專利名稱：用于抑制α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體來講涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及使用玻連蛋白受體αvβ5拮抗劑來抑制αvβ5-介導(dǎo)的血管生成的方法和組合物。
背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是一類細(xì)胞受體，已知與胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合，由此介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-胞外基質(zhì)的相互作用，即通常所謂的細(xì)胞粘著事件。雖然文獻(xiàn)中描述了許多整聯(lián)蛋白及其各自的配體，但許多整聯(lián)蛋白的生物功能仍是不清楚的。整聯(lián)蛋白受體由一簇具有共同結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)組成，為α和β亞基形成的非共價(jià)結(jié)合的異源二聚糖蛋白復(fù)合物。
玻連蛋白受體，以其優(yōu)先與玻連蛋白結(jié)合的本質(zhì)特征而命名，目前已知指三種不同的整聯(lián)蛋白，即αvβ1、αvβ3和αvβ5。Horton，國際實(shí)驗(yàn)病理符雜志(Int.J.Exp.Pathol.)，71741-759(1990)。αvβ1與纖連蛋白和玻連蛋白結(jié)合。αvβ3與多種配體結(jié)合，所述配體包括血纖維蛋白、血纖維蛋白原、層粘連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、玻連蛋白、von Willebrand因子、骨橋蛋白(osteospontin)和骨涎蛋白I。αvβ5與玻連蛋白結(jié)合。目前仍在研究這三種整聯(lián)蛋白在組織中細(xì)胞的許多相互作用中所起的特定的細(xì)胞粘著作用。但是有一點(diǎn)是清楚的，即存在著具有不同生物功能的不同的整聯(lián)蛋白，并且還存在著具有相同生物特性的不同的整聯(lián)蛋白和亞基。
許多整聯(lián)蛋白的配體中一個(gè)重要的識別位點(diǎn)是Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列。在上述已鑒別出的玻連蛋白受體整聯(lián)蛋白的所有配體中均發(fā)現(xiàn)了RGD?？梢杂煤蠷GD序列的為肽(“肽”)模擬RGD識別位點(diǎn)，已知這種RGD肽是整聯(lián)蛋白功能抑制劑。但是，重要的是應(yīng)注意到依賴于RGD肽的序列和結(jié)構(gòu)，可改變抑制作用的特異性，以靶向于特定的整聯(lián)蛋白。
論及RGD識別位點(diǎn)，參見Pierschbacher等，自然(Nature)，30930-33(1984)和Pierschbacher等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，815985-5988(1984)。改變整聯(lián)蛋白特異性的各種RGD多肽還被描述于Grant等，細(xì)胞(cell)，58933-943(1989)、Cheresh等，細(xì)胞(Cell)，58945-953(1989)、Aumailley等，F(xiàn)EBS Letts.，29150-54(1991)和Pfaff等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26920233-20238(1994)以及美國專利No.4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525、4,683,291、4,879,237、4,988,621、5,041,380和5,061,693。
血管生成，也指新血管形成，是一種組織血管形成的過程，包括新生血管的生長向組織中的。此過程由內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的浸潤作用介導(dǎo)。認(rèn)為該過程以下述三種方式之一進(jìn)行1)從預(yù)先存在的血管中可分枝生長出(Sprout)血管；2)從前體細(xì)胞中可從頭產(chǎn)生血管再生(血管發(fā)生)；或者3)已存在的小血管直徑增大。Blood等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Bioch.Biophys.Acta)，103289-118(1990)。已知血管內(nèi)皮細(xì)胞至少含有5種RGD-依賴性整聯(lián)蛋白，包括玻連蛋白受體(αvβ3或αvβ5)、膠原蛋白I型和IV型受體(α1β1)、層粘連蛋白受體(α2β1)、纖連蛋白/層粘連蛋白/膠原蛋白受體(α3β1)和纖連蛋白受體(α5β1)。Davis等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)，51206-218(1993)。已知平滑肌細(xì)胞至少含有6種RGD依賴性整聯(lián)蛋白，包括α5β1、αvβ3和αvβ5。
血管生成在新生兒生長中是一個(gè)重要過程，但其在傷口愈合和多種臨床主要疾病的發(fā)病機(jī)理中也非常重要，所述疾病包括組織炎癥、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑退變和其它新血管性眼病。這些與血管生成有關(guān)的臨床實(shí)例稱為血管生成性疾病。Folkman等，科學(xué)(Science)，235442-447(1987)。雖然在傷口愈合和黃體生長循環(huán)中發(fā)生血管生成，但在成人或成熟組織中通常沒有血管生成。例如參見Moses等，科學(xué)(Science)2481408-1410(1990)。
使用對各種整聯(lián)蛋白α或β亞基具有免疫特異性的單克隆抗體體外抑制細(xì)胞粘著會涉及包括微血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞類型的細(xì)胞粘著中的玻連蛋白受體αvβ3。Davis等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)，51206-218(1993)。此外，Nicosia等在美國病理學(xué)雜志(Am.J.Pathol.)，138829-833(1991)中還描述了使用RGD肽GRGDS體外抑制培養(yǎng)于膠原蛋白膠中大鼠主動脈的“微血管”形成。
但是，在膠原蛋白膠中“微血管”形成的體外抑制作用不是抑制組織中血管生成的模型，因?yàn)闆]有表明微血管結(jié)構(gòu)與新生毛細(xì)血管相同或膠原蛋白膠培養(yǎng)物中微血管形成與實(shí)體組織中新血管生長相同，所述組織如關(guān)節(jié)炎組織、腫瘤組織或疾病組織，其中需要抑制血管生成。
最近確證了αvβ3在血管生成中的作用。參見Brooks等科學(xué)(Science)，264569-571(1994)。表明整聯(lián)蛋白被表達(dá)于人傷口肉芽組織的血管中而在正常皮膚中不被表達(dá)。針對αvβ3受體的單克隆抗體抑制由生長因子(細(xì)胞因子)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及黑素瘤片段誘導(dǎo)的血管生成。然而拮抗劑僅抑制新血管，而不抑制預(yù)先存在的血管。并且，含RGD的特定的線性肽和環(huán)肽也表明能抑制新血管形成。
已有人提出血管生成的抑制將是一種用于限制腫瘤生長的有用療法。已提出通過下述方法抑制血管生成(1)抑制“生成血管的分子”如bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)的釋放，(2)如使用抗-bFGF抗體中和生成血管的分子，(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞對生成血管刺激物的答應(yīng)。后一種方法已受到關(guān)注，且Folkman等人在癌生物學(xué)(CancerBiology)，389-96(1992)中描述了幾種內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答抑制劑，包括膠原蛋白酶抑制劑、基底膜更新抑制劑、收縮血管的(angiostatic)類固醇、真菌衍生的血管生成抑制劑、血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)炎藥物如D-青霉胺和硫代蘋果酸金鹽、維生素D3類似物、α-干擾素以及可用于抑制血管生成的類似物。提出的其它血管生成抑制劑參見Blood等生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Bioch.Biophys.Acta.)，103289-118(1990)、Moses等科學(xué)(Science)，2481408-1410(1990)、Ingber等Lab.Invest.，5944-51(1988)和美國專利Nos.5,092,885、5,112,946、5,192,744、和5,202,352。
但是，直到本發(fā)明為止沒有人指出或明確整聯(lián)蛋白αvβ5在血管生成中的作用，而且上面參考文獻(xiàn)中所描述的任何一種血管生成抑制劑均沒有被靶向于抑制αvβ5。再者，除本發(fā)明之外，沒有參考文獻(xiàn)涉及新血管形成中的αvβ5，特別是由生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)的新血管形成。
雖然控制血管生成中涉及的生長因子的數(shù)目是有限的，但對于靜止?fàn)顟B(tài)向新血管狀態(tài)轉(zhuǎn)化存在著不同水平的控制過程。參見D′Amore，實(shí)驗(yàn)眼科學(xué)和視覺科學(xué)(Investigative ophthal.Visual Sci.)，353974-3979(1994)。當(dāng)血管生成中包括的一些生長因子被調(diào)節(jié)在合成水平時(shí)，其它生長因子由活化狀態(tài)調(diào)節(jié)。在受損傷或局部缺血后靜止血管經(jīng)歷新血管形成，產(chǎn)生這些細(xì)胞過程。
尤其是VEGF被認(rèn)為是初期腫瘤和局部缺血眼病中血管生成的主要介質(zhì)。參見Folkman，天然醫(yī)藥(Nature Medicine)，127-31(1995)中的綜述。VEGF是一種46千道爾頓(kDa)的同源二聚體，為內(nèi)皮細(xì)胞特異性的血管生成性(Ferrara等，內(nèi)分泌學(xué)綜述(Endocrin.Rev.)，1318-32(1992))和血管滲透性因子(Senger等，癌研究(Cancer Res.)，465629-5632(1986))，與具有酪氨酸激酶活性的高親和性膜結(jié)合受體相結(jié)合(Jakeman等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)，89244-253(1992))。
最近受體酪氨酸激酶的活化被表明能促進(jìn)整聯(lián)蛋白依賴性細(xì)胞在胞外基質(zhì)蛋白上遷移。具體來講，Klemke等在細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)，127859-866(1994)中提及了促進(jìn)細(xì)胞移動中的EGF受體(EGFR)酪氨酸激酶，但沒有提及用αvβ5整聯(lián)蛋白使FG人胰腺癌細(xì)胞粘附于玻連蛋白上。作者給出了直接證據(jù)，即，EGFR與EGF配體的結(jié)合活化了酪氨酸激酶對EFGR的活化作用，最終激活了蛋白激酶C(PKC)-依賴性途徑，導(dǎo)致誘發(fā)玻連蛋白底物的αvβ5-依賴性細(xì)胞的遷移，通常細(xì)胞在該底物上是不能遷移的。由此，Klemke等人的發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞遷移中細(xì)胞因子特別是EGF的存在與整聯(lián)蛋白活性之間的相關(guān)性提供了證據(jù)。已表明在小雞絨毛尿囊膜模型系統(tǒng)中PKC活化與血管生成的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。參見Tsopanoglou等，血管研究雜志(J.Vasc.Res.)，30202-208(1993)。該文作者鑒別出PKC特異的活化劑和抑制劑，它們在模型系統(tǒng)中分別刺激和抑制血管生成。
然而，上述的Klemke等人和Tsopanoglou等人都沒有描述各種情況和疾病狀態(tài)中在促進(jìn)血管生成時(shí)細(xì)胞因子的作用和αvβ5整聯(lián)蛋白的表達(dá)和/或活化，以及使用αvβ5特異性拮抗劑對疾病狀態(tài)的抑制。
最近的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在眼病猴模型系統(tǒng)中由視網(wǎng)膜靜脈閉塞誘發(fā)的視網(wǎng)膜缺血導(dǎo)致眼房中VEGF的快速上升。這種上升與Miller等人在美國病理學(xué)雜志(Am.J.Path.)，145574-584(1994)中所描述的觀察到的虹膜新血管形成是一致的。在增殖性視網(wǎng)膜病的小鼠模型系統(tǒng)中給出另一證據(jù)，其中誘發(fā)缺氧，在相對缺氧的6-12小時(shí)內(nèi)VEGF信使RNA顯示出上升狀態(tài)，保持高水平直至發(fā)生新血管形成。當(dāng)新血管衰退時(shí)，VEGF的表達(dá)也下降，正如Pierce等人在美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，92905-909(1995)中所述。
因此，局部缺血性動物模型中所顯示的最新數(shù)據(jù)將VEGF的誘導(dǎo)與局部缺血后新血管形成情況關(guān)聯(lián)起來。在包含新血管形成的其它情況和疾病中也涉及VEGF及其它生長因子，F(xiàn)olkman在天然醫(yī)藥(Nature Medicine)，127-31(1995)中作出了綜述。
Folkman等人的文章中還總結(jié)了用于控制不需要的血管生成的最新臨床手段。臨床試驗(yàn)中的病人接受血管生成抑制劑治療，所述抑制劑包括血小板因子4、煙曲霉素衍生物、羧氨三唑等等。但是，沒有文獻(xiàn)或現(xiàn)有治療方法將αvβ5的表達(dá)與血管生成特別是VEGF誘導(dǎo)的血管生成相互關(guān)聯(lián)起來。因此，本發(fā)明之前，沒有人描述過或使用過以αvβ5拮抗劑來控制經(jīng)受血管生成組織中血管生成的治療方案，所述血管生成與αvβ5的存在和活化是相關(guān)的。
因此，除了這里所報(bào)道的這些有關(guān)αvβ3和生長因子與血管生成的關(guān)系的研究外，申請人們沒有意識到其它任何證據(jù)，即使用αvβ5介導(dǎo)的細(xì)胞粘著抑制劑能夠抑制組織中血管生成。具體而言，以前從未證明過組織中血管生成需要αvβ5或者αvβ5抑制劑能抑制組織中血管生成，尤其是在眼新血管性疾病中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明證明了在需αvβ3的組織血管生成途徑之外，還存在著一條單獨(dú)的新的αvβ5-依賴性途徑。因此，本發(fā)明描述了能抑制血管生成的αvβ5抑制劑。本發(fā)明還描述了促進(jìn)血管生成中αvβ5介導(dǎo)的活性與生長因子受體酪氨酸激酶和蛋白激酶C(PKC)對生長因子(細(xì)胞因子)的活化有關(guān)。以此方式起作用的生長因子(細(xì)胞因子)包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)等等。
由此本發(fā)明描述了抑制組織中血管生成的方法，包括對該組織給藥一種組合物，該組合物含血管生成抑制量的αvβ5拮抗劑。
受治療組織可以是需要抑制血管生成的任何組織，如發(fā)生新血管形成的疾病組織。例如這些組織包括經(jīng)受新血管形成的眼組織、炎癥組織，實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移瘤、經(jīng)受再狹窄的組織和類似組織。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與αvβ5表達(dá)相關(guān)的新血管形成是暴露于生長因子、VEGF、TGF-α和EGF的結(jié)果。
具體優(yōu)選的治療方法是在產(chǎn)生血管生成的疾病組織例如眼中直接抑制VEGF誘導(dǎo)的血管形成，所述疾病包括糖尿病性視網(wǎng)膜病(也稱為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病)、與年齡相關(guān)的黃斑退變性、假性眼組織胞漿菌病、早熟視網(wǎng)膜病、鐮狀細(xì)胞視網(wǎng)膜病和新血管青光眼。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，治療方法是直接抑制發(fā)生于角膜新血管疾病中的血管生成，所述疾病狀況包括角膜移植術(shù)、皰疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼狀胬肉、與使用隱形眼鏡有關(guān)的新血管角膜翳等等。
本方法中使用的αvβ5拮抗劑能夠與αvβ5結(jié)合，并能競爭性抑制αvβ5結(jié)合天然玻連蛋白配體的能力。優(yōu)選此拮抗劑對αvβ5比對其它整聯(lián)蛋白具有特異性。在一具體優(yōu)選實(shí)例中，αvβ5拮抗劑抑制玻連蛋白或其它含RGD配體與αvβ5的結(jié)合，但基本上不抑制玻連蛋白與αvβ3或αIIbβ3的結(jié)合。優(yōu)選的αvβ5拮抗劑可以是一種線性或環(huán)化肽、一種單克隆抗體或其功能片段，或是一種模擬αvβ5配體的有機(jī)分子，也稱之為有機(jī)模擬物，所有這些拮抗劑與αvβ5均具有特異性相互作用。
本發(fā)明αvβ5拮抗劑的給藥方式包括眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、透皮、滑膜腔內(nèi)、肌內(nèi)或口服給藥。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，給藥方式與控制腫瘤發(fā)生和癌轉(zhuǎn)移的化學(xué)療法協(xié)調(diào)一致。


附圖構(gòu)成了本說明書的一部分圖1A-1D說明了由αv整聯(lián)蛋白抗體拮抗劑對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的家兔角膜血管生成的抑制作用。實(shí)施例4中描述了通過bFGF或VEGF處理來誘導(dǎo)血管生成及用αv整聯(lián)蛋白抗體拮抗劑P1F6(αvβ5)和LM609(αvβ5)進(jìn)行處理的效果。OD和OS分別為實(shí)驗(yàn)家兔的右眼和左眼。大箭頭表示水腫的角膜血管生成，小箭頭指明正常結(jié)膜緣血管。圖1A和1B示出用bFGF誘導(dǎo)血管生成，圖1C和1D示出用VEGF誘導(dǎo)。圖1A和1C中的家兔角膜示出用P1F6處理的效果，圖1B和1D示出用LM609處理的效果。
圖2A和2B為組方圖，分別示出用FGF或VEGF誘導(dǎo)再以P1F6或LM609單抗處理后新血管平均面積，以mm2+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n＝8，兩組系列中每一系列中只數(shù))。實(shí)施例4中討論了實(shí)施結(jié)果。
圖3A-3F以圖示說明了抗整聯(lián)蛋白抗體處理小雞CAM標(biāo)本的效果。結(jié)果描述于實(shí)施例6A中。用bFGF或VEGF誘導(dǎo)血管生成，隨后靜脈內(nèi)給藥磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照，或者用圖1說明中所述的P1F6或LM609單克隆抗體處理。以bFGF處理的CAM示于圖3A、3C和3E中，以VEGF處理的CAM示于圖3B、3D和3F中。接受靜脈注射PBS的對照CAM示于圖3A和3B中。用P1F6抗體處理CAM的情況示于圖3C和3D中，用LM609抗體處理CAM的情況示于圖3E和3F中。
圖4A和4B以組方圖形式提供了圖3A-3F中所示結(jié)果的數(shù)量值。在Y軸示出相對于對照或抗體處理的血管生成指數(shù)。圖4A和4B分別顯示出bFGF和VEGF誘導(dǎo)的血管生成。結(jié)果討論見于實(shí)施例4中。
圖5A-5F以圖示說明了合成肽處理實(shí)施例6所述的小雞CAM標(biāo)本的結(jié)果。用bFGF或VEGF誘導(dǎo)血管生成，隨后靜脈內(nèi)給藥磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照，或用合成環(huán)肽RGDfV(SEQ ID NO4)或RADfV(SEQ ID NO5)處理。以bFGF處理的CAM示于圖5A、5C和5E，以VEGF處理的CAM示于圖5B、5D和5F。接受靜脈內(nèi)注射PBS的對照CAM示于圖5A和5B。用RDGfV處理CAM示于圖5C和5D，用RADfV處理CAM示于圖5E和5F。
圖6A和6B以組方圖形式提供了圖5A-5F所示結(jié)果的數(shù)量值。在Y-軸示出相對于對照或抗體處理的血管生成指數(shù)。圖6A和6B分別表示bFGF-和VEFG誘導(dǎo)的血管生成。結(jié)果于實(shí)施例6中討論。
圖7A-7E表明針對分別由細(xì)胞因子、bFGF、TNF-α、VEGF和TGF-α誘導(dǎo)的CAM血管生成用抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體和calphostin C產(chǎn)生的效果。也評估了PMA。分析和結(jié)果描述于實(shí)施例6中。結(jié)果繪成組方圖形式，Y軸表示血管生成指數(shù)，X軸表示各種對照或抑制劑。圖7A-7E分別表明由bFGF、TNF-α、VEGF、TGF-α和PMA誘導(dǎo)的血管生成。
圖8表明在按實(shí)施例5C和6D所述進(jìn)行的小雞胚胎CAM測定中抗體處理CS1黑素瘤生長的效果組方圖。Y軸示出腫瘤重量，以毫克(mg)表示，X軸示出各種處理情況。CSAT是對整聯(lián)蛋白β1亞基特異的對照抗體。LM609和P1F6已在前面描述。
圖9是對照物和標(biāo)記的肽189(SEQ ID NO9)的αvβ5肽拮抗劑相比對黑素瘤生長產(chǎn)生的效果組方圖，測量黑素瘤體積為mm3，示于Y-軸。分析和結(jié)果描述于實(shí)施例8。
圖10說明了實(shí)施例10A-G中所述化合物7的合成。
圖11說明了實(shí)施例10A-C、H-I中所述化合物9的合成。
圖12說明了實(shí)施例10J中所述化合物10的合成。
圖13說明了實(shí)施例10K-L和10M-N中分別描述的化合物12和化合物14的合成。
