專利名稱：C 20 h 27 o 3 在制備漁藥中的應(yīng)用及其制劑和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及C20H27O3的新用途，尤其涉及C20H27O3在制備殺滅魚類體外寄生蟲、特別是指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用及含有C20H27O3的藥物制劑和制劑的制備方法。

背景技術(shù)：
我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，2005年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量5101.65萬t，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖面積754.50萬hm2，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量3393.25萬t，占總產(chǎn)量的67％，而水產(chǎn)品出口也占較大的比重，2005年全國水產(chǎn)品進(jìn)出口總量為623萬t，出口量257萬t，出口額78.9億美元。漁業(yè)生產(chǎn)中，目前存在著兩個(gè)急需解決的問題，一是水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治問題；二是水產(chǎn)品藥物殘留問題，兩者對目前水產(chǎn)品的生產(chǎn)及其重要。據(jù)報(bào)道，2005年，水產(chǎn)養(yǎng)殖生物因病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)110.00億元，采取藥物防治是目前漁業(yè)生產(chǎn)中最主要的措施，但是，有些藥物的使用往往造成水產(chǎn)品質(zhì)量下降、藥殘嚴(yán)重。曾經(jīng)發(fā)生的一系列貿(mào)易事件給我國水產(chǎn)品出口敲響了警鐘2005年受“孔雀石綠殘留事件”影響，廣東烤鰻出口急降了21％；2006年8月來自中國海關(guān)的通報(bào)，日本在中國出口的鰻魚中檢測到農(nóng)藥硫丹的超標(biāo)，嚴(yán)重限制了我國鰻魚的出口。當(dāng)前生產(chǎn)中的漁藥主要是移植人藥、獸藥和部分農(nóng)藥等化學(xué)藥物，長期使用帶來的是環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為我國水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易堡壘問題。魚類體外寄生單殖吸蟲(Monogenoidea)病是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖最為嚴(yán)重的病害之一，特別是寄生在魚類鰓部的指環(huán)蟲(Dactylogyrus)和擬指環(huán)蟲(Pseudodactylogyrus)，大量寄生在魚類鰓部導(dǎo)致魚類呼吸困難出現(xiàn)大批毀滅性死亡，往往給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于該類寄生蟲病的防治，長期以來，主要藥物是甲苯咪唑(Mebendazolum)、吡喹酮(Praziquantelum)等化學(xué)藥物，由于長期使用產(chǎn)生耐藥性，并且有些化學(xué)藥物因不易降解、污染水環(huán)境、殘留、蓄積，危害人類的身體健康多被禁用。
C20H27O3(簡稱C13:0)是從銀杏外種皮中提取分離出來銀杏酚酸類的一種化合物，至今沒有中文命名，其結(jié)構(gòu)式為
該化合物的分子式為C20H27O3，分子量為320，白色晶體，在乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑中易溶，在甲醇、乙醇等醇類溶劑中溶解度低，在水中難溶。
TLC檢測以三氯化鐵顯色呈紫色。銀杏外種皮制劑和銀杏酚酸已知用途有 1.銀杏外種皮提取物制劑能夠應(yīng)用殺滅魚類指環(huán)蟲，申請的專利為“銀杏外種皮植物質(zhì)水產(chǎn)動(dòng)物體外寄生蟲防治劑”，受理號(hào)200310118938.5，申請人王高學(xué)等。
2.利用銀杏外種皮脂溶性提取物制備的生物農(nóng)藥及制備方法，受理號(hào)01135667.7，申請人石啟田，主要是粗提取物殺滅昆蟲、農(nóng)作物真菌病。
3.一種從銀杏外種皮提取的銀杏酸用于殺滅釘螺的用途，受理號(hào)200610085571.5，申請人吳向陽等，主要利用粗提物混合銀杏酸殺滅釘螺。
4.銀杏外種皮提取物或銀杏酚酸混合物能夠殺滅農(nóng)作物的真菌、昆蟲如菜青蟲，作為生物農(nóng)藥應(yīng)用在農(nóng)業(yè)病蟲害防治。萊陽農(nóng)學(xué)院通過對銀杏外種皮殺菌活性較為系統(tǒng)的研究，已成功開發(fā)出植物源仿生合成殺菌劑-“綠帝”乳油。
5.銀杏酚酸混合物能用于治療粉刺、齲齒、皮膚病、心血管疾病等。能高效地抑制酶活和清除自由基、抗過敏、抗疲勞和抗衰老作用。
6.銀杏酚酸混合物表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。
