 具有特定序列的肝癌靶向性的十二肽的化學(xué)修飾 本發(fā)明采用化學(xué)方法，在特定序列的靶向十二肽中引入帶有含硫基團(tuán)的化學(xué)
結(jié)構(gòu)(連接臂)，二者通過(guò)共價(jià)鍵聯(lián)。在多肽上引入某些化學(xué)結(jié)構(gòu)(含硫基團(tuán)) 對(duì)多肽進(jìn)行化學(xué)修飾的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，具體而言是通過(guò)以下
方法來(lái)實(shí)現(xiàn) (1) 在靶向肽與納米金核殼粒子之間選擇合適的連接臂。這些連接臂一端 用于與靶向十二肽進(jìn)行共價(jià)鍵聯(lián)， 一端通過(guò)含硫基團(tuán)鍵聯(lián)到核殼粒子的金層表 面。這些連接臂可以是氨基酸殘基，也可以是具有生物兼容性的高分子鏈，如聚 乙二醇(PEG)，聚賴氨酸等。
(2) 在連接臂中引入含硫基團(tuán)。含硫基團(tuán)以巰基與二硫鍵為佳。如果含硫 基團(tuán)是巰基，由于其易被空氣或其他物質(zhì)氧化，需要利用化學(xué)保護(hù)試劑進(jìn)行保護(hù)。 通常使用的化學(xué)保護(hù)試劑為2-巰基吡啶或三苯基溴甲垸，在催化劑作用下保護(hù)含 巰基的化合物。催化劑以氯代巰基甲酰氯(C1SC0C1)或氯代巰基甲酸甲酯
(C1SC00CH3)為佳。如果含硫基團(tuán)是二硫鍵，則無(wú)需保護(hù)。
(3) 在連接臂中引入靶向十二肽。由于靶向十二肽中含有游離的胺基和羧 基，因此連接臂端基含有胺基或羧基，在催化劑作用下，在非質(zhì)子溶劑中即可與 靶向十二肽縮合，使靶向肽成功鍵合到連接臂上。此步催化劑為iV-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、 MiV-二環(huán)己基碳亞胺(DCC)為佳。此步中非質(zhì)子溶劑包括W-二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲亞砜(DMSO)、 二氯甲烷、三氯甲垸等。
(4) 利用還原劑或催化劑去除含硫基團(tuán)的保護(hù)基。通過(guò)生成二硫鍵S-S保 護(hù)巰基的，如用2-巰基吡啶保護(hù)巰基的，通常采用還原劑還原二硫鍵。常用的還 原劑有巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇(DTT)等，以DTT為佳；通過(guò)三苯 基鹵代甲烷保護(hù)巰基的，去保護(hù)的催化劑以三氟乙酸(TFA)為最佳。
三、靶向多肽-金/二氧化硅復(fù)合納米核殼粒子的制備
(1) 靶向十二肽通過(guò)連接臂上的含硫基團(tuán)與金生成穩(wěn)定的Au-S鍵，從而 鍵聯(lián)到納米金核殼粒子表面合成具有靶向性的復(fù)合納米金核殼粒子?；瘜W(xué)修飾的 靶向十二肽與納米金核殼粒子在水溶液中混合，4'C下溫和攪拌，通過(guò)Au-S鍵 合到納米金核殼粒子表面。
(2) 離心除去未反應(yīng)的多肽，沉淀物超聲再分散在二次去離子水中，得到 表面鍵合靶向肽的復(fù)合納米金核殼粒子。
該靶向復(fù)合納米金核殼粒子體外實(shí)驗(yàn)表明無(wú)生物毒性。本發(fā)明所述的一種 靶向納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子具有高度的生物兼容性。不同濃度的靶 向復(fù)合納米金核殼粒子與細(xì)胞作用，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率以及通過(guò)熒 光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)。體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在無(wú)外源的紅外光源存在下，納米金核殼 粒子具有高度的生物兼容性。同時(shí)，靶向十二肽的引入，增強(qiáng)了該復(fù)合粒子對(duì)肝
癌細(xì)胞的特異靶向性，在有近紅外燈源光照下，能升溫殺死肝癌細(xì)胞Bel-7404 和Bel-7402，因此可應(yīng)用于癌癥的光熱療法。