圖14示出化合物15、化合物16、化合物17和化合物18的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所述化合物的具體合成過程描述于實(shí)施例10O-R中。
具體實(shí)施例方式
A.定義氨基酸殘基由多肽在肽鍵處的化學(xué)消化(水解)形成氨基酸。這里所述的氨基酸殘基優(yōu)選為“L”異構(gòu)體型式。但是，只要多肽仍保持所需的功能性質(zhì)，可以用“D”異構(gòu)體型式的殘基取代任何一種L-氨基酸殘基。NH2指存在于多肽氨基末端的游離氨基。COOH指存在于多肽羧基末端的游離羧基。為與標(biāo)準(zhǔn)多肽命名(描述于生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，2433552-59(1969)并在37CFR§1.822(b)(2)中被采納)一致，氨基酸殘基縮寫形式示于下面對應(yīng)表中對應(yīng)表

此外下述符號含義如下BOC 叔丁氧羰基DCCI二環(huán)己基碳化二亞胺DMF 二甲基甲酰胺OMe 甲氧基應(yīng)注意，此處用結(jié)構(gòu)式表示所有的氨基酸殘基序列，式子左右方向?yàn)榘被┒酥留然┒说某Ｒ?guī)方向。并且，應(yīng)注意在氨基酸殘基序列的開始或末端的短線表示一個(gè)肽鍵，與一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列相連。
多肽氨基酸殘基的一個(gè)線性序列，氨基酸殘基通過相鄰氨基酸殘基的α氨基和羧基間的肽鍵彼此連結(jié)起來。
肽不高于50個(gè)氨基酸殘基按多肽中方式彼此相連形成的線性序列。
環(huán)肽環(huán)肽由相應(yīng)線性肽衍生，其中不存在游離N或C-端，相應(yīng)線性肽的N-端與此相應(yīng)線性肽的C-端羧酸形成酰胺鍵。
蛋白質(zhì)多于50個(gè)氨基酸殘基按多肽中方式彼此連結(jié)形成的線性序列。
合成肽化學(xué)方法生產(chǎn)的由肽鍵連結(jié)在一起的氨基酸殘基鏈，沒有天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或其片段。
B.總的思路本發(fā)明總的來講涉及一種發(fā)現(xiàn)，即血管生成由特定的玻連蛋白受體αvβ5介導(dǎo)，抑制αvβ5功能能抑制血管生成。
由于血管生成在多種疾病過程中的作用，該發(fā)現(xiàn)很重要的。通過抑制血管生成，人們可以干預(yù)疾病、改善癥狀，且某些情況下治愈疾病。
當(dāng)新血管的生長是疾病相關(guān)的病理原因或?qū)Σ±碛杏绊憰r(shí)，抑制血管生成將會減少疾病的有害效果。疾病的例子包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、炎癥、再狹窄等等。當(dāng)需要生長新血管以支持有害組織生長時(shí)，血管生成的抑制將會減少對組織供血，由此有助于減少基于供血需求的組織大小。例子有，在應(yīng)答局部缺血中新血管的生長，導(dǎo)致生長因子誘發(fā)的血管生成，腫瘤的生長，其中新血管形成是一種連續(xù)性需求，由此腫瘤會生長超過幾毫米厚，并形成實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明方法局部有效，因?yàn)榇睡煼▽ρ苌墒歉叨冗x擇性的，對其它生物學(xué)過程則沒有。正如實(shí)施例中所示，僅有新血管生長含有大量αvβ5，因此該療法對成熟血管沒有副作用。
單獨(dú)使用αvβ5的抑制作用會有效抑制血管生成，這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)具有潛在高度特異性的且由此具有較低毒性的治療組合物創(chuàng)造了條件。雖然本發(fā)明揭示了能抑制一種或多種整聯(lián)蛋白的以肽為基礎(chǔ)的試劑的用途，但人們可以設(shè)計(jì)出更能選擇性抑制αvβ5的其它試劑。因此，某些以肽為基礎(chǔ)試劑對那些不是由αvβ5介導(dǎo)的其它生物學(xué)過程沒有抑制副作用。
例如，正如本說明書所示，要制備對與αvβ5而非αvβ1、αvβ3或αIIbβ3的免疫反應(yīng)具有高度選擇性的單克隆抗體是可能的，這與選擇性抑制αvβ5功能類似。此外，能設(shè)計(jì)出選擇抑制αvβ5的含RGD的肽，下文對此進(jìn)一步做出描述。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)之前，人們不知道通過使用拮抗αvβ5生物功能的試劑能夠在體內(nèi)抑制血管生成及依賴于血管生成的任何過程。
C.抑制血管生成的方法本發(fā)明提供了抑制組織中血管生成的方法，并由此抑制組織中依賴血管生成的事件的方法。一般來講，該方法包括對組織給藥一種組合物，所述組合物包含一種血管生成抑制量αvβ5拮抗劑。
在實(shí)施本發(fā)明方法中使用的靶組織被定義為含αvβ5的組織，其特征在于存在可檢測出的αvβ5整聯(lián)蛋白受體。換句話說，含αvβ5的組織被定義為在細(xì)胞膜中存在αvβ5受體復(fù)合物。這類組織包括上皮衍生細(xì)胞和間質(zhì)衍生細(xì)胞?？梢允褂枚喾N方法確定該受體的存在，所述方法包括受體與抗αvβ5整聯(lián)蛋白受體抗體的免疫反應(yīng)性，其中通過顯微鏡檢查法、免疫沉淀法、配體結(jié)合分析的競爭性及類似技術(shù)來檢測組織中免疫反應(yīng)。用于檢測組織中αvβ5存在的優(yōu)選抗體描述于下文及實(shí)施例1中。例如，實(shí)施例2中描述了通過免疫熒光顯微鏡檢術(shù)檢測αvβ5在腎、皮膚和眼組織中的分布。
在本發(fā)明方法的上下文中，含αvβ5的組織也表示具有血管生成現(xiàn)象的組織。如前所述，血管生成包括涉及組織新血管形成的各種過程，包括“生長出新血管(Sprout)”、血管發(fā)生或血管增大，所有這些血管生成過程均由αvβ5介導(dǎo)并依賴于αvβ5的表達(dá)。除外傷愈合、黃體形成和胚胎發(fā)生外，大多數(shù)血管生成過程被認(rèn)為與疾病過程有關(guān)，因此本發(fā)明治療方法的使用對疾病具有選擇性且沒有有害的副作用。
存在著許多種其中血管生成起重要作用的疾病，稱之為血管生成性疾病，它包括炎癥如免疫和非免疫炎癥，慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病和牛皮癬、與不合適或不正常血管侵染相關(guān)的疾病如再狹窄、動脈粥樣硬化斑毛細(xì)血管增殖和骨質(zhì)疏松癥、癌癥相關(guān)疾病如實(shí)體瘤、實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移瘤、血管纖維瘤、晶狀體后纖維組織形成、血管瘤、卡波濟(jì)肉瘤及需要新血管形成支持腫瘤生長的此類癌癥，但不限于此。
以新血管形成為特征的眼病是特別優(yōu)選的治療靶。眼新血管形成是大多數(shù)眼病中所視察到的最常見的病理變化，可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失。從預(yù)存在的脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜或副緣血管(paralimbal)生長新血管可引起水腫，出血或纖維血管膜形成，導(dǎo)致眼睛正常組織構(gòu)造關(guān)系的破壞并伴隨正常視覺功能的喪失。
以血管生成為特征的眼病包括角膜新血管疾病，有角膜移植、皰疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼狀胬肉、與使用隱形眼鏡有關(guān)的新血管角膜翳等等。其它眼病還包括糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、與年齡有關(guān)的黃斑退變(ARMD)、假性眼組織胞漿菌病(POHS)、早熟視網(wǎng)膜病(ROP)和新血管青光眼等等。盡管對這些疾病中血管生成的抑制不一定能治愈病根，但它能顯著減輕與血管生成有關(guān)的視覺疾病。
例如，患糖尿病超過25年的300000病人中90％多少有些DR，這是一種視網(wǎng)膜病，特征為損耗和/或增殖血管。事實(shí)上這些病人中30％具有后一種癥狀，可用本發(fā)明治療方法改善。對于ARDM，25％的超過65歲的人，約630000人多少患有該病，設(shè)想到2030年，將會有超過63000000的人患ARDM。因此，能抑制αvβ5相關(guān)的血管生成的本發(fā)明治療組合物和方法，具有重大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
因此，抑制發(fā)病組織中血管生成的方法改善疾病癥狀，并能根據(jù)疾病情況有助于治愈疾病。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)法抑制組織中血管生成本身。通過多種方法可以評估組織中血管生成的程度以及由本發(fā)明方法達(dá)到的抑制程度，這些方法描述于實(shí)施例中，通過免疫組織化學(xué)檢測αvβ5-免疫陽性的新生血管結(jié)構(gòu)和未成熟血管結(jié)構(gòu)。
正如這里所描述的，各種組織或由有機(jī)組織構(gòu)成的器官均能支持疾病狀態(tài)中的血管生成，這些組織包括皮膚、肌肉、腸、結(jié)締組織、關(guān)節(jié)、骨等類似組織，借助血管生成性刺激物血管能侵入這些組織中。
具體而言，本發(fā)明方法及αvβ5拮抗劑組合物在抑制由生長因子也稱細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成中具有治療用途。在生理?xiàng)l件下，血管生成受高度調(diào)節(jié)，且正如Brooks等在科學(xué)(Science)，264569-5761(1994)中已公開的，已證明血管生成被特定的血管生成性分子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)活化。還描述了血管生成的負(fù)調(diào)節(jié)劑。因此血管生成由局部刺激劑和抑制劑之間復(fù)雜的平衡來調(diào)節(jié)。參見，D′Amore，實(shí)驗(yàn)眼科和視覺科學(xué)(Investigative Ophthal.VisualSci.)，353974-3979(1994)。
當(dāng)緊密控制正常靜止毛細(xì)血管的血管生成性刺激劑和抑制劑間的生理平衡被打破時(shí)，如產(chǎn)生某些疾病狀態(tài)時(shí)，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞便被誘發(fā)增殖、遷移并最終分化，形成新血管。
血管生成特征在于是一個(gè)級聯(lián)過程，具有一系列早期過程，隨后是一系列晚期過程，正如Leibovich在細(xì)胞因子在腫瘤血管生成過程中的作用(Role of Cytokihes in the Process of Tumor Angiogenesis)一文中所做的綜述，該文在Aggarwal和Puri編的人細(xì)胞因子在疾病及治療中的作用(“Human CytokinesTheir Role in Disease andTherapy”)書中第35章，Blackwell Science，Ine(1995)。通過來自血管外源和血管生成性生長因子和細(xì)胞因子的遞送啟動早期過程。然后該早期過程進(jìn)入目標(biāo)微血管，破壞胞間連接、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化作用抗原和蛋白水解表型的表達(dá)并引發(fā)定向方式的內(nèi)皮細(xì)胞遷移。后期過程特征在于生長因子和細(xì)胞因子基因在生長的毛細(xì)血管芽細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自分泌表達(dá)和旁分泌表達(dá)，所述細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞，外膜細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。這些細(xì)胞反過來調(diào)節(jié)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致從已存在的成熟血管中形成新功能毛細(xì)血管袢。
正如此處和背景技術(shù)中所述，文獻(xiàn)中的報(bào)道描述了在人和實(shí)驗(yàn)動物中生長因子的出現(xiàn)與增殖性新血管眼病中發(fā)生血管生成之間的聯(lián)系，其中包括那些隨腫瘤塊增大與αvβ5表達(dá)增多有關(guān)的生長因子，即VEGF、TGF-α和EGF。
因此，在多種其它生長因子中VEGF、EGF、TGF-α被認(rèn)為是以刺激細(xì)胞生長這一性質(zhì)為特征的生長因子。生長因子是由一種細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，作用于分泌細(xì)胞或另一種細(xì)胞。它們能起作用依賴于生長因子受體的存在，這些受體通常是跨膜蛋白。生長因子如VEGF通常也被稱為細(xì)胞因子，被定義為由一種細(xì)胞分泌的多肽激素，影響相同細(xì)胞(自分泌)或另一種細(xì)胞(旁分泌)的生長和代謝。術(shù)語細(xì)胞因子不限于由免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的分子和同一系統(tǒng)的生物答修飾因子。因此，術(shù)語細(xì)胞因子是一個(gè)寬范疇，其中一個(gè)基于生物應(yīng)答型的子范疇是刺激性生長因子或增強(qiáng)因子，如VEGF、bFGF、EGF、TGF-α等等。參見Aggarwal等人的綜述細(xì)胞因子和細(xì)胞因子的常見和不常見性質(zhì)綜述(Common and Uncommon Features of Cytokines andCytokine ReceptorsAn Overview)，該文在Aggarwal和Puri編的“人細(xì)胞因子在疾病和治療中的作用”(Human CytokinesTheir Role inDisease and Therapy)第1章中，Blackwell Science Inc.(1995)出版。
本發(fā)明中，αvβ5特異性拮抗劑而非抗VEGF抗體這種生長因子拮抗劑被計(jì)劃用于抑制組織中血管生成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此處所述的αvβ5拮抗劑被用于抑制生長因子誘導(dǎo)的血管生成，其中αvβ5整聯(lián)蛋白受體的表達(dá)被誘導(dǎo)。本說明書中優(yōu)選的生長因子包括VEGF、EGF、TGF-α等等。
正如背景技術(shù)中所討論的，已知生長因子EGF和VEGF均與用作酪氨酸激酶的其細(xì)胞受體結(jié)合。進(jìn)一步證明了EGF受體的活化與蛋白激酶C的活化有關(guān)，其中蛋白激酶C活化導(dǎo)致αvβ5活化，使得特定細(xì)胞在玻連蛋白底物上遷移。因此，在細(xì)胞因子或生長因子中的暴露與整聯(lián)蛋白表達(dá)或活化中的協(xié)調(diào)應(yīng)答之間的作用機(jī)理是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。正如本發(fā)明所示(參見實(shí)施例6A)，使用細(xì)胞因子VEGF處理家兔眼模型或小雞絨毛尿囊模型中的組織，導(dǎo)致依賴于蛋白激酶C活化的αvβ5-強(qiáng)化的血管生成。
在一具體優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明計(jì)劃使用αvβ5拮抗劑來抑制已由VEGF誘導(dǎo)出血管生成的任何組織中的血管生成。例如，已證明在各種動物模型系統(tǒng)中視網(wǎng)膜缺血造成Muller細(xì)胞分泌的VEGF的向上調(diào)節(jié)，由此VEGF的產(chǎn)生誘導(dǎo)眼內(nèi)組織的新血管形成，參見Miller等美國病理學(xué)雜志(Am.J.Path.)，145574-584(1994)和Pierce等美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)92905-909(1995)。
因此，本發(fā)明中要治療的組織是患有上述糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑退變、新血管青光眼或類似疾病的病人的視網(wǎng)膜組織，并且要抑制的血管生成是視網(wǎng)膜組織血管生成，其中有視網(wǎng)膜組織的新血管形成。這類組織的例子在上文和實(shí)施例中描述，包括眼新血管形成疾病患者的角膜組織。用于詳估本發(fā)明αvβ5拮抗劑對視網(wǎng)膜血管生成的治療效果的一例模型系統(tǒng)是實(shí)施例9中所述的視網(wǎng)膜新血管形成的小鼠模型。
在另一有關(guān)實(shí)施方案中，要治療的組織是發(fā)炎的組織，要抑制的血管生成是發(fā)炎組織血管生成，其中有發(fā)炎組織的新血管形成。這類情況中，本方法計(jì)劃抑制關(guān)節(jié)炎組織如患慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中的血管生成、抑制免疫或非免疫發(fā)炎組織和牛皮癬等組織中的血管生成。
細(xì)胞因子白介素1和腫瘤壞死因子α被認(rèn)為與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)，基于內(nèi)皮細(xì)胞上粘連分子表達(dá)的誘導(dǎo)和酶的釋放它們在關(guān)節(jié)破壞中具有直接作用。參見Arend等，關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕(Arthritis &Rheumatism)，38151-160(1995)。已有人提出了治療方案，使用細(xì)胞因子特異性抑制劑阻斷這兩種細(xì)胞因子，并靶向于疾病中表達(dá)的細(xì)胞粘連分子。參見Haskard等細(xì)胞粘附通訊(Cell AdhesionComm.)，2235-238(1994)。
因此，通過將療法針對αvβ5粘著分子的參與來抑制關(guān)節(jié)炎中血管生成是發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，正如本發(fā)明前文所述。
在另一有關(guān)實(shí)施方案中，要治療的組織是患有實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移瘤、皮膚癌、乳腺癌、血管瘤或血管纖維瘤等這類癌癥的病人的腫瘤組織，要抑制的血管生成是腫瘤組織血管生成，其中有腫瘤組織的新血管形成?？捎杀景l(fā)明方法治療的典型實(shí)體瘤組織包括肺、胰、乳腺、結(jié)腸、喉、卵巢等類似組織。
存在于人實(shí)體瘤中復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)的作用是Leek等人在白細(xì)胞生物學(xué)(J.Leukocyte Biol.)，56423-435(1994)中的綜述主題，該文章在此引作參考文獻(xiàn)。
多種細(xì)胞因子，包括VEGF、酸性和堿性FGF(bFGF)、TGF-α和-β、EGF、TNF-α、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血管生成素、干擾素α和γ、白介素1、白介素6和8等等，被認(rèn)為影響惡性組織和細(xì)胞系中血管生成的各種細(xì)胞機(jī)制。例如，除了其在各種腫瘤中的定位，VEGF最近還被證明與乳腺癌中的血管生成有關(guān)，正如Brown等人在人類病理學(xué)(Human Path.)2686-91(1995)中所述。
通過使用抗細(xì)胞因子抗體篩選腫瘤組織樣品可鑒別出分泌各種細(xì)胞因子并在其中作為應(yīng)答誘導(dǎo)局部血管生成的腫瘤，特別是本發(fā)明中具有細(xì)胞因子VEGF、TGF-α和EGF及產(chǎn)生的αvβ5介導(dǎo)的血管生成的腫瘤。這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的，無論是用于培養(yǎng)的還是用于活檢的腫瘤組織樣品。從Oncogene Science(Uniondale，NY)或Upstate Biotech Incorporated(Lake Placid，NY)可購買到抗上述細(xì)胞因子的抗體。用這些方法篩選所選的腫瘤組織，允許人們對本發(fā)明αvβ5拮抗劑的潛在的血管生成抑制活性進(jìn)行評估。
實(shí)施例中描述了腫瘤組織血管生成及其抑制的例子。
抑制腫瘤組織血管生成也是本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案，因?yàn)樵谀[瘤生長中新血管形成起重要作用。在沒有新血管形成的腫瘤組織中，腫瘤組織得不到所需營養(yǎng)，生長減慢，停止再生長，退化并最終壞死，導(dǎo)致腫瘤死亡。
換句話說，根據(jù)本方法通過抑制腫瘤血管生成，本發(fā)明提供了抑制腫瘤新血管形成的方法。類似地，通過實(shí)施血管生成抑制法，本發(fā)明提供了抑制腫瘤生長的方法。
這些方法對抑制轉(zhuǎn)移瘤的形成也特別有效，因?yàn)?1)它們的形成要求初始腫瘤的血管形成，從而轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞可移出初始腫瘤，(2)它們在第二位點(diǎn)的確立需要新血管形成以支持轉(zhuǎn)移瘤的生長。在有關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明將其它療法如直接抑制實(shí)體瘤和控制轉(zhuǎn)移瘤確立的常規(guī)化學(xué)療法與本方法結(jié)合使用。通常在化學(xué)治療中或治療后給藥血管生成抑制劑，雖然有時(shí)優(yōu)選在化學(xué)療法之后抑制血管生成，其中腫瘤組織將通過誘導(dǎo)血管生成對毒素攻擊作出應(yīng)答，以對腫瘤組織提供血液和營養(yǎng)使其恢復(fù)。此外，作為抑制轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)防措施將實(shí)體瘤除去的情況中，優(yōu)選在手術(shù)后實(shí)施血管生成抑制法。
既然本方法用于抑制腫瘤新血管形成，它們也可用于抑制腫瘤組織生長、抑制轉(zhuǎn)移瘤的形成和使已形成腫瘤退化。對于后一種情況，在本發(fā)明使用的家兔眼分析模型中評估腫瘤塊的減小，或使用嵌合小鼠人模型的模型系統(tǒng)，其中具有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠的皮膚以人新生包皮取代，如Yan等人在臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)，91986-996(1993)中所述，該文內(nèi)容在此引作參考。后一模型是使用本發(fā)明方法研究血管生成及其抑制的另一個(gè)活體模型。實(shí)施例5C和5D中示出使用家兔腫瘤模型和本發(fā)明αvβ5拮抗劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)施例8中描述了在SCID小鼠模型中抑制血管生成的結(jié)果。