以下是發(fā)明人引用的有關(guān)參考文獻(xiàn)王杰，祝樹德，余碧鈺，等.銀杏外種皮提取物對菜青蟲抑制生長與拒食活性的研究.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版).2002，23(1)72-75.石啟田.銀杏外種皮銀杏酚酸類物質(zhì)防治農(nóng)業(yè)害蟲試驗(yàn)初報(bào).江蘇林業(yè)科技，2003，30(5)19-20張洪泉，許麗麗，傘巧秀，等.銀杏外種皮水溶性成分的抗過敏作用.中國中藥雜志，1990，15(8)48-49.顧維戎，孫云，程鵬等.銀杏外種皮對心血管的藥理作用.南京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，9(2)129.孟昭禮，董端瑞，高慶霄，等.白果提取液及抑菌作用研究.農(nóng)藥，1987(6)10-15.顧維戎.銀杏外種皮的抗疲勞和抗衰老作用.江蘇中醫(yī)，1989，832.許愛華，陳華圣等.銀杏外種皮多糖對人癌細(xì)胞株的抑制作用及與阿霉素的協(xié)同效應(yīng).中國新藥雜志.2000，9(11)753-755.Masato Nomura，Takahiro T，Akrica H，et al.Synthesis of 6-[(8Z，11Z)-8，11，14-Pentadecatrienyl] salicylic Acid Derivatives and TheirInhibition Properties toward Tyrosinase or Hyaluronidase.The ChemicalSociety of Japan，1995，12986-993.Hidej Itokawa，Nobuo totsuka，Keisuke nakahara，et al.AQuantitative Structure-Activity Relationship for Antitumor Activity ofLong-Chain Phenols From Ginkgo biloba L.Chen.Parm.Bull.1989，37(6)1619-1621.楊小明，錢之玉，陳鈞等.銀杏外種皮銀杏酸的體外抗腫瘤活性研究.中藥材，2004，27(1)40-42.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人以前的研究發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮提取物能夠殺滅魚類體外寄生蟲，并申請專利“銀杏外種皮植物質(zhì)水產(chǎn)動(dòng)物體外寄生蟲防治劑”，對該研究進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮中起到殺蟲作用的化合物主要是C20H27O3，該化合物不影響水產(chǎn)品質(zhì)量、無殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、不影響水產(chǎn)動(dòng)物的進(jìn)食和生長，在開發(fā)魚類藥物領(lǐng)域具有廣闊的市場前景。
本發(fā)明的目的在于提供C20H27O3在制備殺滅魚類體外寄生蟲藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供C20H27O3在制備殺滅魚類體外寄生蟲-指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種殺滅魚類體外寄生蟲防治劑，它是由下列重量比的原料組成C20H27O35％～30％，溶解劑10％～20％，表面活性劑5％～10％，其余為溶劑，上述原料的總和為100％。
所述溶解劑是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述表面活性劑是指吐溫-80。
所述的溶劑為無水乙醇或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他溶劑。
本發(fā)明優(yōu)選的溶劑為無水乙醇。
本發(fā)明還有一目的是提供上述殺滅魚類體外寄生蟲防治劑的制備方法，按以下步驟進(jìn)行 1)稱取C20H27O3、溶解劑、表面活性劑、溶劑各原料，備用； 2)將所述重量的C20H27O3和溶解劑N，N-二甲基甲酰胺加入不銹鋼容器中攪拌完全溶解后，再加入溶劑； 3)將所述重量的表面活性劑、加入步驟2)所得的溶液中混合，即得殺滅魚類體外寄生蟲防治劑。
將本發(fā)明的殺滅魚類體外寄生蟲防治劑直接潑灑于池塘中，以防治魚類體外寄生蟲一擬指環(huán)蟲、三代蟲，其使用劑量為5mL～30mL/m3。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn) (1)本發(fā)明對已知化合物C20H27O3發(fā)掘了新的用途，開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的C20H27O3安全低毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著具有很好漁藥應(yīng)用前景。
(3)本發(fā)明的C20H27O3具有顯著殺滅魚類指環(huán)蟲效果。
(4)用C20H27O3制備新型的漁藥，不會(huì)產(chǎn)生抗藥性問題，能一次性徹底殺滅指環(huán)蟲。



圖1化合物M1(C13:0)紅外光譜(IR)； 圖2化合物M1(C13:0)質(zhì)譜； 圖3化合物M1(C13:0)核磁氫譜； 圖4化合物M1(C13:0)核磁碳譜和DEPT圖譜。

具體實(shí)施例方式 為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。下面通過用C20H27O3的急性毒性試驗(yàn)、藥效試驗(yàn)及與同類產(chǎn)品的對比試驗(yàn)來說明其在制備殺魚類體外寄生蟲-指環(huán)蟲漁藥中的有益效果。
