專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)食源性土霉素殘留的試紙條及其制備方法。
技術(shù)背景
土霉素(OTC)是常見(jiàn)的四環(huán)素類(lèi)抗生素，分子量為460，為灰黃色結(jié)晶粉末，難溶 于水，鹽酸鹽在水中溶解度為500mg/mL，微溶于乙醇，在空氣中穩(wěn)定。土霉素抗菌譜廣，對(duì)革 蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌、立克次氏體、支原體、衣原體等原核微生物均有抑菌作用且對(duì)某些酵 母及原生動(dòng)物等真核微生物也有抑制效果。
由于土霉素抗菌效果好，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，用于多種 水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病防治，淡水魚(yú)類(lèi)爛鰓病、腸炎病、赤皮病等。但是由于養(yǎng)殖過(guò)程中土 霉素的長(zhǎng)期濫用，導(dǎo)致了在水產(chǎn)品中的大量殘留，其對(duì)人體健康、生態(tài)環(huán)境、水產(chǎn)品貿(mào)易等 方面造成了嚴(yán)重的危害。國(guó)家農(nóng)業(yè)部規(guī)定土霉素在肌肉中最高殘留限量為100 μ g/kg，在水 產(chǎn)品中的最高殘留限量為100 μ g/kg。
目前，應(yīng)用于土霉素抗生素殘留的檢測(cè)方法主要有儀器分析法和免疫分析法兩大 類(lèi)。前者主要包括高效液相色譜，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等，具有精確度高、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但 其存在操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜、成本高、不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法所需 試劑主要依賴(lài)進(jìn)口，費(fèi)用較高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有檢測(cè)土霉素的方法操作繁瑣，樣品處理復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)的問(wèn)題，提供一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條及其制備方法。
本發(fā)明的一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條，由PVC背板、樣品 墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，在PVC背板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝 酸纖維素膜和吸收墊，所述樣品墊與所述結(jié)合墊之間有搭接，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維 素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有抗土 霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，包被量為0. 1 μ g ；所述硝酸纖維素膜上分別包被有土霉 素-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)，包被量均為0. 05 μ g。
上述的一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法，按以下步 驟進(jìn)行一、土霉素人工抗原的合成將鄰聯(lián)甲苯胺(o-Tolidine)溶解于0. 2 0. 3mol/ L的0 4°C的HCl溶液中，然后逐滴加入35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光 反應(yīng)0.5 lh，得到溶液A，稱(chēng)取土霉素(OTC)和牛血清白蛋白(BSA)，溶解于pH值為 7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中，并加入上述溶液A，避光反應(yīng)2 池，在0 4°C 條件下用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液透析2 3天，每隔6 他換一次磷酸鹽緩沖液，透 析完成后，于5000 6000r/min條件下離心5 lOmin，棄去沉淀，得到土霉素免疫抗原 OTC-o-Tolidine-BSA;二、制備土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物，然后包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)4成檢測(cè)線(xiàn)，再將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線(xiàn)；三、制備抗土霉素單克隆抗 體；四、采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后將抗土霉素單克隆抗體加入膠體金 溶液中，制得抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，然后包被在結(jié)合墊上；五、在PVC背板 上依次連續(xù)粘附樣品墊、步驟四所得結(jié)合墊、步驟二所得硝酸纖維素膜和吸水墊，然后切成 60mmX4mm的試紙條，即得到用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條；步驟一中每 毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 01 0. 03mL的 NaNO2溶液；步驟一中土霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1 1.5 2，硼砂緩沖液和溶液 A與土霉素的體積比分別為8 10 1和4 6 1 ；步驟二中土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物 和羊抗鼠IgG的包被量均為0. 05 μ g ；步驟四中抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的包 被量為0. 1 μ g。