再狹窄是一種平滑肌細(xì)胞(SMC)遷移并在經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)處增殖的過程，阻礙血管成形術(shù)的成功。在再狹窄中SMC的遷移和增殖可被認(rèn)為是一種血管生成過程，被本發(fā)明方法抑制。因此，根據(jù)本方法通過在血管成形術(shù)后的病人中抑制血管生成，本發(fā)明還抑制了再狹窄。通常在血管成形術(shù)后給藥αvβ5拮抗劑用于抑制再狹窄，給藥約2天至約28天，且常常為術(shù)后前14天左右。
雖然本發(fā)明原理表明其對包括在術(shù)語“患者”中的所有哺乳動物是有效的，但在本發(fā)明許多實(shí)施方案中治療的患者應(yīng)是人。本文中，認(rèn)為哺乳動物包括任意哺乳動物種類，特別是農(nóng)業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)中的哺乳動物種類，其中使用本發(fā)明方法對其進(jìn)行治療。
抑制組織中血管生成的本方法以及由此用來治療血管生成相關(guān)疾病的方法，包括用一種組合物接觸發(fā)生血管生成或快要發(fā)生血管生成的組織，所述組合物含治療有效量的能抑制αvβ5與其天然受體結(jié)合的αvβ5拮抗劑。因此，本方法包括對病人給藥治療有效量的生理上可耐受的組合物，該組合物含一種本發(fā)明的αvβ5拮抗劑。
αvβ5拮抗劑的給藥劑量范圍如下文所述依賴于拮抗劑的型式及其效力，并且用量足夠產(chǎn)生所需效果，血管生成及由血管生成介導(dǎo)的疾病癥狀均被減輕。劑量不應(yīng)太大以致產(chǎn)生副作用，如粘滯性過高綜合征、肺水腫、充血性心臟衰竭等等。通常，劑量隨年齡、身體條件、性別和病人患病程度而不同，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在任何一種并發(fā)癥的情況中該劑量也可由醫(yī)生個(gè)人調(diào)節(jié)。
αvβ5拮抗劑是一種通過抑制受體與其配體即玻連蛋白的結(jié)合活性來阻斷或抑制αvβ5生理或藥理活性的分子。優(yōu)選的αvβ5拮抗劑可以是單克隆抗體、肽或模擬αvβ5配體的有機(jī)分子。
治療有效量是αvβ5拮抗劑用量足以對被治療組織中的血管生成產(chǎn)生可測出的抑制作用，即血管生成抑制量。通過這里所述的免疫組織化學(xué)或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它方法可原位測量血管生成的抑制。
既然αvβ5拮抗劑可以是αvβ5配體有機(jī)模擬物、含RGD的肽、抗αvβ5單克隆抗體或其片段或αvβ5受體模擬物的形式，應(yīng)理解效力和“治療有效”量的表達(dá)是可以變化的。但正如這些分析鑒定方法所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易評估本發(fā)明候選αvβ5拮抗劑的效力。
正如此處所述，通過各種方法包括在CAM分析中、在活體家兔眼分析中血管生成的抑制及通過測定天然配體與αvβ5結(jié)合的抑制及類似分析等，可以測定αvβ5拮抗劑的效力。
一個(gè)優(yōu)選的αvβ5拮抗劑在其濃度小于0.5微摩爾濃度(μM)，優(yōu)選小于0.1μM，更優(yōu)選小于0.05μM時(shí)能基本抑制溶液中天然配體如玻連蛋白與αvβ5的結(jié)合。“基本”意思指在αvβ5拮抗劑存在時(shí)由于抑制作用觀察到與玻連蛋白的結(jié)合至少減少了50％，這里在50％抑制作用時(shí)稱為IC50值。
更優(yōu)選的αvβ5拮抗劑對αvβ5比對其它整聯(lián)蛋白具有選擇性。因此，優(yōu)選的αvβ5拮抗劑基本抑制玻連蛋白與αvβ5的結(jié)合，而基本不抑制玻連蛋白與另一種整聯(lián)蛋白如αvβ1、αvβ3或αIIbβ3的結(jié)合。具體優(yōu)選的αvβ5拮抗劑，在抑制玻連蛋白與αvβ5結(jié)合時(shí)呈現(xiàn)的IC50活性比在抑制玻連蛋白與另一整聯(lián)蛋白結(jié)合時(shí)的IC50活性低10倍至100倍。實(shí)施例中描述了在抑制玻連蛋白與整聯(lián)蛋白結(jié)合時(shí)測定IC50活性的分析方法。
本發(fā)明單克隆抗體形式的αvβ5拮抗劑的治療有效量通常是當(dāng)以一種生理上可耐受的組合物給藥時(shí)該量足以達(dá)到血清濃度0.01μg/ml至約100μg/ml，優(yōu)選約1μg/ml至約5μg/ml，通常約5μg/ml。換句話說，每天一劑或多劑給藥，劑量可以從約0.1mg/kg至約300mg/kg、優(yōu)選約0.2mg/kg至約200mg/kg、最優(yōu)選約0.5mg/kg至約20mg/kg變化，給藥一天或幾天。
當(dāng)拮抗劑為單克隆抗體的片段形式時(shí)，可根據(jù)片段大小相對于完整抗體大小容易調(diào)節(jié)用量。優(yōu)選血漿摩爾濃度為約2μM至約5μM，并優(yōu)選約100μM至1mM的抗體拮抗劑。
本發(fā)明多肽形式或其它相似大小的小分子αvβ5配體模擬物形式的αvβ5拮抗劑，其治療有效量通常是當(dāng)以一種生理上可耐受的組合物給藥時(shí)，多肽量足以達(dá)到血漿濃度約0.1μg/ml至約200μg/ml，優(yōu)選1μg/ml至約150μg/ml。每摩爾質(zhì)量約為500g的多肽，優(yōu)選血漿摩爾濃度約為2μM至約5mM，優(yōu)選約100μM至1mM的多肽拮抗劑。換句話說，每天一劑或多劑給藥時(shí)，每公斤體重劑量可以從約0.1mg/kg至約300mg/kg，優(yōu)選0.2mg/kg至約200mg/kg變化，給藥一天或多天。
本發(fā)明單克隆抗體、多肽或有機(jī)模擬物可通過注射或一段時(shí)間內(nèi)逐漸輸注進(jìn)行腸胃外給藥。雖然一般通過全身給藥且更常見的是通過靜脈內(nèi)給藥治療組合物可以進(jìn)入要治療的組織，但是，當(dāng)靶向組織可能含有靶分子時(shí)應(yīng)考慮其它組織和遞送方式。因此，本發(fā)明的單克隆抗體、多肽或有機(jī)模擬物可以被眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、透皮給藥，也可用蠕動方式進(jìn)行遞送。
例如通過注射單位劑量，通常靜脈內(nèi)給藥含αvβ5拮抗劑的本發(fā)明治療組合物。術(shù)語“單位劑量”當(dāng)用于本發(fā)明治療組合物時(shí)，指物理上分開的單元，適于給患者的單元藥劑，每個(gè)單元含預(yù)定量的活性物質(zhì)，為產(chǎn)生所需治療效果計(jì)算出這一數(shù)值，與所需稀釋劑即載體或賦形劑配伍。
在如實(shí)施例所示的優(yōu)選實(shí)施方案中，以單一劑量靜脈內(nèi)給藥αvβ5拮抗劑。
以適合劑型的方式和治療有效量給藥組合物。給藥量和給藥時(shí)間依賴要治療的患者、患者身體系統(tǒng)利用活性成分的能力和所需程度的治療效果。給藥所需的活性成分的精確量依賴實(shí)施者的判斷且每個(gè)人各有特點(diǎn)。但是，此處公開了全身施用的合適的劑量范圍，且此范圍依賴給藥途徑。合適的給藥方案也是可變的，但是其特征都是初次給藥后間隔1小時(shí)或幾小時(shí)通過隨后的注射或其它方式給藥重復(fù)劑量?；蛘?，考慮連續(xù)靜脈內(nèi)輸注，足以保持血中濃度在活體內(nèi)治療規(guī)定的范圍內(nèi)。
D.治療組合物本發(fā)明設(shè)計(jì)了用于實(shí)施此處所述治療方法治療組合物。本發(fā)明治療組合物包含生理上可耐受的載體及這里所述的αvβ5拮抗劑，拮抗劑溶解或分散于載體中作為活性成分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)對哺乳動物或人患者給藥αvβ5拮抗劑治療組合物用于治療目的時(shí)，它是非免疫原性的。
此處所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”“生理上可耐受的”及其各種詞性形式，當(dāng)其指組合物、載體、稀釋劑和試劑時(shí)，可交換使用，表示能將這些物質(zhì)給藥或用于哺乳動物，不會產(chǎn)生不需要的生理效應(yīng)，如惡心、眩暈、胃不適等等。
根據(jù)配方，含有活性成分的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域熟知的，不必受限制，其中活性成分是溶解或分散于組合物中的。通常將這種組合物制備成可注射的形式如液體溶液或懸浮液，但是也可制成適于變成溶液或懸浮液的固體形式，使用前溶于液體。制劑也可以是乳化的。
可將活性成分與藥學(xué)上可接受的、與活性成分相容的且用量適于此處所述療法的賦形劑混合。例如，合適的賦形劑有水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其結(jié)合物。此外，如果需要的話，組合物可含有微量助劑如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等，其增強(qiáng)活性成分的有效性。
本發(fā)明治療組合物可包括其成分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括與無機(jī)酸如鹽酸、磷酸或與有機(jī)酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成酸加成鹽(由多肽游離氨基形成)。由游離羧基形成的鹽也可以從無機(jī)堿如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物及從有堿如異丙胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等衍生。
當(dāng)用于環(huán)肽αvβ5拮抗劑的制備時(shí)，具體優(yōu)選的是鹽酸鹽。
生理上可耐受的載體是本領(lǐng)域熟知的。液體載體的例子有無菌水溶液，除活性成分和水之外它不含任何物質(zhì)，或含一種緩沖液如生理pH值的磷酸鈉，含生理鹽水或含這兩種物質(zhì)如磷酸鹽緩沖鹽水。并且，水溶液載體可以含多于一種的緩沖鹽，及氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶質(zhì)。
液體組合物還可以含有除水之外的液體相。這種附加的液體相例子有甘油、植物油如棉子油和水油乳濁液。
治療組合物含有血管生成抑制量的本發(fā)明αvβ5拮抗劑，通常被配制成單位重量的總治療組合物含至少0.1重量百分比的拮抗劑。重量百分比是抑制劑重量與組合物總重的比率。因此，0.1重量百分比是每100g總組合物中有0.1g的抑制劑。
E.整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑本方法中使用αvβ5拮抗劑抑制組織中血管生成，此拮抗劑可以是多種形式的，包括化合物，其與αvβ5相互作用從而阻礙αvβ5與天然αvβ5配體間的功能相互作用。拮抗劑的例子包括αvβ5的類似物或模擬物，其由αvβ5的配體位點(diǎn)上結(jié)合衍生而來；αvβ5天然配體的模擬物，其模擬αvβ5配體結(jié)合相互作用中涉及的結(jié)構(gòu)區(qū)域；多肽，具有與αvβ5特異的天然配體的功能結(jié)合區(qū)域相應(yīng)的序列，特別是與αvβ5天然配體中包含RGD的區(qū)域相應(yīng)的序列；以及與αvβ5或天然配體進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體，所有這些物質(zhì)均表現(xiàn)出此處所定義的拮抗劑活性。
1.多肽在一實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)計(jì)使用多肽形式的αvβ5拮抗劑。αvβ5多肽(肽)拮抗劑可以具有αvβ5天然配體的序列特征，或αvβ5本身在αvβ5-配體相互作用中涉及的區(qū)域序列特征，此多肽具有此處所述的αvβ5拮抗劑活性。優(yōu)選的αvβ5肽拮抗劑含有RGD三肽，且與天然配體含RGD區(qū)域序列一致。
優(yōu)選的含RGD多肽序列與αvβ5天然配體如玻連蛋白的含RGD區(qū)的氨基酸殘基序列一致，其中玻連蛋白的序列是熟知的。
正如前所述，一個(gè)具體優(yōu)選的αvβ5肽拮抗劑，在αvβ5和其它整聯(lián)蛋白相比時(shí)，優(yōu)先抑制αvβ5與其天然配體結(jié)合。至少特別優(yōu)選這些αvβ5特異性肽，因?yàn)閷Ζ羦β5的特異性減少副反應(yīng)如抑制其它整聯(lián)蛋白的發(fā)生。在典型的結(jié)合抑制分析如實(shí)施例中所述的ELISA分析中能很快鑒別出優(yōu)選的對αvβ5具有特異性的αvβ5肽拮抗劑。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含不多于100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不多于60個(gè)殘基，更優(yōu)選不多于30個(gè)殘基。肽可以是線性的或環(huán)狀的，盡管特別優(yōu)選肽是環(huán)狀的。實(shí)施例中描述了優(yōu)選的肽。
應(yīng)理解，主題多肽不必與αvβ5天然配體的氨基酸殘基序列等同，只要該多肽包含拮抗αvβ5配體與αvβ5結(jié)合所必需的序列并能在這里描述的分析中用作αvβ5拮抗劑即可。
主題多肽包括此處示出其氨基酸序列的多肽的任何類似物、片段或化學(xué)衍生物，只要此多肽是αvβ5拮抗劑。因此，可以對現(xiàn)存多肽進(jìn)行各種改變、取代、插入和缺失，這些變化提供了某些使用中的優(yōu)點(diǎn)。從這方面看，本發(fā)明αvβ5多肽拮抗劑與所列舉的肽序列是相應(yīng)的，而非等同，其中進(jìn)行了一處或多處改變且在這里所述的一種或多種分析中保持用作αvβ5拮抗劑的功能。
因此，多肽可以是各種形式的肽衍生物，包括酰胺、與蛋白的結(jié)合物、環(huán)肽、聚合肽、類似物、片段、化學(xué)修飾的肽等此類衍生物。
術(shù)語“類似物”包括任何多肽，它的氨基酸殘基序列與此處具體示出的序列基本相同，其中一個(gè)或多個(gè)殘基被功能相似的殘基保守性替換，表現(xiàn)出此處所述的αvβ5拮抗劑活性。保守性替換的例子包括用一個(gè)非極性(疏水)殘基如Ile、Val、Leu或Met替換另一個(gè)非極性殘基，用一個(gè)極性(親水)殘基替換另一個(gè)極性殘基如Arg和Lys之間、Gln和Asn之間、Gly和Ser之間的替換，用一個(gè)堿性殘基如Lys、Arg或His替換另一個(gè)堿性殘基，或用一個(gè)酸性殘基如Asp或Glu替換另一個(gè)酸性殘基。
術(shù)語“保守性替換”也包括用化學(xué)衍生的殘基替換非衍生的殘基，條件是該多肽具有必需的抑制活性。
“化學(xué)衍生物”指一個(gè)多肽，具有一個(gè)或多個(gè)通過側(cè)鏈官能團(tuán)的反應(yīng)化學(xué)衍生的殘基。例如這類衍生分子包括那些游離氨基被衍生形成胺鹽酸鹽的分子、對甲苯磺酰基、芐氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲?；?。游離羧基可被衍生，形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼。自由羥基可被衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-咪唑-芐基組氨酸(N-im-benzylhistidine)?；瘜W(xué)衍生物也包括含一個(gè)或多個(gè)20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)天然衍生物的那些肽。例如可用4-羥基脯氨酸替換Pro；用5-羥基賴氨酸替換Lys；用3-甲基組氨酸替換組氨酸；用高絲氨酸替換絲氨酸；用烏氨酸替換賴氨酸。本發(fā)明多肽也包括相對于這里所示序列的多肽增加和/或缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的任何多肽，只要保持必需的活性即可。
術(shù)語“片段”指氨基酸殘基序列比此處所示多肽氨基酸殘基序列短的任何多肽。
當(dāng)本發(fā)明多肽的序列與αvβ5天然配體的序列不等同時(shí)，通常由于已進(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)保守性或非保守性替換，所以常替換不多于30％的氨基酸殘基，優(yōu)選不多于10％的氨基酸殘基。為提供一個(gè)“接頭”使本發(fā)明多肽通過此接頭被方便地固定于標(biāo)記上或固體基質(zhì)或載體上，在多肽的每個(gè)末端也可加入另外的殘基。
下面描述了可用于多肽的標(biāo)記、固體基質(zhì)和載體。
通常氨基酸殘基接頭至少是一個(gè)殘基，可以是40個(gè)或更多殘基，更常見的是1至10個(gè)殘基，但它不形成αvβ5配體表位。用于連接的常用氨基酸殘基是酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。此外，除非特別指出，主題多肽與αvβ5配體的天然序列可以通過氨基末端?；饔萌缫阴；驇€基乙酸酰胺化作用，羧基末端酰胺化作用如使用氨、甲胺酰胺化等末端修飾作用對序列進(jìn)行修飾而不同。正如人們所熟知的，末端修飾能用于減少對蛋白酶消化的敏感性，從而延長多肽在溶液中特別是可存在蛋白酶的生物學(xué)流體中的半衰期。在這方面，多肽環(huán)化作用也是有用的末端修飾，并且也因?yàn)榄h(huán)化作用形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及這里所述環(huán)肽顯示的生物活性，特別優(yōu)選多肽環(huán)化作用。
本發(fā)明多肽均可被用于形成藥學(xué)上可接受的鹽。能與本發(fā)明肽形成鹽的合適的酸包括無機(jī)鹽，如三氟乙酸(TFA)、鹽酸(HCl)、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、對氨基苯磺酸等。優(yōu)選HCl鹽。
能與本發(fā)明肽形成鹽的合適的堿包括無機(jī)堿如氫氧化物、氫氧化銨、氫氧化鉀等；有機(jī)堿如單-、雙-和三-烷基和芳基胺(如三乙胺、二異丙胺、甲胺、二甲胺等)以及可任選被取代的乙醇胺(如乙醇胺、二乙醇胺等)。
本發(fā)明肽這里也稱主題多肽，可由多肽領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法合成，包括重組DNA技術(shù)。鑒于純度、抗原特異性、無副產(chǎn)物、易于生產(chǎn)等原因，優(yōu)選合成化學(xué)方法，如固相merrifield型合成法。對這些多種可用方法的極好總結(jié)可參見Steward等人的“固相肽合成”(“Solid Phase Peptide Synthesis”)，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969；Bodanszky等人的(“肽合成”)“Peptide Synthesis”，JohnWiley & Sons，第2版，1976；J.Meienhofer的“激素蛋白和肽”(“Hormonal Proteins and Peptides”)，第2卷，第46頁，AcademicPress(New York)，1993；Merrifield，酶學(xué)進(jìn)展(Adv.Enzymol)，32221-96，1969；Fields等人國際肽和蛋白質(zhì)研究(Int.J.Peptide Protein Res.)，35161-214，1990；有關(guān)固相肽合成的美國專利No.4,244,946和有關(guān)經(jīng)典溶液合成的Schroder等人的“肽(The Peptides)”，第1卷，Academic Press(New York)，1965，這些文獻(xiàn)在此均引為參考?？捎糜谶@類合成中的合適的保護(hù)基描述于上述文獻(xiàn)中及J.F.W.McOmie的“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基(Protective Groups in Organic Chemistry)”，Plenum Press，NewYork，1973，該文獻(xiàn)在此引為參考。
總的來說，所設(shè)計(jì)的固相合成方法包括在增長的肽鏈上按順序加上一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸殘基。通常，第一位氨基酸殘基的氨基或羧基被一個(gè)合適的可選擇脫除的保護(hù)基保護(hù)。對含活性側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸如Lys使用不同的可選擇脫除的保護(hù)基。
利用固相合成作為示例，被保護(hù)的或衍生的氨基酸通過其未保護(hù)的羧基或氨基與惰性固相載體連接。然后選擇脫除氨基或羧基的保護(hù)基，摻入互補(bǔ)基(氨基或羧基)被適當(dāng)保護(hù)的序列中下一個(gè)氨基酸，在適于形成酰胺鍵的條件下，將其與已連接在固相載體上的殘基反應(yīng)。然后從這個(gè)新加入的氨基酸殘基上除去氨基或羧基保護(hù)基，再加入下一個(gè)氨基酸，如此重復(fù)進(jìn)行下去。在所有所需氨基酸被連接成合適的序列后，按順序或同時(shí)將所有殘余的末端或側(cè)鏈保護(hù)基(和固相載體)除去，產(chǎn)生最終的線性多肽。
可以將上述制備的線性多肽產(chǎn)物反應(yīng)形成其相應(yīng)的環(huán)肽。一例環(huán)化肽的方法描述于Zimmer等人的肽類(Peptides)1992，第393-394頁，ESCOM Science Publishers，B.V.，1993。通常，將叔丁氧羰基保護(hù)的肽甲酯溶解于甲醇中，加入氫氧化鈉溶液，混合物于20℃(20C)反應(yīng)；水解除去甲酯保護(hù)基。蒸發(fā)溶劑后，用乙酸乙酯從酸化的水溶液中萃取叔丁氧羰基保護(hù)的肽。然后在弱酸性條件下在二_烷共溶劑中除去叔丁氧羰基保護(hù)基。通過在1-羥基苯并三唑和N-甲基嗎啉存在下，在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合物中將線性肽的稀釋溶液與二環(huán)己基碳化二亞胺反應(yīng)，從而將所得到的具有游離氨基和羧基末端的脫保護(hù)肽轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的環(huán)肽。然后用色譜純化所得環(huán)肽。
