專利名稱：苦竹有效成分提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科，具體涉及從中草藥苦竹 中提取具有酪氨酸酶活性抑制作用的有效成分的方法。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶是黑素生物合成途徑中的主要限速酶。大多數(shù)能使皮膚脫色 的物質(zhì)都通過抑制該酶活性來阻滯皮膚黑素生成，屬酪氨酸酶抑制型皮膚 脫色劑(Depigmenting agent)。近年來，從微生物和植物藥中分離天然的 酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關(guān)注。它不但用于色素增加性皮膚病 (黃褐斑、雀斑等)的臨床治療，而且可用于化妝品使膚色增白。一般來說，與酪氨酸酶的底物類似的單酚類化合物氫醌能抑制該酶活 性，許多具有相似官能團結(jié)構(gòu)的單酚或多酚化合物也能抑制酪氨酸酶活 性。但氫醌及其它酚類化合物的外用制劑化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易氧化變色， 另外還有這類物質(zhì)引起皮膚永久性白斑的報告，限制了此類化合物的開發(fā) 和應(yīng)用。維生素C和熊果苷是當(dāng)前美白化妝品中比較常用的添加物。但是， 維生素C同樣也是非常不穩(wěn)定，無法直接添加到產(chǎn)品中，通常采用維生素 C的衍生物(如維生素C的磷酸鹽等)。而熊果苷在近年來的研究中也發(fā) 現(xiàn)其抑制酪氨酸酶活性不是非常穩(wěn)定。因此，尋找活性高、安全的酪氨酸 酶抑制劑仍是目前研究的一個熱點。竹子這一具有豐富資源的植物在國內(nèi)外已有多方面的開發(fā)利用。在化 妝品生產(chǎn)方面，除了作為一些化妝品輔助產(chǎn)品的原料以外，如睫毛刷、眼 影刷和腮紅刷等的手柄和一些化妝品的包裝盒之類產(chǎn)品，竹子還以竹類提
取物的形式被用作天然化妝品和功能性化妝品的有效添加物，具有保濕、美白、抗衰老、抗炎癥、清潔以及護發(fā)等多種功能。例如，意大利的Erbasol 公司從竹筍中提取得到(x-羥基酸具有更新細胞、保持pH平衡的作用，被 應(yīng)用于保濕沐浴露的生產(chǎn)；日本NOEVIA公司從一種開花竹中獲得的提取 物可以有效抑制B16黑素細胞中酪氨酸酶的T3異構(gòu)酶的生成，將其應(yīng)用 于新型美白化妝品的開發(fā)。國內(nèi)則由浙江安吉的圣氏生物制品有限公司開 發(fā)出的竹葉黃酮產(chǎn)品，可作為天然生物抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥、保健和化妝 品等多種行業(yè)中。目前對苦竹(尸/e/oZ /^y/w51 "附"n/s Keng (Keng) f. (Gramineae))的研究相對較少?？嘀窆S在中藥記載中具有清熱，除濕，明日，治療目痛， 口瘡，湯火傷等功能。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供上述中草藥提取物的制備方法。本發(fā)明提供的從苦竹(P/e/oWaWw Keng ( Keng ) f.(Gramineae))，特別是苦竹筍中制備的提取物中，主要有效成分是 Taxiphyllin， 2R-(3-D-吡喃葡萄糖基-2-對羥基苯乙腈，分子式為C14H17N07(分子量為311)，可占提取物的98%以上，結(jié)構(gòu)為將本發(fā)明所述提取物分離提純可得到白色針晶(氯仿-甲醇)，溶于水、 甲醇。在預(yù)制硅膠板上點樣展開，用碘顯色，斑點顏色由黃色逐漸變成綠 色，再變成藍色，且于空氣中放置，顏色并不消失；當(dāng)展開劑為氯仿-甲醇(2: 1);乙酸乙酯-甲醇(1: 3)苯-甲醇(2: 1)時，Rf值分別為0.56、0.17、 0.42。經(jīng)過電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)，高分辨電子轟擊質(zhì)譜 (HREI-MS) ， 13C NMR和& NMR等數(shù)據(jù)表明該化合物的分子式為 C14H17N07。元素分析顯示，該化合物含有一個腈基。^-NMR (400 MHZ， 二甲亞砜-d6)顯示，該化合物存在一對位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)(5 7.32和S 6.82，J = 8.6Hz， 4H)和一個羥基(S 9.84， 5 5.23， 5 5.05， 5 4.98和S 4.55， 5H)。 