本發(fā)明屬創(chuàng)新性的發(fā)明，提供一種制備對(duì)肝癌具有特殊靶向性的復(fù)合納米金 核殼粒子，即將納米金核殼粒子與對(duì)肝癌細(xì)胞特定靶向性的十二肽之間通過(guò)交聯(lián) 劑連接，形成有機(jī)多肽包裹的復(fù)合納米核殼粒子，該復(fù)合核殼粒子在近紅外區(qū)具
有最大紫外吸收和散射峰，并對(duì)肝癌細(xì)胞具有特定的耙向性，在近紅外光源照射 下能殺死肝癌細(xì)胞，體外生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)生物毒性，這些特點(diǎn)使其在人類各 種癌癥的光熱療法中具有重要意義。


圖1: 二碳酸二叔丁酯保護(hù)的PEG胺(Boc—PEG—NH2)的氫核磁譜圖。
圖2:紅外譜圖，藍(lán)線納米金核殼粒子的紅外譜圖；綠線pH=3.1時(shí)得 到的表面鍵合靶向十二肽的納米金核殼粒子；紅線PH=6.0時(shí)得到的表面鍵合 靶向十二肽的納米金核殼粒子。
圖3:靶向十二肽與靶向十二肽-納米金核殼粒子的拉曼光譜。 圖4:表面連接有靶向十二肽的納米金/二氧化硅核殼粒子的TEM圖象 (200 kV)。
圖5:粒徑約為180nm的二氧化硅-金的核殼粒子以及表面鍵合靶向十二 肽的納米金/二氧化硅核殼粒子的紫外吸收。橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為吸光度。
圖6:表面鍵合靶向十二肽的納米金/二氧化硅核殼粒子的對(duì)人源肝癌細(xì)胞 Bd-7404和7402毒性實(shí)驗(yàn)。橫坐標(biāo)為該粒子的濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞的存活率。
圖7:表面鍵合靶向十二肽的納米金/二氧化硅核殼粒子對(duì)肝癌細(xì)胞 Bel-7404的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(熒光顯微鏡法)。該粒子的濃度分別為(a) 3.0><10 1Q; (b) 3.0x10 9; (c) 3.0x10 8個(gè)/mL; (d)為陰性對(duì)照。
圖8:表面鍵合靶向十二肽的納米金/二氧化硅核殼粒子在近紅外光源照射
下殺死肝癌細(xì)胞Bel-7402的熒光照片，粒子濃度為3.0x10 ^個(gè)/mL，光照時(shí)間為 5 min，近紅外燈源能量為1 W/m2。 (a)黃線左上部分為近紅外光源光照部分， 黃線右下部分為未光照部分(放大倍數(shù)5倍)；(b)近紅外光源照射部分的放大 (40倍);(c)為照射部分的放大(40倍)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述
實(shí)施例1:粒徑約為180 nm的納米金核殼粒子的合成 (l)核殼粒子中以二氧化硅為基質(zhì)的核的合成
在100 mL潔凈的燒杯中加入50 mL的絕對(duì)無(wú)水乙醇和3.0 mL的氨水(25 %)，在攪拌條件下，向該溶液中加入0.2mL (0.9mmo1)的純度為99.999%的 正硅酸乙酯(TEOS)，約15 30mim后溶液變?yōu)槿榘咨幕鞚嵋?，繼續(xù)攪拌8 h。 得到平均粒徑為140nm的二氧化硅粒子。用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)其表面電荷和溶液 的pH值。通過(guò)調(diào)整氨水的濃度和TEOS的用量，可以合成粒徑在50 300 nm 的二氧化硅球形粒子。(2) 二氧化硅表面的氨化
取上述實(shí)驗(yàn)所得粒子懸濁液離心分離(2000rpm)，棄上層清夜，沉淀物加 入10mL的乙醇，超聲分散5min。向該懸濁液中加入400 uL的氨丙基三乙氧基 硅烷(APTES)，室溫下攪拌2h后加入100mL的無(wú)水乙醇稀釋，稀釋液在70 'C下加熱回流lh,冷卻至室溫后，以2500卬m的轉(zhuǎn)速離心分離，棄上層清液， 重復(fù)此操作4 5次。最后所得沉淀用超聲分散在10mL的乙醇中備用。用動(dòng)態(tài) 光散射儀測(cè)其表面電荷和溶液的pH值以及其粒徑和粒徑分布。
