專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥制劑制備方法及其質(zhì)量控制方法，特別是涉及一種丹參注射液的制備工藝及其質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，期望壽命的延長(zhǎng)和膳食結(jié)構(gòu)的改變，冠心病的發(fā)病率和死亡率正呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。我國(guó)目前約有4000萬(wàn)冠心病患者，每小時(shí)約有260例患者死于心腦血管疾病。冠心病發(fā)病率近年來(lái)在我國(guó)呈急劇上升的趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織有報(bào)告指出，即使從現(xiàn)在開(kāi)始就采取有力的預(yù)防措施，我國(guó)心血管疾病發(fā)病率的上升趨勢(shì)也將持續(xù)到2020年左右。心腦血管用藥在藥品市場(chǎng)中的排名也上升至第二位，僅次于抗感染用藥。據(jù)了解，目前國(guó)內(nèi)心腦血管類(lèi)藥物市場(chǎng)總的格局是中西藥各占一半。從醫(yī)院的用藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，心腦血管類(lèi)制劑目前還是由注射劑主導(dǎo)市場(chǎng)，而且，臨床實(shí)踐證明，中藥注射劑治療心腦血管疾病具有化學(xué)藥產(chǎn)品不可替代的獨(dú)特功效，也有中藥其他劑型難以具備的優(yōu)勢(shì)。丹參作為經(jīng)典的活血化瘀中藥，廣泛用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦中風(fēng)等心腦血管疾病，丹參制劑年銷(xiāo)售額約50億元人民幣，尤其是丹參注射液和復(fù)方丹參注射液，年銷(xiāo)售高達(dá)30億支?，F(xiàn)有的丹參注射液收錄于部頒中藥成方制劑第20冊(cè)p34，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3一B—3766—98。功能與主治是活血化瘀，通脈養(yǎng)心。用于冠心病，心絞痛。用法與用量為肌內(nèi)注射，一次24ml，一日12次；靜脈注射，一次4ml(用50^葡萄糖注射液20ml稀釋后使用)，一日12次；靜脈滴注，一次1020ml(用5X葡萄糖注射液100500ml稀釋后使用)，一日1次?；蜃襻t(yī)囑。目前的部頒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅將原兒茶醛作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，用高效液相色譜法測(cè)定其含量每lml含原兒茶醛(C晶03)不得少于0.2mg。該標(biāo)準(zhǔn)收錄的丹參注射液制法為取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí),合并煎液,濾過(guò)，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加注射用水至400ml，混勻，冷藏放置，濾過(guò)，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，煮沸半小時(shí)，濾過(guò)，加注射用水至1000ml，灌封，滅菌，即得。由于歷史的原因，目前的丹參注射劑也存在質(zhì)量和臨床安全性方面的問(wèn)題。質(zhì)量方面的問(wèn)題主要表現(xiàn)為目前的丹參注射液產(chǎn)品是經(jīng)傳統(tǒng)工藝制備的中藥材綜合成分的提取物，由于認(rèn)識(shí)的不到位以及制法、質(zhì)控方法不完善，存在有效成分不明確，質(zhì)量不穩(wěn)定，表現(xiàn)為臨床療效不穩(wěn)定，安全性可控性差，發(fā)生不良反應(yīng)多且難以査找原因，難于適應(yīng)中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化的要求。目前的丹參注射液中未知的非定量成分占相當(dāng)?shù)谋壤?；一些大分子雜質(zhì)，如鞣質(zhì)等難以除去，放置一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)色澤變深、混濁、沉淀等現(xiàn)象，從而影響制劑的療效和安全性。鞣質(zhì)是影響注射液澄明度的主要因素，鞣質(zhì)是相對(duì)分子量大于1000(—般3000—5000)的水溶性多酚類(lèi)化合物，它能同生物堿、蛋白質(zhì)及藥物中的金屬離子作用生成沉淀。例如，它與蛋白質(zhì)分子、生物堿和多糖形成分子間氫鍵，生成不溶于水的沉淀物；因此必須將注射液中所含的鞣質(zhì)去除。一般來(lái)說(shuō)，鞣質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)極易引起黃疸和肝壞死，肌注局部會(huì)發(fā)生硬結(jié)、疼痛，鞣質(zhì)是多元酚的衍生物，既溶于醇又溶于水?，F(xiàn)有的部頒標(biāo)準(zhǔn)中二次醇沉工藝技術(shù)除鞣質(zhì)技術(shù)效果差，所得產(chǎn)品很難合格，并且選擇性差，大量有效成分同時(shí)被除去?，F(xiàn)有的技術(shù)還包括熱處理冷置法、水醇法、膠醇法、聚酰胺法和膠醇樹(shù)脂法等(詳見(jiàn)王凌等，華西藥學(xué)雜志，2003，No.l8，p275;王健等，基層中藥雜志，2001，No.5，p51);水醇法為了除鞣質(zhì)率高，一般pH值調(diào)高至9一10，在如果高的PH下，大量的丹酚酸成分被沉淀除去；在只考慮原兒茶醛的情況下，膠醇樹(shù)脂法被最為看好，但事實(shí)上由于鞣質(zhì)與丹酚酸類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)相似性，大孔樹(shù)脂帶走了大量的主要有效成分。