專利名稱：一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，尤其是涉及一種抗腫瘤及瘤苗免疫佐劑功能融合蛋白的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
1984年，Haritos等從大鼠胸腺分離出一種含有111個(gè)氨基酸殘基的多肽，其N端含已發(fā)現(xiàn)的所有胸腺素α原家族成員的序列，因此命名為胸腺素α原，人ProTα由109個(gè)氨基酸殘基組成，與大鼠ProTα的序列相比，有6個(gè)位點(diǎn)的差異，包括4個(gè)位點(diǎn)的替代和2個(gè)位點(diǎn)的缺失(1、Haritos AA，Goodall GJ，Horecker BL，Prothymosin alphaisolation and propertiesof the major immunoreactive form of thymosin alphal in rat thymus.Proc Natl Acad Sci USA，1984，811008；2、Haritos AA.Alpha-thymosinsrelationships in structure，distribution，andfunction.Isozymes Curr Top Biol Med Res 1987；14123-152；3、Goodall GJ，Dominguez F，Horecker BL.Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha.Proc Natl Acad Sci USA 1986；83(23)8926-8928；4、Pan LX，Haritos AA，Wideman J，Komiyama T，Chang M，Stein S eta1.Human prothymosin alphaamino acid sequence and immunologic properties.Arch BiochemBiophys 1986；250(1)197-201。)。
1985年，Haritos等(Komiyama T，Pan LX，Haritos AA，et al.The primary structure of ratparathymosin.ProcNatl Acad Sci USA 1986；83(5)1242-1245。)發(fā)現(xiàn)大鼠ProTA能增強(qiáng)小鼠抗白色念珠菌(Candida albicans)感染的能力，1986年P(guān)an又發(fā)現(xiàn)ProTα能刺激轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)的釋放，其作用比Tα1強(qiáng)10～20倍(1、Haritos AA，r.Blacher，S.Stein，J..Horecker.Parathymosin alphaa peptide from rat tissues with structural homology to prothymosinalpha.Proc Natl Acad Sci USA，821050-1053；2、Pan LX，Haritos AA，Wideman J，et al.Humanprothymosin alphaamino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys1986；250(1)197-201)，1987年，Sαlvin等發(fā)現(xiàn)腹腔注射ProTα能增強(qiáng)RF/J小鼠產(chǎn)生抗體的能力，鋅能加強(qiáng)這種作用，能使青年大鼠和老年大鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫都增強(qiáng)(1、Salvin SB，Horecker BL，Pan LX，Rabin BS.The effect of dietary zinc and prothymosin alpha oncellular immune responses of RF/J mice.Clin Immunol Immunopathol 1987；43(3)281-288。)。Papanastasiou(Papanastasiou M，Baxevanis CN，Papamichail M.Promotion of murineantitumor activity by prothymosin alpha treatmentI.Induction of tumoricidal peritoneal cellsproducing high levels of tumour necrosis factor alpha.Cancer Immunol Immunother 1992；35(2)145-150。)發(fā)現(xiàn)，CBA/2小鼠如果腹腔接種腫瘤細(xì)胞，一般8-12d之內(nèi)產(chǎn)生腹水，10-14d后死亡，20％的經(jīng)過ProTα處理的小鼠不產(chǎn)生腹水，并能夠使不產(chǎn)生腹水中的40％-60％的小鼠壽命可以延長到70d。當(dāng)腹腔注射ProTα?xí)r，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、提高NK，LAK細(xì)胞的活性(1、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cellsinvitro evaluation of combination with prothymosin alpha.Lymphokine Cytokine Res 1994；13(3)175-182；2、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother 1994；38(4)281-286)；增強(qiáng)MHC限制的細(xì)胞免疫(1、Baxevanis CN，Thanos D，Reclos GJ，J et al.Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression andmessenger RNA accumulation.J Immunol 1992；148(7)1979-1984；2、Baxevanis CN，Thanos D，Reclos GJ，et al.Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigenexpression and messenger RNA accumulation.J Immunol 1992；148(7)1979-1984。)，抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Baxevanis CN，Reclos CJ，Papamichail M et al.Prothymosin alpha restores thedepressed autologous and allogenic mixed lymphocyte responses in patient with systemic lupuserythematosus.Immuopharmaco immunotoxico，1987，9429。)，促進(jìn)IL-2，MIF的分泌和TN F-α，IFN-γ的合成；促進(jìn)IL-2受體的表達(dá)(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Spanakos G，.Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha.CancerImmunol Immunother 1995；40(6)410-418；2、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cellsin vitro evaluation of combination with prothymosin alpha.LymphokineCytokine Res 1994；13(3)175-182；3、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction oflymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother1994；38(4)281-286；4、Voutsas IF，Baxevanis CN，Gritzapis AD，et al.Synergy betweeninterleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytesagainst autologous human carcinomas.Cancer Immunol Immunother 2000；49(8)449-458；5、Cordero OJ，Sarandeses CS，Lopez JL，et al.Prothymosin alpha enhances IL-2 receptor expressionin norma human T-lymphoctyes.Int J Immunpharmacol，1991，131059。)，從而產(chǎn)生非特異性腫瘤殺傷作用，同時(shí)，誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+)和輔助性T細(xì)胞(CD4+)的特異性抗腫瘤作用。ProTα在疾病早期可以刺激淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokien activatedkiller cells，LAK)活性，它是通過增加淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)而增加IFN-γ和IL-2的分泌來實(shí)現(xiàn)的(1、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cellsinvitro evaluation of combination with prothymosin alpha.Lymphokine Cytokine Res 1994；13(3)175-182；2、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother 1994；38(4)281-286)。單獨(dú)使用ProTα?xí)r可以刺激TNF-α和IL-2的分泌，如果與IL-2聯(lián)合使用時(shí)，可增加NK細(xì)胞CD56，CD16/56和CD25及CD18/11黏附分子的表達(dá)。在IFN-γ存在的條件下，ProTα主要通過增加CD54(細(xì)胞黏附分子配體)的表達(dá)，刺激單核細(xì)胞與集結(jié)的腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Spanakos G，.Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha.CancerImmunol Immunother 1995；40(6)410-418；2、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cellsin vitro evaluation of combination with prothymosin alpha.LymphokineCytokine Res 1994；13(3)175-182；3、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction oflymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother1994；38(4)281-286；4、Voutsas IF，Baxevanis CN，Gritzapis AD，et al.Synergy betweeninterleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytesagainst autologous human carcinomas.Cancer Immunol Immunother 2000，49(8)449-458。)。