iH-NMR氫譜數(shù)據(jù)和已發(fā)表的Cyanogenic glucoside taxiphyllin數(shù)據(jù)一致。 "C-NMR碳譜數(shù)據(jù)如表1所示。表1苦竹提取物的"C-NMR碳譜數(shù)據(jù)c苦竹提取物CN118.51123.02128.93115.24157.85115.26128.9765.9r99.72，72.93，76,34，69.85，77.16，61.1本發(fā)明的中草藥提取物具體制備方法為 方法一1. 苦竹筍用50~90%倍體積的乙醇回流提取2次，得到浸膏；2. 苦竹筍浸膏加水溶解(約5 10倍體積)離心、過濾；3. 濾液用正丁醇或者氯仿、乙酸乙酯等溶劑萃??；4. 浸膏用硅膠柱，用氯仿-甲醇洗脫；5. 重結(jié)晶。 方法二1. 苦竹筍用IO倍體積的50 90%乙醇回流提取2次，得到浸膏;2. 苦竹筍浸膏加水溶解(約5 10倍體積)；3. 水溶液加入95%乙醇沉淀，放置過夜；4. 濾液濃縮過濾，并用氯仿、石油醚或等正丁醇溶劑萃?。?. 用大孔吸附樹脂吸附，用30~60%乙醇洗脫；6. 硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫；7. 以甲醇或丙酮、無水乙醇等重結(jié)晶。 方法三1. 苦竹筍用10倍體積的50 90%乙醇回流提取2次，得到浸膏；2. 苦竹筍浸膏加水溶解(約8 12倍體積)離心、過濾；3. 濾液稍加濃縮后用大孔樹脂洗脫，乙醇-水梯度洗脫；4. 洗脫液用硅膠柱層析進行分離，所用溶劑為氯仿-甲醇(2:l 5:l);5. 重結(jié)晶。本發(fā)明所述的苦竹有效成分提取物，具有良好的抗氧化活性，同時具 有明顯的酪氨酸酶抑制活性。將本發(fā)明的提取物和維生素C以及熊果苷在不同濃度下作酪氨酸酶活 性抑制對比，結(jié)果見圖1，可以看出在反應(yīng)物濃度較高時，苦竹有效成分 提取物(YF4332)和維生素C (Vc)活性水平基本接近，高于熊果苷；在 低濃度范圍內(nèi)，維生素C和熊果苷活性迅速下降，而苦竹有效成分提取物 (YF4332)下降緩慢。因此，苦竹有效成分提取物(YF4332)的作用范 圍比維生素C和熊果苷更加寬泛，有利于配方成本的降低。從上述內(nèi)容可知，本發(fā)明的苦竹有效成分提取物十分適合用于膚色增 白的化妝品，或者是色素增加性皮膚病藥物。


本申請中包括的附圖是說明書的一個構(gòu)成部分，附圖與說明書和權(quán)利要求書一起用于說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，用于更好地理解本發(fā)明。附圖中圖1是本發(fā)明的苦竹有效成分提取物(YF4332)和維生素C以及熊 果苷在不同濃度下的酪氨酸酶活性抑制對比示意圖。圖2是在黑素細胞中熊果苷和本發(fā)明的苦竹有效成分提取物 (YF4332)酪氨酸酶抑制活性與濃度的關(guān)系示意圖。圖3是在黑素細胞中熊果苷和本發(fā)明的苦竹有效成分提取物 (YF4332)黑素生成抑制與濃度的關(guān)系示意圖。
實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例不對本發(fā)明構(gòu) 成任何限制。實施例1按照分離方法一進行制備苦竹筍的乙醇浸膏8S2g，用5 10倍量水 溶解沉淀，過濾后的濾液用2 5倍量的溶劑如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等 萃取，萃取液經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(10:1 1:1)洗脫，重結(jié)晶后 得1812.7mg苦竹提取物。實施例2按照分離方法二進行制備苦竹筍的乙醇浸膏700g，用5 10倍水溶 解，加入2 4倍的95%乙醇放置過夜。過濾，濾液濃縮過濾后用正丁醇、 或氯仿、石油醚等溶劑萃取。萃取液經(jīng)甲醇溶解后過濾，濾液上大孔吸附 樹脂用30~60%的乙醇洗脫至無色，得餾份26g。經(jīng)甲醇溶解后上硅膠柱 層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，經(jīng)甲醇或丙酮、無水乙醇等重結(jié)晶后得白色 固體，即苦竹有效成分提取物0.68g。在本方法中，活性成分苦竹有效成分提取物(YF4332)得率為1%。