本發(fā)明的原理當(dāng)待測(cè)樣品溶液滴入試劑條的加樣區(qū)后，樣品溶液因纖維素膜載 體的毛細(xì)管作用向另一端擴(kuò)散。在移動(dòng)過(guò)程中，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過(guò)免疫膠 體金的顏色顯示出來(lái)。如果樣品溶液中含有土霉素殘留，土霉素將與結(jié)合墊上的抗土霉素 單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物先行反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨著樣品溶液擴(kuò)散至檢測(cè)線(xiàn)時(shí)， 膠體金顆粒上的抗體的活性位點(diǎn)因被樣品溶液中的土霉素占據(jù)而無(wú)法與檢測(cè)線(xiàn)上土霉素 特異性抗原結(jié)合；所以當(dāng)樣品中的土霉素含量超過(guò)試紙條檢出限時(shí)，試紙條上的檢測(cè)線(xiàn)將 較控制線(xiàn)顯色淡甚至無(wú)顯色，判定為陽(yáng)性。反之，當(dāng)樣品中土霉素含量在試紙條檢出限以下 或者無(wú)殘留時(shí)，試紙條上的檢測(cè)線(xiàn)顯色與控制線(xiàn)相近偏深，判定為陰性。
本發(fā)明用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢出 限為5 μ g/kg，重復(fù)性好，使用時(shí)樣品制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)操作簡(jiǎn)易，適于實(shí)地現(xiàn)場(chǎng)操作。


圖1為具體實(shí)施方式
一制備的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的 示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一結(jié)合圖1說(shuō)明本實(shí)施方式，本實(shí)施方式用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品 中土霉素殘留的試紙條，由PVC背板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸收墊5組 成，在PVC背板1上依次連續(xù)粘附有樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸收墊5，所述 樣品墊2與所述結(jié)合墊3之間有搭接，所述結(jié)合墊3與所述硝酸纖維素膜4之間有搭接，所 述硝酸纖維素膜4與所述吸收墊5之間有搭接；所述結(jié)合墊3上包被有抗土霉素單克隆抗 體-膠體金標(biāo)記物，包被量為0. 1 μ g ；所述硝酸纖維素膜4上分別包被有土霉素-載體蛋 白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)T和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)C，包被量均為0. 05 μ g。
本實(shí)施方式中的PVC背板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5均購(gòu) 自上海金標(biāo)生物科技有限公司。
本實(shí)施方式用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的示意圖如圖1所示。
本實(shí)施方式用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢出限為5yg/kg。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是硝酸纖維素膜4上包 被的土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白為卵清蛋白(OVA)。其它與具體實(shí)施方式
一相 同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制 備方法，按以下步驟進(jìn)行一、土霉素人工抗原的合成將鄰聯(lián)甲苯胺(o-Tolidine)溶解于 0. 2 0. 3mol/L的0 4°C的HCl溶液中，然后逐滴加入；35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于 4°〇，避光反應(yīng)0.5 11!，得到溶液六，稱(chēng)取土霉素(OTC)和牛血清白蛋白(BSA)，溶解于pH 值為7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中，并加入上述溶液A，避光反應(yīng)2 池，在0 4°C條件下用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液透析2 3天，每隔6 他換一次磷酸鹽緩沖液， 透析完成后，于5000 6000r/min條件下離心5 lOmin，棄去沉淀，得到土霉素免疫抗原 OTC-o-Tolidine-BSA ；二、制備土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物，然后包被在硝酸纖維素膜4上構(gòu) 成檢測(cè)線(xiàn)，再將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜4上構(gòu)成質(zhì)控線(xiàn)；三、制備抗土霉素單克隆 抗體；四、采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后將抗土霉素單克隆抗體加入膠體金 溶液中，制得抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，然后包被在結(jié)合墊3上；五、在PVC背板 1上依次連續(xù)粘附樣品墊2、步驟四所得結(jié)合墊3、步驟二所得硝酸纖維素膜4和吸水墊5， 然后切成60mmX4mm的試紙條，即得到用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條；步 驟一中每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 01 0.03mL的NaNO2溶液；步驟一中土霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1 1.5 2，硼砂緩沖 液和溶液A與土霉素的體積比分別為8 10 1和4 6 1 ；步驟二中土霉素-載體蛋 白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG的包被量均為0. 05 μ g ；步驟四中抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo) 記物的包被量為0. lyg。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟一中每毫克鄰聯(lián) 甲苯胺加入0. ISmL的HCl溶液。其它與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三或四不同的是步驟一中每毫克 鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 02mL的NaNO2溶液。其它與具體實(shí)施方式
三或四相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三至五之一不同的是步驟一中透 析完成后，于^OOr/min條件下離心5min。其它與具體實(shí)施方式