近來研究表明，ProTα在DNA疫苗中還可以起到疫苗佐劑的效果(1、Jin Y，Cao C，Li P，Liu X，Huang W，Li C et al.Boosting immune response to hepatitis B DNA vaccine by coadministrationof Prothymosin alpha-expressing plasmid.Clin Diagn Lab Immunol 2005；12(12)1364-1369；2、Shiau AL，Chen CC，Yo YT，Chu CY，Wang SY，Wu CL.Enhancement of humoral and cellularimmune responses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosinalpha.Vaccine 2005；23(48-49)5563-5571)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤及瘤苗免疫佐劑功能融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明從中國人外周血中所克隆到的胸腺素原α基因及其蛋白原核表達(dá)，為今后研制和開發(fā)新的基因工程抗腫瘤藥物及應(yīng)用于腫瘤疫苗佐劑奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明所述的一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法包括以下步驟 1)根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分別為 上游引物P15’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’， 下游引物P25’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’， 將上游引物P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoR I酶切位點(diǎn)。
2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-TVector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽性菌液測序。
3)采用生物學(xué)軟件DNAman對7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對。
4)用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得GST-Proα融合蛋白。
5)將4經(jīng)過轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因BL21菌株超聲破碎后，離心所獲得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proα。
6)將上清經(jīng)過GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Proα融合蛋白。
上游引物P1和下游引物P2由上海生工公司合成。將鑒定的陽性菌液可送至上海博亞生物公司測序。
在步驟4)中，37℃培養(yǎng)至OD500nm為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h，菌液離心后的沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
本發(fā)明所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物及其瘤苗免疫佐劑中的應(yīng)用。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明具有增加胸腺指數(shù)能力。但在增加胸腺指數(shù)方面對于老齡老鼠效果更明顯。對于脾臟指數(shù)沒有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
在體內(nèi)抗腫瘤活性檢測中，選擇6～8周齡，體重在18～22g的昆明小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過腹腔注射重組融合蛋白，可顯著提高小鼠生存時(shí)間和存活率，同時(shí)在10μg/只可以達(dá)到所有實(shí)驗(yàn)小鼠完全存活的效果。在皮下注射S180腫瘤細(xì)胞觀察重組蛋白對抑瘤率的效果中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用重組蛋白，10μg/只的劑量可以達(dá)到50％以上的抑瘤率，如果在期間注射重組蛋白的同時(shí)注射S180細(xì)胞抗原，則抑瘤率可以達(dá)到80％以上。說明該蛋白具有良好的佐劑功能。
胸腺是人體免疫中樞，青年時(shí)最發(fā)達(dá)，但隨著年齡的增加，胸腺逐漸萎縮，因而人的免疫功能逐漸減弱，臨床上有采用注射胸腺因子來提高病人的免疫功能，其中目前常用的是從動物胸腺中提取的胸腺肽，胸腺肽成分復(fù)雜，質(zhì)量不穩(wěn)定，因此尋找作用穩(wěn)定，成分單一的有效胸腺因子作為臨床應(yīng)用是目前的重要熱點(diǎn)，目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用的單一組份是合成的胸腺素α1(商品名日達(dá)仙，1.6mg 800人民幣，意大利進(jìn)口)，價(jià)格昂貴，本發(fā)明采用基因工程手段表達(dá)前胸腺素原蛋白，純度高，成分一致，并且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)效果顯著，同時(shí)適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。由此可見，本發(fā)明所述的融合蛋白可以單獨(dú)使用，也可以與其他抗原，尤其是瘤細(xì)胞抗原一起使用，達(dá)到有效控制腫瘤細(xì)胞增長，延長機(jī)體壽命的功效。



圖1為中國人外周血淋巴總RNA電泳圖。在圖1中，5S，18S，28S代表不同沉降系數(shù)的RNA。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例檢測RT-PCR獲得的產(chǎn)物。在圖2中，2000bp，1000bp，750bp，500bp，300bp，250bp，100bp分別代表DNA大小，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA。