； 其純度可以達到99.8%。實施例3按照分離方法三進行制各苦竹筍的乙醇浸膏500g,加入8 12倍體 積的水溶解、沉淀，離心過濾后的濾液稍稍濃縮，上大孔吸附樹脂用乙醇 -水梯度洗脫，得餾份14.8g (此時用高效液相色譜HPLC分析即可在 231.8nm檢測到苦竹有效成分提取物(YF4332)含量為73.4%)。然后上 硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(2:1 5:1)洗脫，重結(jié)晶后析出針狀晶體，即 苦竹有效成分提取物(YF4332) 157.6mg。實施例4 抗氧化活性分析
采用DPPH自由基清除法測定抗氧化活性。測定方法o.lml含有不同濃度添麗磊溺樣品與3.9ml的DPPH.乙醇 溶液充分混勻，室溫放置30分鐘后測定517納米吸光度值(OD517nm)。表l:抗氧化活性反應(yīng)物_IC50 ( % )維生素C 0.0003紅景天油性提取物 0.0004紅景天水提物 0.005菊花提取物* 1.51綠茶提取物* 0.0007綠茶水提物 0.05苦竹有效成分提取物 (YF4332)實施例5體外酪氨酸酶活性抑制測定原理在酪氨酸酶的作用下，左旋多巴(L-DOPA)氧化為棕褐 色的多巴色素(DOPAchrome)。測定方法0.5ml含有不同濃度添加劑的樣品與0.5ml的10u/ml酪氨 酸酶溶液和1.5ml緩沖液充分混勻，置3(TC水浴孵育20分鐘。然后在每 一試管中，加入1.0ml的0.2%L-DOPA， 30。C水浴準確反應(yīng)5分鐘，即刻 用分光光度計于475nm處測定多巴色素的吸收峰值，表2:酪氨酸:酶抑制活性反應(yīng)物IC50 (一)壬二酸19521維生素C磷酸鈉鹽7540維生素C159熊果苷327曲酸35苦竹有效成分提取物32(YF4332)實施例6
黑素細胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制測定方法B16黑素細胞培養(yǎng)24小時后添加苦竹有效成分提取物 (YF4332)，經(jīng)過48小時培養(yǎng)后用生理鹽水將培養(yǎng)基沖洗干凈。加入聚乙 二醇辛基苯基醚(Triton X-100)在37。C孵育30min，移取0.2ml用茚三酮 定量細胞蛋白質(zhì)，向余下細胞中加入Dopa，在37'C孵育30min時測定 OD475。測試了苦竹提取物在黑素細胞中對酪氨酸酶活性的抑制。結(jié)果如圖2 所示。數(shù)據(jù)表明苦竹有效成分提取物(YF4332)在黑素細胞中的確具有抑 制酪氨酸酶活性和黑素的作用。實施例7黑素細胞黑素生成抑制測定方法向培養(yǎng)24小時后的黑素細胞中添加苦竹有效成分提取物 (YF4332)，經(jīng)過48小時培養(yǎng)后用磷酸鹽緩沖液(PBS)將培養(yǎng)基沖洗 干凈。加入胰酶消化細胞。離心后去上清，同樣移取0.2ml用茚三酮定量 細胞蛋白質(zhì)，向余下細胞中加入NaOH煮沸20min，冷卻后測定400納米 吸光度值(OD400)。測試了苦竹提取物在黑素細胞中對黑素生成的抑制。結(jié)果如圖3所示。 數(shù)據(jù)表明苦竹有效成分提取物(YF4332)在黑素細胞中的確具有抑制黑素 生成的作用。
權(quán)利要求
1、一種苦竹有效成分提取物的制備方法，其特征在于包括下列步驟將苦竹原料用50～90％乙醇回流提取2次或2次以上，得到浸膏，將浸膏加5～10倍體積的水溶解，水溶液中加入濃度95％或者95％以上的乙醇沉淀，靜置后濃縮過濾，用例如正丁醇、石油醚、氯仿等溶劑萃取，然后用大孔吸附樹脂吸附，用30～60％的乙醇洗脫，再用氯仿甲醇混合液作為洗脫劑進行硅膠柱層析分離，重結(jié)晶后得到苦竹有效成分提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種苦竹有效成分提取物，其制備方法以及其在化妝品和制藥中的應(yīng)用。所述提取物的主要有效成分是Taxiphyllin(2R-β-D-吡喃葡萄糖基-2-對羥基苯乙腈)，其具有良好的抗氧化活性，同時具有明顯的酪氨酸酶抑制活性，可應(yīng)用于膚色增白的化妝品，或者是色素增加性皮膚病藥物。
文檔編號A61P17/00GK101112354SQ200710112730
公開日2008年1月30日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者慧 姚, 林惠芬, 魏少敏 申請人:上海家化聯(lián)合股份有限公司