專利名稱：：血根堿在制備水產(chǎn)動物藥物中的應(yīng)用及其制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于血根堿的新用途，具體涉及血根堿在制備殺滅水產(chǎn)動物病原菌、體外寄生蟲、特別是指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用以及含有血根堿的藥物制劑和制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，2005年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量5101.65萬t，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖面積754.50萬hm2，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量3393.25萬t，占總產(chǎn)量的67%，而水產(chǎn)品出口也占較大的比重，2005年全國水產(chǎn)品進(jìn)出口總量為623萬t，出口量257萬t，出口額78.9億美元。漁業(yè)生產(chǎn)中，目前存在著兩個急需解決的問題，一是水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治問題；二是水產(chǎn)品藥物殘留問題,兩者對目前水產(chǎn)品的生產(chǎn)及其重要。據(jù)報(bào)道，2005年，水產(chǎn)養(yǎng)殖生物因病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)110.00億元，采取藥物防治是目前漁業(yè)生產(chǎn)中最主要的措施，但是，有些藥物的使用往往造成水產(chǎn)品質(zhì)量下降、藥殘嚴(yán)重。曾經(jīng)發(fā)生的一系列貿(mào)易事件給我國水產(chǎn)品出口敲響了警鐘2005年受"孔雀石綠殘留事件"影響，廣東烤鰻出口急降了21%;2006年8月來自中國海關(guān)的通報(bào)，日本在中國出口的鰻魚中檢測到農(nóng)藥硫丹的超標(biāo)，嚴(yán)重限制了我國鰻魚的出口。當(dāng)前生產(chǎn)中的,漁藥主要是移植人藥、獸藥和部分農(nóng)藥等化學(xué)藥物，長期使用帶來的是環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為我國水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易堡壘問題。魚類體外寄生單殖吸蟲(Monogenoidea)病是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖最為嚴(yán)重的病害之一，特別是寄生在魚類鰓部的指環(huán)蟲(DflcO;/ogvrus)和擬指環(huán)蟲(i^eWo必cO;/ogvms)，大量寄生在魚類鰓部導(dǎo)致魚類呼吸困難出現(xiàn)大批毀滅性死亡，往往給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于該類寄生蟲病的防治，長期以來，主要藥物是甲苯咪挫(Mebendazolum)、吡喹酮(Praziquantelum)等化學(xué)藥物，由于長期使用產(chǎn)生耐藥性，并且有些化學(xué)藥物因不易降解、污染水環(huán)境、殘留、蓄積，危害人類的身體健康多被禁用。血根堿(Sanguinarine)是從罌粟科、博落回屬(ife"esj^)兩種植物博落回ifec7ea/acoi^ate(Willd)R.Br.或小果博落回肌'cr0ca2pa(Maxim)Fedde中提取分離出來的一種生物堿，其結(jié)構(gòu)式為-該化合物的分子式為C2。H1404N，分子量為332，紅色針狀結(jié)晶。已知臨床用途有(1)用做人用藥對抗腫瘤、治療感染性疾病、治療滴蟲性陰道炎和宮頸糜爛、治療皮膚疾病、治療酒糟鼻、手足癬、疥瘡、牛皮癬、頭皮濕疹有確.切效果；(2)用做獸藥具有清熱解毒、抗菌消炎的功能，對豬黃痢、白痢、水腫病、副傷寒和豬的傳染性腸胃炎等多f+疾病有特效且無抗藥性、無殘留和副作用，使用安全可靠；(3)用作生物農(nóng)藥具有殺蛆、殺螨作用。以下是發(fā)明人引用的有關(guān)參考文獻(xiàn)Masayuki0.StudiesontheconstituentsofBocconiacordataII.Bocconine.ChemPharmBull(Japan)，1970,1435.胡之璧，徐垠，馮勝初，等.博落回果實(shí)中有效成分的研究.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1979，14(9):535—539.樊淑蓮，焦峰，張園,等.博落回總生物堿對動物移植性腫瘤的作用研究.陜西腫瘤醫(yī)學(xué)，2000，8(3):174.熊曉榮.三味博落回煎劑治療痔瘡合并感染.云南中醫(yī)雜志，1988，23(4):18.余震生.草藥號筒樹治療膿性指頭炎.江西醫(yī)藥,1966，6(7):371.解放軍366醫(yī)院婦產(chǎn)科.號筒桿治療滴蟲性陰道炎的療效觀察.新醫(yī)學(xué)，1971，(6—7):45.羅裕民.博落回為主外治皮膚病.福建中醫(yī)藥，1987，18(1):封四.宋有林.博落回酊劑治療手足股癬30例.中醫(yī)外科雜志，2000，9(5):40.吳茂旺，朱建華.博落回藥理研究與應(yīng)用概況.基層中藥雜志，2002，16(3):46—48.張勝菊,楊治國，南玉生.博落回抽提物對黃守瓜、菜青蟲的田間藥效評價.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(5):450—451.陳昭存，宋清,王素俠，等.博落回防治梨木虱和二斑葉螨藥效試驗(yàn).果農(nóng)之友，2003,8:30.,