上述這些除去鞣質(zhì)的方法選擇性差，在除去鞣質(zhì)的同時(shí)，大量的丹酚酸類(lèi)有效成分被除去；有些方法還引入其他雜質(zhì)，使產(chǎn)品的質(zhì)量降低。隨著對(duì)丹參成份認(rèn)識(shí)的不斷深入，近年的研究發(fā)現(xiàn)，丹參中以丹酚酸B和丹酚酸A為代表的水溶性丹酚酸類(lèi)成分(一般相對(duì)分子量小于1000)心血管活性遠(yuǎn)比丹參素、原兒茶醛強(qiáng)，丹參水溶性酚酸類(lèi)成分是丹參注射液的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)已得到學(xué)術(shù)界公認(rèn)。丹參酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)心血管系統(tǒng)具有廣泛而顯著的藥理活性，具有極強(qiáng)的抗氧化作用，能保護(hù)缺血及缺血再灌注引起的心肌損傷、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、促進(jìn)血管舒張并改善血液流變。令人關(guān)注的是，現(xiàn)有的部頒標(biāo)準(zhǔn)中的丹參注射液生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵工藝點(diǎn)未對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行規(guī)定，特別是濃縮等環(huán)節(jié)未對(duì)溫度進(jìn)行控制，由于丹參中主要有效成分是熱敏性的水溶性成分，這些成分都不太穩(wěn)定，原有的整個(gè)生產(chǎn)方法對(duì)有效成分特別是丹酚酸A、丹酚酸B的破壞嚴(yán)重，丹酚酸A、丹酚酸B損失非常大，需要進(jìn)一步改進(jìn)和提高生產(chǎn)工藝。研究表明，丹酚酸B等丹參水溶性有效成分在溶液中均易降解不穩(wěn)定，張軍等人(中國(guó)中藥雜志vol.30，No.10，p789)曾對(duì)丹參水提液中的丹酚酸B穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，丹參水液10(TC加熱l小時(shí)，丹酚酸B含量降低約30X，受熱9小時(shí)，丹酚酸B含量降低約95X;6(TC加熱1小時(shí)，丹酚酸B含量降低約15%，受熱9小時(shí)，丹酚酸B含量降低約60%;50。C加熱l小時(shí)，丹酚酸B含量降低約30%，受熱8小時(shí)，丹酚酸B含量降低約40%。另曲桂武等人(中草藥，2005，No.11，pl654)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酚酸B的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水溶液中的丹參酚酸B在低質(zhì)量濃度(〈0.lmg/mL〉下室溫過(guò)夜損失接近30%，其分解產(chǎn)物為丹參素、原兒茶醛等。岳喜典等人(中草藥，2005，No.2,p205)研究表明，要保持溶液中丹參酚酸B穩(wěn)定性，應(yīng)盡可能做到低溶液pH值、高丹參酚酸B質(zhì)量濃度、低溫，并且要盡量縮短溶液狀態(tài)的存放時(shí)間。80年代以來(lái)膜分離技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于中藥制劑的生產(chǎn)。雖然該技術(shù)起步較晚，應(yīng)用規(guī)模較小，但已受到人們的極大關(guān)注。其中尤以超濾膜的應(yīng)用報(bào)道最多。主要涉及以下幾個(gè)方面l)中藥有效部位的提取；2)口服液的生產(chǎn)；3)浸膏制劑的制備；4)熱源的去除；5)從制藥廢水中回收藥物有效成分。郝莉等(中草藥，1996，No.8，p471)曾用截留分子量2萬(wàn)的超濾膜進(jìn)行除雜應(yīng)用于丹參注射液的工藝改進(jìn)，由于所用膜孔徑太大，雖然能去除部分鞣質(zhì)，但對(duì)相對(duì)分子量5000以下的鞣質(zhì)去除效果較差。同時(shí)單純使用超濾法去除鞣質(zhì)，由于鞣質(zhì)含量較高，超濾效率低下，同時(shí)由于吸附等作用，導(dǎo)致有效成分大量損失。在超濾膜的生產(chǎn)廠家中，不得不提及K0CH公司，該公司于1991年收購(gòu)美國(guó)Romicon公司(世界上中空纖維膜的發(fā)明者，該公司于1973年發(fā)明了中空纖維膜超濾膜)，Romicon公司的中空纖維膜具有極強(qiáng)的抗污染性，擁有全球唯一的切割分子量最小、最精確的1000分子量膜。Romicon中空纖維膜由不對(duì)稱(chēng)的人造聚合物制成，內(nèi)表面是一層極薄的超濾膜，這種獨(dú)特的性能使得濾膜纖維能自我支撐并允許反洗，此不對(duì)稱(chēng)楔型結(jié)構(gòu)也使得污染物不會(huì)滯留在膜內(nèi)部形成深層污染，故此類(lèi)中空纖維膜具有更強(qiáng)的抗污染性能和清洗易恢復(fù)性，廣泛應(yīng)用于物料分離及廢水處理。K0CH提供的中空纖維膜產(chǎn)品有1000分子量、2000分子量、5000分子量、l萬(wàn)、3萬(wàn)、5萬(wàn)、10萬(wàn)、50萬(wàn)分子量等。