圖3為ProTα的PCR擴(kuò)增結(jié)果。在圖3中，1為PCR產(chǎn)物，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA。
圖4為質(zhì)粒PUCT-α限制性酶切分析。在圖4中，1PUCT-α/BamHI+EcoRI雙酶切結(jié)果(2.6Kb，300bp)；M標(biāo)準(zhǔn)DNA DL2000(bp)；2pMD18-T-Vector質(zhì)粒。
圖5為質(zhì)粒pGEX-ProTα的PCR鑒定結(jié)果。在圖5中，1、2PCR產(chǎn)物(300bp)，3陰性對照，MM代表標(biāo)準(zhǔn)DNA，DL2000(bp)。
圖6為質(zhì)粒pGEX-α限制性酶切分析。在圖6中，1、2pGEX-α/BamHI+EcoRI(4.9kb，300bp)，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA，DL2000(bp)。
圖7為表達(dá)載體pGEX-α構(gòu)建流程圖。在圖7中，將proT基因克隆到質(zhì)粒pUCT載體中，并用EcoRI和BamHI雙酶切，同時(shí)用與之相同的兩種酶雙酶切載體pEGX6p-1，在T4連接酶作用下連接構(gòu)建成表達(dá)載體，連接產(chǎn)物在Amp+抗性板篩選陽性克隆子。EcoRI，BamHI，XhoI，NotI，SmaI，SalI等代表多克隆酶切位點(diǎn)。
圖8為融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE。在圖8中，1.沉淀；2.上清；3.全蛋白；4誘導(dǎo)前對照；5.空載體誘導(dǎo)后；6.空載體誘導(dǎo)前；M蛋白標(biāo)準(zhǔn)；116KDa，66.2KDa，45.0KDa，37KDa，35.0KDa，26KDa，25.0KDa，18.8KDa，14.4KDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖9為融合蛋白表達(dá)純化的SDS-PAGE分析。在圖9中，1和3為純化的蛋白；2為空載體誘導(dǎo)前；4為重組載體誘導(dǎo)后上清；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖10為Western blot分析(一抗采用兔抗ProTα)。在圖10中，M小分子量蛋白Maker，1轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)后蛋白；2純化后蛋白；3，4分別為陽性和陰性血清雜交結(jié)果；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖11為純化蛋白Western-blot分析(一抗采用兔抗Tα1)。在圖11中，M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化蛋白；2純化蛋白雜交(一抗為兔抗thymosinα1)，175kDa，83kDa，62kDa，47.5kDa，32.5kDa，25.0kDa，16.5kDa，6.5kDa代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖12為ProTα單獨(dú)使用抗腫瘤活性照片。在圖12中，(a)500μg/kg；(b)50μg/kg；(c)5μg/kg；(d)0.5μg/kg；(e)對照組；(f)對照組；(g)S180再次攻擊(用藥組)。
圖13為ProTα聯(lián)合S180抗原一起使用時(shí)抗腫瘤活性照片。在圖13中，(a)用藥組接種S180(第15d)；(b)對照組接種S180(第15d)；(c)用藥組接種S180(第30d)；(d)對照組接種S180(第25d)；(e)用藥組接種S180(第30d)；(f)對照組接種S180(第25d)。

具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例采用的材料與方法說明如下。
1.實(shí)驗(yàn)取材和主要分子生物試劑 試驗(yàn)動物昆明種小鼠，(20±2)g，6-7周齡，雌性，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號0501452；S180腫瘤種鼠由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
正常成人外周血來自廈門大學(xué)醫(yī)院體檢健康成年人，由廈門大學(xué)醫(yī)院提供。淋巴細(xì)胞分離液購自廈門泰京技術(shù)有限公司，TRIZOL Reagent試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工公司，pMD18-T Vector試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量和Taq DNA聚合酶為TakaRa公司產(chǎn)品，pGEX 6P-1表達(dá)載體，大腸桿菌DH5α及BL21均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
本發(fā)明實(shí)施例的健康中國人cDNA序列如下。
ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG 2.引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物P15’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物P25′GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’引入EcoR I酶切位點(diǎn)。引物由上海生工公司合成。