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人多年來對殺滅水產(chǎn)動物病原菌、體外寄生蟲、特別是指環(huán)蟲做了大量的試驗(yàn)，近期在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)從小果博落回(M肌'crocarps(Maxim)Fedde)中提取分離的血根堿具有顯著的殺菌、殺蟲效果，而且不影響水產(chǎn)品質(zhì)量、無殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、不影響水產(chǎn)動物的進(jìn)食和生長，在開發(fā)水產(chǎn)動物藥物領(lǐng)域具有廣闊的市場前景。本發(fā)明的目的是提供血根堿在制備殺滅水產(chǎn)動物病原菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供血根堿在制備殺滅水產(chǎn)動物體外寄生蟲藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供血根堿在制備殺滅魚類體外寄生蟲-指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供一種殺滅水產(chǎn)動物病原菌和體外寄生蟲的防治劑，它是由下列重量比的原料組成血根堿5%20%，表面活性劑3%10%，其余為溶劑，上述原料的總和為100%。所述的表面活性劑是指二甲基亞砜和吐溫-80混合物。所述的二甲基亞砜和吐溫-80混合物的比例為1:1。所述的溶劑為無水乙醇或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他溶劑。本發(fā)明優(yōu)選的溶劑為無水乙醇。本發(fā)明的另一目的是提供以上所述防治劑的制備方法，具體包括下列步驟1)稱取血根堿、表面活性劑、溶劑各原料，備用；2)將所述重量的血根堿完全溶解預(yù)先加熱為40'C5(TC的溶劑中，獲得含5%20°/。血根堿的溶液；，3)再將所述重量的表面活性劑和步驟2)所得溶液加入勻質(zhì)機(jī)中混合，即得血根堿水產(chǎn)動物病原菌和體外寄生蟲防治劑。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明對已知化合物血根堿發(fā)掘了新的用途，開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域；(2)本發(fā)明特別適用對水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病和體外寄生的寄生蟲有防治效果，尤其對爛鰓病、出血病、弧菌病具有顯著的防治效果，并對指環(huán)蟲、擬指環(huán)蟲、三代蟲等蠕蟲具有顯著的殺滅作用，對水產(chǎn)動物及環(huán)境都非常安全，在生產(chǎn)上完全可以替代化學(xué)殺蟲劑，是對環(huán)境無污染的無公害植物源水產(chǎn)動物寄生蟲防治劑，廣泛適用于對鱖魚、鱸魚、鯉、草魚、鰻魚、鯛、鲆等多種淡水、海水魚類的細(xì)菌性病和體外寄生蟲病(原蟲、蠕蟲)的防治劑。(3)本發(fā)明的產(chǎn)品原料來源豐富，價廉、制備工藝簡單而且使用方便。(4)本發(fā)明的產(chǎn)品是一種新型的漁藥，不會產(chǎn)生抗藥性問題，能一次性徹底殺滅指環(huán)蟲。圖l化合物M3的紫外吸收光譜圖2血根堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖3化合Ms的高效液相色譜圖4血根堿標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖5化合物M3的紅外吸收圖譜；圖6化合物M3的EIMS圖譜；圖7血根堿標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式'為了更清楚的理解本發(fā)明，以下通過發(fā)明人給出的急性毒性試驗(yàn)、藥效學(xué)試驗(yàn)及對比試驗(yàn)來進(jìn)一步說明本發(fā)明防治劑的有益效果。試驗(yàn)例1血根堿對鯽魚急性毒性試驗(yàn)1材料與方法1.1材料1.1.1供試樣品試驗(yàn)所用血根堿純度為95.4%,由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。1.1.2試驗(yàn)動物試驗(yàn)所用鯽魚購于寶雞市柔谷漁場，要求體質(zhì)健壯，規(guī)格均一，平均體重3.9g(Z5g)。購回后用濃度20mg丄"的K2MnO4藥浴1520min,撈出后在水簇箱中暫養(yǎng)7d左右，每天投喂12次，投入的飼料(實(shí)驗(yàn)室自制飼料)在10min內(nèi)吃完為限。待適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件后再進(jìn)行毒性試驗(yàn)。1.1.3試驗(yàn)儀器ALC-1100.2百分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器；510uL，20200yL移液器VoluMate，MadeinGermany;自動控溫加熱棒，浙江舟山市漁具廠生產(chǎn)；塑料盆(容積為6L)等。1.2試驗(yàn)方法1.2.1試驗(yàn)條件采用靜水式試驗(yàn)法，每盆加充分暴氣的自來水5L，pH7.2，控制水溫為25±rC，先加入試驗(yàn)藥液充分混勻后再加入試驗(yàn)用魚，每盆放養(yǎng)10尾。放養(yǎng)魚后，要求保持水中溶氧在5mg.L"以上。為了保持恒定的藥物濃度，每隔24h換水從新加藥。1.2.2試驗(yàn)藥物濃度的設(shè)定首先，反復(fù)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定正式試驗(yàn)藥液濃度的大致范圍，即試驗(yàn)魚在24h內(nèi)全部中毒死亡的藥液濃度(5.5mg丄—1)和96h內(nèi)不發(fā)生死亡的藥液濃度(3,0mg丄")。然后在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在藥液濃度3.05.55mg丄"范圍內(nèi)按濃度對數(shù)等差(公差d-0.0376)插入3.2711、3.5607、3.8896、4.2413、4.6249、5.0431mg丄"六個濃度試驗(yàn)組，進(jìn)行正式試驗(yàn)，觀察各濃度下試驗(yàn)魚的中毒死亡情況。