凝膠色譜技術(shù)是一種新興的技術(shù)，它的原理是是利用被分離物質(zhì)分子量大小、形狀的不同導(dǎo)致在填料上滲透程度不同使組分分離(分子篩原理)，大分子物質(zhì)由于擴(kuò)散受阻，在凝膠中行徑較短而最先洗脫下來(lái)，進(jìn)入凝膠內(nèi)的小分子物質(zhì)按分子大小由大至小被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到相互分離的目的，根據(jù)樣品的性質(zhì)選用水、緩沖溶液加鹽或有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。使用葡聚糖凝膠過(guò)濾介質(zhì)S印hadexGIO、G15、G25、G50等去除大分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%。只需在進(jìn)樣后收集從l/3-l/2柱體積開(kāi)始的洗脫液(最初的洗脫液為大分子物質(zhì)，廢棄)，就可以獲得該填料分離范圍上限以下的小分子，簡(jiǎn)單直接。由于只是去除大分子，柱高10cm以上即可。1"l至要極能分離范圍(相對(duì)分子量)型號(hào)<700SephadexG-lO葡聚糖凝膠G15J〈1500SephadexG-151000-5000SephadexG-25鑒于現(xiàn)有的丹參注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅將原兒茶醛作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于丹參制劑實(shí)際質(zhì)量控制需要。近年來(lái)，為了提高對(duì)丹參注射液的有效成分的質(zhì)控水平，許多學(xué)者和機(jī)構(gòu)進(jìn)行了不懈的研究，潘海妮等人對(duì)以丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行了研究，建立了一種丹參注射液的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)和分析方法；國(guó)家有關(guān)部門(mén)也即將實(shí)行一個(gè)新的結(jié)合指紋圖譜技術(shù)的丹參注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要質(zhì)控指標(biāo)主要有2個(gè)，一是按國(guó)家藥典會(huì)提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)，本品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜比較，相似度不得低于O.80;二是本品每lml含丹參素鈉(C晶0sNa)不得少于0.60mg;含原兒茶醛(C7H603)不得少于0.20mg;含丹酚酸B(C加HA)不得少于O.25mg。近年的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在目前己知的水溶性丹酚酸類(lèi)成分中，丹酚酸A為其中最強(qiáng)的有效成分，其藥效作用是目前主流丹參制劑質(zhì)控有效成分丹酚酸B的12倍左右。由于長(zhǎng)期以來(lái)獲得高含量的丹酚酸A的技術(shù)一直很難突破，丹酚酸A一直未能作為丹參制劑的質(zhì)控指標(biāo)。綜上，目前現(xiàn)有的丹參注射液生產(chǎn)技術(shù)的主要缺陷是制法不很合理，導(dǎo)致主要有效成分丹酚酸A、B損失非常大；缺乏對(duì)關(guān)鍵有效成分丹酚酸A的質(zhì)量控制，導(dǎo)致產(chǎn)品臨床療效不穩(wěn)定；鞣質(zhì)去除不完全，臨床應(yīng)用有較大的安全隱患。
發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)有的丹參注射液的制備方法中的缺陷以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅將原兒茶醛作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，己遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)目前對(duì)丹參注射液有效成分的質(zhì)量控制和臨床用藥安全有效的要求，我們?cè)讷@得高含量丹酚酸A的生產(chǎn)技術(shù)(詳見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200610165779.8)后，通過(guò)不斷努力，發(fā)明了一種丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法，即控制工藝工程中的濃縮溫度，在低堿度初步堿沉后，利用鞣質(zhì)(相對(duì)分子量大于1000,—般3000—5000)和丹參主要有效成分水溶性丹酚酸類(lèi)成分(一般相對(duì)分子量小于IOOO)相對(duì)分子量的差異除去少量殘留鞣質(zhì)；采用本發(fā)明的復(fù)合除鞣質(zhì)技術(shù)(低溫冷藏、低堿度醇沉、超濾或葡聚糖葡聚糖凝膠色譜技術(shù)復(fù)合除鞣)，在有效去除鞣質(zhì)的情況下最大限度地保留了丹參的主要有效成分，采用同時(shí)控制丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素鈉以及原兒茶醛(研究表明丹參素和原兒茶醛雖然作用沒(méi)丹酚酸類(lèi)成分強(qiáng)，但還存在協(xié)同作用，所以這2個(gè)成分也需要質(zhì)控)的有效含量為質(zhì)控指標(biāo)有效提升了丹參注射液的質(zhì)量，使本發(fā)明生產(chǎn)的丹參注射液真正達(dá)到了安全有效質(zhì)量可控的全新水平。