試驗(yàn)例1 C20H27O3對鯽魚的急性毒性試驗(yàn) 1材料與方法 1.1 材料 1.1.1供試樣品 C20H27O3，純度為95.4％，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。
1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)所用鯽魚購于寶雞市柔谷漁場，要求體質(zhì)健壯，規(guī)格均一，體重3.5～5g。購回后用濃度20mg.L-1的K2MnO4藥浴15～20min，撈出后在水簇箱中暫養(yǎng)7d左右，每天投喂1～2次，投入的飼料(實(shí)驗(yàn)室自制飼料)在10min內(nèi)吃完為限。待適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件后再進(jìn)行毒性試驗(yàn)。
1.1.3試驗(yàn)儀器 ALC-1100.2百分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器；5～10μL，20～200μL移液器VoluMate，Made in Germany；自動(dòng)控溫加熱棒，浙江舟山市漁具廠生產(chǎn)；塑料盆(容積為8L)等。
1.2試驗(yàn)方法 1.2.1試驗(yàn)條件 采用靜水式試驗(yàn)法，每盆加充分瀑氣的自來水5L，pH7.2，控制水溫為25±1℃，先加入試驗(yàn)藥液充分混勻后再加入試驗(yàn)用魚，每盆放養(yǎng)10尾。放養(yǎng)魚后，要求保持水中溶氧在5mg.L-1以上。為了保持恒定的藥物濃度，每隔24h換水重新加藥。
1.2.2試驗(yàn)藥物濃度的設(shè)定 首先，反復(fù)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定正式試驗(yàn)藥液濃度的大致范圍，即試驗(yàn)魚在24h內(nèi)全部中毒死亡的藥液濃度(6.5mg.L-1)和96h內(nèi)不發(fā)死亡的藥液濃度(2.0mg.L-1)。然后在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在藥液濃度2.0～6.5mg.L-1范圍內(nèi)按濃度對數(shù)等差(公差d＝0.064)插入2.317、2.685、3.112、3.606、4.178、4.841、5.610mg.L-1七個(gè)濃度試驗(yàn)組，進(jìn)行正式試驗(yàn)，觀察各濃度下試驗(yàn)魚的中毒死亡情況。
在試驗(yàn)期間隨時(shí)觀察記錄試驗(yàn)魚的死亡情況，如發(fā)現(xiàn)魚中毒死亡，應(yīng)即時(shí)撈出，以免影響水質(zhì)，影響試驗(yàn)結(jié)果。判斷魚死亡的方法是當(dāng)魚停止呼吸后(鰓蓋運(yùn)動(dòng)停止)，用玻璃棒或鑷子輕擊魚的尾柄部，如果在3min之內(nèi)魚體不產(chǎn)生任何應(yīng)激反應(yīng)，即可判斷死亡。
試驗(yàn)期間統(tǒng)計(jì)在24h、48h、72h和96h內(nèi)各藥物濃度下試驗(yàn)魚的死亡情況。試驗(yàn)期間應(yīng)保持安靜，盡可能避免對試驗(yàn)魚的任何干擾。當(dāng)對照組的死亡率小于5％，各時(shí)間段內(nèi)試驗(yàn)魚的死亡率可不予校正；若對照組的死亡率大于5％，則應(yīng)予校正，校正公式采用Abbott公式；如果對照組死亡率達(dá)20％以上，則在查找原因后，重新進(jìn)行毒性試驗(yàn)。
Abbott公式p＝p′-C/1-C P校正死亡率，即純屬藥物引起的死亡率 P′試驗(yàn)組死亡率，即自然因素和藥物引起的死亡率 C對照組死亡率，即自然因素引起的死亡率 1.2.3 C20H27O3最低致死濃度范圍、半數(shù)致死濃度(LC50) 觀察記錄供試魚在第24h、48h、72h和96h內(nèi)的死亡情況，試驗(yàn)魚各時(shí)間段開始出現(xiàn)死亡的最低濃度和下一個(gè)濃度為該時(shí)間段的最低致死濃度范圍，并計(jì)算致死率。利用直線回歸法，用直線回歸方程y＝a+bx (x-藥物濃度的濃度對數(shù)；y-死亡率轉(zhuǎn)換成的概率單位；a，b分別為直線的截距與斜率。)，求出a與b，a與b的計(jì)算公式為 k藥物濃度的組數(shù)(死亡率為0和100％的濃度不計(jì)算在內(nèi)) 求出a、b后，便可確定出回歸方程，然后再將50％死亡率的概率單位y＝5.0帶入方程，求出x，取其反對數(shù)，便得出該時(shí)間內(nèi)的LC50，并計(jì)算其95％的可信限，公式為
式中 N供試的動(dòng)物總數(shù)(死亡率為0和100％的濃度不計(jì)算在內(nèi) xLC50值的對數(shù) 1.2.4 C20H27O3安全濃度的計(jì)算 根據(jù)Turbell公式計(jì)算安全濃度
2結(jié)果與分析 2.1 C20H27O3半數(shù)致死濃度(LC50) 2.1.1 C20H27O3各試驗(yàn)濃度在不同時(shí)間內(nèi)對鯽魚致毒情況 各試驗(yàn)藥物濃度在第24h、48h、72h和96h內(nèi)的鯽魚死亡情況見表1。在藥物濃度為6.5mg.L-1的高濃度試驗(yàn)組，試驗(yàn)魚中毒反應(yīng)非常明顯，用藥后2h左右出現(xiàn)異常表現(xiàn)，鯽魚將頭浮出水面，繼而行動(dòng)遲緩，出現(xiàn)側(cè)游，不久后開始出現(xiàn)麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在濃度為3.112mg.L-1的低濃度試驗(yàn)組中，鯽魚表現(xiàn)較安靜，對外界反應(yīng)靈敏，活動(dòng)正常。