在試驗(yàn)期間隨時觀察記錄試驗(yàn)魚的死亡情況，如發(fā)現(xiàn)魚中毒死亡，應(yīng)即時撈出，以免影響水質(zhì)，影響試驗(yàn)結(jié)果。判斷魚死亡的方法是當(dāng)魚停止呼吸后(鰓蓋運(yùn)動停止)，用玻璃棒或鑷子輕擊魚的尾柄部，如果在3min之內(nèi)魚體不產(chǎn)生任何應(yīng)激反應(yīng)，即可判斷死亡。試驗(yàn)期間統(tǒng)計(jì)在12h、48h和96h內(nèi)各藥物濃度下試驗(yàn)魚的死亡情況。試驗(yàn)期間應(yīng)保持安靜，盡可能避免對試驗(yàn)魚的任何干擾。試驗(yàn)重復(fù)3次，測定試驗(yàn)結(jié)果的再現(xiàn)性。并同時設(shè)空白對照組。當(dāng)對照組的死亡率小于5%，各時間段內(nèi)試驗(yàn)魚的死亡率可不予校正；若對照組的死亡率大于5%，則應(yīng)予校正，校正公式采用Abbott公式；如果對照組死亡率達(dá)20%以上，則在査找原因后，重新進(jìn)行毒性試驗(yàn)。Abbott公式p=p'-C/l-CP:校正死亡率，即純屬藥物引與的死亡率P':試驗(yàn)組死亡率，即自然因素和藥物引起的死亡率C:對照組死亡率，即自然因素引起的死亡率1.2.3最低致死濃度范圍、半數(shù)致死濃度(iC5。)觀察記錄供試魚在第12h、24h和96h內(nèi)的死亡情況，試驗(yàn)魚各時間段開始出現(xiàn)死亡的最低濃度和下一個濃度為該時間段的最低致死濃度范圍，并計(jì)算致死率。利用直線回歸法，用直線回歸方程^^a+fec(x-藥物濃度的濃度對數(shù)；y-死亡率轉(zhuǎn)換成的概率單位；"，6分別為直線的截距與斜率。)，求出"與6，"與6的計(jì)算公式為*2>2-(2>)2~~6②xy)-》》L藥物濃度的組數(shù)(死亡率為0和100%的濃度不計(jì)算在內(nèi))求出a、b后，便可確定出回歸方程，然后再將5(m死亡率的概率單位y-5.0帶入方程，求出;c，取其反對數(shù)，便得出該時間內(nèi)的丄C^，并計(jì)算其95%的可信限，公式為/:<:5。的95%可信限=1經(jīng)—乂jc士"^x1.96)式中W:供試的動物總數(shù)(死亡率為0和100%的濃度不計(jì)算在內(nèi)x:丄Q值的對數(shù)1.2.4安全濃度的計(jì)算根據(jù)Tnrbell公式計(jì)算安全濃度安全濃度=-4^^^°^(24MC50/48MC50)22結(jié)果2.1半數(shù)致死濃度(LCsg),2.1.1各試驗(yàn)濃度在不同時間內(nèi)對鯽魚致毒情況各試驗(yàn)藥物濃度在第24h、48h和96h內(nèi)的鯽魚死亡情況見表1。在藥物濃度為5.5mg丄"的高濃度試驗(yàn)組，試驗(yàn)魚中毒反應(yīng)非常明顯，用藥后2h左右出現(xiàn)異常表現(xiàn)，鯽魚將頭浮出水面，繼而行動遲緩，出現(xiàn)側(cè)游，不久后開始出現(xiàn)麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在濃度為3.0mg丄"的低濃度試驗(yàn)組中，鯽魚表現(xiàn)較安靜，對外界反應(yīng)靈敏，活動正常。表1血根堿對鯽魚的中毒死亡結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.1.2,,最低致死濃度范圍、半數(shù)致死濃度(￡C5。)統(tǒng)計(jì)不同濃度試驗(yàn)藥液在第24h、48h和96h內(nèi)的死亡情況，結(jié)果見表2，可看出在3個時間段內(nèi)最低致死濃度范圍均為3.03.2711mg丄"，致死率為20%。表2血根堿對鄉(xiāng)魚的急性毒性結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將各試驗(yàn)濃度取其對數(shù)，得其濃度對數(shù)，并將各時間段試驗(yàn)魚中毒死亡的百分率查表得其概率值，將各時間段的藥物濃度對數(shù)及其對應(yīng)的死亡率的概率值代入公式，求出回歸方程，可計(jì)算出各時間段的半數(shù)致死濃度(￡C5。)，和其^。的95%可信限，結(jié)果見表3。由表3可知，第24h內(nèi)所得的回歸方程為y=-1.4134+10.9613x,ZC5。=3.8468mg丄"，95%的可信限為3.56864.1467mg丄"；第48h內(nèi)所得的回歸方程為)^-3.3219+14.5598x，￡C5。=3.7288mg丄"，95%的可信限為S^AW-^OWSmgl^表3各時間段的AOo及其9554的可信限試驗(yàn)時間直線回歸方程丄C幼(mg丄")95%的可信限(mg丄")第24hy=-1.4134+10.9613x3.84683.56864.1467第48hy=-3.3219+14.5598x3.72883.44194.04022.2安全濃度計(jì)算結(jié)果根據(jù)Turbell公式計(jì)算出血根堿對鯽魚的安全濃度，安全濃度=^概。x。'3，=(3.7288x0.3)+(3.8468+3.7288)2=1.0511mg丄'13討論雖然血根堿殺滅指環(huán)蟲具有高效性，有效使用濃度為O.Smg丄-1，48h內(nèi)就可將指環(huán)蟲全部殺滅，但其安全濃度1.0511mg丄"，高于最高有效濃度2倍，所以該制劑對魚類是比較安全的，具有重要的推廣應(yīng)用前景。試驗(yàn)例2血根堿殺滅水產(chǎn)動物病原菌和體外寄生蟲-指環(huán)蟲藥效試驗(yàn)1材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)動物寄主模型為金魚(6krassj'"sa"rsz^s)，寄生蟲模型為中型指環(huán)蟲，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室活體保種；感染金魚體重均小于5g，來源于陜西省水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖場。1.1.2病原菌柱狀黃桿菌(魚害粘球菌)(/^araZ^cten'咖coh鵬are，編號G4)、鰻弧菌(K/6n'oa/7^yj'"ar咖，編號E-3-11)、點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種(^ero邁o朋sp"/7"atasub./w/7c^3ta，編號XP91-4-1)、嗜7K氣單胞菌"er咖o;7as/yrfro」。