具體優(yōu)選的環(huán)肽合成法描述于Gurrath等人的歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)210911-921(1992)和實(shí)施例中。本方法在主要表現(xiàn)αvβ5相關(guān)血管生成的組織中使用的具體優(yōu)選肽描述于實(shí)施例中，并包括SEQ ID Nos 4、6、7、8和9所示的多肽。
2.單克隆抗體在一實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了單克隆抗體形式的αvβ5拮抗劑，它們與αvβ5進(jìn)行免疫反應(yīng)并抑制αvβ5與此處所述的其天然配體結(jié)合。本發(fā)明還描述了生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系、生產(chǎn)細(xì)胞系的方法和生產(chǎn)單克隆抗體的方法。
本發(fā)明的單克隆抗體包含(1)與分離的αvβ5免疫反應(yīng)且(2)抑制玻連蛋白與αvβ5結(jié)合的抗體分子。優(yōu)選的單克隆抗體優(yōu)先與αvβ5結(jié)合，包括具有mAb P1F6和mAb P5H9免疫反應(yīng)特征的單克隆抗體，其被描述于實(shí)施例中。
各種詞性形式的術(shù)語“抗體或抗體分子”在這里用作一個(gè)集合名詞，指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子中免疫活性部分的群體，即包含抗體結(jié)合位點(diǎn)或抗原互補(bǔ)位的分子。
“抗體結(jié)合位點(diǎn)”是抗體分子中包含與抗原特異性結(jié)合的重鏈、輕鏈可變區(qū)及高變區(qū)的結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明中使用的抗體例子是完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含抗原互補(bǔ)位的免疫球蛋白分子部分，包括本領(lǐng)域已知的那些部分如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)，也稱之為抗體片段。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)計(jì)使用一種截短的免疫球蛋白分子，它包含來自本發(fā)明單克隆抗體的Fab片段。Fab片段缺乏Fc受體，是可溶的，使用可溶性Fab片段形式具有血清半衰期方面的治療優(yōu)點(diǎn)和診斷優(yōu)點(diǎn)?？扇苄訤ab片段的制備通常是免疫學(xué)領(lǐng)域已知的，可由多種方法實(shí)施。
例如，用熟知方法，對基本完整的抗體通過分別使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反應(yīng)制備抗體的Fab和F(ab′)2部分(片段)。例如參見Theofilopolous和Dixon的美國專利No.4342566。Fab′抗體部分也是熟知的，并由F(ab′)2部分制備，即制備出F(ab′)2部分后，如使用巰基乙醇還原連接兩個(gè)重鏈部分的二硫鍵，并隨后用試劑如碘乙酰胺使所得的蛋白硫醇烷基化。優(yōu)選含完整免疫球蛋白分子的抗體并如此處所述使用該抗體。
各種詞性形式的術(shù)語“單克隆抗體”指僅包含一種能與一個(gè)特定表位進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群。因此，單克隆抗體通常對與其進(jìn)行免疫反應(yīng)的任何表位呈現(xiàn)出單一結(jié)合親和性。因此單克隆抗體可以包含一種具有多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，其中每個(gè)位點(diǎn)對不同表位是免疫特異性的，如雙特異的單克隆抗體。
單克隆抗體通常由僅分泌(產(chǎn)生)一種抗體分子的單一細(xì)胞克隆即雜交瘤產(chǎn)生的抗體組成。通過使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤或其它自身永生細(xì)胞系融合形成雜交瘤細(xì)胞。這種抗體的制備首先由Kohler和Milstein描述于Nature，256495-497(1975)中，該文獻(xiàn)在此引作參考。其它方法描述于Zola，單克隆抗體方法手冊(MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques)，CRS Press，Inc.(1987)中。然后可對如此制備的雜交瘤上清液篩選抗體分子的存在，所述抗體分子與αvβ5進(jìn)行免疫反應(yīng)并抑制αvβ5與天然配體結(jié)合。
簡單地說，為形成產(chǎn)生單克隆抗體組合物的雜交瘤，將骨髓瘤或其它自身永生細(xì)胞系與用αvβ5源超免疫的哺乳動物脾淋巴細(xì)胞融合。
優(yōu)選用于制備雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞系與淋巴細(xì)胞來自同一物種。通常129 GlX+品系小鼠是優(yōu)選的哺乳動物。用于本發(fā)明的合適的小鼠骨髓瘤包括次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷敏感的(HAT)細(xì)胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14，可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，保藏號分別為CRL1580和CRL1581。
通常使用聚乙二醇(PEG)1500將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過它們對HAT的敏感性篩選融合的雜種細(xì)胞。使用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)鑒別產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤，實(shí)施例中描述了ELISA的改變。
也可通過使含有一種營養(yǎng)培養(yǎng)基的單克隆雜交瘤培養(yǎng)物初始化來制備本發(fā)明單克隆抗體，培養(yǎng)基中含分泌合適特異性抗體分子的雜交瘤。培養(yǎng)物在一定條件下保持，且保持時(shí)間足以使雜交瘤向培養(yǎng)基中分泌抗體分子。然后收集這種含抗體的培養(yǎng)基?？稍儆檬熘椒ㄟM(jìn)一步分離抗體分子。
這些組合物制備所用的材料是本領(lǐng)域熟知的，且可購買到，包括合成的培養(yǎng)基、近親繁殖的小鼠等等。一例合成的培養(yǎng)基是Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM；Dulbecco等，病毒學(xué)(Virol.)，8396，1959)，補(bǔ)充有4.5mg/l葡萄糖、20mM葡萄糖胺和20％胎牛血清。一例近親繁殖小鼠品系是Balb/c。
生產(chǎn)單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的其它方法也是熟知的。例如參見Sastry等人在美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，865728-5732(1989)和Huse等人在科學(xué)(Science)，2461275-1281(1989)中描述的從所有免疫組成成分(immunological repertoire)中分離單克隆抗體的方法。
本發(fā)明還設(shè)計(jì)了產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和包含雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物。特別優(yōu)選的是分泌單克隆抗體mAb P1F6和mAbP5H9的雜交瘤細(xì)胞系，其制備描述于實(shí)施例中。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)計(jì)了具有mAb P1F6或mAb P5H9免疫反應(yīng)特性的單克隆抗體。
無需過多實(shí)驗(yàn)，也可以確定一種單克隆抗體與本發(fā)明單克隆抗體是否具有相同(即等同)的特異性(免疫反應(yīng)特性)，通過確定前者是否阻礙后者與預(yù)先選擇的靶分子相結(jié)合。如果被測試的單克隆抗體與本發(fā)明單克隆抗體相競爭，正如在測定與固相中存在靶分子相結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)競爭性分析中本發(fā)明單克隆抗體的結(jié)合減少所表明，那么這兩種單克隆抗體與相同的或緊密相關(guān)的表位結(jié)合。
確定一種單克隆抗體是否具有本發(fā)明單克隆抗體的特異性的另一種辦法是將本發(fā)明單克隆抗體和通常與之反應(yīng)的靶分子一起預(yù)溫育，然后加入被測試的單克隆抗體，確定此被測單克隆抗體結(jié)合靶分子的能力是否被抑制。如果該被測單克隆抗體被抑制，那么十之八九它具有本發(fā)明單克隆抗體相同的或功能等同的表位特異性。
確定一種單克隆抗體是否具有本發(fā)明單克隆抗體的特異性的另一種方法是確定所研究抗體的CDR區(qū)氨基酸殘基序列。在其CDR區(qū)具有相同或功能等同的氨基酸殘基序列的抗體分子具有相同的結(jié)合特異性。多肽測序方法在本領(lǐng)域是熟知的。
抗體的免疫特異性、其靶分子結(jié)合容量和抗體對表位呈現(xiàn)的伴隨親和性均由抗體與之進(jìn)行免疫反應(yīng)的表位限定。表位特異性至少部分由免疫球蛋白抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸殘基序列限定、部分由輕鏈可變區(qū)氨基酸殘基序列限定。
使用術(shù)語“具有…的結(jié)合特異性”表示等同的單克隆抗體呈現(xiàn)相同的或相似的免疫反應(yīng)(結(jié)合)特性，競爭結(jié)合預(yù)先選擇的靶分子。
人源化單克隆抗體比鼠單克隆抗體具有特別的優(yōu)點(diǎn)，特別是它們能被用于治療人的疾病。具體來講，人抗體不會象“外源”抗原被從循環(huán)中迅速清除。此外，人抗體不以外源抗原和外源抗體的相同方式活化免疫系統(tǒng)。通常制備“人源化”抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的，可容易應(yīng)用于本發(fā)明抗體。
因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種單克隆抗體，通過移植術(shù)使抗體人源化以導(dǎo)入人免疫系統(tǒng)成分，基本上不干擾抗體結(jié)合抗原的能力。
3.αvβ5特異的模擬物本發(fā)明證明αvβ5拮抗劑通?？捎糜诒景l(fā)明中，這些拮抗劑可包括能阻礙αvβ5功能的多肽、抗體和其它分子，被稱為“模擬物”。特別優(yōu)選那些特異性阻礙αvβ5功能而不阻礙其它整聯(lián)蛋白功能的拮抗劑。
在本文中，認(rèn)為多種試劑可適用于本方法，只要這些試劑具有必需的生物活性。這些試劑從種屬上講被稱為模擬物，因?yàn)樗鼈兙哂心Mαvβ5配體的能力，通過受體上配體結(jié)合區(qū)域參與受體和配體功能相互作用，由此阻礙(即抑制)正常功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，αvβ5拮抗劑可以是受體模擬物而非配體。
除了抗體或配體衍生的肽，模擬物是任何具有上述性質(zhì)的分子。它可以是肽的合成類似物、形狀象上述結(jié)合區(qū)域口袋樣的化合物或其它分子。本發(fā)明優(yōu)選的模擬物是有機(jī)分子因而稱為有機(jī)模擬物。特別優(yōu)選的有機(jī)模擬分子通過模擬αvβ5配體而用作αvβ5拮抗劑，為化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18，描述于實(shí)施例10中。
可以用任何一種本領(lǐng)域已知的用于藥物設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)分析法進(jìn)行αvβ5模擬物的設(shè)計(jì)，這些方法包括分子模型設(shè)計(jì)、二維核磁共振(-2D NMR)分析、X-射線晶體衍射、肽的隨機(jī)篩選、肽類似物或其它化學(xué)聚合物文庫等藥物設(shè)計(jì)方法學(xué)。
本說明書示出了許多結(jié)構(gòu)證據(jù)，表明αvβ5拮抗劑可以是小的多肽、單克隆抗體或有機(jī)分子，它們是具有選擇性抑制αvβ5這一共同功能性質(zhì)的非常不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從這點(diǎn)來看用于本方法的主題αvβ5拮抗劑的結(jié)構(gòu)不必如此限制，但包括這里所定義的任何一種αvβ5模擬物。
F.鑒別αvβ5拮抗劑的方法本發(fā)明還描述了用于鑒別按本方法使用的候選αvβ5拮抗劑的分析方法。在這些分析方法中，評價(jià)候選物分子在抑制αvβ5結(jié)合天然配體中的效能，并進(jìn)一步評價(jià)它們在抑制組織血管生成中的效能。
第一種分析法是測定小雞絨毛尿囊膜(CAM)中的血管生成，稱為CAM分析。別人已詳細(xì)描述過CAM分析，并進(jìn)一步使用該方法測定腫瘤組織的血管生成和新血管形成。參見Ausprunk等，美國病理學(xué)雜志(Am.J.pathol.)，79597-618(1975)和Ossonski等，癌癥研究(Cancer Res.)，402300-2309(1980)。
CAM分析是一種熟知的活體血管生成分析模型，因?yàn)榘l(fā)生的是整個(gè)組織的新血管形成。真正的小雞胚胎血管在CAM中或CAM上生成的組織中生長。
正如此處所示，CAM分析從新血管生長的數(shù)量和程度上說明對新血管形成的抑制作用。并且，容易監(jiān)測移植至CAM上的任何組織如腫瘤組織的生長。最后，由于在該分析系統(tǒng)中具有毒性的內(nèi)部控制，所以該分析特別有用。將小雞胚胎暴露給任意測試試劑。這樣，胚胎的健康是毒性的指征。
測定血管生成的第二種分析法是活體家兔眼模型，稱為家兔眼分析。別人已詳細(xì)描述過家兔眼分析，并進(jìn)一步使用該方法測定血管生成性抑制劑如酞胺哌啶酮存在條件下血管生成和新血管形成。參見D′Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，914082-4085(1994)。
家兔眼分析是一種熟知的活體血管生成分析模型，因?yàn)閺慕悄ぞ壣L至角膜的家兔血管例證的新血管形成過程容易透過家兔眼的自然透光角膜被造影。此外，能隨時(shí)間方便地監(jiān)測新血管形成的刺激或抑制的程度或數(shù)量或新血管形成的衰退。
最后，將家兔暴露于任意測試試劑，這樣家兔的健康是測試試劑的毒性指征。
第三種分析法測定天然配體玻連蛋白與αvβ5直接結(jié)合的抑制作用，優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)描述于實(shí)施例中。該分析法通常在固相中通過ELISA法測定天然配體如玻連蛋白與分離的αvβ5結(jié)合的抑制程度，此抑制作用由αvβ5特異的抑制作用介導(dǎo)。
因此，該分析法能用于鑒別對αvβ5具有特異性而不抑制天然配體結(jié)合其它整聯(lián)蛋白的化合物。使用平價(jià)ELISA分析進(jìn)行此特異性分析，其中在分離開的分析室中，同時(shí)篩選αvβ5和其它整聯(lián)蛋白分別與天然配體結(jié)合的能力和抑制這種整聯(lián)蛋白分別結(jié)合預(yù)選配體的能力的候選化合物。優(yōu)選的篩選分析方式描述于實(shí)施例中。
實(shí)施例有關(guān)本發(fā)明的下述實(shí)施例是說明本發(fā)明，當(dāng)然不應(yīng)認(rèn)為它們具體限制本發(fā)明。并且，本發(fā)明的由本領(lǐng)域技術(shù)人員可預(yù)知的這類改變，現(xiàn)在已知的或今后開發(fā)的，均被認(rèn)為落入后面權(quán)利要求所要求的本發(fā)明范圍內(nèi)。
1.αvβ5特異的單克隆抗體的制備使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法通過將A549肺癌細(xì)胞免疫入RBF/DnJ小鼠制備單克隆抗體P1F6和P5H9，如Wayner等人在細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)113919-929(1991)中所述，該文在此引作參考。從免疫小鼠中分離出脾，并與Ns-1/FOX-NY骨髓瘤細(xì)胞融合。如Wayner等人所述，通過特異性抑制UCLA-P3粘著于玻連蛋白涂膜表面，篩選出產(chǎn)生針對癌細(xì)胞玻連蛋白受體的抗體的雜交瘤，并通過胸腺細(xì)胞飼養(yǎng)層的有限稀釋克隆雜交瘤。
已表明P1F6和P5H9單克隆抗體均與αvβ5復(fù)合物進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，不與αv亞基、β5亞基或其它整聯(lián)蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)。P1F6單克隆抗體可從Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)購買，P5H9單克隆抗體可從the Fred Hutchinson Cancer ResearchInstitute，Seattle，WA的E-Wayner博士處得到。
通過相似方法得到用于本發(fā)明的其它αvβ5單克隆抗體并表示出這些抗體特征，如此處所述。此外，用不純的或純化形式的αvβ5受體對小鼠進(jìn)行免疫接種，通過融合分離自小鼠的脾生產(chǎn)αvβ5單克隆抗體。αvβ5的純化是整聯(lián)蛋白生物領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的過程，已由Smith等人在生物化學(xué)雜志(J.Biol Chem.)，26511008-11013(1990)中描述，該文內(nèi)容在此引為參考。一旦被純化，分離的受體被制備成免疫原用于免疫小鼠，如E2部分中所述，且基本按Kohler和Milstein在自然(Nature)，256495-497(1975)中所述方法制備，該文內(nèi)容在此引作參考。篩選所得雜交瘤克隆與免疫原的反應(yīng)性，然后表示出雜交瘤克隆特征，如下述實(shí)施例中所述。
2.抗αvβ5單克隆抗體的特異性的表征和在作αvβ5表達(dá)的組織分布圖譜中的應(yīng)用A.對玻連蛋白的特異性Wayner等人在細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)，113919-929(1991)中表明實(shí)施例1中制備的P5H9單克隆抗體阻止UCLA-P3癌細(xì)胞附著于玻連蛋白而不影響細(xì)胞附著于膠原蛋白或纖連蛋白。還表明了同樣細(xì)胞僅含有αvβ5玻連蛋白受體，沒有αvβ5特異性，免疫沉淀非還原狀態(tài)α鏈(160kD)和β鏈(95kD)組成的異源二聚體。由P5H9檢測的αvβ5受體也表明介導(dǎo)M21黑素癌細(xì)胞和H2981癌細(xì)胞對玻連蛋白的粘著。P1F6單克隆抗體具有同樣的免疫反應(yīng)性分布圖。
B.用抗整聯(lián)蛋白受體抗體進(jìn)行的免疫熒光在傷口愈合中，血管基底膜表達(dá)一些粘著蛋白，包括VonWillebrand團(tuán)子、纖連蛋白和血纖維蛋白。另外，粘著受體整聯(lián)蛋白家族的一些成員在培養(yǎng)的平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞表面被表達(dá)。參見Cheresh，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，846471(1987)；Janat等人細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell.Physiol.)，151588(1992)；和Cheng等人，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell Physiol.)，139275(1989)。
除了整聯(lián)蛋白β5亞基的結(jié)構(gòu)和功能，由其它抗β5單克隆抗體繪制的該亞基組織分布已描述于Pasqualini等人的細(xì)胞科學(xué)雜志(J.CellSci.)，105101-111(1993)，該文內(nèi)容在此引為參考。
上述β5亞基特異的單克隆抗體，與實(shí)施例1中所述相似，由使用來自小鼠的脾細(xì)胞制備的雜交瘤分泌，小鼠已用A549人肺癌細(xì)胞系免疫接種。然后，該單克隆抗體用于描繪β5亞基在正常人胸腺、皮膚和腎中的組織分布。在低溫箱切片機(jī)上從冷凍組織塊切下4μm厚切片，用于隨后的與β5整聯(lián)蛋白特異的抗體進(jìn)行的鏈霉素和素-生物素免疫過氧化物酶染色，按Pasqualini等人的參考文獻(xiàn)中所述方法進(jìn)行。
胸腺切片的染色顯示了β5在血管、哈索爾小體、皮質(zhì)和髓質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞和基底膜中的分布。皮膚切片顯示了β5在表皮基底層和一些皮膚血管壁上的分布，腎切片顯示了腎小球區(qū)、近腎小球器官、近曲小管和集合小管的染色。因此，對不同細(xì)胞類型，β5的分布是不均勻的，包括且更重要的是在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，該細(xì)胞的染色與培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的染色是一致的。
C.用抗整聯(lián)蛋白受體抗體進(jìn)行眼病患者的人視網(wǎng)膜組織的免疫熒光在大多數(shù)導(dǎo)致嚴(yán)重視力喪失的眼病中眼新血管形成是觀察到的最常見的病理變化。從先存在的脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜或副緣血管中生長新血管可導(dǎo)致水腫、出血或纖維血管形成，造成眼睛正常解剖學(xué)關(guān)系的破壞并伴隨正常視功能的喪失。
在生理?xiàng)l件下，血管生成是高度被調(diào)節(jié)的，并已表明由特定的血管原細(xì)胞因子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)活化。正如Brooks等在科學(xué)(Science)，264569-571(1994)中所述，抗αvβ3單克隆抗體表明在模型系統(tǒng)包括下述CAM模型中阻斷bFGF和TNF-α誘導(dǎo)的血管生成。正如實(shí)施例4-6所述，抗αvβ5單克隆抗體阻斷一個(gè)單獨(dú)的血管生成途徑，特別是由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)的血管生成。
