專利名稱：抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，尤其是涉及一種抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
胸腺素原α(prothymosinα)是一個(gè)小的酸性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量13,000，最初由大鼠的胸腺分離得到。雖然胸腺素是由胸腺分泌的，但在體內(nèi)許多組織都有胸腺素原α的表達(dá)，而且是不含內(nèi)含子的一種保守的DNA序列。胸腺肽的臨床應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代中期，其最主要的貢獻(xiàn)是對(duì)胸腺依賴性疾病的治療，它對(duì)于維持原發(fā)性免疫缺陷病，自身免疫疾病和癌癥患者的免疫反應(yīng)性，刺激其特異性淋巴細(xì)胞的活性起著主要作用，因此廣泛應(yīng)用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞氏綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥感染、支氣管哮喘、急慢性肝炎和腫瘤等疾病。另外，由于人類的老化明顯地反映胸腺組織的萎縮和功能的衰竭，胸腺肽可以推遲一些老年性疾病的出現(xiàn)，因此應(yīng)用胸腺肽抗衰老也有著極其廣闊的前景。
隨著研究的深入，人們已經(jīng)將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向胸腺素中的單一肽，以期發(fā)現(xiàn)更有效的臨床治療藥物。文獻(xiàn)表明，胸腺素α原(prothymosinα，ProTα)和Tα1是當(dāng)前胸腺素研究中的熱點(diǎn)。
胸腺素原α的前28個(gè)肽(Thymosinα1，Tα1)已有許多實(shí)驗(yàn)證明它是一種免疫激素，1984年，Haritos(Haritos A A et al.Proc Natl Acad Sci.USA，1984，811008)等從大鼠胸腺分離出一種含有111個(gè)氨基酸殘基的多肽，其N端含已發(fā)現(xiàn)的所有胸腺素α，原家族成員的序列，因此命名為胸腺素α原，ProTα是一個(gè)小分子蛋白，由109~113個(gè)氨基酸殘基組成。由111個(gè)氨基酸殘基組成。人ProTα由109個(gè)氨基酸殘基組成，它對(duì)提高機(jī)體免疫力，抗機(jī)會(huì)感染，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的成熟與分化；對(duì)IL-2和IL-2R的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用；甚至于發(fā)現(xiàn)它對(duì)腫瘤也有一定治療作用。
1986年P(guān)an和Haritos(Pan et al.Arch Biochem Biophys 1986；Haritos et al.Proc NatlAcad Sci USA 1986)等發(fā)現(xiàn)大鼠ProTA能增強(qiáng)小鼠抗白色念珠菌(Cαndidαα1bicαns)感染的能力，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)ProTα能刺激轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)的釋放，其作用比Tα1強(qiáng)10～20倍。
I型糖尿病的重要原因與自身免疫疾病密切相關(guān)，其中主要是因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞受到自身免疫細(xì)胞的攻擊，造成抗原暴露，引起免疫系統(tǒng)進(jìn)一步的反應(yīng)，使得胰島β細(xì)胞大量損失，正常胰島素的分泌受到影響，血糖升高，形成糖尿病癥狀。STZ在I型糖尿病模型制備中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，大鼠在50mg/kg一次性注射情況下并可以造模成功，而小鼠則在相同劑量經(jīng)過(guò)5次連續(xù)注射后基本達(dá)到造模目的，目前認(rèn)為STZ的作用機(jī)理是通過(guò)使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的NO，攻擊破壞胰島β細(xì)胞，引起胰島細(xì)胞抗原暴露，激活機(jī)體免疫機(jī)制，大量巨噬細(xì)胞進(jìn)入胰島細(xì)胞從而加劇胰島細(xì)胞的損傷，最后造成胰島素分泌減少，引起血糖增高，誘發(fā)糖尿病。誘導(dǎo)的小鼠胸腺萎縮，腎臟明顯腫大，并且血清抗氧化能力顯著下降。
近年來(lái)，糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)理研究表明氧化應(yīng)激與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)(曹文彬等，抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素防治糖尿病的研究進(jìn)展，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(2)73-74)，為了防止糖尿病的發(fā)生發(fā)展，人們對(duì)一些具有防治糖尿病作用的天然抗氧化物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)它們通過(guò)表達(dá)不同的機(jī)制與作用環(huán)節(jié)打斷氧化侵襲引致胰島β細(xì)胞損害的惡性循環(huán)，從而為天然抗氧化治療糖尿病提供了一個(gè)新的策略。