/j7a，編號ST78-3-3)均由中國科學(xué)院水生生物研究所魚病室細(xì)菌組提供；溶藻弧菌(Kz7^'oa&i加""m)、哈維弧菌(Kz'&j'o力wre7)、殺鮭氣單胞菌G4ero/w^assaJ/z70wVa)由西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.3供試樣品血根堿，純度為97.9。X，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。1.1.4培養(yǎng)基普通肉湯培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，KH2P04lg，蒸餾水1000mL，pH為7.47.6，121。C高壓滅菌20min。普通營養(yǎng)瓊脂蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH7.2,121。C滅菌30min。粘細(xì)菌培養(yǎng)基胰蛋白胨5g，#母膏0.5g，乙酸鈉O.Olg，BaCl2.2H200.01g，K2HPO40.1g，KH2PO40.05g，MgS04.7H200.3g，CaCl2'2H200扁7g，F(xiàn)eS04-7H20O.OOlg，NaHC030.05g，固體培養(yǎng)基加瓊脂12.0g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，12rC滅菌30min。1.2試驗(yàn)方法1.2.1血根堿藥液的制備精確稱取血根堿1g，在lOOmL容量瓶中用無水甲醇定容，使?jié)舛葹?0mg.mL'1，使用時再用甲醇稀釋到試驗(yàn)所用濃度。1.2.2血根堿抑菌試驗(yàn)(1)菌懸液的制備將7株水產(chǎn)病原菌分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25'C下培養(yǎng)2448h后，反復(fù)活化3次，然后分別將第3代的菌種用0.65%無菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液，采用平板活菌計(jì)數(shù)法測定菌懸液濃度后稀釋為105106cfu/mL，4。C冰箱保存?zhèn)溆谩?株細(xì)菌菌懸液濃度見表4。_表4試驗(yàn)菌菌懸液濃度(cfu.mL—"__菌株種類Pathogensvarieties_數(shù)量Number柱狀黃桿菌F/ovo6acte"'wmco/鵬mwe4x106鰻弧菌fttr:'oa/jgia'/torw/nlx106點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種乂era加o"as/wn"atosub.尸wwctata5xl06嗜水氣單胞菌jg腿o膨；^c&"cp/K7a6x106嗜水氣單胞菌嗜水亞種Jera7wo"as^/to//h7。sub,ir>66X10哈維弧菌W6n'oi7arwy8x106殺鮭氣單胞菌^eroOTOMassa//wo/H'cfa!_6xl06(2)對細(xì)菌病原菌抑菌活性測定采用試管連續(xù)倍比稀釋法測定血根堿對7株病原菌的最低抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimumbactericidalconcentration，MBC)。判定標(biāo)準(zhǔn)為:24h后肉湯沒有渾濁的試管中樣品濃度為該樣品對試驗(yàn)細(xì)菌的最低抑菌濃度，48h后肉湯沒有渾濁的試管再分別取樣，接種于普通瓊脂平皿中，28。C培養(yǎng)，若無菌落生長，則該試管樣品濃度為該樣品對試驗(yàn)細(xì)菌的最低殺菌濃度。并設(shè)陽性、陰性和甲醇對照組。首先將濃度為lOmg.mi;1的血根堿溶液稀釋為1000嗎.mL4。按如下方法分別對7種病原菌進(jìn)行試驗(yàn)。具體步驟為取試管9只，第一管加入普通肉湯0.8mL，其余9管均為0.5mL。第1管加入上述各個配制稀釋好的樣品0.2mL，混勻后取出0.5mL放入第2管中，照此連續(xù)稀釋至第9管。取出0.5mL棄去，此時藥物在各管中的濃度分別為1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640和1/1280倍，測試樣品濃度為200嗎.mL-1、100嗎.mL國1、50ng.ml/1、25jxg.ml/1、12.5嗎.ml/1、6.25嗎.mL-1、3.125嗎.m1/1、1.5625(ig.ml/1和0.78125jag.mlA分別取0.5mL7種上述表4中計(jì)過數(shù)，稀釋好的菌懸液直接加入上述9只試管中，振蕩均勻。另設(shè)3支對照試管普通肉湯培養(yǎng)液；0.2mL/mL濃度甲醇普通肉湯培養(yǎng)液；接種細(xì)菌的普通肉湯培養(yǎng)液。每管設(shè)3支平行組。1.2.3殺滅指環(huán)蟲活性試驗(yàn)對感染了中型指環(huán)蟲的活體金魚抽樣鏡檢觀察，當(dāng)金魚鰓部中型指環(huán)蟲感染的數(shù)量平均1525個/尾時便可進(jìn)行藥效試驗(yàn)。使用體積為10L的IO個塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.07.5，控制水溫25士rC，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定血根堿的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃度按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪,拌均勻,48h時取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。x對照組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量-試驗(yàn)組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量^m。