本發(fā)明公開(kāi)了一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的丹參注射液的制備方法包括如下步驟(1)煎煮取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，每次煎畢放出藥液過(guò)濾(60目篩)，合并濾液。(2)濃縮將濾液低于60。C減壓濃縮至750ml，冷卻。(3)醇沉濃縮液冷卻后，先加乙醇至含醇量75%，攪拌，靜置約1小時(shí)。取上清液，冷藏20-48小時(shí)，冰庫(kù)溫度控制在5t:以下。冷藏后過(guò)濾，低于60'C減壓蒸餾回收乙醇?；厥找掖贾翝饪s液約300ml，放冷至室溫。(4)再加乙醇至含醇量85%,用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，充分?jǐn)嚢瑁o置約1小時(shí)。冷藏40-68小時(shí)，冷藏后的二次醇沉液過(guò)濾，低于6(TC減壓蒸餾回收乙醇?；厥找掖贾良s250ml(每lml約含原生藥8.5-10g)。(5)超濾加注射用水至400ml,加10%鹽酸調(diào)pH至6.8，混勻，冷藏放置36一60小時(shí)，采用超濾膜超濾，收集濾液。(6)加入適量注射用水，加熱煮沸30分鐘，放冷至60°C，加入適量0.1%活性炭，保溫10分鐘，濾過(guò)，取藥液測(cè)得原始PH值，用10%的NaOH溶液調(diào)PH至6.8,用過(guò)濾后的注射用水補(bǔ)足至1000ml，并充分?jǐn)嚢杈鶆?。灌封，滅菌，即得。與傳統(tǒng)丹參注射液生產(chǎn)工藝不同的是，本發(fā)明在步驟(2)、(3)、(4)中均對(duì)濃縮溫度進(jìn)行了明確限定，不超過(guò)6(TC;這個(gè)溫度選擇6(TC而不是5(rC，主要是50'C所需的濃縮時(shí)間太長(zhǎng)，不利于實(shí)際生產(chǎn)，而且研究表明在減壓濃縮狀態(tài)下，5(TC或6(TC時(shí)丹酚酸B含量降低程度基本差異不大。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝步驟(4)二次醇沉?xí)r的pH值為8.0，主要是研究表明，pH再高的時(shí)候，方法選擇性差，在除去鞣質(zhì)的同時(shí)，大量的丹酚酸類(lèi)有效成分被除去；pH值太低時(shí)則起不到除去鞣質(zhì)的作用；本發(fā)明的生產(chǎn)工藝步驟(5)使用的超濾膜是截留相對(duì)分子量1000—1萬(wàn)的中空纖維膜，例如KOCH公司的Romicon中空纖維膜。KOCH提供的中空纖維膜產(chǎn)品有1000分子量、2000分子量、5000分子量、l萬(wàn)等。由于超濾屬錯(cuò)流過(guò)濾方式，實(shí)際使用時(shí)要使用比理論孔徑稍大些的中空纖維膜，否則過(guò)濾壓力過(guò)大，同時(shí)有效成分大量損失，影響超濾效果，優(yōu)選2000分子量、5000分子量超濾膜。研究表明，本發(fā)明的步驟(5)還可以是利用葡聚糖凝膠色譜技術(shù)代替超濾技術(shù)。本發(fā)明的葡聚糖凝膠過(guò)濾介質(zhì)最好是S印hadexGIO、G15、G25等。本發(fā)明的丹參注射液的質(zhì)量控制方法包括如下內(nèi)容它包括對(duì)丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A進(jìn)行定性和定量控制，在一定的色譜條件下測(cè)試供試液液相圖譜，本品要求每lml含丹參素鈉(C9H905Na)不得少于O.65mg;含原兒茶醛(C7HB03)不得少于O.23mg;含丹酚酸B(C36H3。016)不得少于O.28mg，含丹酚酸A(C26H2A。)不得少于O.10mg(國(guó)家新準(zhǔn)備實(shí)行的標(biāo)準(zhǔn)只控制如下3個(gè)質(zhì)控指標(biāo)每lml含丹參素鈉(C9H905Na)不得少于O.60mg;含原兒茶醛(C7H603)不得少于O.20mg;含丹酚酸B(C3eH3Q016)不得少于O.25mg)。應(yīng)用本發(fā)明，我們將上述4個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的含量要求作為產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)的檢驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，將丹參注射液的新生產(chǎn)工藝及檢測(cè)技術(shù)成功應(yīng)用于丹參注射液的生產(chǎn)檢驗(yàn)質(zhì)量控制，由于新增加丹酚酸類(lèi)中藥效最強(qiáng)的丹酚酸A作為質(zhì)控指標(biāo)，與傳統(tǒng)工藝和質(zhì)控技術(shù)比較，所得丹參注射液產(chǎn)品質(zhì)量更為穩(wěn)定可靠，產(chǎn)品的有效性和安全性基本解決，真正達(dá)到安全有效，質(zhì)量可靠。本發(fā)明所述的定量控制方法為使用梯度洗脫程序應(yīng)用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參注射液中4種水溶性成分丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A;本發(fā)明所使用的一定的色譜條件，包括如下因素色譜柱AgilentIIOO高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)，流動(dòng)相A:水一乙腈一甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫30°C，DAD掃描范圍190400nm。