三至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟二中制備土霉 素-載體蛋白偶聯(lián)物的具體步驟為將125mg鄰聯(lián)甲苯胺溶解于22. 5mL的0. 2mol/L的0°C 的HCl溶液中，然后逐滴加入35mg/mL的NaNO2溶液2. 5mL,于4°C避光反應(yīng)lh，得到溶液A， 稱(chēng)取0. 08g 土霉素和0. 085g卵清蛋白(OVA)，溶解于IOmL的pH值為7. 4的0. lmol/L的硼 砂緩沖液中，并加入5mL上述溶液A，避光反應(yīng)2小時(shí)，用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液于4°C 透析3天，每隔他換一次磷酸鹽緩沖液，透析完后，于5000r/min離心5min，棄去沉淀，即得 到土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物。其它與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟二中檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控 線(xiàn)的制備方法為a、用點(diǎn)膜機(jī)將土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗小鼠IgG包被在纖維素膜 上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；b、然后于37°C恒溫箱中固定15min，再經(jīng)封閉液封閉30min， 然后用PBST緩沖液沖洗3次后，于37°C烘干，即完成檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備；其中步驟a中土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗小鼠IgG的包被量均為0. 05μ g ；步驟b中的封閉液由 0. 01mol/L的pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量濃度1 %的牛血清白蛋白組成；步驟b中 的PBST緩沖液為含0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。其它與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟三中制備抗土霉 素單克隆抗體的具體步驟為a、將1001^土霉素免疫抗原0幾-0-1101丨肚1^-834溶解于 100 μ L生理鹽水中，然后與等體積的弗氏佐劑混合乳化，乳化完全，然后首次免疫采用皮 下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，注射劑量為ImL/只；b、兩周后，改用弗氏不完全佐劑乳化土霉素 免疫抗原，采用腹腔注射小鼠，注射劑量為0. 3mL/只；C、之后每隔一周使用弗氏不完全佐 劑乳化土霉素免疫抗原，采用腹腔注射免疫小鼠，注射劑量為0. 3mL/只，第5次免疫后，尾 靜脈采血，血液置于4°C靜置Mh，然后于5000r/min離心lOmin，取上清采用間接非競(jìng)爭(zhēng) ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)，當(dāng)抗血清效價(jià)達(dá)到1 6400以上，取小鼠脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn) 行細(xì)胞融合；d、用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；e、向小鼠腹腔注射0. 5mL 無(wú)菌液體石蠟，取陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，于2500r/min離心5min，將沉淀用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，之后將沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為IO5個(gè)/mL，注入小鼠腹腔，待腹腔膨大， 采集腹水，于4°C且轉(zhuǎn)速2500r/min條件下離心IOmin取上清，采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純 化，獲得抗土霉素單克隆抗體。其它與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟四中采用檸檬酸三 鈉還原法制備膠體金溶液的具體步驟為a、取一個(gè)250mL三角瓶，加IOOmL雙蒸水及ImL質(zhì) 量濃度為的氯化金，加熱至沸騰；b、加入2. 5mL質(zhì)量濃度為1 %的檸檬酸鈉水溶液，混 勻，繼續(xù)加熱沸騰30min ；c、溶液顏色首先變黑，再逐漸變紫紅，冷卻后，于4°C下保存，即完 成膠體金溶液制備。其它與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟四中制備抗土霉 素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的具體步驟為a、將pH值為7. 2的膠體金溶液置于磁力攪拌 器上，將抗土霉素單克隆抗體逐滴加入膠體金溶液中，5min加入Img抗土霉素單克隆抗體， 攪拌30min ；加入牛血清白蛋白至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min ；然后置于4°C作用池后， 于4°C，2000r/min條件下離心20min，去沉淀；上清繼續(xù)在4°C，10000r/min條件下離心lh， 去上清，得沉淀，即完成抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備。其它與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試 紙條的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、土霉素人工抗原的合成將125mg鄰聯(lián)甲苯胺 (o-Tolidine)溶解于22. 5mL的0. 2mol/L的0 °C的HCl溶液中，然后逐滴加入2. 5mL的 35mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光反應(yīng)lh，得到溶液A，稱(chēng)取0.08g 土霉素(OTC)和 0. 