/木忠竿()一對照組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量03.2結(jié)果與分析3.2.1血根堿對水產(chǎn)動物病原菌抑制作用血根堿對水產(chǎn)動物病原菌抑制作用見表5。結(jié)果顯示，血根堿對7株水產(chǎn)動物病原菌均表現(xiàn)很好的抑制效果，對引起魚類爛鰓病的病原菌一柱狀黃桿菌以及出血病一嗜水氣單胞菌嗜水亞種抑制效果最好,MIC均為12.5pg.mL-1，MBC均為25iig.ml/1。_表5血根滅對水產(chǎn)動物病原菌抑制作用結(jié)果___菌株(Pathogens)MIC(嗎mL")MBC(ngml/1)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種^eromo加iSp"nc加asub./u"ctato2550哈維弧菌W6rioAarv^y50100縵弧菌Wfrn》awgui7/arww50100柱狀黃桿菌novo6acfe"'";wco/um"。re12.525嗜水氣單胞菌嗜水亞種^era;no咖知dropAi70sub.ja/inow'cic/a12.525殺鮭氣單胞菌史氏亞種4ewmortasscAu6ertrt501003.2.2血根堿殺滅指環(huán)蟲活性3.2.2.1對照組試驗(yàn)進(jìn)行中設(shè)立的對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的0h、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染中型指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的0h鏡檢，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為16.7個/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為22.4個/尾。以此與各藥物測定的結(jié)果計(jì)算寄生蟲的殺滅率。(2)血根堿對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果血根堿48h殺滅中型指環(huán)蟲的結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，當(dāng)血根堿濃度為0.06mg丄"時，殺蟲率達(dá)91.2%;當(dāng)濃度為0.08mg丄"時，殺蟲率達(dá)98%;濃度為0.10mg丄'i時殺蟲率為100。/0。_表6血根堿48h對中型指環(huán)蟲殺滅效果_<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>總之，血根堿對水產(chǎn)動物病原菌和寄生指環(huán)蟲均有很好的殺滅效果，可以作為無公害漁藥開發(fā)利用。試驗(yàn)例3血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑的藥效學(xué)試驗(yàn)1材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)動物寄主模型為金魚(&ras^^a"ra^/s)，寄生蟲模型為中型指環(huán)蟲，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室活體保種；感染金魚體重均小于5g，來源于陜西省水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖場。1.1.2供試藥品含20%血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。1.1.3儀器設(shè)備XH-B旋渦混合器姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；BX41光學(xué)顯微鏡OLYMPUS。MadeinJapan;Satorius萬分之一電子天平；控溫裝置。1.2試驗(yàn)方法使用體積為10L的IO個塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.07.5，控制水溫25士rC，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定血根堿的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃虔按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪拌均勻，48h時取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。方法同試驗(yàn)例2。殺蟲，(％)—對照組的指環(huán)蟲平，存活數(shù)，-試驗(yàn)組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量:;100%對照組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量2結(jié)果2.1對照組試驗(yàn)進(jìn)行中設(shè)立的對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的Oh、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染中型指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的Oh鏡檢,中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為16.4個/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，中型指環(huán)蟲平均數(shù)量為20.5個/尾。以此與各藥物測定的結(jié)果計(jì)算寄生蟲的殺滅率。2.2血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑對寄生蟲殺滅結(jié)果血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑48h殺滅指環(huán)蟲的結(jié)果見表7。