前胸腺素α原具有調(diào)節(jié)平衡免疫功能的作用，能夠使過(guò)激的免疫功能下調(diào)，避免自身免疫疾病的發(fā)生，同時(shí)，最近研究(Malicet，C.，Dagorn，J.C.，Neira，j.l.and Iovanna，J.L.P8and prothymosin alphaunity is strenthe.Cell cycle，2006，5(8)829-830)還表明，ProTα與細(xì)胞凋亡因子P8能夠形成復(fù)合體，共同起到抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞分裂的功能。此外，最近研究(Mallo，G.V.，F(xiàn)iedler，F(xiàn).，Calvo，E.L.，Ortiz，E.M.，Vasseur，et al.cloningand expression on the rat p8 cDNA，a new gene pancreas during the acute phase ofpancreatitis，pancreas development，and regeneration，and which promostes celluarproduction.J.Biol.Chem.1997，272(51)32360-32369)還證明，P8能夠刺激胰島素β細(xì)胞細(xì)胞增殖，因此，推測(cè)ProTα不僅能夠保護(hù)胰島細(xì)胞避免自身免疫細(xì)胞的攻擊，同時(shí)能夠促進(jìn)胰島細(xì)胞的分裂，從而增加胰島素的分泌功能。早在20世紀(jì)80年代Tabata，T(Tabata，T.，Kinoshita，Y.，F(xiàn)ujin，S.，Hato，F(xiàn).，et al.pretection by thymosin fraction5 from streptozotocin induce diabetes in mice.Cellular and molecular biology1989，35(2)121-127)采用從豬的胸腺分離到的肽腺因子進(jìn)行抵抗STZ誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生，有一定的效果，但所用的是含有多種成分的復(fù)合物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用基因工程手段，從健康人獲得人ProTαcDNA，并經(jīng)過(guò)重組技術(shù)在原核細(xì)胞中以可溶性形式得到高效表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的28％。
本發(fā)明所述的一種抗氧化融合蛋白的制備方法包括以下步驟 1)根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分別為 上游引物P15’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’， 下游引物P25’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’， 將上游引物P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoR I酶切位點(diǎn)。
2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長(zhǎng)基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-TVector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽(yáng)性菌液測(cè)序。
3)采用生物學(xué)軟件DNAman對(duì)7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對(duì)。
4)用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得轉(zhuǎn)基因BL21菌株，在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得融合蛋白。
上游引物P1和下游引物P2由上海生工公司合成。將鑒定的陽(yáng)性菌液可送至上海博亞生物公司測(cè)序。
在步驟4)中，所述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得轉(zhuǎn)基因BL21菌株可經(jīng)過(guò)超聲破碎后離心，得上清，將上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Proα融合蛋白。所述的在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)在培養(yǎng)至OD500nm為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為5h，菌液離心后的沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
本發(fā)明所述的一種抗氧化融合蛋白可在制備抗氧化藥物以及預(yù)防糖尿病藥物中的應(yīng)用。
通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該融合蛋白具有增加胸腺指數(shù)能力，但在增加胸腺指數(shù)方面對(duì)于老齡老鼠效果更明顯。對(duì)于脾臟指數(shù)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
在抗氧化能力活性檢測(cè)中，選擇4個(gè)月齡，體重在40g以上的老齡老鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)注射重組融合蛋白，不僅可以顯著提高老鼠胸腺指數(shù)，同時(shí)可以顯著提高老鼠抗氧化能力。
通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明該融合蛋白具有很好的抵抗STZ誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生，并且能夠承受再次STZ的攻擊，表現(xiàn)出很好的抵抗糖尿病誘發(fā)因素的影響。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該融合蛋白不僅能夠有效平衡機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，同時(shí)能夠提高胸腺指數(shù)，提高小鼠糖耐量能力，并且能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能。這些因素對(duì)于抑制由STZ誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生都有重要影響。同時(shí)證明該蛋白在抵抗糖尿病的發(fā)生中具有重要保護(hù)作用，為今后開(kāi)發(fā)糖尿病基因工程潛在藥物奠定基礎(chǔ)。