表1 C20H27O3對鯽角的中毒死亡結(jié)果 2.1.2最低致死濃度范圍、半數(shù)致死濃度(LC50) 統(tǒng)計(jì)不同濃度試驗(yàn)藥液在第24h、48h、72h和96h內(nèi)的死亡情況，結(jié)果見表2，可看出在24h、48h和72h 3個(gè)時(shí)間段內(nèi)最低致死濃度范圍為3.112～3.606mg.L-1，致死率為10％～20％。
表2 C20H27O3對鯽魚的急性毒性結(jié)果 將各試驗(yàn)濃度取其對數(shù)，得其濃度對數(shù)，并將各時(shí)間段試驗(yàn)魚中毒死亡的百分率查表得其概率值，將各時(shí)間段的藥物濃度對數(shù)及其對應(yīng)的死亡率的概率值代入公式，求出回歸方程，可計(jì)算出各時(shí)間段的半數(shù)致死濃度(LC50)，和其LC50的95％可信限，結(jié)果見表3。由表3可知，第24h內(nèi)所得的回歸方程為 y＝-3.7316799+11.991406x，LC50＝5.348mg.L-1，95％的可信限為5.295～5.400mg.L-1；第48h內(nèi)所得的回歸方程為y＝-2.4702545+11.167656x，LC50＝4.666mg.L-1，95％的可信限為4.355～4.999mg.L-1；第72h內(nèi)所得的回歸方程為y＝-2.8738633+11.991406x，LC50＝4.535mg.L-1，95％的可信限為4.076～4.813mg.L-1；第96h內(nèi)所得的回歸方程為y＝-3.16615+13.15x，LC50＝4.178mg.L-1，95％的可信限為4.178～4.178mg.L-1。
表3各時(shí)間段的LC50及其95％的可信限 2.2安全濃度計(jì)算結(jié)果 根據(jù)Turbell公式計(jì)算出M1對鯽魚的安全濃度，
從結(jié)果顯示，C20H27O3對鯽魚的安全濃度比較低，但是，實(shí)際中，濃度在3.606mg.L-1的情況下，48h沒有出現(xiàn)魚死亡的發(fā)生，結(jié)合殺滅指環(huán)蟲的有效劑量是2.0mg.L-1綜合考慮，C20H27O3作為殺蟲漁藥仍然具有很好的推廣價(jià)值。
試驗(yàn)例2 C20H27O3殺滅魚類體外寄生蟲藥效學(xué)試驗(yàn) 1材料與方法 1.1 材料 1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 寄主模型為金魚(Carassius auratus)，寄生蟲模型為中型指環(huán)蟲，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室活體保種；感染金魚體重均小于5g，來源于陜西省水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖場。
1.1.2供試樣品 C20H27O3，純度為95.4％，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。
1.2 殺滅指環(huán)蟲活性試驗(yàn)方法 對感染了中型指環(huán)蟲的活體金魚抽樣鏡檢觀察，當(dāng)金魚鰓部中型指環(huán)蟲感染的數(shù)量平均15～25個(gè)/尾時(shí)便可進(jìn)行藥效試驗(yàn)。
使用體積為10L的10個(gè)塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.0～7.5，控制水溫25±1℃，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定C20H27O3的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃度按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪拌均勻，48h時(shí)取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。

2結(jié)果與分析 (1)對照組 試驗(yàn)進(jìn)行中設(shè)立的對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的0h、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染中型指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的0h鏡檢，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為16.6個(gè)/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為22.5個(gè)/尾。以此與各藥物測定的結(jié)果計(jì)算寄生蟲的殺滅率。