所用的線性梯度洗脫程序，具體條件如下表l:表l:線性梯度洗脫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對(duì)照品溶液的制備取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，力P5X甲醇制成每lml含丹參素鈉0.32mg、原兒茶醛O.10mg、丹酚酸B0.12mg和丹酚酸A0.05mg的混合溶液，即得。供試品溶液的制備精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本發(fā)明的質(zhì)量控制4個(gè)含量控制指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品HPLC圖譜如圖1所示，由4個(gè)特征峰組成。所述的四個(gè)特征峰的保留時(shí)間U為從左到右依次為丹參素鈉"二5.40min，原兒茶醛tR二9.60min，丹酚酸BtR=30.10min，丹酚酸A1^二34.30min。本發(fā)明方法可一次同時(shí)測(cè)定丹參注射液中的多個(gè)有效成分。通過(guò)對(duì)這4個(gè)丹參中主要有效成分的定量控制，可大大提高丹參注射液的安全性和有效性。本發(fā)明專(zhuān)利生產(chǎn)的丹參注射液制劑質(zhì)量穩(wěn)定、可控性強(qiáng)，且檢測(cè)方法先進(jìn)、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適用于常規(guī)生產(chǎn)跟蹤質(zhì)量檢驗(yàn)，對(duì)控制丹參注射液的質(zhì)量有重要作用。丹參注射液分析方法建立及質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)價(jià)情況簡(jiǎn)單匯總?cè)缦聝x器AgilentllOO型高效液相色譜儀，配脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器(Agilent公司)。試劑乙腈為色譜純(MERCK公司)，其余試劑均為分析純，水為純凈水。對(duì)照品丹參素鈉(中檢所，批號(hào)110855-200507)，原兒茶醛(中檢所，批號(hào)110809-200503)、丹酚酸B(中檢所，批號(hào)111562-200609)、丹酚酸A(自制，歸一化標(biāo)定含量98.8%)。色譜條件色譜柱Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm),流動(dòng)相A:水一乙腈一甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫3CTC，DAD掃描范圍190400nm。所用的線性梯度洗脫程序OminO%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%。分離條件與檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇在上述色譜條件下，丹參注射液中4個(gè)定量指標(biāo)成分色譜峰與相鄰峰均達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間適宜，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A的tK分別為丹參素鈉tB二5.40min，原兒茶醛tB二9.60min，丹酚酸B^二30.10min，丹酚酸AU二34.30min，確定樣品檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。線性關(guān)系考察精密吸取上述對(duì)照品溶液5iU，注入液相色譜儀，按前述色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度X(g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表2:線性關(guān)系表)。各指標(biāo)成分在測(cè)定質(zhì)量濃度內(nèi)，線性關(guān)系良好。表2:線性關(guān)系表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>精密度試驗(yàn):儀器精密度精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5Ul,注入液相色譜儀，按前述色譜條件測(cè)定。連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88-1.47%。方法精密度取丹參注射液制劑平行配制5份供試液，各供試液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3次，以峰面積計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為l.08-1.46%。日間精密度取同一批丹參注射液樣品，連續(xù)6天測(cè)其含量，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均〈1.5%，結(jié)果表明該方法日間精密度量符合要求。樣品穩(wěn)定性取丹參注射液供試品，分別在0hr，lhr，2hr,3hr，4hr，按前述色譜條件測(cè)定供試品溶液丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A含量，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均〈1.5M，結(jié)果表明供試品在4小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定?