胸腺是人體免疫中樞，青年時(shí)最發(fā)達(dá)，但隨著年齡的增加，胸腺逐漸萎縮，因而人的免疫功能逐漸減弱，臨床上有采用注射胸腺因子來(lái)提高病人的免疫功能，此外對(duì)于包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，I型糖尿病等自身免疫性疾病方面胸腺素具有穩(wěn)定系統(tǒng)免疫功能的作用。其中目前常用的是從動(dòng)物胸腺中提取的胸腺肽，胸腺肽成分復(fù)雜，質(zhì)量不穩(wěn)定，因此尋找作用穩(wěn)定，成分單一的有效胸腺因子作為臨床應(yīng)用是目前的重要熱點(diǎn)。目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用的單一組份是合成的胸腺素α1(商品名日達(dá)仙，1.6mg 800人民幣，意大利進(jìn)口)，價(jià)格昂貴，本發(fā)明從中國(guó)人外周血中所克隆到的胸腺素原α基因及其蛋白原核表達(dá)，采用基因工程手段表達(dá)前胸腺素α原蛋白，純度高，成分一致，并且經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)效果顯著，同時(shí)適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所述的融合蛋白可以起到穩(wěn)定機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)抗氧化能力，防止I型糖尿病的發(fā)生的功效，為今后研制和開(kāi)發(fā)新的基因工程抗氧化藥物及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。



圖1為中國(guó)人外周血淋巴總RNA電泳圖。在圖1中，5S，18S，28S代表不同沉降系數(shù)的RNA。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)RT-PCR獲得的產(chǎn)物。在圖2中，2000bp，1000bp，750bp，500bp，300bp，250bp，100bp分別代表DNA大小，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA。
圖3為ProTα的PCR擴(kuò)增結(jié)果。在圖3中，1為PCR產(chǎn)物，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA。
圖4為質(zhì)粒PUCT-α限制性酶切分析。在圖4中，1PUCT-α/BamHI+EcoRI雙酶切結(jié)果(2.6Kb，300bp)；M標(biāo)準(zhǔn)DNA DL2000(bp)；2pMD18-T-Vector質(zhì)粒。
圖5為質(zhì)粒pGEX-ProTα的PCR鑒定結(jié)果。在圖5中，1、2PCR產(chǎn)物(300bp)，3陰性對(duì)照，MM代表標(biāo)準(zhǔn)DNA，DL2000(bp)。
圖6為質(zhì)粒pGEX-α限制性酶切分析。在圖6中，1、2pGEX-α/BamHI+EcoRI(4.9kb，300bp)，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA，DL2000(bp)。
圖7為表達(dá)載體pGEX-α構(gòu)建流程圖。在圖7中，將proT基因克隆到質(zhì)粒pUCT載體中，并用EcoRI和BamHI雙酶切，同時(shí)用與之相同的兩種酶雙酶切載體pEGX6p-1，在T4連接酶作用下連接構(gòu)建成表達(dá)載體，連接產(chǎn)物在Amp+抗性板篩選陽(yáng)性克隆子。EcoRI，BamHI，XhoI，NotI，SmaI，SalI等代表多克隆酶切位點(diǎn)。
圖8為融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE。在圖8中，1.沉淀；2.上清；3.全蛋白；4誘導(dǎo)前對(duì)照；5.空載體誘導(dǎo)后；6.空載體誘導(dǎo)前；M蛋白標(biāo)準(zhǔn)；116KDa，66.2KDa，45.0KDa，37KDa，35.0KDa，26KDa，25.0KDa，18.8KDa，14.4KDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖9為融合蛋白表達(dá)純化的SDS-PAGE分析。在圖9中，1和3為純化的蛋白；2為空載體誘導(dǎo)前；4為重組載體誘導(dǎo)后上清；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖10為Western blot分析(一抗采用兔抗ProTα)。在圖10中，M小分子量蛋白Maker，1轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)后蛋白；2純化后蛋白；3，4分別為陽(yáng)性和陰性血清雜交結(jié)果；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖11為純化蛋白Western-blot分析(一抗采用兔抗Tα1)。在圖11中，M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化蛋白；2純化蛋白雜交(一抗為兔抗thymosinα1)，175kDa，83kDa，62kDa，47.5kDa，32.5kDa，25.0kDa，16.5kDa，6.5kDa代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
圖12為用藥組和對(duì)照組胸腺指數(shù)的差異。在圖12中，proT10，proT1，proT0.1，proT0.01分別代表不同濃度proT，STZ代表鏈脲菌素。
圖13為用藥組與對(duì)照組腎臟指數(shù)的比較。在圖13中，proT10，proT1，proT0.1，proT0.01分別代表不同濃度proT，STZ代表鏈脲菌素。
圖14為用藥組與對(duì)照組小鼠在糖耐量實(shí)驗(yàn)的比較。在圖14中，proT10，proT1，proT0.1，proT0.01分別代表不同濃度proT，STZ代表鏈脲菌素。
圖15為用藥組和對(duì)照組血糖變化差異比較。在圖15中，10，1，0.1，0.01分別代表不同濃度proT，citrate代表檸檬酸，STZ代表鏈脲菌素。
圖16為實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重變化比較。在圖16中，10，1，0.1，0.01分別代表不同濃度proT，citrate代表檸檬酸，STZ代表鏈脲菌素。
圖17為用藥組對(duì)STZ再次抵抗的效果。在圖17中，10，1，0.1，0.01分別代表不同濃度proT，STZ代表鏈脲菌素。

具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例所采用的材料與方法說(shuō)明如下。