(3) 含1 3 rnn金顆粒的金膠溶液的制備
取80%的四羥甲基氯化鱗(THPC)水溶液1.2mL用二次去離子水稀釋至 100mL備用。向45.5mL的水溶液中加入1.5 mL的NaOH (0.2 M)水溶液、lm L的THPC溶液和2.0mL的高氯酸金(HAuCU， 25mmo1)，劇烈攪拌lh后，在 室溫下放置1天，用孔徑為200 nm的過(guò)濾膜過(guò)濾，得到1 3 nm的金顆粒。濾 液于4i:冰箱中繼續(xù)放置5 50天備用。高氯酸金(HAuCU)為99.9%的純度。
(4) 含1 3 rnn金顆粒的種金溶液的制備
取上述表面氨化的二氧化硅納米粒子懸濁液1 mL和上述100 mL的金膠溶 液混合，溫和攪拌2 3小時(shí)。以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離棄去未被吸附到二氧 化硅粒子表面的膠體溶液，加入乙醇超聲分散，此操作反復(fù)重復(fù)4 5次，得到 以二氧化硅為核的種金粒子。該種金粒子最后超聲分散在15 mL的二次去離子 水中備用。該種金粒子粒徑約為150nm。并用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)其表面電荷和溶 液的pH值以及其粒徑和粒徑分布。
(5) 納米核殼粒子的制備
把25 mg的K2C03和1.5 mL的HAuCl4 (25 mmol)溶液加入到100 mL的 二次去離子水中，該混合溶液(PCG)在可在避光下放置一天后使用。取上述種 金溶液1 mL和60 mL的PCG溶液混合，劇烈速度攪拌10 mim后，快速加入5 mL 的甲醛溶液(1%)，繼續(xù)攪拌0.5h后，以3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離去除 未被吸附到種金表面的納米金屬粒子，反復(fù)重復(fù)此操作最少5次。所得沉淀超聲 再分散于5mL的水中，該溶液中納米粒子的濃度約為4Xl()H個(gè)/mL。用透射電 境測(cè)其粒徑并用紫外光譜儀測(cè)其紫外吸收，并用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)其表面電荷和溶 液的pH值以及其粒徑和粒徑分布。納米二氧化硅表面連續(xù)包裹了一層金，該金 層厚度約為20 nm。紫外譜圖顯示其在約850 nm具有最大紫外吸收。
實(shí)施例2:以含巰基的氨基酸作為連接臂合成靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù) 合粒子
(1)半胱氨酸巰基的保護(hù)
向溶有半胱氨酸(1.21 g, 0.01 mol)和三乙胺(1.01 g， 0.01 moD的干燥二 氯甲烷(DCM)和WW-二甲基甲酰胺(DMF)的50mL混合溶劑(體積比9:
1)中滴甲加三苯基氯甲垸(2.78 g, 0.01 mol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，反應(yīng)24小時(shí)后， 減壓蒸除絕大部分溶劑，向殘余物中加入10mL蒸餾水，超聲分散后，離心分 離，棄去上層清液，所得固體真空干燥，得巰基保護(hù)的半胱氨酸。 (2)通過(guò)半胱氨酸向靶向十二肽中引入含硫基團(tuán)-巰基
把巰基保護(hù)的半胱氨酸(C)的胺基固定在樹脂上，在其基礎(chǔ)上利用商業(yè)固 相合成法繼續(xù)合成特定序列的靶向十二肽(A—G—K一G—T一P—S—L一E—T 一T一P)，然后利用三氟乙酸把所得產(chǎn)物從樹脂上切割下來(lái)并同時(shí)使得巰基去保 護(hù)基，得到含巰基的和靶向十二肽的十三肽(C—A—G—K一G—T_P_S_L— E—T—T—P)。
(3)表面通過(guò)氨基酸連接臂鍵合有靶向十二肽的納米金核殼粒子的合成
取上述實(shí)例1 (5)中實(shí)驗(yàn)所得平均粒徑為180nm的金/二氧化硅核殼粒子懸 濁液lmL，離心分離(1000 2000rpm)，棄上層清夜，沉淀物加入50mL的 蒸餾水，超聲分散5min。向該懸濁液中加入25mg的實(shí)施例2 (2)中所得十三 肽，(C下攪拌6h后，溶液由綠色逐漸變?yōu)楹谏Ｒ?500rpm的轉(zhuǎn)速離心分離， 棄去上層清液，沉淀物繼而分散于10mL滅菌的生理鹽水中，再離心分離。重 復(fù)此操作3 4次以除去未反應(yīng)的十三肽，得到表面通過(guò)氨基酸連接臂鍵合有靶 向十二肽的納米金核殼粒子。最后所得沉淀用超聲分散在1 mL的滅菌生理鹽水 中備用。用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)其表面電荷和溶液的pH值以及其粒徑和粒徑分布。