(2)C20H27O3對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果 表4 C20H27O3在48h對中型指環(huán)蟲殺滅效果 C20H27O3在48h殺滅中型指環(huán)蟲的結(jié)果見表4。從表4可以看出，單體C20H27O3當(dāng)濃度為0.25mg/L時(shí)，殺蟲力較弱，僅為25.6％；當(dāng)濃度為1.0～2.0mg/L時(shí)，其殺蟲率可達(dá)91～100％，濃度為2.0mg/L時(shí)殺蟲率為100％，而對魚是安全的；當(dāng)濃度為3.5mg/L時(shí)，試驗(yàn)魚出現(xiàn)中毒死亡，死亡率達(dá)20％。
試驗(yàn)例3 C20H27O3與市場常規(guī)漁藥殺蟲效果比較試驗(yàn) 1材料與方法 1.1 材料 1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 寄主模型為金魚(Carassius auratus)，寄生蟲模型為中型指環(huán)蟲，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室活體保種；感染金魚體重均小于5g，來源于陜西省水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖場。
1.1.2供試藥品 C20H27O3，純度為95.4％，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供；甲苯咪唑(Mebendazolum)，含量99.8％，陜西漢江制藥廠生產(chǎn)，吡喹酮(Praziquantelum)，含量96.5％，南京制藥廠生產(chǎn)。
1.1.3儀器設(shè)備 XH-B旋渦混合器姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；BX41光學(xué)顯微鏡OLYMPUS。Made in Japan；Satorius萬分之一電子天平；控溫裝置。
1.2試驗(yàn)方法 使用體積為10L的10個(gè)塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.0～7.5，控制水溫25±1℃，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定血根堿的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃度按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪拌均勻，48h時(shí)取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。方法同試驗(yàn)例2。

2 結(jié)果 2.1對照組 試驗(yàn)進(jìn)行中設(shè)立的對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的0h、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的0h鏡檢，指環(huán)蟲平均數(shù)量為14.2個(gè)/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，指環(huán)蟲平均數(shù)量為19.9個(gè)/尾。以此與各濃度藥物測定的結(jié)果計(jì)算寄生蟲的殺滅率。
2.2三種藥物對寄生蟲殺滅結(jié)果比較 由表6可以看出，3種殺蟲藥物在試驗(yàn)48h時(shí)，C20H27O3當(dāng)濃度為0.6g/m3時(shí)，殺滅指環(huán)蟲達(dá)62.9％；而甲苯咪唑的濃度為0.6g/m3時(shí)，殺蟲率只有58.8％；吡喹酮0.8g/m3時(shí)，殺蟲率為22.6％?？梢钥闯觯珻20H27O3比甲苯咪唑殺蟲效果略好，顯著高于吡喹酮的殺蟲效果，C20H27O3是一種殺滅魚類指環(huán)蟲很高活性的植物源漁藥。
表6三種殺蟲藥物48h對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果 試驗(yàn)例4本發(fā)明防治劑的藥效學(xué)試驗(yàn) 1材料與方法 1.1 材料 1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 寄主模型為金魚(Carassius auratus)，寄生蟲模型為中型指環(huán)蟲，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室活體保種；感染金魚體重均小于5g，來源于陜西省水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖場。
1.1.2供試藥品 含30％C20H27O3防治劑，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。
1.1.3儀器設(shè)備 XH-B旋渦混合器姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；BX41光學(xué)顯微鏡OLYMPUS。Made in Japan；Satorius萬分之一電子天平；控溫裝置。
1.2試驗(yàn)方法 使用體積為10L的10個(gè)塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.0～7.5，控制水溫25±1℃，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定C20H27O3的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃度按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪拌均勻，48h時(shí)取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。方法同試驗(yàn)例2。