1.實(shí)驗(yàn)取材和主要分子生物試劑 試驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，(20±2)g，6-7周齡，雌性，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)0501452；S180腫瘤種鼠由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
正常成人外周血來(lái)自廈門大學(xué)醫(yī)院體檢健康大學(xué)生，由廈門大學(xué)醫(yī)院提供。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自廈門泰京技術(shù)有限公司，TRIZOL Reagent試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自上海生工公司，pMD18-T Vector試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量和Taq DNA聚合酶為TakaRa公司產(chǎn)品，pGEX 6P-1表達(dá)載體，大腸桿菌DH5α及BL21均為本申請(qǐng)人保存。
本發(fā)明實(shí)施例的健康中國(guó)人cDNA序列如下。
ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG 2.引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物P15’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物P25’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’引入EcoR I酶切位點(diǎn)。引物由上海生工公司合成。
3.中國(guó)人外周血中ProTα基因的RT-PCR擴(kuò)增 按照參考文獻(xiàn)(郭葆玉，余建國(guó)，張淑英，等.克隆人胸腺素原αcDNA及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和帶X a因子的融合表達(dá).第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(1)34-37.)的方法及TRIZOLReagent試劑盒上的說(shuō)明，常規(guī)分離中國(guó)人正常成人外周血PBMC，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以總RNA為模板按照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系100μl∶10μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，引物P1、P2各50pmol，4種dN TP各0.4mmol/L、Taq DNA酶5U。擴(kuò)增條件94℃變性5min，94℃45s、60℃45s、72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min(見(jiàn)圖1和2)。
4.PCR產(chǎn)物克隆鑒定與測(cè)序 按常規(guī)方法將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取7個(gè)單克隆37℃，LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定重組菌。將鑒定的陽(yáng)性菌液送至上海博亞生物公司測(cè)序。
5.表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá) 用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將該基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD500nm為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h，菌液離心后沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(見(jiàn)圖3和4)。
6.表達(dá)產(chǎn)物純化 超聲破碎菌體，15000g，10min離心取上清，ProTα-GST融合蛋白的純化Glutathione Sepharose 4B預(yù)處理根據(jù)谷胱甘肽-瓊脂糖4B(Glutathione SepharoseTM4B)操作說(shuō)明書(shū)，按下列程序純化GST融合蛋白因每升細(xì)菌培養(yǎng)物約需谷胱甘肽-瓊脂糖4B 0.5ml，故按0.5ml柱床體積進(jìn)行(圖5)。
1)將谷胱甘肽-瓊脂糖4B基質(zhì)轉(zhuǎn)移至一次性的小柱子； 2)輕扣小柱以去除氣泡，然后讓谷胱甘肽-瓊脂糖4B基質(zhì)著床； 3)移取底蓋，讓柱子滴干； 4)加入10倍床體積的1×PBS洗滌，讓柱子滴干，重復(fù)2次； 5)在基質(zhì)中每次加入100μl GSTreduction elution buffer洗脫GST融合蛋白。共洗脫四次； 6)收集洗脫液，每次各取5μl用于SDS-PAGE分析。SDS-PAGE[參照分子克隆手冊(cè)]進(jìn)行，分離膠和濃縮膠濃度分別為12％和5％； 7)將蛋白置于-20℃保存。
7.重組人前胸腺素原對(duì)老齡老鼠抗氧化功能的影響的活性實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)表1)。
選擇4個(gè)月齡，體重在40克以上的老齡雄性昆明老鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為6個(gè)組，每組10只，用藥劑量組分別為0.5mg/kg；0.05mg/kg；0.005mg/kg；0.0005mg/kg，此4組每天腹腔注射重組人前胸腺素原融合蛋白0.5ml。另設(shè)2個(gè)對(duì)照組，1個(gè)為不注射任何試劑，1組注射相同體積的生理鹽水，20天后從眼眶靜脈取血，分離血清檢測(cè)小鼠血清SOD，GSH-Px，MDA活性，檢測(cè)試劑為南京建成生物技術(shù)公司產(chǎn)品。
表1重組胸腺素α原融合蛋白對(duì)老齡老鼠抗氧化功能的影響 (x±s，n＝10，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)) a與空白組相比；p＜0.01；b與生理鹽水組相比，p＜0.01 8.重組人前胸腺素α原融合蛋白抵抗由STZ誘導(dǎo)的糖尿病實(shí)驗(yàn) 事先連續(xù)注射ProTα7天后再與空白組一起注射STZ，并連續(xù)再注射ProTα7天后停止用藥。