因此，正如本發(fā)明文中所述，血管生成的兩條途徑受不同的整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5限定。為研究這些整聯(lián)蛋白在人眼病中的表達(dá)和作用，從患增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病(PDR)的病人玻璃體切割術(shù)整個(gè)獲得視網(wǎng)膜上新血管膜和視網(wǎng)膜下新血管膜。這些病人已被臨床跟蹤，通過臨床檢查和基底熒光素血管造影術(shù)證明患活性增殖性新血管病，在此基礎(chǔ)上篩選病人用于組織學(xué)評價(jià)。得到的組織立即在Tissue Tek低溫保藏箱中冷凍并切片。
當(dāng)使用免疫熒光法檢查這些病人組織時(shí)，對于整聯(lián)蛋白αvβ5血管是陽性的，正如由與小鼠單克隆抗體LM609的免疫反應(yīng)性表明的結(jié)果。整聯(lián)蛋白的分布表明限于血管并與血管標(biāo)記Von Willebrand因子的染色一致，正如用家兔抗體對該因子的繪圖。用若丹明結(jié)合的抗小鼠免疫球蛋白或熒光素結(jié)合的抗兔免疫球蛋白顯現(xiàn)出免疫反應(yīng)性位點(diǎn)，這兩種免疫球蛋白的使用能同時(shí)定位整聯(lián)蛋白的位置和血管特異性抗體。
從正常眼中或沒有活性增殖血管的萎縮膜病人得到的標(biāo)本，通過用免疫熒光，對整聯(lián)蛋白αvβ3是陰性的。
同時(shí)，用實(shí)施例1制備的抗αvβ5單克隆抗體P1F6以免疫組織化學(xué)法分析相同組織αvβ5的存在和分布。染色表明αvβ5存在于與VonWillebrand因子共定位的血管上。但是，用P1F6抗體無血管組織也呈現(xiàn)出有限的熒光，表明αvβ5的廣泛分布。這與αvβ3限于血管中存在不同。
當(dāng)使用各自的抗體LM609和P1F6在αvβ3和αvβ5之間比較膜免疫熒光染色時(shí)，血管壁上的染色圖實(shí)際上是一樣的，表明αvβ3和αvβ5均呈現(xiàn)在新血管眼病如糖尿病視網(wǎng)膜病中存在的新增殖人血管的表面。
因此，此處所述結(jié)果表明，αvβ5整聯(lián)蛋白受體被選擇性表達(dá)于發(fā)生血管生成的特定組織類型中，正如在患活性增殖性新血管疾病病人新血管膜所見。由此，正如下面實(shí)施例4-6所述，這些組織與暴露于特定生長因子的組織一起為本發(fā)明治療方法提供了理想的靶子。
3.合成肽的制備使用標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成本發(fā)明方法中使用的環(huán)多肽，例如，如Merrifield在酶學(xué)進(jìn)展(Adv.Enzymol.)，32221-296(1969)中和Fields，G.B.和Noble，R.L.在國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志(Int.J.Peptide Protein Res.)，35161-214(1990)中所述。
首先將2克(g)BOC-Agr-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe(SEQ ID NO1)溶解于60毫克(ml)甲醇中，向其中加入1.5ml2N氫氧化鈉溶液形成一種混合物。然后在20度C(20C)攪拌混合物3小時(shí)。蒸發(fā)后，將殘余物取出放于水中并用稀HCl酸化至pH3，用乙酸乙酯萃取。萃取液由Na2SO4脫水，再次蒸發(fā)，將所得BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ ID NO2)與20ml 2NHCl在二_烷中于20C攪拌2小時(shí)。蒸發(fā)得到的混合物獲得H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ ID NO3)，隨后將其溶解于1800ml二氯甲烷和200ml二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，冷卻至0C。然后攪拌下順序加入0.5g二環(huán)己基碳化二亞胺(DCCI)、0.3g 1-羥基苯并三唑和0.23ml N-甲基嗎啉。
在0C將所得混合物再攪拌24小時(shí)，然后在20C再攪拌48小時(shí)。濃縮此溶液并用混合床離子交換劑處理以脫鹽。過濾除去所得樹脂后，蒸發(fā)澄清的溶液，用色譜法純化殘余物，得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(用單字母也表示為c-RGDfV)(SEQ IDNO4)。肽中小寫字母表示D型氨基酸，不是大寫字母表示的L型。
如上所述制備對照環(huán)肽環(huán)(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(用單字母也表示為RADfV)(SEQ ID NO5)。前面己說明環(huán)肽c-RADfV(SEQ ID NO5)抑制血纖維蛋白原與整聯(lián)蛋白αvβ3的結(jié)合，不抑制血纖維蛋白原與整聯(lián)蛋白αIIbβ3或α5β1的結(jié)合(Pfatf.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26920233-20238，1994)。
用類似方法制備特異抑制天然配體與αvβ5結(jié)合的其它肽，特異性和活性范圍測試如下述實(shí)施例中所述。包括下面用類似方法獲得的肽環(huán)(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO6)和環(huán)(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(SEQ ID NO7)。氨基酸殘基序列為Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO8)和環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal)(SEQ ID NO9)的肽也由合成法制備。在SEQ ID NO9中，MeVal中前綴“Me”表示第6位的Val是甲基化的Val。
4.用αvβ5拮抗劑抑制生長因子誘導(dǎo)的血管生成，通過活體家兔眼模型分析進(jìn)行測定在天然透光結(jié)構(gòu)例如眼角膜中可觀察抗αvβ5拮抗劑對生長因子誘導(dǎo)的血管生成的效應(yīng)。新血管從供血富足的角膜緣生長至正常條件下沒有血管的角膜中心。血管生成刺激劑如VEGF和TGF-α當(dāng)施用于角膜時(shí)，誘導(dǎo)新血管從角膜緣的生長。血管生成抑制劑當(dāng)施用于角膜時(shí)抑制新血管從角膜緣生長。因此，角膜經(jīng)歷血管生成，通過內(nèi)皮細(xì)胞從角膜緣侵入容易看到的堅(jiān)韌的充滿膠原蛋白的角膜組織。由此，家兔眼模型分析提供了一個(gè)活體模型，用于在將化合物直接植入眼角膜后，直接觀察血管生成的刺激和抑制。
A.活體家兔眼模型分析1)生長因子誘導(dǎo)的血管生成在活體家兔眼模型分析中用生長因子誘導(dǎo)血管生成，并描述如下。
a.含生長因子和單克隆抗體的海昌丸(hydron pellets)的制備根據(jù)D′Amato等在美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，914082-4085(1994)中所述制備含生長因子和單克隆抗體(mAbs)的海昌聚合物丸。單個(gè)小丸含750ng的生長因子(也稱細(xì)胞因子)，特別是與sucralfate(carafet，Marion Merrell DowCorporation，Cincinnati，OH)結(jié)合的bFGF或VEGF，sucralfate用來穩(wěn)定細(xì)胞因子并確保它們緩慢釋放于周圍組織中。此外，制備含40μg mAb P1F6(抗αvβ5)或?qū)φ湛贵wLM609(抗αvβ3)的PBS的海昌丸。
根據(jù)熟知方法，利用蛋白-A Sepharose CL-4B親和柱層析，從腹水中純化所有測試mAbs。然后洗脫的免疫球蛋白對PBS透析并用Detoxi-膠(Pierce Chemicals，Rockford，IL)處理以除去內(nèi)毒素。已表明內(nèi)毒素是一種有效的血管生成性和炎癥刺激劑。因此，用生色性鱟阿未巴梓細(xì)胞裂解物測定(Chromogenic Limulus AmebocyteLysate Assay)(Bio Whittaker，Walkersville，MD)測試單克隆抗體中內(nèi)毒素的存在，只有那些沒有測出內(nèi)毒素的mAbs被用于家兔眼模型分析中。
小丸被澆鑄入特制的特氟隆栓，這些栓上有2.5mm芯鉆入其表面。在每個(gè)栓內(nèi)放入約12μl的澆鑄物，并在一個(gè)消毒罩內(nèi)聚合一晝夜。然后用紫外線照射對小丸消毒。
使用一組8只動物進(jìn)行配對眼實(shí)驗(yàn)，其中每只動物接受一個(gè)包含預(yù)選細(xì)胞因子和預(yù)選抗體或?qū)φ彰庖咔虻鞍椎暮２踩胛铩＞唧w來說，對每只家兔，一只角膜被手術(shù)植入一粒包含bFGF或VEGF和mAbP1F6的海昌丸，另一只角膜用bFGF或VEGF與MAb LM609一起處理。各個(gè)小丸被植入家兔角膜中間基質(zhì)手術(shù)形成的“口袋”中。在無菌條件下進(jìn)行手術(shù)，使用一個(gè)裝備有分光鏡的Wild型M691手術(shù)顯微鏡，其中分光鏡上安裝著照相機(jī)，通過照相記錄各個(gè)角膜。用69 Beaver刀片在角膜基質(zhì)中切一個(gè)3mm切口至角膜厚度的一半，產(chǎn)生一個(gè)3mm×5mm的“口袋”。用虹膜藥刀從外周解剖出基質(zhì)；并植入小丸，其周邊距角膜緣2mm。
在接下來的12天中，細(xì)胞因子和mAbs從植入的小丸擴(kuò)散入周圍組織中，由此影響自角膜緣的血管生成。
左眼和右眼角膜分別稱為OS和OD。然后觀察角膜12天。在手術(shù)后第10天拍照，這時(shí)新血管形成最大。
上述用細(xì)胞因子/mAb混合物進(jìn)行處理的有代表性的照片結(jié)果示于圖1A-1D。平行的mAb抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成的定量數(shù)值示于圖2A和2B中。在圖1A和1D中，角膜分別暴露于bFGF/P1F6和VEGF/LM609組合物中，伴有水腫的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成是明顯的，正如大箭頭所示。因此，αvβ5抗體P1F6在抑制bFGF誘導(dǎo)的血管生成中是無效的。與此類似，αvβ3抗體LM609在抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成中是無效的。
作為對比，當(dāng)在家兔模型中使用細(xì)胞因子/mAb組合物bFGF/LM609和VEGF/P1F6時(shí)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成被抗體抑制，分別如圖1B和1C所示。這些圖中，小箭頭示出的正常結(jié)膜緣血管，表明整聯(lián)蛋白抗體在抑制一類細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成中的效力。
特異的mAb整聯(lián)蛋白免疫反應(yīng)性對上述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成的效應(yīng)也被定量，如圖2A和2B所示。血管生成由bFGF或VEGF刺激，分別如圖2A和2B所示。使用配備Nikon相機(jī)的Wild手術(shù)顯微鏡，每天對處理眼睛拍照。相片記錄于Kodak Ektachrome 64T底片上，通過Model GS 670圖象密度計(jì)獲得數(shù)值后，圖象被轉(zhuǎn)化用于計(jì)算機(jī)輔助定量，使用Biorad′s Nolecular Analyst 1.1軟件。組方圖示出暴露于mAbsP1F6或LM609后新血管平均面積+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝8，兩組中每組只數(shù))。
正如圖2A所示，與P1F6處理的同一動物另一只配對眼睛相比，LM609使bFGF誘導(dǎo)的血管生成減少了86％(p＜0.005，配對t-試驗(yàn))。當(dāng)VEGF被用于刺激血管生成時(shí)如圖2B所示，觀察到相反效果，LM609處理的眼睛對VEGF誘導(dǎo)的血管生成具有最小效應(yīng)，與之相比，P1F6使新血管形成的平均面積減少了60％(p＜0.03，配對t-試驗(yàn))。
值得注意的是，通過暴露給特定的抗體，只有細(xì)胞因子誘導(dǎo)的新血管受影響，而每種mAb都不影響預(yù)先存在的緣周血管，表明觀察到的效果限于新形成的角膜血管。
使用實(shí)施例3中制備的合成肽進(jìn)行類似分析，如下所述，用于抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的與αvβ5表達(dá)特異相關(guān)的血管生成。
這些結(jié)果表明由特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成僅受一種抗整聯(lián)蛋白抗體的影響，特別是αvβ5整聯(lián)蛋白受體在VEGF誘導(dǎo)的血管生成中起作用，為確證這些結(jié)果，用細(xì)胞因子和整聯(lián)蛋白抗體的組合物評價(jià)另一個(gè)新血管模型小雞絨毛尿囊膜(CAM)，如下一實(shí)施例所述。
5.在小雞絨毛尿囊膜(CAM)標(biāo)本中的血管生成A.來處理的CAM的特征1)CAM的制備正常胚胎血管生成導(dǎo)致成熟血管形成后，在小雞絨毛尿囊膜(CAM)上可誘導(dǎo)血管生成。已表明在應(yīng)答特定的細(xì)胞因子或腫瘤片段中血管生成被誘導(dǎo)，正如Leibovich等人在自然(Nature)，329630(1987)和Ausprunk等人在美國病理學(xué)雜志(Am.J.Pathol.)，79597(1975)中所述。從雞胚中制備CAMs，用于隨后血管生成的誘導(dǎo)和用本發(fā)明αvβ5拮抗劑對其抑制，正如下面及實(shí)施例6中所述。
從McIntyre Poultry(Lakeside，CA)獲得10日齡雞胚，于37℃60％濕度下孵育。用一個(gè)小的工藝鉆(Dremel，Division ofEmerson Electric Co.，Racine，WI)直接在雞蛋殼一端氣囊上扎一個(gè)小孔。在雞蛋大頭一端再鉆一個(gè)孔，避開預(yù)先通過對光檢查雞蛋確定的胚胎血管。在初始孔施加負(fù)壓，從殼膜上拉出CAM(絨毛尿囊膜)并在CAM上產(chǎn)生一個(gè)人造氣囊。用小型砂輪(Dremel)在懸垂的CAM的蛋殼上開一個(gè)1.0厘米(cm)×1.0cm方形窗口。這個(gè)小窗口允許直接通入下面的CAM。
然后在胚胎形成10天使用所得CAM標(biāo)本，其中血管生成已衰退。在本發(fā)明中使用此標(biāo)本，用于應(yīng)答細(xì)胞因子處理時(shí)誘導(dǎo)恢復(fù)的血管生成。
2.CAM的組織學(xué)為在顯微鏡下分析雞胚CAMs的結(jié)構(gòu)，在低溫箱切片機(jī)上從冷凍塊切下6微米(μm)厚切片，用于免疫熒光分析。
未處理的10日齡CAM的特征是無血管區(qū)。因?yàn)榈脚咛バ纬呻A段時(shí)CAM系統(tǒng)中的血管生成在減退，所以此系統(tǒng)可用于本發(fā)明中由各種細(xì)胞因子刺激新血管產(chǎn)生，從存在的血管鄰近區(qū)進(jìn)入目前無任何血管的CAM區(qū)。
正如CAM模型和下述實(shí)施例中所示，當(dāng)血管在正常胚胎形成中或由細(xì)胞因子誘導(dǎo)生長新的血管時(shí)，血管表達(dá)αvβ3和αvβ5。
B.生長因子誘導(dǎo)的血管生成已表明血管生成由細(xì)胞因子或生長因子誘導(dǎo)，正如實(shí)施例4A家兔眼模型中所述。這里描述的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)施例4中所述的家兔角膜標(biāo)本中的血管生成相似地由生長因子誘導(dǎo)，其中生成因子被局部施用于CAM血管上，如此處所述。
誘導(dǎo)血管生成過程如下將一個(gè)5毫米(mm)×5mm Watman濾紙片(Watman Filter Paper No.1)用含預(yù)選濃度預(yù)選細(xì)胞因子的Hanks平衡鹽溶液(HBSS，GIBCO，Grand Island，NY)或HBSS飽和，其中預(yù)選濃度即影響血管生成測試濃度，將此濾紙片放置在10天雞胚的無血管CAM上，隨后用膠帶封閉窗口。72小時(shí)后用照相顯微鏡監(jiān)測血管生成。CAMs被速凍，然后6μm低溫箱切片以丙酮固定，用10μg/ml選擇的抗整聯(lián)蛋白抗體包括那些實(shí)施1所述的針對αvβ5的抗體通過免疫熒光使切片染色，如實(shí)施例2B和2C所述。
先前由Brooks等人在科學(xué)(Science)264569-571(1994)中進(jìn)行的研究已表明在bFGF和TNF-α處理的標(biāo)本中血管是明顯可見的，但在未處理的CAM中沒有血管。bFGF誘導(dǎo)血管生成后表達(dá)增強(qiáng)。在未處理的CAM中所看到的整聯(lián)蛋白β1的表達(dá)沒有改變，而在刺激的血管上也可很快測出β1。
這些公開的發(fā)現(xiàn)表明，在人和雞中參與血管生成的血管顯示出增強(qiáng)的αvβ3的表達(dá)。與這一點(diǎn)一致的是，αvβ3在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)在體外由各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)，正如Janat等人在細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Physiol.)，151588(1992)；Enenstein等人在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究(Exp.Cell Res.)，203499(1992)和Swerlick等人在實(shí)驗(yàn)皮膚病學(xué)雜志(J.Invest.Derm.)，99715(1993)中所述。
本發(fā)明中，確定了一條單獨(dú)的細(xì)胞因子介導(dǎo)的刺激血管生成的途徑，其中血管生成依賴于一種不同的粘著整聯(lián)蛋白受體αvβ5的表達(dá)和活化。正如本文所述，CAM暴露于細(xì)胞因子VEGF、TGF-α和EGF的效果相關(guān)于αvβ5的表達(dá)、血管生成及用αvβ5拮抗劑對血管生成的抑制被描述于實(shí)施例6中。
C.腫瘤誘導(dǎo)的血管生成為研究αvβ5在腫瘤誘導(dǎo)的血管生成中的作用，在CAM分析中使用各種αvβ5陰性的人黑素瘤和癌碎片，這些碎片預(yù)先從17日雞胚的CAM中生長并分離，如Brooks等人在細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)，1221351(1993)中所述，如此處所述。
在CAM分析系統(tǒng)中將腫瘤碎片直接放置在CAM上，誘導(dǎo)血管生成。雞胚CAM的制備與上面描述方法相同。用下述細(xì)胞系懸浮液中生成的αvβ5陰性的腫瘤碎片50毫克(mg)至55mg，代替濾紙片放置在CAM起初的無血管區(qū)上。
細(xì)胞系rabdomyosarcoma、骨髓樣(HL-60或KG-1)和淋巴梓(T細(xì)胞-Jurkat、HPB/ALL、PEER；和各種B細(xì)胞系)如Pasqualini等人在細(xì)胞科學(xué)雜志(J.Cell Sci.)，105101-111(1993)中所述，被用來在雞胚CAMs上生長人實(shí)體瘤。首先將各種細(xì)胞系在總體積30μl的無菌HBSS中的單一細(xì)胞懸浮液施用于CAMs。用膠帶封閉窗口，孵育胚胎7天，使人腫瘤病灶生長。在第7天末，即17天的胚胎，將腫瘤從CAMs上切除，剪掉周圍的CAM組織。腫瘤被切成50mg至55mg的腫瘤碎片，用于血管生成。如實(shí)施例5A中所述這些腫瘤碎片被放置在一組新的10天雞胚CAMs上無血管區(qū)中。
然后，在局部或靜脈內(nèi)應(yīng)用或未應(yīng)用αvβ5誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(VEGF、TGF-α或EGF)的雞胚CAMs上活體生長的腫瘤被mAbsP1F6或P5H9染色用于分析αvβ5的表達(dá)，如前所述。
隨后根據(jù)實(shí)施例6C和6D所述處理這些CAM腫瘤標(biāo)本，用于測定抗體和肽對腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的效應(yīng)。
在一實(shí)施方案中，從舊金山加利福尼亞大學(xué)Caroline Damsky博士處得到的倉鼠黑素瘤細(xì)胞CS-1被用于上述CAM分析中，形成黑素瘤約50mgCS-1腫瘤碎片轉(zhuǎn)移至新的10天雞胚CAM上后，各個(gè)標(biāo)本接受靜脈內(nèi)注射100μg或300μg的P1F6抗體、LM609抗體或?qū)φ誄SAT(抗β1)抗體。另一對照樣是沒有處理的標(biāo)本。結(jié)果討論于下面實(shí)施例6D中。
6.CAM分析中所測定的血管生成的抑制A.通過靜脈內(nèi)應(yīng)用抑制劑抑制生長因子誘導(dǎo)的血管生成靜脈內(nèi)注射入CAM標(biāo)本的單克隆抗體對生長因子誘導(dǎo)的血管生成產(chǎn)生的效應(yīng)被評價(jià)用作本發(fā)明活體模型系統(tǒng)。
活化的新血管形成后，一旦血管停止生長，那么通過免疫熒光分析αvβ5的表達(dá)使減少至測不出的水平。在經(jīng)歷血管生成的血管中αvβ5表達(dá)的這種調(diào)節(jié)與成熟血管中缺乏表達(dá)相反，它使本發(fā)明能控制和抑制下述CAM血管生成分析系統(tǒng)中所示的血管生成。
用于靜脈注射的雞胚CAMs標(biāo)本基本如上所述。
首先通過應(yīng)用生長因子飽和的濾紙片在10日齡雞胚上誘導(dǎo)血管生成。具體而言，在第一步分析中，通過暴露于濃度為150ng/ml的bFGF或VEGF誘導(dǎo)血管生成。
為應(yīng)用生長因子，在對光檢查步驟中，進(jìn)出突出的血管并在蛋殼上作出標(biāo)記示出其位置。在殼上鉆孔，垂懸下CAMs，然后將生長因子飽和的濾紙分別放在CAMs上，如上所述。用無菌膠帶封閉窗口，胚胎放于恒溫箱中。
24小時(shí)后，直接在先選出的突出血管正上方蛋殼的側(cè)面上仔細(xì)開另一個(gè)小窗口。小心去除雞蛋外殼留下完整的胚胎膜。用一小滴礦物油(Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)使殼膜呈透明，使得血管易于觀察。然后，將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、PBS中75μg純化的無菌抗整聯(lián)蛋白抗體或75μg合成肽(環(huán)肽RGDfV，SEQ ID NO4和對照環(huán)肽RADfV，SEQ ID NO5)被注射入生長因子誘導(dǎo)的CAMs上明顯可見的血管中。用膠帶封閉窗口，孵育胚胎直至72小時(shí)。