當(dāng)濃度為0.21111/1113時，殺蟲力較弱，僅為62.9%;當(dāng)濃度為0.3mL/ii^時，其殺蟲率可達(dá)95.2%;濃度為0.4mL/mS時殺蟲率為100。/。。表720X血村i堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑48h對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3討論本研究結(jié)果表明，20%血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑對魚類的中型指環(huán)蟲具有顯著的殺滅作用，其殺蟲濃度為0.4mL/m3，殺滅率達(dá)100%，表明該制劑是一種應(yīng)用前景良好的生物殺蟲漁藥。在該濃度下，換算成純血根堿用量為0.08mgi;1，低于試驗(yàn)例2種純單體血根堿0.10mg丄"的用量，說明20%制劑中加入乳化劑后顯著提高了在水體中的溶解度，從而也提高了藥效，降低了血根堿的用量。國內(nèi)外關(guān)于血根堿生物活性研究很少，在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用尚未研究資料，殺蟲活性研究證明，殺滅魚類指環(huán)蟲效果顯著，可以作為殺蟲漁藥很好的母體藥源，進(jìn)一步進(jìn)行仿生合成研究。試驗(yàn)例4血根堿制劑與市場常規(guī)漁藥殺蟲效果比較試驗(yàn)1材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)動物寄主模型為金魚()，寄生蟲模型為中型指環(huán)蟲，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室活體保種；感染金魚體重均小于5g，來源于陜西省水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖場。1.1.2供試藥品20%血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供；甲苯咪唑(Mebendazolum)，含量99.8%，陜西漢江制藥廠生產(chǎn)，吡喹酮(Praziquantelum)，含量96.5%，南京制藥廠生產(chǎn)。1.1.3儀器設(shè)備XH-B旋渦混合器姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；BX41光學(xué)顯微鏡OLYMPUS。MadeinJapan;Satorius萬分之一電子天平；控溫裝置。1.2試驗(yàn)方法使用體積為10L的IO個塑料盆，盛入充分曝氣地下水8L，pH7.07.5,控制水溫25士rC，分別投放感染有中型指環(huán)蟲的金魚30尾。首先大范圍設(shè)定血根堿的使用濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，再根據(jù)殺蟲的有效濃度按照梯度遞增或遞減重新設(shè)定，分別加入各濃度藥物并攪拌均勻，48h時取金魚全鰓制片、鏡檢，觀察在不同濃度下對指環(huán)蟲的殺滅效果，統(tǒng)計(jì)最高有效濃度、最高殺蟲率。試驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)對照組。方法同試驗(yàn)例2。x^啦,。,、_對照組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量-試驗(yàn)組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量irvw水蟲率(/。)=對照組的指環(huán)蟲平均存活數(shù)量X100/02結(jié)果2.1對照組試驗(yàn)進(jìn)行中設(shè)立的對照組魚一般為30尾，分別在試驗(yàn)的0h、48h隨即抽檢10尾，解剖全鰓鏡檢統(tǒng)計(jì)感染指環(huán)蟲平均數(shù)量。在試驗(yàn)的0h鏡檢，指環(huán)蟲平均數(shù)量為14.2個/尾，試驗(yàn)進(jìn)行48h，指環(huán)蟲平均數(shù)量為19.9個/尾。以此與各濃度藥物測定的結(jié)果計(jì)算寄生蟲的殺滅率。2.2三種藥物對寄生蟲殺滅結(jié)果比較由表8可以看出，3種殺蟲藥物在試驗(yàn)48h時，20%血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑當(dāng)濃度為0.4mL/n^時，殺滅指環(huán)蟲達(dá)100%，換算成純血根堿用量為0.08g/m、而甲苯咪唑的濃度為0.6g/mS時，殺蟲率只有58.8%;吡喹酮1.6g/mS時，殺蟲率為70.9%。試驗(yàn)結(jié)果說明，3種藥物對魚類指環(huán)蟲殺滅效果有很大的差異，特別是使用劑量上。按照農(nóng)業(yè)部2006年漁藥國家標(biāo)準(zhǔn)，含10%甲苯咪唑殺滅魚類指環(huán)蟲使用劑量在67g/畝100g/畝，換算純品用量為0.01g/m30.15g/m3。而試驗(yàn)中，殺蟲率達(dá)41.2%的甲苯咪唑純品用量在0.4g/n^己經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上述國標(biāo)中規(guī)定劑量，使用劑量過大已經(jīng)對魚產(chǎn)生毒性；相比較，3種殺蟲藥物活性最高的是20%血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑。而吡喹酮用量最高，殺蟲活性也最低。可見，血根堿水產(chǎn)動物體外寄生蟲防治劑是一種殺滅魚類指環(huán)蟲很高活性植物源漁藥。表8三種殺蟲藥物48h對指環(huán)蟲殺滅結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例來詳細(xì)說明從小果博落回(M(Maxim)Fedde)中提取、分離、檢測、鑒定血根堿方法、制備產(chǎn)品的方法，這些僅是本發(fā)明較好的實(shí)施例，但不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1血根堿的提取、分離、檢測、鑒定一、血根堿的提取、分離l.