2 結(jié)果 2.1對照組 試驗(yàn)進(jìn)行中設(shè)立的對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的0h、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染中型指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的0h鏡檢，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為20.2個(gè)/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為23.6個(gè)/尾。以此與藥物不同濃度測定的結(jié)果計(jì)算寄生蟲的殺滅率。
2.2防治劑對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果 表5防治劑在48h對中型指環(huán)蟲殺滅效果 本發(fā)明的防治劑(C20H27O3含量30％)在48h殺滅中型指環(huán)蟲的結(jié)果見表5。從表5可以看出，當(dāng)濃度為0.50mL/m3時(shí)，殺蟲力較弱，僅為20.2％；當(dāng)濃度為3.50mL/m3時(shí)，其殺蟲率可達(dá)97.8％，濃度為5.00mL/m3時(shí)殺蟲率為100％，而對魚是安全的；當(dāng)濃度為11.00mL/m3時(shí)，試驗(yàn)魚出現(xiàn)中毒死亡，死亡率達(dá)12.3％。
本研究結(jié)果表明，含30％C20H27O3防治劑對魚類的中型指環(huán)蟲具有顯著的殺滅作用，其最高殺蟲濃度為5.00mL/m3，殺滅率達(dá)100％，表明該制劑是一種應(yīng)用前景良好的生物殺蟲漁藥。
3討論 本研究結(jié)果表明，含30％C20H27O3防治劑對魚類的中型指環(huán)蟲具有顯著的殺滅作用，其殺蟲濃度為5.0mL/m3，殺滅率達(dá)100％，在該濃度下，換算成純C20H27O3用量為1.5mg.L-1，低于試驗(yàn)例2種純單體C20H27O3的2.0mg.L-1的用量，說明30％制劑中加入乳化劑后顯著提高了在水體中的溶解度，從而也提高了藥效，降低了C20H27O3的用量。
以下結(jié)合圖和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例來詳細(xì)說明從銀杏外種皮中提取、分離、檢測、鑒定的方法、制備產(chǎn)品的方法、產(chǎn)品的使用方法，這些僅是本發(fā)明較好的實(shí)施例，但不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1從銀杏外種皮中提取、分離、鑒定C20H27O3方法 一、C20H27O3的提取、分離 1.提取 于江蘇泰州市采集銀杏外種皮，晾干、粉碎，稱取樣品，使用8～10倍甲醇，70℃熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，過濾，減壓濃縮、獲得浸膏。
2.分離 將所得的浸膏以石油醚萃取3～5次，直至萃取液幾乎無色，減壓濃縮萃取液得石油醚浸膏，對其再進(jìn)行硅膠柱層析分離。
(1)一級(jí)硅膠柱層析分離 取石油醚萃取物浸膏100g，用甲醇溶解后加入100g硅膠拌勻，置恒溫水浴鍋(溫度50℃)上蒸干，研磨均勻。
①裝柱與上樣玻璃層析柱柱徑100mm，柱長1200mm，柱層析硅膠2000g(200～300目，按1g樣品20g硅膠計(jì)算)，氯仿濕法裝柱，干法上樣。
②溶劑系統(tǒng)經(jīng)薄層層析(TLC)預(yù)試，確定以氯仿-甲醇(1∶0、200∶1、100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1、5∶1、2∶1、1∶1和甲醇洗柱)作為洗脫系統(tǒng)，進(jìn)行梯度洗脫。
③薄層層析(TLC)分析采用硅膠GF254制備薄層板，對收集的各個(gè)流分進(jìn)行TLC分析。結(jié)合熒光、硫酸乙醇顯色劑100℃顯色，檢測柱層析中各組分變化，根據(jù)變化調(diào)整洗脫劑極性。每200mL收集一個(gè)流分，共收集到165個(gè)流分。同時(shí)采用TLC檢查，合并相似流分，真空干燥箱中真空低溫(50℃)干燥共得到5個(gè)流分組A(第1～15流分，5.0g)、B(第16～62流分，31.5g)、C(第63～105流分，19.4g)、D(第106～135流分，17.5g)和E(第136～165流分，13.2g)。
④殺蟲活性追蹤測定同時(shí)再分別稱取A、B、C、D和E各合并流分組1g，用無水乙醇溶解后，定容于10mL容量瓶中，配成濃度為100mg/mL的藥液，分別測定A、B、C、D和E殺滅指環(huán)蟲的活性。
殺蟲活性測定方法為 A.藥效試驗(yàn)測定 使用體積為10L的10個(gè)塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.0～7.5，控制水溫25±1℃，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定血根堿的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃度按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪拌均勻，48h時(shí)取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。方法同試驗(yàn)例2。