在一立體顯微鏡拍照濾紙片和有代表性的周圍CAM組織(圖3A-3F和圖5A-5F)，確定每種條件12個(gè)CAMs的平均血管生成指數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差(圖4A-4B和圖6A-6B)。通過分析每張紙片區(qū)域內(nèi)血管分支的數(shù)目和程度，以雙盲方式評分每個(gè)胚胎的血管生成。分?jǐn)?shù)從1(低)至4(高)，通過從總數(shù)中減去背景1確定血管生成指數(shù)。
整聯(lián)蛋白抗體介導(dǎo)的對CAM模型中生長因子誘導(dǎo)的血管生成的抑制作用的特異性鏡面反映了上述家兔角膜模型中觀察到的結(jié)果。分別如圖3A和3B所示，bFGF和VEGF均在對照的PBS處理的CAM中引起血管生成。但是，用αvβ5特異抗體P1F6處理導(dǎo)致VEGF誘導(dǎo)的血管生成的抑制，如圖3D所示，而在bFGF誘導(dǎo)的血管生成中未檢測出抑制作用，如圖3C所示。相反，αvβ3特異抗體LM609抑制bFGF誘導(dǎo)的血管生成(圖3E)而對VEGF誘導(dǎo)的CAM中的血管生成沒有什么作用(圖3F)。
這些結(jié)果還分別示于棒圖4A和4B，分別對于bFGF和VEGF處理的CAMs，將血管生成指數(shù)對暴露于LM609或P1F6作圖，沒有暴露于抗體的作為對照。因此，由整聯(lián)蛋白特異抗體對生長因子誘導(dǎo)的血管生成的抑制作用依賴于生長因子的種類。
暴露于含RGD肽的情況支持上面的結(jié)果。在PBS存在下，如圖5A和5B所示，暴露于bFGF和VEGF導(dǎo)致對照CAM中血管生成。相反，針對αvβ3和αvβ5的環(huán)肽拮抗劑RGDfV(SEQ ID NO4)使bFGF或VEGF誘導(dǎo)的血管形成消除。環(huán)肽RADfV(SEQ ID NO5)不影響bFGF-或VEGF處理的CAM標(biāo)本中的血管生成。結(jié)果還示于圖6A和6B中，其中示出bFGF和VEGF刺激的CAMs的血管生成指數(shù)，表明暴露于試驗(yàn)肽和對照肽情況。因此，這些發(fā)現(xiàn)與家兔角膜中測定結(jié)果一起說明了bFGF和VEGF誘導(dǎo)的血管生成依賴于不同的但同源αv特異整聯(lián)蛋白，但是用環(huán)肽RGDfV可抑制這兩種整聯(lián)蛋白。
用根據(jù)實(shí)施例3所述制備的合成肽進(jìn)行另外類似分析，以限定對αvβ5而非αvβ3相關(guān)血管生成有特異性的肽。還用按實(shí)施例10所述制備的有機(jī)分子進(jìn)行分析。
通過將生長因子血管生成誘導(dǎo)作用分析延伸至腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)或佛波酯、4-β-佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)，使整聯(lián)蛋白抗體抑制生長因子誘導(dǎo)的血管生成的特異性進(jìn)一步確證并強(qiáng)化。
上述生長因子(細(xì)胞因子)包括bFGF和VEGF，在濃度為1.0μg/ml時(shí)分別施用于如前所述的10日齡CAM模型。PMA使用濃度為20ng/ml。
生長因子處理后24小時(shí)后，通過如上所述的單一靜脈內(nèi)劑量或下一實(shí)施例所述的局部給藥分別對CAM模型提供抗體LM609和P1F6或蛋白激酶C(PKC)抑制劑、Calphostin C。在接下來連續(xù)3天時(shí)間靜脈內(nèi)注射時(shí)，抗體使用濃度為每只胚胎75μg，Calphostin C劑量為100nM。
在第13天時(shí)，切下濾紙片和相關(guān)CAM組織，并用立體顯微鏡分析血管生成。通過分析濾紙片區(qū)內(nèi)血管數(shù)量和分支程度，以雙盲形式評分血管生成。分?jǐn)?shù)范圍從低(1)至高(4)。通過從所有數(shù)據(jù)中減去背景分?jǐn)?shù)1確定血管生成指數(shù)。每種條件下用5-6只胚胎重復(fù)實(shí)驗(yàn)2-4次。
分別如圖7A和7B所示，抗αvβ3抗體LM609阻斷應(yīng)答bFGF和TNF-α的血管生成，而抗αvβ5抗體P1F6沒有什么抑制劑效果。相反，分別如圖7C-7E所示，P1F6在抑制VEGF、TGF-α或PMA誘導(dǎo)的血管生成中是有效的，而LM609沒有這種效果。
PNA一種有效的血管生成誘導(dǎo)劑，能活化蛋白激酶C(PKC)，一族胞內(nèi)絲氨酸蘇氨酸激酶。因此，我們還檢測了Calphostin C一種PKC抑制劑對小雞CAM上血管生成的效果。Calphostin C阻斷PMA(圖7E)和VEGF、TGF-α(分別示于圖7C和7D)誘導(dǎo)的血管生成，而對bFGF或TNF-α介導(dǎo)的血管生成(分別示于圖7A和7B)具有最小效果。
這些結(jié)果一起表明存在兩條單獨(dú)的不同的血管生成途徑，其中一條途徑依賴于αvβ3介導(dǎo)的信號，與PKC遠(yuǎn)遠(yuǎn)無關(guān)，正如先前Brooks等在科學(xué)(Science)，264569-571(1994)中所述，另一條途徑由αvβ5介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號強(qiáng)化，關(guān)鍵依賴PKC活化作用。
除上述實(shí)驗(yàn)外，為確定P1F6和LM609 mAbs在靜脈內(nèi)注射LM609的CAM組織中的定位，室溫下用HBSS中2.5％BSA封閉固定切片1小時(shí)，隨后用1∶250山羊抗小鼠若丹明標(biāo)記的二級抗體(Tago)染色。然后用Zeiss免疫熒光化合物顯微鏡分析切片。
B.通過局部施用抑制劑抑制生長因子誘導(dǎo)的血管生成為確定αvβ5是否在血管生成中起活化作用，上述用生長因子飽和的濾紙片被放置于CAMs上以誘導(dǎo)血管生成，隨后施用P1F6或LM609。
然后用總體積25μl的無菌HBSS在0、24和48小時(shí)處理濾紙片，其中于50ml HBSS中含25mg mAb。在72小時(shí)，收集CAMs，放置于陪替氏培養(yǎng)皿中并用1ml PBS洗滌1次。然后在Olympus立體顯微鏡下由兩名觀察者以雙盲形式分析濾紙底部和CAM組織。當(dāng)CAMs呈現(xiàn)出紙片正下方CAM的血管浸潤減少＞50％時(shí)，認(rèn)為血管生成抑制明顯。每種條件用6至7個(gè)胚胎，每個(gè)抗體重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)。
為檢測整聯(lián)蛋白抗體對預(yù)先存在的由正常血管發(fā)育的鄰近無血管區(qū)的成熟血管的效果，將mAbs飽和的濾紙片放于CAMs的血管形成區(qū)，CAMs來自10天胚胎，沒有接受細(xì)胞因子表面施用。
還用本發(fā)明合成肽進(jìn)行了CAM分析，以確定環(huán)肽和線性肽對生長因子誘導(dǎo)的血管生成的效應(yīng)。將如前所述制備的8μg肽分別放入總體積25μl的無菌HBSS中。立即將此肽溶液施用于CAM標(biāo)本，24小時(shí)和48小時(shí)再次施用。在72小時(shí)，切除濾紙及周圍CAM組織，如上所述進(jìn)行觀察。
用實(shí)施例10所述制備的有機(jī)分子進(jìn)行類似分析。
C.通過局部施用抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成1)用單克隆抗體處理在上述血管生成分析中評估了抗αvβ5抗體和肽拮抗劑的效應(yīng)，除此之外，還研究αvβ5在腫瘤誘導(dǎo)的血管生成中的作用。作為誘導(dǎo)物，使用預(yù)先生長并分離自17日雞胚的CAM中的αvβ5陰性的人組織。如實(shí)施例5C所述制備碎片。
如上所述，將mAbs分別局部施用于腫瘤碎片，濃度為25μl HBSS中25μg，然后用膠帶封閉窗口。以同樣方式在24小時(shí)和48小時(shí)再次加入mAbs。在72小時(shí)，如上所述分析腫瘤和周圍CAM組織。
如實(shí)施例5C所述，通過向10日齡雞胚的CAMs上移植人細(xì)胞系使腫瘤開始生長，所述細(xì)胞素不表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ5。
為定量mAbs對腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的效果，由兩名觀察者以雙盲形式計(jì)數(shù)立體顯微鏡下進(jìn)入CAM焦平面內(nèi)腫瘤的血管。
如上所述，將實(shí)施例3制備的合成肽和實(shí)施例10制備的有機(jī)分子以類似方法表面施用于腫瘤誘導(dǎo)的血管生成性CAM分析系統(tǒng)。以類似方法評估肽和有機(jī)分子對血管生存力的影響效應(yīng)。
D.通過靜脈內(nèi)施用抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成1)用單克隆抗體處理還通過靜脈注射施用單克隆抗體對上面制備的腫瘤誘導(dǎo)的血管進(jìn)行處理。將CS-1黑素瘤按實(shí)施例5C所述方法放置在CAMs上，窗口用膠帶封閉，24小時(shí)后，100至300μg純化的mAbs靜脈內(nèi)接種入雞胚血管一次，如上所述。然后使雞胚孵育7天。按前述方法觀察血管生成程度。這個(gè)時(shí)期之后，切除腫瘤并分析重量，以確定暴露于抗體對腫瘤生長或抑制的效應(yīng)。
用300μgαvβ5特異抗體P1F6處理CS-1腫瘤的結(jié)果示于圖8。與未處理的到CSAT處理的腫瘤相比，腫瘤重量顯著減至少于50mg。αvβ3特異抗體LM609也抑制腫瘤生長，但比用P1F6的效果差。用100μgP1F6處理腫瘤獲得了可比結(jié)果。因此，P1F6在抑制CAM標(biāo)本上腫瘤模型中αvβ5介導(dǎo)的血管生成時(shí)是有效的，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞量減少。
2)用合成肽或有機(jī)分子處理還評估了肽或有機(jī)分子對CAM分析系統(tǒng)中腫瘤誘導(dǎo)的血管形成的效應(yīng)。如上所述使用腫瘤-CAM標(biāo)本，除了將分別按實(shí)施例3和10所述制備的合成肽和有機(jī)分子各自靜脈內(nèi)注射入可見血管，代替靜脈內(nèi)注射mAb。
7.通過配體-受體結(jié)合分析檢測鑒別αvβ5特異的拮抗劑通過測定它們在純化的配體-受體結(jié)合分析中拮抗αvβ5、αvβ3和αIIbβ3受體結(jié)合活性的能力，篩選分別由實(shí)施例1和3制備的αvβ5免疫反應(yīng)抗體和合成肽。用于這些結(jié)合測定的方法描述于Barbas等美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，9010003-10007(1993)，Smith等生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26511008-11013(1990)和Pfaff等生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26920233-20238(1994)，其內(nèi)容在此引作參考。
描述了在配體-受體結(jié)合分析中鑒別拮抗劑的方法，其中受體被固定化于固相載體，配體和拮抗劑是可溶的。也描述了配體-受體結(jié)合分析，其中配體被固定化于固相載體，受體和拮抗劑是可溶的。
簡單來說，所選擇的純化的整聯(lián)蛋白被分別固定在Titertek微量滴定孔中，覆膜濃度為每孔50納克(ng)。用于配體-受體結(jié)合分析中的受體的純化是本領(lǐng)域熟知技術(shù)，由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知方法很易獲得。在4℃孵育18小時(shí)后，用10毫克/毫升(mg/ml)中血清白蛋白(BSA)的Tris緩沖鹽水封閉板上非特異結(jié)合位點(diǎn)。研究抑制作用時(shí)，測試所選擇抗體或肽的各種濃度阻斷125I-玻連蛋白或其它標(biāo)記配體與整聯(lián)蛋白受體αvβ5、αvβ3、αvβ1和αIIbβ3結(jié)合的能力。
雖然這些配體表現(xiàn)出對一個(gè)特定整聯(lián)蛋白的最佳結(jié)合，玻連蛋白對αvβ5和αvβ3、血纖維蛋白原對αIIbβ3，但使用抗體或肽以阻斷玻連蛋白與每個(gè)受體結(jié)合的結(jié)合抑制作用研究能準(zhǔn)確測定半最大抑制受體與配體結(jié)合所需的肽的微摩爾(μM)量。使用放射性標(biāo)記的配體濃度1nM，分別用未標(biāo)記的合成肽進(jìn)行競爭結(jié)合。溫育3小時(shí)后，洗滌除去游離配體，由γ計(jì)數(shù)檢測結(jié)合配體。
由此，此處所述的配體-受體分析被用于篩選對特定整聯(lián)蛋白受體特別是αvβ5具有選擇性特異性的環(huán)狀或線性合成肽以及單克隆抗體和有機(jī)分子，它們均在實(shí)施本發(fā)明中用作玻連蛋白受體(αvβ5)拮抗劑。
8.使用αvβ5拮抗體使活體腫瘤組織生長衰退，通過嵌合小鼠人分析測定通過用人新生包皮替換SCID小鼠的一塊皮膚產(chǎn)生一種活體嵌合小鼠人模型。基本按Yan等人在臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)，91986-996(1993)中所述制備活體嵌合小鼠人模型。簡單來說，通過手術(shù)從SCID小鼠(6-8周齡)除去一塊2cm2的皮膚，并以人包皮替換。使小鼠麻醉，刮去位于側(cè)腹區(qū)每邊5cm2區(qū)的毛。通過除去全層皮直至筋膜以下制備出兩個(gè)2cm2的圓形移植床。將來自人新生包皮的同樣大小的全層人皮膚移植片放在傷口床上并縫合就位。用Band-Aid包覆移植片，與皮膚縫合。再用紗布帶包覆傷口。
皮膚移植完成后，用黑素瘤細(xì)胞接種人包皮。M21L人黑素瘤細(xì)胞系被用于在SCID小鼠人皮膚移植片上形成人實(shí)體腫瘤。2×106M21L單一細(xì)胞懸浮液被真皮內(nèi)注射入人皮膚移植片。然后觀察小鼠2至4周，使人腫瘤生長至可測量水平。
可測的腫瘤長成后，用250μg序列為SEQ ID NO9(含RGD環(huán)肽Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-甲基化Val)的肽(體積100μl)或?qū)φ针沫h(huán)Arg-βAla-Asp-D-Phe-Val腹膜內(nèi)注射小鼠，每周3次，共3周。之后，切除腫瘤并分析其重量和組織學(xué)。
結(jié)果示于圖9，其中腫瘤體積以mm3示于Y軸，相對于X軸為肽處理法。序列為SEQ ID NO9的測試肽，在圖中被標(biāo)為肽189，使腫瘤體積顯著減小至約25mm3，相比于對照肽(標(biāo)記為肽601)腫瘤體積大于300mm3。
因此，通過靜脈內(nèi)施用αvβ5拮抗劑肽189阻斷αvβ5受體，導(dǎo)致此模型系統(tǒng)中黑素瘤的衰退，與如前所述的CAM和家兔眼模型系統(tǒng)中的方式相同。
上面SCID/人嵌合模型也用于評估本發(fā)明其它αvβ5拮抗劑的效力，即抗體和有機(jī)分子，后者由實(shí)施例10所述制備。
9.用于αvβ5介導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成的小鼠模型的制備和用αvβ5拮抗劑對血管生成的抑制基于實(shí)施例2C中觀察的αvβ3和αvβ5在視網(wǎng)膜新血管組織中的表達(dá)，使用新的小鼠模型研究系統(tǒng)給藥兩種整聯(lián)蛋白的環(huán)肽拮抗劑對視網(wǎng)膜血管生成的效應(yīng)。新生小鼠在出生后前兩周中生長視網(wǎng)膜血管，這期間淺表視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)形成一個(gè)豐富的、高度分支的血管網(wǎng)絡(luò)，它起源于視神經(jīng)頭并向周圍輻射以覆蓋視網(wǎng)膜表面，方式類似于在其它哺乳動物和人中所觀察到的(Jiang等在Glia，151-10(1995))。
對于該模型，用環(huán)肽RGDfV(SEQ ID NO4)(也稱為肽203)或?qū)φ针腞ADfV(SEQ ID NO5)每天兩次皮下注射新生小鼠，從0天開始共4天。在出生后第5天，眼球被移去并室溫固定于4.0％多聚甲醛(PFA)中。
為定量小鼠視網(wǎng)膜血管生成，測量單一血管從視神經(jīng)頭至最遠(yuǎn)端的距離，其中在一個(gè)12小時(shí)鐘的6個(gè)等分扇區(qū)的每一扇區(qū)內(nèi)選擇血管。計(jì)算平均距離，用從整個(gè)視網(wǎng)膜得到的近似數(shù)平均。為測量視網(wǎng)膜血管的總體積，整個(gè)樣品在2.0μm可視區(qū)部分掃描并計(jì)數(shù)存儲。然后使用Bio-Rad′s Lasersharp軟件的“seed”功能進(jìn)行限閾并計(jì)算每一部分的立方象素(cubic pixels)。存儲入宏，以加和出全部部分的體積，確定出全部血管結(jié)構(gòu)的數(shù)值。
根據(jù)在圖片二維體系直接測定血管生長，系統(tǒng)給藥肽拮抗劑203抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)生，與對照肽相比，抑制了44％(N＝9，p＜.0000001，配對t-試驗(yàn))。在未處理的新生小鼠和接受肽203的5日齡小鼠間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此該肽有效抑制血管發(fā)生。此外，在未處理間5日齡小鼠和接受對照肽的同齡小鼠間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此在RGDfV處理的新生小鼠中視網(wǎng)膜血管發(fā)生的抑制作用與未處理的對照小鼠相比有效率為100％。
使用一個(gè)考慮血管生長三維性質(zhì)的定量分析，與對照動物相比發(fā)現(xiàn)肽203處理的動物中視網(wǎng)膜血管體積減少了78％。203處理的動物在出生后第5天血管平均體積為3.6×106μm3，對照處理動物為15.7×106μm3。在未處理的新生小鼠中視網(wǎng)膜血管占的體積與5日齡203處理的動物之間難以區(qū)別。
以上獲得的結(jié)果表明這些拮抗劑特異地抑制新血管形成，對已形成血管沒有影響。這些結(jié)果表明視網(wǎng)膜新血管疾病的病理不同于視網(wǎng)膜下新血管疾病的病理，αvβ5拮抗劑在治療相關(guān)于血管生成的使眼失明疾病中是有效的。
用實(shí)施例10制備的有機(jī)模擬物αvβ5拮抗劑進(jìn)行類似分析。
10.αvβ5拮抗劑有機(jī)分子的制備下面描述了有機(jī)αvβ5拮抗劑化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18的合成，并且還示于附圖中。所得的有機(jī)分子稱為本發(fā)明有機(jī)模擬物，然后用于抑制αvβ5介導(dǎo)的血管生成。
對于下述每種合成，在Perkin-Elmer 241分光光度計(jì)上測量旋光性，在Beckmann DU-70分光計(jì)上記錄紫外和可見光譜。在BrukerAMX-400和AMX-500分光計(jì)上在400和500MHz記錄1H和13CNMR譜。在VG ZAB-ZSE質(zhì)譜儀上在快速原子轟擊(FAB)條件下記錄高分辨質(zhì)譜(HRMS)。用70-230目硅膠進(jìn)行柱色譜。在Merck Art.5744(0.5mm)上進(jìn)行制備型TLC。在Thomas Hoover裝置上測定熔點(diǎn)。
A.化合物1t-Boc-L-酪氨酸芐基酯，于圖10所示 化合物125℃時(shí)向0.10M(M)N-(叔-丁氧羰基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-Tyr)(1.0當(dāng)量，Aldrich)的二氯甲烷溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(1.5當(dāng)量)，并攪拌1小時(shí)。接著，加入1.5當(dāng)量芐醇，并于25℃再攪拌混合物12小時(shí)。然后反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋并用水洗滌兩次(2X)、用鹽水洗1次(1X)，在硫酸鎂上干燥。真空除去溶劑，然后粗產(chǎn)物用硅膠色譜純化。也可以從Sigma購買化合物1，t-Boc-L-酪氨酸芐酯。
B.化合物2(S)-3-(4-(4-溴丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸芐酯，示于圖10步驟i 化合物2
將t-Boc-L-酪氨酸芐酯(2g，5.38mmol；如上合成)、1，4-二溴丁烷(1.9ml，16.2mmol，Aldrich)、碳酸鉀(5g)和18-冠(醚)-6(0.1g，Aldrich)的混合物于80℃加熱12小時(shí)。冷卻后，濾去沉淀，真空中蒸發(fā)反應(yīng)混合物至干燥。然后利用100％己烷通過結(jié)晶純化粗產(chǎn)物，得2.0g(92％)的化合物2。
C.化合物3(S)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸芐酯，示于圖10步驟ii 化合物3將化合物2(2.5g，4.9mmol)與疊氮化鈉(1.6g，25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中25℃攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)除去溶劑，殘余物用水(約10ml)處理并用乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)層，通過硫酸鎂干燥，蒸發(fā)，得到2.0g(90％)化合物3，為無色漿液(FAB-MS469(M+H+))。
D.化合物4(S)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-氨基-丙酸芐酯，示于圖10步驟iii 化合物4將化合物3(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)中，室溫下攪拌3小時(shí)。真空中蒸發(fā)得到1.6g(定量的)化合物4，為無色漿液，被用于下一步驟無需進(jìn)一步純化。FAB-MS369(M+N+)。
E.化合物5(S)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸芐酯，示于圖10步驟iv