；厥章试囼?yàn)精密吸取己知含量的丹參注射液5ml，置10ml量瓶中，分別加入各對(duì)照品適量，每個(gè)對(duì)照品均配3個(gè)濃度，各對(duì)照品加入量依次為丹參素鈉(3.9mg，3.3mg，2.6mg)、原兒茶醛(1.4mg，1.2mg，0.9mg)、丹酚酸B(1.7mg,1.4mg,1.lmg)和丹酚酸A(0.6mg，0.5mg，0.4mg)對(duì)照品溶液lml，制成供試品溶液，按上述液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算各質(zhì)控成分的平均回收率依次為丹參素鈉99.6%(RSD1.50%)、原兒茶醛100.1%(RSD1.37%)、丹酚酸B99.8%(RSD1.46%)、丹酚酸A99.5%(RSD1.41%)。經(jīng)過(guò)上述研究，本發(fā)明確定了如下的色譜條件色譜柱AgilentIIOO高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)，流動(dòng)相A:水一乙腈一甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫30°C，DAD掃描范圍190400nm。所用的線性梯度洗脫程序Omin0%B，20min15%B,50min25%B，70min85%B，80min85B%。使用儀器類(lèi)型高效液相色譜儀器型號(hào)Agilent1100流動(dòng)相A:水一乙腈一甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈；梯度方式OminO%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%，檢測(cè)器二極管陣列(DAD)檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)280nm柱溫30°C柱型號(hào)ZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)流速1.0mL/min，積分方法面積歸一法圖l4個(gè)含量控制指標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品HPLC圖譜圖2實(shí)施例l(傳統(tǒng)工藝)制備的丹參注射液HPLC圖譜圖3實(shí)施例l(傳統(tǒng)工藝，pH=9.0)制備的丹參注射液HPLC圖譜圖4實(shí)施例2(傳統(tǒng)工藝，pH=8.0)制備的丹參注射液HPLC圖譜圖5實(shí)施例4(新工藝，超濾，5000分子量)制備的丹參注射液HPLC圖譜圖6實(shí)施例5(新工藝，葡聚糖凝膠G15)制備的丹參注射液HPLC圖譜具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。如下實(shí)施例中對(duì)4個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的檢驗(yàn)方法按照本發(fā)明的含量測(cè)定方法進(jìn)行(即每lml含丹參素鈉不得少于0.65mg;含原兒茶醛不得少于O.23mg;含丹酚酸B不得少于O.28mg，含丹酚酸A不得少于O.10mg)，鞣質(zhì)檢驗(yàn)依據(jù)2005版藥典附錄注射劑項(xiàng)下鞣質(zhì)檢査法進(jìn)行。實(shí)施例l傳統(tǒng)工藝制備丹參注射液取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加注射用水至400ml,混勻，冷藏放置，濾過(guò)，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，煮沸半小時(shí)，濾過(guò)，加注射用水至1000ml，灌封，滅菌，即得。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉1.00mg;含原兒茶醛0.90mg;含丹酚酸BO.10mg，含丹酚酸AO.05mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)有大量沉淀。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，除丹參素鈉和原兒茶醛符合要求外，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和丹酚酸A、B均不合格。實(shí)施例2傳統(tǒng)工藝結(jié)合堿沉(傳統(tǒng)工藝，pH=9.0)制備丹參注射液與實(shí)施例l基本相同，所不同的是在第二次醇沉?xí)r，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，充分?jǐn)嚢?，靜置約1小時(shí)。冷藏，冷藏后的二次醇沉液過(guò)濾,減壓蒸餾回收乙醇。加注射用水至400ml，力tU:l鹽酸調(diào)pH至6.8，煮沸半小時(shí)，濾過(guò)，加注射用水至1000ml,灌封，滅菌，即得。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉O.95mg;含原兒茶醛0.80mg;含丹酚酸B0.05mg，含丹酚酸AO.02mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)澄清。結(jié)果判斷，鞣質(zhì)檢驗(yàn)合格，但按本發(fā)明質(zhì)控方法，除丹參素鈉和原兒茶醛符合要求(均比實(shí)施例l低)夕卜，和丹酚酸A、B均不合格(均比實(shí)施例l低)。實(shí)施例3傳統(tǒng)工藝結(jié)合堿沉(傳統(tǒng)工藝，pH=8.0)制備丹參注射液與實(shí)施例2基本一樣，所不同的是在第二次醇沉?xí)r，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，其他均相同。