3.中國人外周血中ProTα基因的RT-PCR擴(kuò)增 按照參考文獻(xiàn)的方法(郭葆玉，余建國，張淑英，等.克隆人胸腺素原αcDNA及RNA二級結(jié)構(gòu)分析和帶Xa因子的融合表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(1)34-37.)及TRIZOL Reagent試劑盒上的說明，常規(guī)分離中國人正常成人外周血PBMC，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測。以總RNA為模板按照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒上的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系100μl∶10μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，引物P1、P2各50pmol，4種dN TP各0.4mmol/L、Taq DNA酶5U。擴(kuò)增條件94℃變性5min，94℃45s、60℃45s、72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min(見圖1和2)。
4.PCR產(chǎn)物克隆鑒定與測序 按常規(guī)方法將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取7個(gè)單克隆37℃，LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定重組菌。將鑒定的陽性菌液送至上海博亞生物公司測序。
5.表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá) 用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將該基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD500nm為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h，菌液離心后沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(參見圖3和4)。
6.表達(dá)產(chǎn)物純化 超聲破碎菌體，15000g，10min離心取上清，ProTα-GST融合蛋白的純化Glutathione Sepharose 4B預(yù)處理根據(jù)谷胱甘肽-瓊脂糖4B(Glutathione SepharoseTM4B)操作說明書，按下列程序純化GST融合蛋白因每升細(xì)菌培養(yǎng)物約需谷胱甘肽-瓊脂糖4B 0.5ml，故按0.5ml柱床體積進(jìn)行(參見圖5)。
1)將谷胱甘肽-瓊脂糖4B基質(zhì)轉(zhuǎn)移至一次性的小柱子； 2)輕扣小柱以去除氣泡，然后讓谷胱甘肽-瓊脂糖4B基質(zhì)著床； 3)移取底蓋，讓柱子滴干； 4)加入10倍床體積的1×PBS洗滌，讓柱子滴干，重復(fù)2次； 5)在基質(zhì)中每次加入100μl GSTreduction elution buffer洗脫GST融合蛋白，共洗脫4次； 6)收集洗脫液，每次各取5μl用于SDS-PAGE分析，SDS-PAGE參照《分子克隆手冊》進(jìn)行，分離膠和濃縮膠濃度分別為12％和5％； 7)將蛋白置于-20℃保存。
7.重組人前胸腺素α原對腫瘤細(xì)胞S180的抑制活性實(shí)驗(yàn) 腫瘤抑制率實(shí)驗(yàn)按如下方法進(jìn)行 重組人前胸腺素α原融合蛋白抗小鼠肉瘤S180及免疫功能實(shí)驗(yàn)，選擇腹腔接種S180后15d，生長狀況良好的荷瘤鼠，從腹腔用一次性注射器無菌吸取腹水，以生理鹽水稀釋細(xì)胞，洗滌2次，再用生理鹽水稀釋細(xì)胞數(shù)為8×106個(gè)/ml，活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于95％，取0.2ml瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠右腋皮下。于接種次日隨機(jī)分成5組，每組10只，稱重開始給樣。設(shè)計(jì)6組試驗(yàn)，其中一組為對照組，每組為10只小鼠，首先皮下注射S180細(xì)胞1*105個(gè)/只老鼠，7d后腫瘤長出，對照組注射PBS緩沖液，其余5組分別開始注射胸腺素原(按此劑量0.05，0.5，5，50，500μg/kg)連續(xù)注射7d，之后解剖小鼠測腫瘤重，胸腺重，脾臟重。
另設(shè)兩個(gè)對照組，一組為腫瘤模型對照組(Tumour control)；另一組為藥物對照組(Medicament control)。該兩組每天分別腹腔注射生理鹽水和環(huán)磷酰胺(CPA，劑量為15mg/kg·d)0.5ml。連續(xù)腹腔注射20d后，稱取體重?cái)囝i處死小鼠，稱取瘤結(jié)以及荷瘤小鼠胸腺、脾臟重量，進(jìn)行影響效果分析。
以下給出融合蛋白生物活性的評價(jià)指標(biāo)，評價(jià)指標(biāo)為抑瘤率，可按下列公式計(jì)算 抑瘤率＝(C-T)/C×100％ 式中C為對照組平均瘤重(mg)，T為實(shí)驗(yàn)組平均瘤重(mg)。
臟器指數(shù)按下列公式計(jì)算 臟器指數(shù)＝內(nèi)臟各器官重量(mg)/終體重(g)。
8.重組蛋白ProTα與腫瘤細(xì)胞抗原一起聯(lián)合使用觀察抑制S180效果 實(shí)驗(yàn)步驟如前，但在皮下注射重組蛋白ProTα?xí)r同時(shí)注射S180細(xì)胞經(jīng)過蛋白提取試劑盒提取的抗原，抗原總共注射3次，每次間隔7d。抑瘤率和體重變化與前步驟相同。
9.延長荷瘤小鼠壽命實(shí)驗(yàn) 選擇腹腔接種S180后15d，生長狀況良好的荷瘤鼠，從腹腔用一次性注射器無菌吸取腹水，以生理鹽水稀釋細(xì)胞，洗滌2次，再用生理鹽水稀釋細(xì)胞數(shù)為8×106個(gè)/ml，活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于95％，取0.2ml瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔。于接種第6日隨機(jī)分成6組，每組10只，稱重開始給樣。用藥劑量組分別為0.05，0.5，5，50，500μg/kg。，此四組每天每鼠腹腔注射重組人前胸腺素α原融合蛋白0.5ml/次。