化合物5將化合物4(1.6g；4.3mmol)、丁烷磺酰氯(0.84ml；6.6mm0l)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中室溫下攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘余物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。蒸發(fā)至干燥后，粗產(chǎn)物用快速色譜(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化，得到1.4g(67％)化合物5，為無定形固體。
F.化合物6(S)-3-(4-(4-氨基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于圖10步驟v 化合物6將化合物5(1.3g(2.6mmol))溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)中，在100mg Pd(炭上10％)存在下25℃在氫氣(1個(gè)大氣壓；Parr Shaker儀)中氫化。3小時(shí)后，濾出催化劑，蒸發(fā)溶劑得到化合物6，為油狀殘余物。冷凍干燥脫水后，得到1.0g(定量的)化合物6，為白色粉末。FAB-MS373(M+H+)。
G化合物7(S)-3-( 4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于圖10步驟vi 化合物7
將化合物6(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸鹽(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和乙三胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，真空中蒸發(fā)掉溶劑，殘余物用HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化，得50mg(25％)化合物7，冷凍干燥后為無定形白色粉末。FAB-MS415(M+H+)，m.p.70℃。
H.化合物8(S)-3-(4-(4-氨基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸，示于圖11步驟iii 化合物8將化合物3(0.5g，1.07mmol)溶解于10ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.1ml三氟乙酸(TFA)中，在30mg Pd(炭上10％)存在下25℃在氫氣(1個(gè)大氣壓，Parr Shaker儀)中氫化。3小時(shí)后，濾去催化劑，蒸發(fā)掉溶劑，得化合物8為油狀殘余物。冷凍干燥脫水后，得到370mg(定量的)化合物8，為白色粉末。FAB-MS353(M+H+)。
I.化合物9(S)-3-( 4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸，示于圖11步驟iv 化合物9將化合物8(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸鹽(DPFN)(170mg，0.8mmol，Aldrich ChemicalCompany)和乙三胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF，5ml)中60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，真空蒸發(fā)掉溶劑，殘余物用HPLC(Lichrocart RP-18 ，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化，得160mg(90％)化合物9，冷凍干燥后為白色無定形粉末。FAB-MS395(M+H+)。
J.化合物10(R)-3-(4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于圖12步驟i-vi 化合物10用與合成化合物7相同的反應(yīng)順序制備D-酪氨酸類似物10，得到205mg白色無定形物質(zhì)FAB-MS415(M+H+)，正如下面使用中間體化合物100-600形成化合物101)化合物100t-Boc-D-酪氨酸芐酯，示于圖12 化合物10025℃時(shí)向0.10M的N-(叔丁氧羰基)-D-酪氨酸(t-Boc-L-Tyr)(1.0當(dāng)量；Aldrich)的二氯甲烷溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(1.5當(dāng)量)并攪拌1小時(shí)。接著，加入1.5當(dāng)量芐醇，于25℃再攪拌混合物12小時(shí)。然后反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，用水洗滌2X，用鹽水洗滌1X，在硫酸鎂上干燥。真空除去溶劑，然后用硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物。
2)化合物200(R)-3-(4-(4-溴丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸芐酯，示于圖12步驟i
化合物200將t-Boc-D-酪氨酸芐酯(2g，5.38mmol，如上合成)、1，4-二溴丁烷(1.9ml，16.2mmol，Aldrich)、碳酸鉀(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物在80℃加熱12小時(shí)。冷卻后，濾去沉淀，真空中蒸發(fā)反應(yīng)混合物至干燥。然后利用100％己烷通過結(jié)晶純化粗產(chǎn)物，得到2.5g(92％)化合物200。
3)化合物300(R)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸芐酯，示于圖12步驟ii 化合物300化合物200(2.5g，4.9mmol)與疊氮化鈉(1.6g，25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25℃攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)掉溶劑，殘余物用水(約10ml)處理，用乙酸乙酯萃取2次。合并有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，并蒸發(fā)得到2.0g(90％)化合物300，為無色漿液(FAB-MS469(M+H+))。
4)化合物400(R)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-氨基-丙酸芐酯，示于圖12步驟iii 化合物400
將化合物300(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA，2ml)中，于室溫下攪拌3小時(shí)。真空蒸發(fā)得到1.6g(定量的)化合物400，為無色漿液，其被用于下一步驟，無需純化。FAB-MS369(M+H+)。
5)化合物500(R)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸芐酯，示于圖12步驟iv 化合物500將化合物400(1.6g，4.3mmol)、丁烷磺酰氯(0.84ml，6.6mmol)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中室溫下攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。蒸發(fā)至干燥后，通過快速色譜(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化粗產(chǎn)物，得到1.4g(67％)化合物500，為無定形固體。
6)化合物600(R)-3-(4-(4-氨基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于圖12步驟v 化合物600將化合物500(1.3g(2.6mmol))溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)中，并在100mg Pd(炭上10％)存在下于25℃在氫氣(1個(gè)大氣壓，Parr Shaker儀)中氫化。3小時(shí)后，濾去催化劑，蒸發(fā)掉溶劑，得到化合物600，為油狀殘余物。冷凍干燥脫水后，得到1.0g(定量的)化合物600，為白色粉末。FAB-MS373(M+H+)。
7)化合物10(R)-3-(4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于圖12步驟vi將化合物600(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸鹽(DPFN)(170mg，0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，真空中蒸發(fā)掉溶劑，通過HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化殘余物，得到50mg(25％)化合物10，冷凍干燥后為白色無定形粉末。FAB-MS415(M+H+)，m.p.70℃K.化合物11(S)-3-(4-(4-疊氮基丁基氧基)苯基-2-(10-樟腦磺酰氨基)-丙酸芐酯，示于圖13 化合物11將化合物4(1.0g，2.7mmol)、10-樟腦磺酰氯(6.6mmol，Aldrich Chemical Company)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫下攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。蒸發(fā)至干燥后，通過快速色譜(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化粗產(chǎn)物，得1.4g(67％)化合物11，為無定形固體。
L.化合物12(S)-3-(4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-(10-樟腦磺酰氨基)-丙酸，示于圖13步驟i-ii 化合物12按下述條件將化合物11氫化并脒基化后得化合物12步驟i將化合物11(1.3g(2.6mmol))溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)中，在100mg Pd(炭上10％)存在下于25℃在氫氣(1個(gè)大氣壓，Parr Shaker儀)中氫化。3小時(shí)后，濾去催化劑，蒸發(fā)溶劑得中間體胺，為油狀殘余物，冷凍干燥脫水后，得1.0g(定量)中間體胺，為白色粉末，繼續(xù)以下操作步驟ii將上述中間體胺化合物(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸鹽(DPFN)(170mg，0.8mmol；AldrichChemical Company)和三乙胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF，5ml)中于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，真空蒸發(fā)溶劑，殘余物由HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化，得50mg(25％)化合物12，冷凍干燥后為白色無定形粉末。FAB-MS509.6(M+H+)。
M.化合物13(S)-3-(4-(5-溴戊基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基丙酸芐酯， 化合物13將t-Boc-L-酪氨酸芐酯(4.5g，12.1mmol；如上合成的化合物1)、1，5-二溴戊烷(5ml，36.7mmol；Aldrich)、碳酸鉀(10g)和18-冠醚-6(0.25g；Aldrich)的混合物于80℃加熱12小時(shí)。冷卻后，濾去沉淀，真空中蒸發(fā)反應(yīng)混合物至干燥。然后利用100％己烷通過結(jié)晶純化粗產(chǎn)物，得到5.35g(85％)化合物13。
N.化合物14(S)-3-(4-(5-胍基戊基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于圖13步驟i-v 化合物14進(jìn)行5步反應(yīng)，順序?yàn)殇?疊氮交換、Boc-脫除、用丁烷磺酰氯進(jìn)行磺酰化、氫化和用DPFN脒基化，與上述使用中間體化合物1-6形成7的步驟相同，或與上述使用化合物100-600形成化合物10的步驟相同。得到化合物14為白色粉末FAB-MS429(M+H+)。
O.化合物153-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，二鹽酸鹽示于圖141)用于化合物15的原料2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯的合成 化合物15通過(D或L)，N-(叔丁氧羰基)-L(D)-酪氨酸(t-BOC-L(D)-Tyr)(1.0當(dāng)量；Sigma)在0.10M甲醇和1％稀鹽酸中的酯化作用得到原料2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯。反應(yīng)混合物于25℃攪拌12小時(shí)，然后通過碳酸鉀中和，用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X，用鹽水洗滌1X，在硫酸鎂上干燥。真空下除去溶劑，之后用硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物，得到2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯。
2)用于化合物15的原料3-P-N-BOC-脒基-苯基-5-甲烷磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮的合成3步法如下將對-氨基-芐腈(1.0當(dāng)量；Aldrich)在二氯甲烷(0.10M)中與2，3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量，Aldrich)一起于25℃攪拌12小時(shí)。接著，真空除去溶劑，粗4-(2，3-二羥丙氨基)芐腈進(jìn)行下一步驟如下將25℃二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2，3-二羥丙氨基)芐腈(10當(dāng)量；如上所述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量，Aldrich)一起于110℃攪拌6小時(shí)。接著，用乙酸乙酯(0.10M)稀釋反應(yīng)混合物，并用水洗滌2X，用鹽水洗滌1X，在硫酸鉀上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得到3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷，進(jìn)行下一步驟，如下將3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷(1.0當(dāng)量；如上所述)在二氯甲烷(0.10M)中與1.1當(dāng)量的硫化氫、1.1當(dāng)量的碘代甲烷和1.1當(dāng)量的乙酸銨一起攪拌。將反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X，鹽水洗滌1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得到脒，進(jìn)行下一步驟，如下上述合成的1.0當(dāng)量脒由二氯甲烷(0.10M)中的1.1當(dāng)量BOC-ON(2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯乙腈，Aldrich)于25℃保護(hù)，攪拌6小時(shí)。然后反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.1M)稀釋)，并用水洗滌2X，鹽水洗滌1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物在0.1M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。于0℃攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)驟冷，用乙酸乙酯(0.1M)稀釋，并用水洗滌2X，鹽水洗滌1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物由硅膠柱色譜純化，得到3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮。
3)將中間體2-N-BOC-氨基-3-(4-羥苯基)-丙酸酯與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮偶聯(lián)，形成保護(hù)形式的化合物153-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2N-BOC-氨基-乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮將1.9g 2-N-BOC-氨基-3-(4-羥苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)的混合物于室溫下攪拌30分鐘。攪拌后，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8g 3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，于室溫下再攪拌15分鐘。然后用乙酸乙酯(0.1M)稀釋反應(yīng)混合物，并用水洗2X，鹽水洗1X，于硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得到被保護(hù)形式的化合物153-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2N-BOC-氨基-乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮，繼續(xù)進(jìn)行下一步驟。
4)保護(hù)形式的化合物15脫保護(hù)，形成化合物153-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮二鹽酸鹽，圖14在室溫下用4ml 2N NaOH處理保護(hù)形式的化合物153-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2N-BOC-氨基-乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量；合成如上所述)4小時(shí)。然后在0℃-25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液3小時(shí)。反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)驟冷，再用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得化合物153-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮二鹽酸鹽；m.p.165℃(d)。
P.化合物163-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧)甲基-2-_唑烷酮，示于圖141)用于化合物16的原料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯的合成 化合物16通過((D或L)酪氨酸)(1.0當(dāng)量，Sigma)在0.1M甲醇和1％稀鹽酸中的酯化作用獲得原料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯。反應(yīng)混和物于25℃攪拌12小時(shí)然后用碳酸鉀中和，并用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行如下反應(yīng)將上述化合物(4.3mmol)、丁烷磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物于室溫下在二氯甲烷(20ml)中攪拌12小時(shí)。然后，蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，殘余物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。蒸發(fā)至干燥后，粗產(chǎn)物用快速色譜(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。
2)用于化合物16的原料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮的合成3步法如下將對-氨基-芐腈(1.0當(dāng)量，Aldrich)在二氯甲烷(0.10M)中與2，3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量，Aldrich)一起于25℃攪拌12小時(shí)。接著，真空除去溶劑，粗4-(2，3-二羥丙氨基)芐腈繼續(xù)進(jìn)行如下步驟將25℃二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2，3-二羥丙氨基)芐腈(1.0當(dāng)量，如上所述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量，Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量，Aldrich)一起于110℃攪拌6小時(shí)。接著，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，用水洗滌2X，鹽水洗滌1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠色譜柱純化，得到3-(4-氰丙基)-5-羥甲基-2-_唑烷酮，繼續(xù)進(jìn)行如下步驟將3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量；如上所述)在二氯甲烷(0.10M)中25℃與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量碘代甲烷和1.1當(dāng)量乙酸銨一起攪拌。攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得到脒，繼續(xù)進(jìn)行如下步驟將上述合成的1.0當(dāng)量脒用二氯甲烷(0.10M)中1.1當(dāng)量的BOC-ON(2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)保護(hù)，25℃攪拌6小時(shí)。接著，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物在0.1M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。于0℃攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)驟冷，用乙酸乙酯(0.10M)稀釋)，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠色譜純化，得3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮。