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉O.85mg;含原兒茶醛0.76mg;含丹酚酸B0.09mg，含丹酚酸A0.04mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)有少量沉淀。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，除丹參素鈉和原兒茶醛符合要求外，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和丹酚酸A、B均不合格。與實(shí)施例l相比，4個(gè)主要成分含量相差不大。實(shí)施例4本發(fā)明的低溫濃縮，超濾(分子量5000)復(fù)合除鞣工藝與實(shí)施例3基本一樣，所不同的是在提取后的濃縮和回收乙醇時(shí)控制低于60'C進(jìn)行，另外在二次醇沉，pH-8.0堿沉后增加超濾除鞣。所用的超濾膜為Romicon中空纖維膜(5000分子量)。具體如下(1)煎煮取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，每次煎畢放出藥液過(guò)濾(60目篩)，合并濾液。(2)濃縮將濾液低于6(TC減壓濃縮至750ml，冷卻。(3)醇沉濃縮液冷卻后，先加乙醇至含醇量75%，攪拌，靜置約1小時(shí)。取上清液，冷藏20-48小時(shí)，冰庫(kù)溫度控制在5'C以下。冷藏后過(guò)濾，低于60'C減壓蒸餾回收乙醇。回收乙醇至濃縮液約300ml，放冷至室溫。(4)再加乙醇至含醇量85%，用40X氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，充分?jǐn)嚢?，靜置約1小時(shí)。冷藏40-68小時(shí)，冷藏后的二次醇沉液過(guò)濾，低于6(TC減壓蒸餾回收乙醇?；厥找掖贾良s250ml(每lml約含原生藥8.5-10g)。(5)超濾加注射用水至400ml，力fU0。/。鹽酸調(diào)pH至6.8，混勻，冷藏放置36一60小時(shí)，采用Romicon中空纖維膜(5000分子量)超濾，收集濾液。(6)加入適量注射用水，加熱煮沸30分鐘，放冷至60°C，加入適量0.1%活性炭，保溫10分鐘，濾過(guò)，取藥液測(cè)得原始PH值，用10%的NaOH溶液調(diào)PH至6.8,用過(guò)濾后的注射用水補(bǔ)足至1000ml，并充分?jǐn)嚢杈鶆?。灌封，滅菌，即得。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉O.70mg;含原兒茶醛0.35mg;含丹酚酸B0.35mg，含丹酚酸AO.15mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)澄清。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和4個(gè)主要成分含量質(zhì)控都符合要求。實(shí)施例5本發(fā)明的低溫濃縮，葡聚糖凝膠色譜技術(shù)復(fù)合除鞣工藝與實(shí)施例4基本一樣，所不同的是實(shí)施例4的步驟(5)中改用葡聚糖凝膠色譜技術(shù)，采用葡聚糖凝膠G15，步驟(4)所得藥液上葡聚糖凝膠柱，進(jìn)樣后收集從l/3-l/2柱體積開(kāi)始的洗脫液(最初的洗脫液為大分子物質(zhì)，廢棄)，洗脫液采用適量純凈水。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉0.69mg;含原兒茶醛0.36mg;含丹酚酸B0.32mg，含丹酚酸AO.13mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)澄清。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和4個(gè)主要成分含量質(zhì)控都符合要求。但葡聚糖凝膠G15處理量較少，不如實(shí)施例4的超濾法。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明所要求保護(hù)的具體技術(shù)方案，不限于上述實(shí)施例所表達(dá)的技術(shù)方案的具體組合。權(quán)利要求1、本發(fā)明公開(kāi)了一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的丹參注射液的制備方法包括如下步驟(1)煎煮取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，每次煎畢放出藥液過(guò)濾(60目篩)，合并濾液。(2)濃縮將濾液低于60℃減壓濃縮至750ml，冷卻。(3)醇沉濃縮液冷卻后，先加乙醇至含醇量75％，攪拌，靜置約1小時(shí)。取上清液，冷藏20-48小時(shí)，冰庫(kù)溫度控制在5℃以下。冷藏后過(guò)濾，低于60℃減壓蒸餾回收乙醇?；厥找掖贾翝饪s液約300ml，放冷至室溫。(4)再加乙醇至含醇量85％，用40％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，充分?jǐn)嚢?，靜置約1小時(shí)。冷藏40-68小時(shí)，冷藏后的二次醇沉液過(guò)濾，低于60℃減壓蒸餾回收乙醇。回收乙醇至約250ml(每1ml約含原生藥8.5-10g)。(5)超濾加注射用水至400ml，加10％鹽酸調(diào)pH至6.8，混勻，冷藏放置36-60小時(shí)，采用超濾膜超濾，收集濾液。(6)加入適量注射用水，加熱煮沸30分鐘，放冷至60℃，加入適量0.1％活性炭，保溫10分鐘，濾過(guò)，取藥液測(cè)得原始PH值，用10％的NaOH溶液調(diào)PH至6.8，用過(guò)濾后的注射用水補(bǔ)足至1000ml，并充分?jǐn)嚢杈鶆?。灌封，滅菌，即得?.