提取于陜西省周至縣秦嶺山野外采集小果博落回(屋孤'woca7pa(Maxim)Fedde)全草晾干、粉碎，稱取樣品10kg，使用810倍甲醇，70。C熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，過濾，減壓濃縮、獲得浸膏(2.36kg);用石油醚萃取上述浸膏，將萃取液進(jìn)行減壓濃縮、獲得浸膏(708.5g)，進(jìn)行硅膠柱層析分離。2.分離一級硅膠柱層析分離柱層析硅膠200300目(購自青島海洋化工有限公司)，首先用石油醚溶解上述浸膏，按lg樣品20g硅膠計(jì)算裝柱，石油醚濕法裝柱，干法上樣。以石袖醚乙酸乙酯(500:1，200:1，100:1，50:1，30:1，20:1,10:1，5:1，1:1)作為洗脫系統(tǒng)，進(jìn)行梯度洗脫。采用硅膠GF254(購自青島海洋化工有限公司)制備薄層板，對收集的各個流分進(jìn)行薄層層析(TLC)分析。并進(jìn)行殺滅指環(huán)蟲活性跟蹤試驗(yàn)。對具有活性的流分減壓濃縮、獲得浸膏為(685.3g)，再進(jìn)行活性成分的分離。二級硅膠柱層析分離上述浸膏用石油醚溶解，濕法裝柱(柱層析自100—200目)，干法上樣。洗脫系統(tǒng)為石油醚乙酸乙酯(50:1,30:1，20:1，10:1，5:1，1:1)，最后用甲醇洗脫。減壓回收溶劑，獲得各流分進(jìn)行薄層層析檢査，相同或相近部分合并，依次進(jìn)行殺滅指環(huán)蟲測定，確定具有殺蟲活性的流分后進(jìn)行減壓濃縮、浸膏，獲得浸膏(242.6g)并進(jìn)行更細(xì)致的分離。，三級硅膠柱層析分離石油醚溶解上述浸膏，拌入硅膠(200—300目)，濕法裝柱，干法上樣。用石油醚一乙酸乙酯=(3:1)進(jìn)行恒定極性洗脫，TLC跟蹤檢測，分離得到4個較純的化合物，分別為Mi、M2、M3和M4，對4個化合物進(jìn)行殺滅指環(huán)蟲藥效試驗(yàn)，有1種化合物M3(35.4g)在O.1mg/L濃度下48h內(nèi)對指環(huán)蟲殺滅率為100%，是殺滅活性最強(qiáng)的化合物。3.化合物M3純度檢測使用X-6型顯微熔點(diǎn)測定儀(北京泰克儀器有限公司生產(chǎn))測定化合物M3熔點(diǎn)，熔程為1分鐘26秒，說明純度大于95%。二、化合物M3鑒定1.化合物M3薄層層析(TLC)檢測將上述得到的化合物單體M3，用薄層層析檢測，分別用石油醚一乙酸乙酯(3:1)，苯一乙酸乙酯(3:l)為展開劑展開，同時以血根堿標(biāo)準(zhǔn)品做對照，在紫外分析儀254nm和365nm光下觀察，在兩種展開體系中，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品得Rf值均一樣(表9)。在碘缸中顯色，以及在用改良碘化鉍鉀顯色進(jìn)行觀察，檢測其純度。均為單一斑點(diǎn)，說明該化合物為純凈化合物。表9化合物M。與血根滅對照品TLC特性比較供試樣品展開系統(tǒng)顯色劑Rf值sampledevelopmentsystemdeveloperRfvalue化合物M3石油醚乙酸乙酯(3:1)苯乙酸乙酯(3:1)5%硫酸乙醇溶液0.930.86血根堿對照品石油醚乙酸乙酯(3:1)苯乙酸乙酯(3:1)5酸乙醇溶液0.930.862.化合f/M3紫外光吸收光譜分析化合物M3在229.0nm、283.5nm、323.0nm處有吸收峰(圖1)注化合物M,溶液在229.0nm，283.5nm,323.0nm處有特征吸收峰，血根堿對照品紫外光吸收圖譜(圖2)比較，兩者特征吸收峰吸收波長基本相同。3.化合物M3高效液相(HPLC)分析以MeOH:0.8%HAc(40:60)為流動相，在280nm，6.9MPa，流速l.OmL/min的條件下對化合物M3和血根堿標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖3、圖4所示，兩者的出峰時間基本相同。4.化合物M3紅外光譜(IR)分析IR如圖5所示，IR(KBr，cm-1):3431.55為-0H的伸縮振動；1635.25，1544.15，1464.17(—C=C—)為苯環(huán)的骨架伸縮振動，為苯環(huán)的特征吸收峰；1635為C一0的變形振動。5.化合物M3質(zhì)譜(EIMS)分析化合物M3的EIMS譜圖，如圖6所示，由化合物的氮規(guī)則和MS圖，可初步推斷如下MSm/z334.3(M+2)，333.3(M+l)，332.3(M+)，331.3(M-1),315.3(M-CH3)。分子量為332.30。與血根堿的理論分子量332基本一致?？偨Y(jié)以上結(jié)果，從小果博落回全草中提取、分離的殺滅指環(huán)蟲的活性化合物Ma與血根堿標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過TLC、紫外光譜、紅外光譜、高效液相和質(zhì)譜分析表明，化合物Ma是血根堿。6.試驗(yàn)使用主要儀器與血根堿標(biāo)準(zhǔn)品Waters高效液相色譜Waters600E泵，996PDA紫外檢測器，Millennium色譜管理工作站；SHIMADZU高效液相色譜:LC-6AD泵，SPD-10AVPUV-VIS紫外檢測器，CLASS-VP6.14SR1色譜管理工作站；HP5988型四極桿質(zhì)譜儀，美國HP公司；Esquire3000P^型ESI-MS，德國BrukerDaltonics公司；NicoletAVATAR360FT-IR型紅外光譜儀，美國Nicolet公司。血根堿標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所，血根堿含量99.6%。三、化合物M3中血根堿含量測考結(jié)果采用紫外一可見分光法對血根堿對照品溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知血根堿在23L0nm、283.5nm、323.0nm處有吸收峰，其中在323.0nm處有最大吸收峰。選用323.0nm作為血根堿分光光度法得檢測波長。在此波長下測量不同濃度血根堿對照品溶液的吸收度如表2所示，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。計(jì)算得回歸方程Y=0.030591667+3.5515197X,r=0.99951。