3)使中間體2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮偶聯(lián)形成保護(hù)形式的化合物163-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮將1.9g 2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)的混合物于室溫下攪拌30分鐘。攪拌后，加入10ml二甲基甲酰胺中的1.8g 3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，并于室溫下再攪拌15分鐘。然后反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得到保護(hù)形式的化合物163-(4-BOC-脒苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)-苯氧基甲基-2-_唑烷酮，繼續(xù)進(jìn)行下一步驟。
4)保護(hù)形式的化合物16脫保護(hù)，形成化合物163-(4-脒苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，圖14用4ml 2N NaOH在室溫下處理保護(hù)形式的化合物16，3-(4-BOC-脒苯基)-5-(4-(2-甲氧-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量，合成如上)4小時(shí)。然后在0℃-25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液3小時(shí)。反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)淬火，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得化合物163-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮；m.p.236-237℃。
Q.化合物173-(4-脒苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，示于圖14中1)用于化合物17的原料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯的合成 化合物17
通過在0.10M甲醇和1％稀鹽酸中((D或L)酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Sigma)的酯化作用得到原料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯。反應(yīng)混合物于25℃攪拌12小時(shí)，用碳酸鉀中和，并用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空除去溶劑，粗產(chǎn)物進(jìn)行如下步驟將上述化合物(4.3mmol)、丙磺酰氯(6.6mmol，Aldrich)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中室溫下攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。蒸發(fā)至干燥后，粗產(chǎn)物通過快速色譜(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化，得標(biāo)題化合物。
2)用于化合物17的原料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮的合成3步法如下將對-氨基-芐腈(1.0當(dāng)量，Aldrich)在二氯甲烷中(0.10M)與2，3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量；Aldrich)一起于25℃攪拌12小時(shí)。然后真空除去溶劑，粗4-(2，3-二羥丙氨基)芐腈繼續(xù)進(jìn)行如下步驟將25℃二甲基甲酰胺中(0.10M)的4-(2，3-二羥丙氨基)芐腈(1.0當(dāng)量，如上所述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量，Aldrich)一起于110℃攪拌6小時(shí)。接著，用乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷酮，進(jìn)行如下步驟3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量，如上所述)在25℃二氯甲烷中(0.10M)與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量碘代乙烷和1.1當(dāng)量乙酸銨一起攪拌。攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，得到脒，繼續(xù)如下步驟將上面合成的1.1當(dāng)量脒用二氯甲烷中(0.10M)1.1當(dāng)量BOC-ON(2-(BOC-氧亞胺基)-2-苯乙腈；Aldrich)保護(hù)，并攪拌6小時(shí)。接著，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物在0.10M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。0℃時(shí)攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)驟冷，用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮。
3)將中間體2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酮酯與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮偶聯(lián)，形成保護(hù)形式的化合物173-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)-苯氧甲基-2-_唑烷酮室溫下，將1.9mg 2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)的混合物一起攪拌30分鐘。攪拌后，加入溶在10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8g 3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，于室溫下再攪拌15分鐘。然后用乙酸乙酯稀釋(0.10M)反應(yīng)混合物；并用水洗滌2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得到保護(hù)形式的化合物17，3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧甲基-2-_唑烷酮，繼續(xù)下一步驟。
4)保護(hù)形式的化合物17脫保護(hù)，形成化合物173-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，圖14室溫下用4m 2N NaOH處理保護(hù)形式的化合物173-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量；如上合成)4小時(shí)。然后0℃至25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液。然后反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)驟冷，用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得化合物173-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮；m.p.200℃(d)。
R.化合物183-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，示于圖141)用于化合物18的原料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯的合成 化合物18通過在0.10M甲醇和1％稀鹽酸中((D或L)酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Sigma)的酯化作用獲得原料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯。于25℃攪拌反應(yīng)混合物12小時(shí)，然后用碳酸鉀中和，用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物繼續(xù)如下步驟室溫下將上述化合物(4.3mmol)、乙基磺酰氯(6.6mmol，Aldrich)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。蒸發(fā)至干燥后，粗產(chǎn)物通過快速色譜(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。
2)用于化合物18的原料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮；3步法如下25℃時(shí)將對-硝基-芐腈(1.0當(dāng)量；Aldrich)二氯甲烷(0.10M)溶液與2，3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量，Aldrich)一起攪拌12小時(shí)。接著，真空中除去溶劑，粗4-(2，3-二羥基丙氨基)芐腈繼續(xù)進(jìn)行如下步驟將25℃二甲基甲酰胺中(0.10M)的4-(2，3-二羥基丙氨基)芐腈(1.0當(dāng)量，如上所述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量，Aldrich)于110℃一起攪拌6小時(shí)。接著，用乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物(0.10M)，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得到3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷酮，繼續(xù)如下步驟將25℃二氯甲烷中(0.10M)的3-(4-氰苯基)-5-羥甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量，如上所述)與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量碘代甲烷和1.1當(dāng)量乙酸銨一起攪拌。攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，水洗2X，鹽水洗1X，并在硫酸鎂上干燥。然后真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得到脒，繼續(xù)進(jìn)行如下步驟將上述合成的1.0當(dāng)量脒用25℃二氯甲烷中(0.10M)1.1當(dāng)量的BOC-ON(2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)保護(hù)，并攪拌6小時(shí)。接著，用乙酸乙酯(0.10M)稀釋反應(yīng)混合物，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物在0.10M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。0℃時(shí)攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)驟冷，用乙酸乙酯稀釋(0.10M)，水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮。
3)使中間體2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮偶聯(lián)，形成保護(hù)形式的化合物183-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)-苯氧甲基-2-_唑烷酮室溫下將1.9g 2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)的混合物攪拌30分鐘。攪拌后，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8g 3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，再于室溫下攪拌15分鐘。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋反應(yīng)混合物，用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得保護(hù)形式的化合物183-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)-苯氧基甲基-2-_唑烷酮，繼續(xù)進(jìn)行下一步。
4)保護(hù)形式的化合物18脫保護(hù)，形成化合物183-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，圖14室溫下用4ml 2N NaOH處理保護(hù)形式的化合物183-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧-羰基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮(1.0當(dāng)量，如上所述合成)4小時(shí)。然后在0℃至25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液3小時(shí)。反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)驟冷，用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗2X，鹽水洗1X，在硫酸鎂上干燥。真空中除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得化合物183-(4-脒基苯基)-5-(4-2-羧基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮；m.p.212℃(d)。
上述說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。事實(shí)上，除此處所示及所述內(nèi)容之外對本發(fā)明的各種改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)前面說明書是顯而易見的，并且落入后附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表(1)總體信息(i)申請人THE SCRIPPS RESERCH INSTITUTE(ii)發(fā)明名稱用于抑制αvβ5介導(dǎo)的血管生成的方法和組合物(iii)序列數(shù)9(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(v)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朠CT/US96/(B)申請日1996年8月13日(C)分類(vi)優(yōu)先權(quán)申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/514,799(B)申請日1995年8月14日(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝BOC(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Phe
/注＝“D-Phe中前綴“D”表示第4位的苯丙氨酸是D-氨基酸”(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記＝OMe(xi)序列描述SEQ ID NO1Arg Gly Asp Phe Val1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝BOC(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Phe/注＝“D-Phe中前綴“D”表示第4位的苯丙氨酸是D-氨基酸”(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記＝OH(xi)序列描述SEQ ID NO2Arg Gly Asp Phe Val1 5
(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝H(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Phe/注＝“D-Phe中前綴“D”表示第4位苯丙氨酸為D-氨基酸”(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記＝OH(xi)序列描述SEQ ID NO3Arg Gly Asp Phe Val1 5(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部
(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝cyclo(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Phe/注＝“D-Phe中前綴“D”表示第4位苯丙氨酸是D-氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO4Arg Gly Asp Phe Val1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝環(huán)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Phe/注＝“D-Phe中前綴“D”表示第4位苯丙氨酸是D-氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO5Arg Ala Asp Phe Val1 5
(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝環(huán)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置2(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Arg/注＝“D-Arg中前綴“D”表示第2位精氨酸是D-氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO6Gly Arg Gly Asp Phe Val1 5(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)狀(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記＝環(huán)
(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Val/注＝“D-Val中前綴“D”表示第5位的纈氨酸是D-氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO7Arg Gly Asp Phe Val1 5(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵肽(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記＝D-Phe/注＝“D-Phe中前綴“D”表示第4位的苯丙氨酸是D-氨基酸”(ix)特點(diǎn)
(A)名稱/鍵肽(B)位置6(D)其它信息/標(biāo)記＝MeVal/注＝“MeVal中的前綴“Me”表示第6位的纈氨酸是甲基化纈氨酸”(xi)序列描述SEQ ID NO9Arg Gly Asp Phe Asn Val1 權(quán)利要求
1.αvβ5拮抗劑在制備用于抑制含αvβ5的組織中αvβ5介導(dǎo)的血管生成的藥物中的用途，其中所述αvβ5拮抗劑是有機(jī)模擬物。
2.權(quán)利要求1的αvβ5拮抗劑的用途，其中所述有機(jī)模擬物由下面結(jié)構(gòu)表示
3.權(quán)利要求1的αvβ5拮抗劑的用途，其中所述有機(jī)模擬物由下面結(jié)構(gòu)表示
4.權(quán)利要求1的αvβ5拮抗劑的用途，其中所述有機(jī)模擬物由下面結(jié)構(gòu)表示
5.權(quán)利要求1的αvβ5拮抗劑的用途，其中所述有機(jī)模擬物由下面結(jié)構(gòu)表示
6.權(quán)利要求1的αvβ5拮抗劑的用途，其中所述有機(jī)模擬物由下面結(jié)構(gòu)表示
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制α
文檔編號A61P29/00GK101053561SQ20071008630
公開日2007年10月17日 申請日期1996年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月14日
發(fā)明者P·布魯克斯, D·A·徹雷, M·弗里蘭德爾 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院