B.殺蟲結(jié)果 殺蟲對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的0h、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染中型指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的0h鏡檢，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為21.2個(gè)/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為25.0個(gè)/尾。分離的5種流分樣品殺蟲效果見表7。從表7可以看出，B流分對指環(huán)蟲的殺蟲活性最強(qiáng)，是殺蟲物質(zhì)存在的主要部分，需進(jìn)行進(jìn)一步分離。
表7 5種樣品對寄生蟲殺滅結(jié)果 (2)B流分硅膠柱層析分離 取B流分組合并物25.0g，用甲醇溶解后加入25.0g硅膠拌勻，置恒溫水浴鍋(溫度50℃)上蒸干，研磨均勻。再次進(jìn)行硅膠柱層析分離。
①玻璃層析柱柱徑70mm，柱長1000mm，柱層析硅膠750g(300～400目，按1g樣品30g硅膠計(jì)算)，石油醚濕法上柱，干法上樣。
②洗脫系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯(1∶0、200∶1、100∶1、99∶1、98∶2、97∶3、95∶5、90∶10、80∶20、2∶1和甲醇洗柱)，進(jìn)行梯度洗脫。
③以薄層層析(TLC)分析，結(jié)合熒光、硫酸乙醇顯色劑100℃顯色，檢測柱層析中各組分變化，根據(jù)變化調(diào)整洗脫劑極性。每100mL收集一個(gè)流分，共收集到126個(gè)流分。
對收集的各流分進(jìn)行TLC分析，合并相似流分，真空干燥箱中真空低溫(50℃)干燥共得到4個(gè)流分組B-1(1～10流分，1.5g)、B-2(11～40流分，6.3g)、B-3(41～80流分，4.8g)、B-4(80～126流分，5.1g)。
同時(shí)再分別稱取B-1、B-2、B-3和B-4各流分合并組0.5g，用無水乙醇溶解后，定容于5mL容量瓶中，配成濃度為100mg/mL的藥液，測定殺滅指環(huán)蟲的活性。殺蟲活性測定方法同前。結(jié)果見表8。從表8可以看出，B-2流分合并組殺滅指環(huán)蟲活性最強(qiáng)，最低殺滅濃度為0.5mg/L，殺蟲率為30.5％；濃度為2.5mg/L時(shí)，其殺蟲率可達(dá)100％。B-2流分仍然為許多物質(zhì)組成的混合物，需要對其進(jìn)一步分離，直至獲得純度較高的殺蟲活性單體。
表8 4種流分樣品對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果 (3)B-2流分的反相高效液相制備(RP-HPLC)分離 ①設(shè)備儀器 BUCHI B688型中壓色譜制備儀，瑞士BUCHI公司；Waters高效液相色譜WatersTM600E泵，996PDA紫外檢測器，Millennium色譜管理工作站；SHIMADZU高效液相色譜LC-6AD泵，SPD-10A VP UV-VIS紫外檢測器，CLASS-VP 6.14SR1色譜管理工作站；日本YMC公司分析色譜柱(ODS-A C185μm 120&Aring；4.6mm×250mm)，日本YMC公司半制備色譜柱(ODS-A C185μm 120&Aring；10mm×250mm)； ②色譜制備條件色譜柱為ODS A C18，5μm 120&Aring；10mm×250mm；流動(dòng)相組成為甲醇4％HAc溶液(93.5∶6.5，/v∶v)；紫外檢測波長310nm，流速5.0mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量500μL。
③單體制備方法對B-2流分樣品用甲醇超聲溶解，0.45μm微孔濾膜過濾后得到制備色譜樣品溶液，采用RP-HPLC制備等技術(shù)，反復(fù)分離得到高純度的單體。每次進(jìn)樣500μL，餾分收集器設(shè)定步速為0.5min/格。旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀濃縮、減壓真空干燥獲得單體M1，其殺蟲效果顯著。
二、M1單體的鑒定 (1)設(shè)備儀器 HP 5988型四極桿質(zhì)譜儀，美國HP公司；Esquire 3000plus型ESI-MS，德國BrukerDaltonics公司；ZAB-HS型FAB-MS，英國VG公司；Nicolet AVATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀，美國Nicolet公司；Varian Mercury 300 BB型核磁共振儀，美國VARIAN公司；Brucker AM 400超導(dǎo)核磁共振儀等，美國Brucker公司。