樣品在323.Onm處吸光度五次分別為0.071、0.071、0.071、0.072、0.071,取平均數(shù)0.0712，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其濃度相當(dāng)血根堿對照品溶液0.01143mg/mL，化合物M3中血根堿含量為99.91%X98%=97.9118%。表2不同濃度對照品溶液的吸收度Table5-5TheabsorbanceofreferencesubstanceindifferentconcentrationbyUV組號groupnurabsr濃度c(mg/mU吸收度Aabsorbance平均值concentration(mg/m。重復(fù)lrep.1重復(fù)2r印.2重復(fù)3rep.3重復(fù)4rep.4重復(fù)5r印.5比色皿誤差10.03750.1580.1580.1580.1580.1580.00460.153420.0750.2880.2880.2880.2880.2880.00460.283430.150.5780.5780.5790.5790.5790.01580.562840.31.1431.1431.1431.1431.1430.0031.1450.62.1442.1442.1442.1442.1440.0022.142實(shí)施例2:防治劑的制備方法其制備方法是，將無水工業(yè)乙醇在不銹鋼夾層罐中加溫45t;5(rc，稱取血根堿2g加入罐內(nèi)，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙夂?，再同表面活性劑二甲基亞砜和吐?80混合物1.2g，余為乙醇溶劑，全部加入勻質(zhì)機(jī)中均質(zhì)后冷卻至常溫，即得該制劑40g。實(shí)施例2防治劑的制備方法殺滅魚類病原菌和寄生蟲防治劑采用血根堿和其他輔料組成，所述的制劑的配方按下述質(zhì)量百分比血根堿10g、表面活性劑6g，其余為乙醇或其他本領(lǐng)域熟知的溶劑，構(gòu)成100g;表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為l:1。制備方法同實(shí)施例l。實(shí)施例3防治劑的制備方法殺滅魚類病原菌和體外寄生蟲防治劑采用血根堿和其他輔料組成，所述的制劑的配方按下述質(zhì)量百分比血根堿15g、表面活性劑8g，其余為乙醇或其他本領(lǐng)域熟知的溶劑，構(gòu)成100g;表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為l:1。制備方法同實(shí)施例l。實(shí)施例4防治劑的制備方法殺滅魚類病原菌和體外寄生蟲防治劑采用血根堿和其他輔料組成，所述的制劑的配方按下述質(zhì)量百分比血根堿20g、表面活性劑IOg，其余為乙醇或其他本領(lǐng)域熟知的溶劑，構(gòu)成100g;表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為l:1。制備方法同實(shí)施例l。實(shí)施例5使用方法將血根堿制劑按直接潑灑于池塘中。權(quán)利要求1、血根堿在制備殺滅水產(chǎn)動物病原菌藥物中的應(yīng)用。2、血根堿在制備殺滅水產(chǎn)動物體外寄生蟲藥物中的應(yīng)用。3、血根堿在制備殺滅魚類體外寄生蟲-指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用。4、一種殺滅水產(chǎn)動物病原菌和體外寄生蟲的防治劑，其特征在于由下列重量比的原料構(gòu)成血根堿5%~20%，表面活性劑3%~10%，其余為溶劑，上述原料的總和為100%。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治劑，其特征在于所述的表面活性劑是指二甲基亞砜和吐溫-80混合物。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的防治劑，其特征在于所述的二甲基亞砜和吐溫-80混合物的比例為1:1。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治劑，其特征在于所述的溶劑為無水乙醇或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他溶劑。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的防治劑，其特征在于所述的溶劑為無水乙醇。9、如權(quán)利要求4所述防治劑的制備方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行:1)稱取血根堿、表面活性劑、溶劑各原料，備用；2)將所述重量的血根堿完全溶解預(yù)先加熱為4(TC5(TC的溶劑中，獲得含5%20%血根堿的溶液；3)再將所述重量的表面活性劑和步驟2)所得溶液加入勻質(zhì)機(jī)中混合，即得血根堿水產(chǎn)動物病原菌和體外寄生蟲防治劑。全文摘要本發(fā)明公開了血根堿在制備殺滅魚類病原菌、體外寄生蟲、特別是指環(huán)蟲藥物中的應(yīng)用及其防治劑的制備。該防治劑是由血根堿、表面活性劑、溶劑組成。該防治劑的制備方法1)將血根堿完全溶解預(yù)先加熱為40℃～50℃的溶劑中，獲得含5％～20％血根堿的溶液；2)再將表面活性劑和步驟1)所得溶液加入勻質(zhì)機(jī)中混合，即得。該防治劑直接潑灑于池塘中，使用劑量為0.4mL～2mL/m³。該防治劑低毒，不影響水產(chǎn)品質(zhì)量，無殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、不影響水產(chǎn)動物的進(jìn)食和生長，使用劑量低，廣泛適用于對鱖魚、鱸魚、鯉、草魚、鰻魚、鯛、鲆等體外寄生蟲的防治。文檔編號A61P31/00GK101099738SQ20071001721公開日2008年1月9日申請日期2007年1月10日優(yōu)先權(quán)日2007年1月10日發(fā)明者付維法,馮婷婷,原居林,姚嘉赟,鈺徐,梁朝軍,王建福,王高學(xué),超程,明袁,趙云奎,顧忠旗申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)