另設(shè)兩個(gè)對照組，一組為腫瘤模型對照組(Tumour control)；另一組為藥物對照組(Medicament control)。該兩組每天分別腹腔注射生理鹽水和環(huán)磷酰胺(CPA，劑量為15mg/kgd)0.5ml。連續(xù)腹腔注射30d，每天觀察小鼠生活狀態(tài)，取食情況，每隔5d稱重，連續(xù)觀察60d，計(jì)算死亡率，用藥組延長小鼠壽命程度，存活時(shí)間超過60d作為完全存活標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算完全存活率。用藥組對再次接種S180的抵抗力實(shí)驗(yàn)將生存下來的用藥(注射重組ProTα)小鼠每組取5只，選擇相同年齡和體重的雄性健康小鼠做對照，腹腔接種與前述相同數(shù)量的S180細(xì)胞，觀察用藥組和對照組小鼠生存情況。
本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)通過SPSS(version11.0，SPSS)軟件進(jìn)行分析處理。
本發(fā)明成功地采用基因工程的方法從經(jīng)過體檢健康的成年人外周血淋巴細(xì)胞中獲得前胸腺素原cDNA，并經(jīng)過重組技術(shù)在原核細(xì)胞中以可溶性形式得到高效表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的28％。采用生物學(xué)軟件DNAman對7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對，該cDNA序列與已報(bào)道的AF257099 ProTα序列存在3個(gè)堿基的差異，但是與1984年首次從胸腺中克隆到的基因序列只有84％的同源性。
重組胸腺素α原融合蛋白抑制S180生長效果見表1。
表1 3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，x±s，n＝10。
重組胸腺素α原融合蛋白聯(lián)合瘤細(xì)胞抗原一起抑制S180生長見表2，抑瘤率明顯比單獨(dú)用重組胸腺素α原融合蛋白效果好，說明重組胸腺素α原融合蛋白具有免疫佐劑的效果。
表2 x±s，n＝10 重組胸腺素α原融合蛋白對荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響見表3。
表3 3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，x±s，n＝10。
用藥組小鼠對再次接種S180的抵抗效果見表4。
表4 健康中國人cDNA序列 ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG 上游引物P15’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’， 下游引物P25’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法，其特征在于其包括以下步驟
1)根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分別為
上游引物P15’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P25’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，
將上游引物P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)；
2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-TVector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽性菌液測序；
3)采用生物學(xué)軟件DNAman對7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對；
4)用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得GST-Proα融合蛋白；
5)將4經(jīng)過轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因BL21菌株超聲破碎后，離心所獲得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proα；
6)將上清經(jīng)過GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Proα融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法，其特征在于在步驟4)中，37℃培養(yǎng)至OD500nm為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h。
3.如權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法，其特征在于在步驟4)中，菌液離心后的沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白在制備瘤苗免疫佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用，涉及一種融合蛋白。根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物P1和P2，P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，P2引入EcoR I酶切位點(diǎn)。用RT-PCR方法得前胸腺素α原全長基因cDNA，PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列比對。用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，加入IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，離心取上清電泳，得GST-Proα融合蛋白。
文檔編號A61K38/16GK101096384SQ20071000908
公開日2008年1月2日 申請日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者周克夫, 李俊燕 申請人:廈門大學(xué)