權(quán)利要求1所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。所述的制備方法步驟(5)中使用的超濾膜是截留相對(duì)分子量1000—10000的中空纖維膜。3、權(quán)利要求l所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。所述的制備方法步驟(5)中使用的超濾膜可以是Romicon2000或Romicon5000其中的一種。4、權(quán)利要求l所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。所述的制備方法步驟(5)中使用的超濾膜可以為Romicon5000。5、權(quán)利要求1所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。所述的制備方法步驟(5)可以用葡聚糖凝膠色譜技術(shù)代替超濾技術(shù)，采用葡聚糖凝膠G15，步驟(4)所得藥液上葡聚糖凝膠柱，進(jìn)樣后收集從1/3-1/2柱體積開(kāi)始的洗脫液(最初的洗脫液為大分子物質(zhì)，廢棄)，洗脫液采用適量純凈水。6、權(quán)利要求l所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。所述的質(zhì)量控制方法包括如下內(nèi)容對(duì)丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A進(jìn)行定性和定量控制，在一定的色譜條件下測(cè)試供試液液相圖譜，本品要求每lml含丹參素鈉(GHANa)不得少于0.65mg;含原兒茶醛(C7H603)不得少于0.23mg;含丹酚酸B(C36H3。016)不得少于0.28mg，含丹酚酸A((^^0,。)不得少于0.10mg。7、權(quán)利要求6所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。所述的一定的色譜條件，包括如下因素色譜柱；流動(dòng)相；線性梯度洗脫程序；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,柱溫30°C，DAD掃描范圍:190~400亂8、權(quán)利要求7所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法，所述的一定的色譜條件中的色譜柱選用的是AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18或InertsilODS-3其中的一種。9、權(quán)利要求7所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法，所述的一定的色譜條件中的色譜柱，指的是AgilentZorbaxSB-C18。10、權(quán)利要求7所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法，所述的一定的色譜條件中的流動(dòng)相，指的是流動(dòng)相A:水一乙腈一甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈。11、權(quán)利要求7所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法，所述的一定的色譜條件中的線性梯度洗脫程序，具體條件如下0min0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%。12、權(quán)利要求6所述的一種新的丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法，所述的質(zhì)量控制方法中，對(duì)丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A進(jìn)行定性和定量控制，所得的HPLC圖譜中所述的四個(gè)特征峰的保留時(shí)間tK分別為丹參素鈉5.40min，原兒茶醛9.60min，丹酚酸B30.10min，丹酚酸A34.30min。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種丹參注射液的制備方法及其質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的丹參注射液的制備方法為在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)控制工藝工程中的濃縮溫度，在低堿度醇沉后，利用鞣質(zhì)和丹參主要有效成分水溶性丹酚酸類(lèi)成分相對(duì)分子量的差異除去少量殘留鞣質(zhì)；本發(fā)明丹參注射液質(zhì)量控制方法主要是采用同時(shí)控制丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素鈉以及原兒茶醛的有效含量為質(zhì)控指標(biāo)，該質(zhì)控方法有效提升了丹參注射液的質(zhì)量。使用本發(fā)明生產(chǎn)的丹參注射液真正達(dá)到了安全有效質(zhì)量可控的全新水平。大規(guī)模臨床應(yīng)用表明，本發(fā)明的丹參注射液不良反應(yīng)少、安全性高，療效確切，質(zhì)量可控。文檔編號(hào)A61P9/00GK101129463SQ20071014330公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年8月20日優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日發(fā)明者張建兵,柴建國(guó),沈培強(qiáng),潘迎鋒,王木蘭,許正宇,黎豫杭申請(qǐng)人:正大青春寶藥業(yè)有限公司