實(shí)施例3:以含巰基的聚乙二醇(PEG)作為連接臂合成靶向多肽-金/二氧 化硅納米復(fù)合粒子
(1) PEG的功能化修飾
第一步向PEG兩端引入鹵代基。取PEG2000 (數(shù)均分子量2000， 10 g, 5 mniol)溶于甲苯(250mL)，油水分離器共沸除水。加入新鮮蒸餾的吡啶(0.41 mL， 5mmo1)和二氯亞砜(3.54 mL， 50 mmol) ,75°?；亓?2 h。冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)除去絕大部分溶劑，再溶于二氯甲垸，用無(wú)水碳酸鉀干燥12h，過(guò)濾。收集 濾液用中性三氧化二鋁(20 g, 12(TC活化2h)吸附處理，過(guò)濾，將濾液濃縮后 用乙醚沉淀，收集沉淀并用二氯甲烷溶解，乙醚重沉淀一次，離心，固體真空干 燥，得到產(chǎn)物7g，記為C1一PEG—Cl (產(chǎn)率66%)。
第二步PEG兩端通過(guò)鹵代基引入疊氮基。取C1一PEG—C1 (7 g， 3.4 mmol) 溶于DMF (20mL)，加入疊氮化鈉(3.85 g， 59mmo1)， 7(TC回流攪拌24h。反 應(yīng)液冷卻至室溫后過(guò)濾，旋蒸除去絕大部分DMF，再溶于二氯甲垸，過(guò)濾，濾 液濃縮后，用乙醚沉淀，得到產(chǎn)物6.3g，記為N3—PEG—N3(產(chǎn)率890/。)。
第三步PEG兩端疊氮基還原為胺基。取N3—PEG—N3 (2.5 g， 1.2mmo1) 溶于四氫呋喃(THF， 20mL),加入三苯基磷(0.8 g， 3.5 mmol)，用蒸餾水(127.5 uL， 7.1mmo1)稀釋。5(TC氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流36 h，旋蒸除去大部分有機(jī)溶劑，殘余物溶解在蒸餾水中，4'C靜置12h，過(guò)濾，濾液濃縮后，冷凍干燥，得到產(chǎn)物 2.1 g，記為H2N—PEG—NH2 (產(chǎn)率89%)。
第四步PEG兩端胺基中一端胺基進(jìn)性保護(hù)。取H2N—PEG—NH2 (2.1 g， 1.01 mmol)溶于IOO mL二氯甲烷。6h內(nèi)向該溶液中緩慢滴加溶有二碳酸二叔 丁酯(Boc， 240uL， 1.01 mmol)的二氯甲垸溶液(20mL)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)?拌12h，濃縮后乙醚中沉淀，離心，所得固體真空干燥，200-400目硅膠柱層析 分離產(chǎn)物，淋洗劑為氯仿/二氯甲垸(v:v= 16:1)，得到產(chǎn)物lg,記為Boc—PEG 一NH2(產(chǎn)率44%)。
(2)功能化的PEG中巰基的引入
第一步巰基的保護(hù)。向含有4.77g G8mmol)氯代巰基甲酸甲酯的100mL 干燥二氯甲烷溶液中滴加50 mL溶有4.0 g (38 mmol) 3-巰基丙酸的二氯甲烷。 滴加完畢后室溫?cái)嚢?0min，減壓蒸除溶劑，殘余物溶解在100mL干燥的二氯 甲垸中。向此溶液中緩慢滴加含有2-巰基吡啶(4.19 g， 38 mmol)的二氯甲烷 溶液(50 mL)，滴加完畢后反應(yīng)過(guò)夜，減壓蒸除溶劑，得油狀產(chǎn)物，為巰基保 護(hù)的3-巰基丙酸。
第二步PEG中巰基的引入。向溶有三乙胺(0.2 g， 2mmo1)、 JV-羥基琥珀 酰亞胺(0.09 g， 1 mmol)的干燥二氯甲烷溶液(50 mL)中加入巰基保護(hù)的3-巰基丙酸(0.22 g， lmmol)，反應(yīng)在室溫下攪拌2h，再在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，滴加實(shí) 施例3 (1)中第四步所得的Boc—PEG-NH2 (2 g，約lmmol)的二氯甲垸溶 液(10mL)，回流72h后，蒸除絕大部分溶劑，殘余物溶解在lmL的二氯甲烷 中，于-20。C下用1:1的乙醚和正己烷混合溶劑重沉淀，過(guò)濾，收集所得固體， 用三氯甲垸和甲醇作為淋洗劑(v:v = 95:5)，硅膠柱層析分離，收集主要組分， 產(chǎn)物記為Boc—PEG—PSH。