選擇健康昆明雄性鼠100只，隨機(jī)分為6組，設(shè)計(jì)6組試驗(yàn)，其中一組為對(duì)照組(10只)(注射生理鹽水代替STZ組)，一組為溶劑對(duì)照組(10只)(注射檸檬酸溶液組)，一組為空白組(只注射STZ)(10只)，另外4組為用藥組，分別注射胸腺素α原(按劑量10μg/每只，1μg/每只，0.1μg/每只，0.01μg/每只)連續(xù)注射七天，之后與實(shí)驗(yàn)空白組一起同時(shí)注射STZ，劑量為50mg/kg，連續(xù)注射4天，而后每隔5天稱小鼠體重，測(cè)血糖一次，并且在實(shí)驗(yàn)的20天檢測(cè)各組小鼠耐糖量實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)25天，最后處死小鼠，解剖小鼠測(cè)胸腺重，腎臟和脾臟重，并分別計(jì)算其指數(shù)。
糖耐量實(shí)驗(yàn)按以下公式計(jì)算 AUC＝0.25×(BS value at 0 hour+4×BS value at 0.5 hours+3×BS value at 2 hours)。
臟器指數(shù)按以下公式計(jì)算 臟器指數(shù)＝內(nèi)臟各器官重量(mg)/總體重(g)。
本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS(version 11.0，SPSS Inc.)軟件進(jìn)行分析處理，其結(jié)果參見(jiàn)圖6～17。
本發(fā)明成功地采用基因工程的方法從經(jīng)過(guò)體檢健康的成人外周血淋巴細(xì)胞中獲得前胸腺素原cDNA，并經(jīng)過(guò)重組技術(shù)在原核細(xì)胞中以可溶性形式得到高效表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的28％。
采用生物學(xué)軟件DNAman對(duì)7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對(duì)，該cDNA序列與已報(bào)道的AF257099 ProTα序列存在3個(gè)堿基的差異，但是與1984年首次從胸腺中克隆到的基因序列只有84％的同源性。
健康中國(guó)人cDNA序列 ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG 上游引物P15’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’， 下游引物P25’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’。
權(quán)利要求
1.抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，其特征在于其包括以下步驟
1)根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分別為
上游引物P15’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P25’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，
將上游引物P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)；
2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長(zhǎng)基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-TVector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽(yáng)性菌液測(cè)序；
3)采用生物學(xué)軟件DNAman對(duì)7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對(duì)；
4)用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得轉(zhuǎn)基因BL21菌株，在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得轉(zhuǎn)基因BL21菌株可經(jīng)過(guò)超聲破碎后離心，得上清，將上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Proα融合蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述的在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)在培養(yǎng)至OD500nm為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為5h，菌液離心后的沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白在制備預(yù)防糖尿病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，涉及一種融合蛋白。根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物P1和P2，將P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將P2引入EcoR I酶切位點(diǎn)。采用RT-PCR方法得前胸腺素α原全長(zhǎng)基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列比對(duì)。用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得轉(zhuǎn)基因BL21菌株，培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，離心取上清電泳。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101096385SQ20071000908
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者周克夫, 李俊燕 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)