(2)鑒定結(jié)果 白色晶體，在乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑中易溶，在甲醇、乙醇等醇類溶劑中溶解度低，在水中難溶。TLC檢測以三氯化鐵顯色呈紫色，在三種以上溶劑系統(tǒng)展開情況下為單點(diǎn)。HPLC檢測，檢測條件為Hypersil ODS C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶醋酸＝90∶10，流速1mL/min，進(jìn)樣量20uL，檢測波長254nm，檢測結(jié)果為一單峰，相對純度＞96％，熔點(diǎn)為76℃～77℃，該化合物為純品化合物。
IR(KBr)，v/cm-13425.3，2922.0，1654.7，1603.5，1465.5，1380.8，1308.8，1246.8，1211.51，1077.9，511.7，493.9，473.4，452.5，435.4，見圖1； EI-MS(70eV)m/zC20H27O3，320(M+，8.5)，302，276，259，199，185，175，108，見圖2； 1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm7.26(t，1H)，6.74(m，2H)，2.93(t，2H)，1.56(m，2H)，1.25(m，20H)，0.88(t，3H，J＝6.8Hz)，見圖3； 13C-NMR(CDCl3，100MHz)，DEPTδppm176.2，162.8，146.9，134.4，122.423，116.8，109.8，31.9，31.2，29.7，29.4，22.7，14.1，見圖4。
實(shí)施例2 防治劑的制備方法 稱取C20H27O35g和N，N-二甲基甲酰胺15g倒入不銹鋼容器中攪拌完全溶解后，再加入70g無水乙醇，最后將吐溫-80 10g混合均勻，即得100g殺滅魚類體外寄生蟲防治劑。
實(shí)施例3 防治劑的制備方法 稱取C20H27O315g加入不銹鋼罐中，再稱量溶解劑N，N-二甲基甲酰胺20g，加入罐內(nèi)，充分?jǐn)嚢韬螅偌尤霟o水工業(yè)乙醇57g攪拌完全溶解后，加入表面活性劑吐溫-80為8g，充分?jǐn)嚢杈鶆?，即得該制?00g。
實(shí)施例4防治劑的制備方法 稱取C20H27O3 30g加入不銹鋼罐中，再稱量溶解劑N，N-二甲基甲酰胺20g，加入罐內(nèi)，充分?jǐn)嚢韬螅偌尤霟o水工業(yè)乙醇40g攪拌完全溶解后，加入表面活性劑吐溫-80為10g，充分?jǐn)嚢杈鶆?，即得該制?00g。
權(quán)利要求
1.C20H27O3在制備殺滅魚類體外寄生蟲藥物中的應(yīng)用。
2.C20H27O3在制備殺滅魚類體外寄生蟲-指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用。
3.一種殺滅魚類體外寄生蟲防治劑，其特征在于，它是由下列重量比的原料組成C20H27O35％～30％，溶解劑10％～20％，表面活性劑5％～10％，其余為溶劑，上述原料的總和為100％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治劑，其特征在于所述的溶解劑是N，N-二甲基甲酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治劑，其特征在于所述的表面活性劑是指吐溫-80。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治劑，其特征在于所述的溶劑為無水乙醇或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的防治劑，其特征在于所述的溶劑為無水乙醇。
8.如權(quán)利要求3所述的殺滅魚類體外寄生蟲防治劑的制備方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行
1)稱取C20H27O3、溶解劑、表面活性劑、溶劑各原料，備用；
2)將所述重量的C20H27O3和溶解劑N，N-二甲基甲酰胺加入不銹鋼容器中攪拌完全溶解后，再加入溶劑；
3)將所述重量表面活性劑、加入步驟2)所得的溶液中混合，即得殺滅魚類體外寄生蟲防治劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了化合物C20H27O3在殺滅魚類體外寄生蟲、特別是指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用，開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明還公開了一種以C20H27O3活性成份的殺滅魚類體外寄生蟲防治劑，由C20H27O35％～30％、溶解劑10％～20％、表面活性劑5％～10％、其余為溶劑組成；制備方法將所述重量的C20H27O3和溶解劑N，N－二甲基甲酰胺加入不銹鋼容器中攪拌完全溶解后，再加入溶劑；再將所述重量的表面活性劑、加入上一步驟所得的溶液中混合，即得。該防治劑能一次性徹底殺滅魚類體外寄生蟲且不產(chǎn)生抗藥性問題。本發(fā)明的產(chǎn)品原料來源豐富，價(jià)廉、制備工藝簡單而且安全無毒，藥理作用強(qiáng)，具有廣闊的漁藥應(yīng)用市場前景。
文檔編號(hào)A61P33/00GK101069682SQ20071001721
公開日2007年11月14日 申請日期2007年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月10日
發(fā)明者王高學(xué), 趙云奎, 程超, 王建華, 付維法, 原居林, 姚嘉赟, 周壯, 顧忠旗, 袁明, 崔婧, 梁朝軍, 馮婷婷 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)