145g牛血清白蛋白(BSA)，溶解于IOmL的pH值為7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中，并 加入5mL上述溶液A，避光反應(yīng)2h，在4°C條件下用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液透析3天，每 隔幾換一次磷酸鹽緩沖液，透析完成后，于5000r/min條件下離心5min，棄去沉淀，得到土 霉素免疫抗原OTC-o-Tolidine-BSA ；二、制備土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物，然后包被在硝酸纖 維素膜4上構(gòu)成檢測(cè)線(xiàn)，再將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜4上構(gòu)成質(zhì)控線(xiàn)；三、制備抗 土霉素單克隆抗體；四、采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后將抗土霉素單克隆抗 體加入膠體金溶液中，制得抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，然后包被在結(jié)合墊3上；五、在PVC背板1上依次連續(xù)粘附樣品墊2、步驟四所得結(jié)合墊3、步驟二所得硝酸纖維素膜 4和吸水墊5，然后切成60mmX4mm的試紙條，即得到用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留 的試紙條；其中步驟二中土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG的包被量均為0. 05 μ g ；步 驟四中抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的包被量為0. 1 μ g。
本實(shí)施方式制備的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的使用方法
1、樣品制備稱(chēng)取2g待檢樣品(肉類(lèi)或水產(chǎn)品)，用4mL甲醇旋渦振蕩2min，過(guò) 濾，濾液用PBST緩沖液稀釋10倍，得待測(cè)液，備用。
2、檢測(cè)步驟將制備的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條插入上述1 制備的待測(cè)液中，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)5min后取出，目視辨別顏色深淺。
3、結(jié)果判斷讀取結(jié)果時(shí)，將試紙條水平放置于觀(guān)察者正面。
陰性結(jié)果檢測(cè)線(xiàn)T的顏色比質(zhì)控線(xiàn)C深或者與質(zhì)控線(xiàn)C 一樣深，表明樣品中土霉 素濃度低于5 μ g/kg或者無(wú)土霉素殘留。
陽(yáng)性結(jié)果檢測(cè)線(xiàn)T顯色比質(zhì)控線(xiàn)C淺，或者檢測(cè)線(xiàn)T無(wú)顯色，表明樣品中土霉素 濃度高于5 μ g/kg ；檢測(cè)線(xiàn)T或質(zhì)控線(xiàn)C越淺，表明樣品中土霉素濃度越高。
無(wú)效若質(zhì)控線(xiàn)C不顯色，可能是操作不當(dāng)或者試劑條已經(jīng)失效。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條，其特征在于用于檢測(cè)肉類(lèi)及水 產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條，由PVC背板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，在 PVC背板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述樣品墊與所述結(jié) 合墊之間有搭接，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述 吸收墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，包被量為 0. Iug ；所述硝酸纖維素膜上分別包被有土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)和羊抗鼠 IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)，包被量均為0. 05 μ g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條，其特征在于 硝酸纖維素膜上包被的土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白為卵清蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方 法，其特征在于用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法，按以下步驟進(jìn) 行一、土霉素人工抗原的合成將鄰聯(lián)甲苯胺溶解于0. 2 0. 3mol/L的0 4°C的HCl溶 液中，然后逐滴加入35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光反應(yīng)0. 5 lh，得到溶液 A，稱(chēng)取土霉素和牛血清白蛋白，溶解于pH值為7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中， 并加入上述溶液A，避光反應(yīng)2 池，在0 4°C條件下用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液透析 2 3天，每隔6 他換一次磷酸鹽緩沖液，透析完成后，于5000 6000r/min條件下離心 5 lOmin，棄去沉淀，得到土霉素免疫抗原；二、制備土霉素_載體蛋白偶聯(lián)物，然后包被 在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測(cè)線(xiàn)，再將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線(xiàn)；三、制 備抗土霉素單克隆抗體；四、采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后將抗土霉素單克 隆抗體加入膠體金溶液中，制得抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，然后包被在結(jié)合墊 上；五、在PVC背板上依次連續(xù)粘附樣品墊、步驟四所得結(jié)合墊、步驟二所得硝酸纖維素膜 和吸水墊，然后切成60mmX4mm的試紙條，即得到用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的 試紙條；步驟一中每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加 入0.01 0.03mL的NaNO2溶液；步驟一中土霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1 1. 5 2，硼砂緩沖液和溶液A與土霉素的體積比分別為8 10 1和4 6 1;步驟二中土 霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG的包被量均為0. 05μ g ；步驟四中抗土霉素單克隆抗 體-膠體金標(biāo)記物的包被量為0. 1 μ g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法， 其特征在于步驟一中每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. ISmL的HCl溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法， 其特征在于步驟一中每毫克鄰聯(lián)甲苯胺加入0. 