(3)功能化的PEG中靶向十二肽的引入
第一步引入巰基后的PEG中胺基的去保護(hù)。實(shí)施例3 (3)中所得的產(chǎn)物 Boc—PEG—PSH (0.2 g，約2 mmol)溶于三氟乙酸(TFA)和干燥二氯甲烷混 合溶劑中(2mL， v:v=l:l)，在25'C下攪拌反應(yīng)3 h后，減壓蒸除溶劑，殘余物 再溶解于1 mL的二氯甲垸中，于-2(TC下用1:1的乙醚和正己烷混合溶劑重沉淀， 所得固體用三氯甲烷、甲醇和氨水為淋洗劑(V:V:v = 89:10:1)，硅膠柱層析分離 (230-400目)，收集主要組分，產(chǎn)物記為H2N—PEG—PSH。
第二步引入靶向十二肽。50 mg (0.5 mmol)的靶向十二肽溶于5mL干燥 的二氯甲垸/DMF (v:v = 4:l)中，并加入催化劑量的4-二甲胺基吡啶(DMAP) 和21 mg (0.1 mmol )的W,iV-二環(huán)己基碳亞胺(DCC)， 4。C下反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾 除去反應(yīng)生成的沉淀，收集濾液，加入溶有100 mg (約0.5 mmol)的H2N—PEG 一SH 二氯甲烷溶液，繼續(xù)反應(yīng)24 h，減壓蒸除絕大部分溶劑后，殘余物溶于5 mL
的蒸餾水中，用截留分子量為1000的透析袋透析，冷凍干燥所得產(chǎn)物，記為Pep 一PEG—PSH。
(4) PEG中巰基的去保護(hù)
實(shí)施例3 (3)中所得的產(chǎn)物Pep—PEG—PSH(O.l g，約0.5 mmol)溶于5 mL 蒸餾水中，于4'C下加入DTT (0.063， 0.5mmo1)攪拌2h后，繼續(xù)攪拌過(guò)夜， 可得產(chǎn)物Pep—PEG—SH。該反應(yīng)液無(wú)需處理直接進(jìn)行下步反應(yīng)。
(5) 表面通過(guò)含巰基的PEG連接臂鍵合有靶向十二肽的納米金核殼粒子的
合成
取上述實(shí)例1 (5)中實(shí)驗(yàn)所得平均粒徑為180nrn的金/二氧化硅核殼粒子懸 濁液2mL，離心分離(1000 2000rpm)，棄上層清夜，沉淀物加入100mL的 蒸餾水，超聲分散5min，置于4"備用。向該溶液中加入實(shí)施例3 (4)中所得 的產(chǎn)物Pep—PEG—SH的5 mL反應(yīng)液，在4'C條件下緩慢攪拌4 h，離心分離 (2500 rpm)，棄去上層清液，沉淀物繼而分散于10 mL滅菌的生理鹽水中，再 離心分離。重復(fù)此操作3次以除去未反應(yīng)的含巰基和靶向十二肽的PEG，得到 表面通過(guò)PEG連接臂鍵合有靶向十二肽的納米金核殼粒子。最后所得沉淀用超 聲分散在2 mL的滅菌生理鹽水中備用。
實(shí)施例4:以含二硫鍵的聚乙二醇(PEG)作為連接臂合成靶向多肽-金/二 氧化硅納米復(fù)合粒子
(1) 功能化的PEG中二硫鍵的引入
向溶有三乙胺(0.2 g， 2mmo1)、 vV-羥基琥珀酰亞胺(0.09 g， 1 mmol)的干 燥二氯甲烷溶液(50mL)中加入硫辛酸(0.21 g， lmmol)，反應(yīng)在室溫下攪拌 2h，再在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，滴加實(shí)施例3 (1)中第四步所得的Boc—PEG—NH2(2g， 約lmmol)的二氯甲垸溶液(10mL)，回流72 h，蒸除絕大部分溶劑，殘余物 溶解在1 mL的二氯甲烷中，于-2(TC下用1:1的乙醚和正己烷混合溶劑重沉淀， 過(guò)濾，收集所得固體，用三氯甲烷和甲醇作為淋洗劑(v:v = 100:5)，硅膠柱層 析分離，收集主要組分，產(chǎn)物記為Boc—PEG—SSH。
(2) 功能化的PEG中靶向十二肽的引入
第一步引入二硫鍵后的PEG中胺基的去保護(hù)。實(shí)施例4 (1)中所得的產(chǎn) 物Boc—PEG—SSH (0.2 g，約2mmo1)溶于三氟乙酸(TFA)和干燥二氯甲烷 混合溶劑中(2mL， v:V=l:l)，在25'C下攪拌反應(yīng)3 h后，減壓蒸除溶劑，殘余 物再溶解于1 mL的二氯甲垸中，于-2(TC下用1:1的乙醚和正己烷混合溶劑重沉 淀，所得固體用三氯甲烷、甲醇和氨水為淋洗劑(v:v:v = 90:9:1)，硅膠柱層析 分離(230-400目)，收集主要組分，產(chǎn)物記為H2N—PEG—SSH。
第二步引入靶向十二肽。50 mg (0.5mmo1)的靶向十二肽溶于5mL干燥 的二氯甲垸/DMF (v:v = 4:l)中，并加入催化劑量的4-二甲胺基吡啶(DMAP)
和21 mg (O.lmmol )的W,二環(huán)己基碳亞胺(DCC)， 4。C下反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾 除去反應(yīng)生成的沉淀，收集濾液，加入溶有100 mg (約0.5 mmol)的H2N—PEG 一SSH二氯甲垸溶液，繼續(xù)反應(yīng)24h，減壓蒸除絕大部分溶劑后，殘余物溶于5 mL的蒸餾水中，用截留分子量為1000的透析袋透析，冷凍干燥所得產(chǎn)物，記 為Pep—PEG—SSH。
(3)表面通過(guò)含二硫鍵的PEG連接臂鍵合有靶向十二肽的納米金核殼粒子 的合成
取上述實(shí)例1 (5)中實(shí)驗(yàn)所得平均粒徑為180nrn的金/二氧化硅核殼粒子懸 濁液2mL，離心分離(1000 2000rpm)，棄上層清夜，沉淀物加入100mL的 蒸餾水，超聲分散5min，置于4'C備用。向該溶液中加入實(shí)施例4 (2)中所得 的產(chǎn)物Pep—PEG—SSH的5mL反應(yīng)液，在4。C條件下緩慢攪拌4 h，離心分離 (2500 rpm)，棄去上層清液，沉淀物繼而分散于10 mL滅菌的生理鹽水中，再 離心分離。重復(fù)此操作3次以除去未反應(yīng)的含二硫鍵和靶向十二肽的PEG，得 到表面通過(guò)含二硫鍵的PEG連接臂鍵合有靶向十二肽的納米金核殼粒子。最后 所得沉淀用超聲分散在2mL的滅菌生理鹽水中備用。
實(shí)施例5:
實(shí)施例1中第(2)步中的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)分別用氨丙基三 甲氧基硅烷、二氨丙基二乙氧基硅烷、4-氨丁基二甲基甲氧基硅垸或者苯基三乙 氧基硅烷替代對(duì)二氧化硅表面進(jìn)行胺化。其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例6:
實(shí)施例3中第(1)步中的聚乙二醇2000 (PEG2000)分別用聚乙二醇1000 (PEGIOOO)、聚乙二醇400 (PEG400)替代進(jìn)行功能化修飾，得到不同鏈長(zhǎng)的 連接臂連接耙向十二肽和含硫基團(tuán)。其他同實(shí)施例3。 實(shí)施例7: MTT實(shí)驗(yàn)
肝癌細(xì)胞Bel-7404和7402全部被0.1%胰酶消化，再懸浮于新鮮的RPMI1640 培養(yǎng)液(含有10%小牛血清和1%雙抗)中，并接種于96孔板中(lx104個(gè)/ 孔)，每孔中加入100 uL，在37'C和含有5%濃度C02潮濕空氣環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜， 棄去該培養(yǎng)液，然后加入含有不同濃度的納米金核殼顆粒(3.0xlOIQ， 6.0xl09， 1.2x109， 2.4x108， 4.8x107， 9.6x106， 1》106， 2.6x105個(gè)/mL)的培養(yǎng)基RPMI1640 (100uL)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，加入10uL的MTT (0.5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí)后，棄去含有MTT的培養(yǎng)基，加入100 uL的DMSO，溶解甲臜晶體，然 后放在BIO-TEK酶標(biāo)儀(PowerwaveXS， USA)上用570納米的濾光片來(lái)讀甲 臜晶體的吸光度，細(xì)胞存活率的計(jì)算是與陰性對(duì)照組比較下算出的。