02mL的NaNO2溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法， 其特征在于步驟二中制備土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的具體步驟為將125mg鄰聯(lián)甲苯胺溶 解于22. 5mL的0. 2mol/L的0°C的HCl溶液中，然后逐滴加入:35mg/mL的NaNO2溶液2. 5mL， 于4°C避光反應(yīng)lh，得到溶液A，稱(chēng)取0. 08g 土霉素和0. 085g卵清蛋白，溶解于IOmL的pH 值為7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中，并加入5mL上述溶液A，避光反應(yīng)2小時(shí)，用0. Imol/ L的磷酸鹽緩沖液于4°C透析3天，每隔他換一次磷酸鹽緩沖液，透析完后，于5000r/min 離心5min，棄去沉淀，即得到土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法，其特征在于步驟二中檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備方法為a、用點(diǎn)膜機(jī)將土霉素-載體蛋白偶聯(lián) 物和羊抗小鼠IgG包被在纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；b、然后于37°C恒溫箱中 固定15min，再經(jīng)封閉液封閉30min，然后用PBST緩沖液沖洗3次后，于37°C烘干，即完成 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備；其中步驟a中土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗小鼠IgG的包被量 均為0. 05 μ g ；步驟b中的封閉液由0. 01mol/L的pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量濃度 的牛血清白蛋白組成；步驟b中的PBST緩沖液為含0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方法， 其特征在于步驟三中制備抗土霉素單克隆抗體的具體步驟為a、將IOOyg 土霉素免疫抗 原溶解于IOOyL生理鹽水中，然后與等體積的弗氏佐劑混合乳化，乳化完全，然后首次免 疫采用皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，注射劑量為ImL/只；b、兩周后，改用弗氏不完全佐劑乳 化土霉素免疫抗原，采用腹腔注射小鼠，注射劑量為0. 3mL/只；C、之后每隔一周使用弗氏 不完全佐劑乳化土霉素免疫抗原，采用腹腔注射免疫小鼠，注射劑量為0. 3mL/只，第5次免 疫后，尾靜脈采血，血液置于4°C靜置Mh，然后于5000r/min離心lOmin，取上清采用間接 非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)，當(dāng)抗血清效價(jià)達(dá)到1 6400以上，取小鼠脾細(xì)胞，與骨髓瘤 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合；d、用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；e、向小鼠腹腔注射 0. 5mL無(wú)菌液體石蠟，取陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，于2500r/min離心5min，將沉淀用磷酸鹽緩沖液 沖洗3次，之后將沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為IO5個(gè)/mL，注入小鼠腹腔，待腹腔 膨大，采集腹水，于4°C且轉(zhuǎn)速2500r/min條件下離心IOmin取上清，采用辛酸-硫酸銨法進(jìn) 行純化，獲得抗土霉素單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方 法，其特征在于步驟四中采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液的具體步驟為a、取一個(gè) 250mL三角瓶，加IOOmL雙蒸水及ImL質(zhì)量濃度為1 %的氯化金，加熱至沸騰；b、加入2. 5mL 質(zhì)量濃度為的檸檬酸鈉水溶液，混勻，繼續(xù)加熱沸騰30min ；c、溶液顏色首先變黑，再逐 漸變紫紅，冷卻后，于4°C下保存，即完成膠體金溶液制備。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條的制備方 法，其特征在于步驟四中制備抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的具體步驟為a、將pH 值為7. 2的膠體金溶液置于磁力攪拌器上，將抗土霉素單克隆抗體逐滴加入膠體金溶液 中，5min加入Img抗土霉素單克隆抗體，攪拌30min ；加入牛血清白蛋白至終濃度為1 %，繼 續(xù)攪拌30min ；然后置于4°C作用2h后，于4°C，2000r/min條件下離心20min，去沉淀；上清 繼續(xù)在4°C，lOOOOr/min條件下離心lh，去上清，得沉淀，即完成抗土霉素單克隆抗體-膠體 金標(biāo)記物的制備。
全文摘要
一種用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條及其制備方法，涉及一種檢測(cè)食源性土霉素殘留的試紙條及其制備方法。本發(fā)明為了解決現(xiàn)有檢測(cè)土霉素的方法操作繁瑣，樣品處理復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的問(wèn)題。試紙條由PVC背板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成。制備方法一、土霉素人工抗原的合成；二、制備土霉素-載體蛋白偶聯(lián)物，制成檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；三、制備抗土霉素單克隆抗體；四、制備膠體金溶液，制得抗土霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，然后包被在結(jié)合墊上；五、在PVC背板上依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，即得到用于檢測(cè)肉類(lèi)及水產(chǎn)品中土霉素殘留的試紙條。應(yīng)用于食源性土霉素殘留檢測(cè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102043057SQ20101054096
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者丁忠慶, 代翠紅, 崔艷華, 徐桂連, 馬鶯 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)