實(shí)施例8:熒光顯微鏡研究細(xì)胞毒性及納米金核殼粒子粒子在近紅外光源 下抑制肝癌細(xì)胞性能將蓋玻片放于12孔腔的培養(yǎng)板的孔里，Bel-7402培養(yǎng)在覆玻片上，(每孔含 有7.5xl()5個(gè)細(xì)胞和1.5mL的RPMI1640培養(yǎng)基)，在37'C和含有5%濃度C02 潮濕空氣環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜后，該培養(yǎng)基被3.0 mL的含納米金核殼顆粒的培養(yǎng)基 置換，然后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。取出蓋玻片，用PBS小心沖洗以后，細(xì)胞用95% 乙醇來(lái)固化30分鐘，然后用1%冰醋酸浸泡30秒，再把細(xì)胞放置于100ug/mL 濃度的AO溶液中染色15分鐘，PBS洗滌，再浸入0.1M氯化鈣溶液45秒，再 用PBS洗滌后，鋪蓋于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞在暗場(chǎng)顯微鏡下成 像，使用裝配有可分別激發(fā)和發(fā)射490 nm和520 nm波長(zhǎng)的冷光CCD攝像頭 Motic AE31熒光顯微鏡來(lái)拍攝。觀察納米金核殼粒子粒子在近紅外光源下抑制 肝癌細(xì)胞性能只需在細(xì)胞固化前進(jìn)行近紅外光源照射即可，其他操作相同。
本項(xiàng)目所得納米顆粒的粒徑分布用MARLVEN公司ZetasizerNano-ZS型動(dòng) 態(tài)光散射(DLS)測(cè)試，測(cè)試溫度為25'C，入射激光波長(zhǎng)為633 nm。透射電境 圖片用JEOL公司的JEM2100F型透射電境測(cè)試(200 kV)。紫外光譜儀為紫外 光譜儀為上海亞研電子有限公司UV1900PC型紫外儀。
上述實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明但并不局限于此，應(yīng)該理解在不脫離本發(fā)明的 精神范圍內(nèi)還可有多種變通或替換方案。
權(quán)利要求
1.一種靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，包括二氧化硅核、金屬殼，以及靶向多肽，其特征在于核為粒徑在50nm至300nm之間的二氧化硅，殼為金，且殼的厚度在5nm至30nm之間，金殼通過(guò)交聯(lián)劑連接在二氧化硅核粒子的表面，金屬殼外層通過(guò)連接臂的含硫基團(tuán)連接的靶向多肽，其中連接臂為氨基酸殘基，或者具有生物兼容性的高分子。
2. 如權(quán)利要求l所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于二 氧化硅核粒子形狀為球形。
3. 如權(quán)利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于組 成殼的金屬層為一種金形成的單層，或者多層。
4. 如權(quán)利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于交 聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅垸、氨丙基三甲氧基硅烷、二氨丙基二乙氧基硅烷、 4-氨丁基二甲基甲氧基硅垸或者苯基三乙氧基硅烷。
5. 如權(quán)利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于納 米復(fù)合物金/二氧化硅核殼粒子的形狀為球形。
6. 如權(quán)利要求l所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于納 米核殼粒子的金屬層完全包裹二氧化硅粒子核的部分。
7. 如權(quán)利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于連 接臂中的含硫基團(tuán)生成Au-S鍵連接靶向性的多肽。
8. 如權(quán)利要求l所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于含 硫基團(tuán)為巰基或二硫鍵。
9. 如權(quán)利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子，其特征在于靶 向性多月太的序歹U為(從N端至lJC端)A —G — K—G—T—P — S —L—E—T—T—P。
10. —種靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于包括 如下步驟(1)制備納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子；(2) 化學(xué)修飾肝癌靶向性的十二肽在連接臂中引入含硫基團(tuán)；并通過(guò)靶 向十二肽中含有游離的胺基和羧基，和連接臂端基含有的胺基或羧基的作用，在 可溶性非質(zhì)子溶劑中即可與靶向十二肽縮合，使靶向肽成功鍵合到連接臂上；(3) 耙向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制備將(1)中所得納米核殼粒子加入到(2)所得靶向多肽的水溶液中，攪拌，離心分離，得靶向納米復(fù)合物金/二氧化硅核殼粒子。
11. 如權(quán)利要求10所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制備方法， 其特征在于(2)中的非質(zhì)子溶劑，包括W,二甲基甲酰胺(DMF) 、 二甲亞砜(DMSO) 、 二氯甲垸或者三氯甲院。
12. 如權(quán)利要求10所述的耙向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制備方法， 其特征在于(2)中含硫基團(tuán)為巰基時(shí)，化學(xué)修飾肝癌靶向性的十二肽時(shí)要利用 化學(xué)試劑進(jìn)行保護(hù)，修飾完畢要利用還原劑或催化劑去除含硫基團(tuán)的保護(hù)基。
13. 如權(quán)利要求12所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制備方法， 其特征在于化學(xué)試劑為2-巰基吡啶，或三苯基溴甲垸，或碘乙酰胺，或氯化芐， 或iV-乙基丁烯二亞酰胺，或?qū)β裙郊姿帷?br> 14. 如權(quán)利要求12所述的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子的制備方法， 其特征在于還原劑為巰基乙醇，或巰基乙酸，或二硫蘇糖醇(DTT)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有生物兼容性的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子及其制備方法，屬材料科學(xué)的納米生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的靶向多肽-金/二氧化硅納米復(fù)合粒子是以二氧化硅納米粒子為核，表面包裹金殼，繼而在金殼表面覆蓋有肝癌靶向十二肽的納米復(fù)合核殼粒子。本發(fā)明采用一種分子交聯(lián)劑把二氧化硅和金屬層進(jìn)行交聯(lián)，金屬殼外層通過(guò)連接臂的含硫基團(tuán)連接的靶向多肽，該復(fù)合核殼粒子在近紅外區(qū)具有最大紫外吸收和散射峰，并對(duì)肝癌細(xì)胞具有特定的靶向性，在近紅外光源照射下能殺死肝癌細(xì)胞，體外生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)生物毒性，這些特點(diǎn)使其在人類各種癌癥的光熱療法中具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K9/14GK101352574SQ20071017108
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者余家會(huì), 劉順英, 梁重時(shí), 羅淑芳, 峰 高 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)